CN100351369C - 产d－泛解酸内酯水解酶的微生物及其制备d－泛解酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物酶拆分DL-泛解酸内酯生产D-泛解酸的方法。利用镰孢霉属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)、粘帚霉属(Gliocladium)以及短梗霉属(Aureobasidium)等属丝状真菌的产D-泛解酸内酯水解酶的菌株，发酵培养，以湿菌体为粗酶，以化学合成的DL-泛解酸内酯为底物，进行选择性水解DL-泛解酸内酯中的D-泛解酸内酯生成高光学活性的D-泛解酸。L-泛解酸内酯可以回收，经过消旋化反应得到DL-泛解酸内酯重新用于拆分。
Description
技术领域
本发明属生物催化研究领域，涉及产D-泛解酸内酯水解酶的微生物及其制备D-泛解酸的方法。
背景技术
D-泛解酸(Pantothenic acid)是制造D-泛酸的重要手性中间体，D-泛酸是维生素B族物质，辅酶A的组成部分，参与糖、脂肪、蛋白质代谢，其产品多以D-泛酸钙形式存在。D-泛酸钙广泛应用于医药、食品、饲料工业中。
目前制备D-泛酸一般采用化学或生物拆分方法。传统的化学拆分方法存在产生成本高、生产量小、产品光学纯度差等弱点。生物拆分方法中，采用微生物酶法拆分DL-泛解酸内酯，因具有环境污染和毒性少等特点而成为研究的一个重要方向。其中，微生物酶法拆分DL-泛解酸内酯的一种方法是利用产L-泛解酸内酯酶的微生物，分解DL-泛解酸内酯中的L-泛解酸内酯，得到未分解的D-构型泛解酸内酯(JPA 47-19745、JPA 57-152895)，此方法的缺点只有L-构型的内酯被水解得非常彻底才能得到高光学纯度的D-泛解酸内酯，反应时间长，大约需要72小时，长时间的水解过程会导致一部分D-泛解酸内酯水解，因此所得到的产物D-泛解酸内酯收率不高。另一种方法是利用产D-泛解酸内酯酶的微生物，选择性水解DL-泛解酸内酯中的D-泛解酸内酯，得到D-泛解酸，再将D-泛解酸进行内酯化生成D-泛解酸内酯。该方法水解时间短，虽然水解率不高(30％左右)，但未水解的L-泛解酸内酯可消旋后再利用，产物的总收率高。该法已先后在日本第一制药公司和中国浙江鑫生化股份有限公司用于工业生产，分别采用尖孢镰孢Fusariumoxysporum IFO 000或串珠镰孢霉菌Fusarium moniliforme CGMCC 0536。
在研究与生产实践过程中发现，不同微生物产酶菌株的使用效果不同。例如尖孢镰孢Fusarium oxysporum IFO5942，存在发酵培养时间长(7天)、只进行一次酶转化、酶的利用率低等缺陷(US Patent 5275949，1994)；而串珠镰孢霉菌Fusariummoniliforme SW-902(即CGMCC 0536)菌株，菌株发酵产酶时间短(2～3天)，对D-泛解酸内酯选择专一性高，产品光学纯度高(99％e.e)(中国专利CN01104070.X，2001)。
发明内容
本发明的目的在于研究更多的能高效生产D-泛解酸内酯的微生物菌珠。
本发明对产D-泛解酸内酯酶、具有水解D-泛解酸内酯能力的丝状真菌进行筛选，对其中选择性高，产品光学纯度高的微生物菌株进行培养，以其湿菌体或其用戊二醛交联得到的固定化细胞为粗酶，选择性拆分D-泛解酸内酯生产D-泛解酸。
本发明的产D-泛解酸内酯水解酶的微生物，是在D-泛解酸内酯和溴百里酚蓝的筛选培养基上产生变色圈的丝状真菌镰孢霉属Fusariu、赤霉属Gibberella、曲霉属Aspergill、青霉属Penicillium、根霉属Rhizopu、粘帚霉属Gliocladium或短梗霉属Aureobasidium的菌株及其突变株，其特征在于将该微生物应用于拆分DL-泛解酸内酯生产D-泛解酸。
本发明包括以下步骤：
(1)权利要求1所述的微生物的筛选及培养；
(2)利用权利要求1所述的微生物对DL-泛解酸内酯进行选择性拆分；
其中，初筛培养基组成为：甘油0.5％～1％、蛋白胨0.5％～1％、酵母膏0.5％～1％、玉米浆0.5％～1％、pH值6.0～7.5、琼脂1.5％～2.5％，并加入1％～3％D-泛解酸内酯和0.001％～0.01％的溴百里酚蓝。温度25～30℃，培养时间5～8天。挑取产生黄色变色圈大的菌珠，接种到马铃薯浸汁斜面培养。
复筛培养基组成为：甘油1％～8％、蛋白胨0.5％～3％、酵母膏0.5％～3％、玉米浆0.2％～3％、pH值6.0～8.0、500mL三角瓶装液量50～200-mL、摇瓶转速100～200r/min、温度25～35℃、培养时间2～7天，收集菌体测定其D-泛解酸内酯酶粗酶活力。
微生物的培养是按常规的丝状真菌培养方法进行发酵培养，产酶培养基为甘油0.1％～10％、蛋白胨0.1％～5％、酵母膏0.1％～5％、玉米浆0.1％～5％、pH值5.0～9.0，摇瓶发酵条件为20～35℃、100～200r/min、500mL三角瓶装液量50～200mL、发酵培养2～7天，发酵液过滤得到粗酶液或湿菌体。
选择性拆分方法如下：将DL-泛解酸内酯配制成10％～70％水溶液，加入10～50mmol/L CaCl2，用NaOH或HCl溶液调pH为7.0～7.5，作为酶催化反应底物，在发酵液过滤得到的粗酶液或湿菌体或经戊二醛交联固定化的菌体中加入该底物溶液，加入的量为每100ml底物溶液加入0.1g～10g湿菌体，并控制pH为6.0～9.0，20～55℃，120～200r/min，反应时间8～16小时。
所述的镰孢霉属Fusariu为串珠镰孢、尖镰孢、球茎状镰孢、尖孢镰刀菌豌豆专化型、尖喙镳草镰孢、燕麦镰孢、草燕麦镰孢、链状镰刀菌、黄色镰孢、大刀镰孢、双胞镰孢、双孢镰刀菌、木贼镰孢、禾本科镰孢、禾谷镰孢、砖红镰刀菌、节孢镰刀菌木菠萝变种、幼角镰孢、雪腐镰孢、早熟禾镰孢、早熟镰刀菌、多枝镰孢、接骨木镰孢、镳草镰孢、腐皮镰孢、马特腐皮镰孢、茄病镰刀菌嗜石油变种、球孢镰刀菌、胶孢镰孢、腹状镰孢、蚀脉镰孢。
赤霉属Gibberella为藤仓赤霉、小麦赤霉、玉蜀黍赤霉；曲霉属Aspergill为黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉、土曲霉；青霉属Penicillium为产黄青霉；根霉属Rhizopu为米根霉、华根霉、日本根霉；粘帚霉属Gliocladium为链孢粘帚霉；短梗霉属为Aureobasidium出芽短梗霉，具体包括以下之一：
镰孢霉属Fusarium
串珠镰孢Fusarium moniliforme AS3.296，AS3.349，AS3.0752，AS3.1526，AS3.2835(GIM3.64)，AS3.2879(GIM3.65)，AS3.2962，AS3.2974，AS3.2989，AS3.2992，AS3.3489，AS3.4269(GIM3.398)，AS3.4722，AS3.4723，AS3.4759，AF93314，ACCC30133，ACCC30174，ACCC30175，ACCC30217，ACCC30325，ACCC30331，ACCC30334，ACCC31034，SW05H
Fusarium moniliforme var.intermedium AS3.2966
Fusarium moniliforme Sheldon AS3.752(GIM3.63)，AF 93271，AF 93241，AF93242
尖镰孢Fusarium oxysporum AS3.283，AS3.1785，AS3.1786，AS3.179，AS3.1793，AS3.1795，AS3.1796，AS3.1799，AS3.3633，AS3.3638，AS3.4743，AS3.2830(GIM3.392)
球茎状镰孢Fusarium oxysporum AS 3.3633
Fusarium oxysporum Schlechtendal AS3.1789()GIM3.390，AS3.731(GIM3.391)
尖孢镰刀菌豌豆专化型ACCC31037
尖喙镳草镰孢Fusarium acuminatum AS3.4277，AS3.4603
Fusarium anthophilum AS3.4712，AS3.4742
Fusarium annulatum AS3.4728
燕麦镰孢Fusarium avenaceum AS3.0709，AS3.1809，AS3.3628，AS3.4594
草燕麦镰孢Fusarium avenaceum var.herbarum AS3.3641
Fusarium avenaceum subsp.herbarum〖WT〗(Corda)SaccardoAF 93248
Fusarium avenaceum(Corda ex Fries)Saccardo AF 93243
链状镰刀菌Fusarium catenulatum AS3.4704
Fusarium chlamydosporum AS3.3642
黄色镰孢Fusarium culmorum AS3.4734
大刀镰孢Fusarium culmorum AS3.4283，AS3.4595
Fusarium dlaminii AS3.1768，AS3.4737
双胞镰孢Fusarium dimerum AS3.1831
双孢镰刀菌Fusarium dimerum AS3.4596
Fusarium dimerum Penz.AF 93237
木贼镰孢Fusarium equiseti AS3.1806，AS3.1812，AS3.1813，AS3.1815，AS3.1832，AS3.3658，AS3.4597
Fusarium equiseti(Corda)Saccardo AF 93245，AF 93235
Fusarium fujikuroi AS3.4716，AS3.4729
禾本科镰孢Fusarium graminearum AS3.349，AS3.3489，AS3.3631，AS3.4521，AS3.4522
禾谷镰孢Fusarium graminearum AS3.0712，AS3.4733，AS3.4598
Fusarium graminearum Schw.AF 97003
砖红镰刀菌Fusarium lateritium AS3.4599
节孢镰刀菌木菠萝变种Fusarium merismoides var.artocarpum AS3.4491
Fusarium napiforme AS3.4735
幼角镰孢Fusarium neoceras AS3.1818，AS3.1819，AS3.4736
Fusarium neoceras Wollenw et Reink AF 93236
雪腐镰刀菌Fusarium nivale AS3.46
雪腐镰孢Fusarium nivale AS3.1852
Fusarium nygamai AS3.0713，AS3.4732
Fusarium oxysporum Schlechtendal AF 93327
Fusarium oxysporum Schlechtendal AF 93247
早熟禾镰孢Fusarium poae AS3.3805
早熟镰刀菌Fusarium poae AS3.4601
Fusarium proliferatum AS3.471，AS3.1777，AS3.4709，AS3.4724
Fusarium proliferatum var.minus AS3.4726
Fusarium proliferatum var.proliferatum AS3.474，AS3.3635，AS3.4738，AS3.4739，AS3.4741，
Fusarium redolens AS3.2626
多枝镰孢Fusarium reticulatum AS3.0708，AS3.0721
Fusarium roseum Link AF 93274
接骨木镰孢Fusarium sambucinum AS3.1837，AS3.1844，AS3.1846，AS3.4602
Fusarium sacchari var.elongatum AS3.4727
Fusarium sambucinum Fuckel AF 93238，AF 93337
Fusarium semitectum AS3.0719
镳草镰孢Fusarium scirpi AS3.3656
腐皮镰孢Fusarium solani AS3.183，AS3.584，AS3.1791，AS3.1828，AS3.2189，AS3.2889，AS3.4604
马特腐皮镰孢Fusarium solani var.martii AS3.3639
茄病镰刀菌嗜石油变种Fusarium solani var.petroliphilum AS3.4489
Fusarium solani(Martius)Appel et Wollenweber AF 93239，AF 93250，AF93249
球孢镰刀菌Fusarium sphaerosporum AS3.4488
胶孢镰孢Fusarium subglutinans AS3.473，AS3.4711，AS3.4725
Fusarium tricinctum AS3.4731
Fusarium tricinctum(Corda)Sacc.AF 93240
腹状镰孢Fusarium ventricosum AS3.4610
蚀脉镰孢Fusarium vasinfectum AS3.1854，AS3.4305
赤霉属Gibberella
藤仓赤霉Gibberella fujikuroi AS3.1756，AS3.1763，AS3.1764，AS3.1765，AS3.1775，AS3.4663，AF 93164
藤仓赤霉串珠变种Gibberella fujikuroi var.moniliforme AS3.4714，AS3.4715，AS3.4746，AS3.4747
藤仓赤霉藤仓变种Gibberella fujikuroi var.fujikuroi AS3.4748，AS3.4749
藤仓赤霉间型变种Gibberella fujikuroi var.intermedia AS3.4717，AS3.4718，AS3.4719，AS3.4750
藤仓赤霉胶孢变种Gibberella fujikuroi var.subglutinans AS3.4744，AS3.4745
Gibberella fujikuroi(Saw.)Wollenw.AF 9201，AF 92016
小麦赤霉Gibberella saubinetii AS3.4267，AS3.4288
玉蜀黍赤霉Gibberella zeae AS3.2873，ACCC31053，ACCC31054，ACCC31055，ACCC31056，ACCC31057，ACCC31058，ACCC31059，ACCC31060
曲霉属Aspergillus
黑曲霉Aspergillus niger JIMS3013，JIM3024，SW SW33，SW13-1，SW Zzq-19
米曲霉Aspergillus oryzae JIM3008，JIM3009，SIM 206
泡盛曲霉Aspergillus awamori AS3.0078，AS3.0079，AS3.0324，AS3.0327，AS3.0344
土曲霉Aspergillus terrus SW 3.19
土曲霉Aspergillus terrus SW 3.20
青霉属Penicillium
产黄青霉Penicillium chrysogenum AF 93097，AF 93073，AF93098
根霉属Rhizopus
米根霉Rhizopus oryzae AF 93277，AF 93156，GIM3.207，GIM3.208，JIM 3054
华根霉Rhizopus chinesis AS3.0817，AS3.0947，AS3.0948
日本根霉Rhizopus japonesis AS3.0237，AS3.0820，AS3.0821，JIM 3053
黑根霉Rhizopus niger AS3.0031，AS3.0038，AS3.0039
粘帚霉属Gliocladium
链孢粘帚霉Gliocladium catenulatum AS3.3655
短梗霉属Aureobasidium
出芽短梗霉Aureobasidium pullulans CGMCC 1244
本发明详细的过程如下：
1、产D-泛解酸内酯酶的菌种筛选
产D-泛解酸内酯水解酶的微生物菌株主要有镰孢霉属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)、粘帚霉属(Gliocladium)以及短梗霉属(Aureobasidium)等属的相关丝状真菌。收集各种丝状真菌进行筛选，特别是将选择性高，产品光学纯度高的镰孢霉菌属、赤霉菌属的各种菌株接种到马铃薯浸汁斜面培养基，其配方为：10％～20％马铃薯浸汁、葡萄糖1％～2％、琼脂1.5％～2.5％、pH自然、28℃、培养时间4～5天。
从生长好的斜面上挑取一小块菌体，在有玻璃小珠的无菌三角瓶中，用无菌水制成孢子悬液，稀释至每毫升约10-4～10-6个孢子，涂布于初筛平板培养基上，进行产酶菌株的初筛。初筛培养基组成为：甘油0.5％～1％、蛋白胨0.5％～1％、酵母膏0.5％～1％、玉米浆0.5％～1％、pH值6.0～7.5、琼脂1.5％～2.5％，并加入1％～3％D-泛解酸内酯和0.001％～0.01％的溴百里酚蓝。温度25～30℃，培养时间5～8天。挑取产生黄色变色圈大的菌珠，接种到马铃薯浸汁斜面培养。
将在斜面上生长好的菌体转接到液体产酶培养基中，进行产酶菌株的复筛。产酶培养基组成为：甘油1％～8％、蛋白胨0.5％～3％、酵母膏0.5％～3％、玉米浆0.2％～3％、pH值6.0～8.0、500mL三角瓶装液量50～200-mL、摇瓶转速100～200r/min、控制温度25～35℃、培养2～7d后收集菌体，测定其D-泛解酸内酯酶粗酶活力。
酶活力单位的测定与定义：取10mL发酵液，滤出菌丝体，与酶反应底物(2.5mL 2％泛解酸内酯溶液和2.5mL含50mol CaCl2的pH 7.5、0.2mol/L Tris(三羟甲基氨基甲烷)-HCl缓冲液)混合，在28℃摇床150r/min反应30分钟，抽滤除去菌体，用HPLC分析测定D-泛解酸。在上述条件下，每分钟水解D-泛解酸内酯生成1μmol D-泛解酸的酶量定义为1个酶活力单位(U)。
D-泛解酸的HPLC测定：色谱柱型ZORBAX SB C18 5μM 250×4.6mm，流动相为乙腈：0.02mol/L KH2PO4＝1∶9，用HCl调pH为3，流速1mL/min，紫外检测波长215nm，温度25℃。
D-泛解酸内酯水解生成D-泛解酸后，其旋光发生了反转，由D-(-)-泛解酸内酯的左旋转变为D-(+)-泛解酸的右旋。酶水解液中剩下未反应的L-(+)-泛解酸内酯也是右旋的，因此酶水解反应液应是富右旋的。酶的水解效果越好，酶水解液旋光值越高，呈右旋。测定酶反应滤清液中的旋光大小，以表示酶水解反应程度。具体方法可参见专著《生物催化工艺学》(孙志浩主编，化工出版社，2004年)
2，产酶培养
对上述筛选所得到的黄色变色圈大的各种丝状真菌菌株，特别是其中复筛得到的选择性高，产物光学纯度高的各种菌株，如串珠镰孢Fusarium moniliformeAS3.3489，F.moniliforme AS3.349，尖镰孢F.oxysporum AS3.1785，F.oxysporum AS3.1786，双胞镰孢F.dimerum AS3.1831，藤仓赤霉Gibberellafujikuroi AS3.4663，G.fujikuroi AS3.1756，藤仓赤霉串珠变种G.fujikuroivar.moniliformis AS3.4746，藤仓赤霉藤仓变种G.fujikuroi var.fujikuroiAS3.4748，玉蜀黍赤霉G.zeae ACCC31053，米曲霉Asp.oryzae SIM206，泡盛曲霉Asp.awamori，华根霉R.chinesis，米根霉R.oryzae GIM3.207，出芽短梗霉Aureobasidium pullulans CGMCC 1244等等菌株，进行产酶发酵培养，其斜面培养方法同以上所述，用马铃薯浸汁斜面培养基培养。上述菌株编号中，AS：中国科学院微生物研究所菌种保藏中心编号；AF：中国典培养物保藏中心编号；CGMCC中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存号；ACCC：中国农业菌种保藏中心菌种保藏编号；JIM：江苏省微生物研究所菌种保藏编号；GIM：广东省微生物研究所菌种保藏编号；SIM：上海市工业微生物研究所菌种保藏编号；SW：江南大学生物催化研究室菌种保藏编号。
产酶发酵条件为：培养基组成甘油0.1％～10％、蛋白胨0.1％～5％、酵母膏0.1％～5％、玉米浆0.1％～5％、pH值5.0～9.0、500mL三角瓶装液量50～200mL、摇瓶转速100～200r/min、控制温度25～35℃、培养2～7天。适合于产酶的碳源有：葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘油、可溶性淀粉、豆油、油酸钠、菜籽油、丙二醇、乙醇等，其中甘油为最佳碳源。适合于产酶的氮源有：硝酸钠、氯化铵、硫酸铵、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、豆饼粉、玉米浆、酪蛋白等，其中以酵母膏、蛋白胨、豆饼粉为较佳氮源。
3，微生物酶水解拆分
将用常规方法合成的工业级DL-泛解酸内酯溶解，配制成10％～70％水溶液，加入10～50mmol/L CaCl2，用NaOH或HCl溶液调pH为7.0～7.5，作为酶催化反应底物。将发酵后的粗酶液、湿菌体或其用戊二醛交联得到的固定化细胞作为酶源，粗酶液或固定化细胞(均以湿菌体计)与底物溶液的比例为每100ml底物液加入0.1g～10g湿菌体。控制反应温度20～55℃，其中25～35℃之间较为适宜。控制反应pH 6.0～9.0，其中pH 7.0～8.0时最佳。酶反应在较短的时间内(例如10小时内)完成时，底物浓度以10％～20％为较适宜，酶水解率为20％～30％。酶反应液中酶浓度越高，D-泛解酸的生成量就越多，即酶水解率越高，较适宜的酶浓度为5％～10％。
通过实验，本发明人发现镰孢霉属Fusariu、赤霉属Gibberella、曲霉属Aspergill、青霉属Penicillium、根霉属Rhizopu、粘帚霉属Gliocladium或短梗霉属Aureobasidium的菌株及其突变株，对选择性拆分DL-泛解酸内酯生产D-泛解酸有效。
以下是说明本项发明的实施例，但本项发明决不仅限以下的实施例。
具体实施方式
实施例1
产D-泛解酸内酯酶的菌种的初筛
针对96株镰孢霉属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)、粘帚霉属(Gliocladium)以及短梗霉属(Aureobasidium)等属的丝状真菌菌株进行初筛。
配制含甘油1％、蛋白胨0.5％、酵母膏0.5％、玉米浆0.5％、pH值7.0、琼脂1.5％的培养基，灭菌后冷却到50℃，加入1.5％D-泛解酸内酯和0.01％的溴百里酚蓝，混匀到平板。收集各种丝状真菌进行筛选，涂布于平板上，在25～30℃培养5～8天。观察菌落周围的变色圈，明显产黄色变色圈的微生物菌株如表1，主要有镰孢霉属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Phizopus)、粘帚霉属(Gliocladium)以及短梗霉属(Aureobasidium)等属的丝状真菌菌株，具体黄色变色圈大的有：串珠镰孢F.moniliforme AS3.349、AS 3.2835，AS 3.2989、AS3.3489，SW05H、尖镰孢F.oxysporum AS3.1785、AS3.1786、AS 3.2830，AS 3.4743、球茎状镰Fusarium oxysporum AS 3.3633、Fusarium anthophilum AS 3.4712、双胞镰孢F.dimerum AS3.1831、Fusarium napiforme AS 3.4735、幼角镰孢Fusariumneoceras AS 3.1818、Fusarium neoceras AS 3.4736、雪腐镰孢FusariumnivaleAS 3.1852、Fusarium nygamai AS 3.713、腐皮镰孢菌Fusariu msolaniAS 3.2889、Fusarium proliferatum var.minus AS 3.4726、Fusariumproliferatum var.proliferatum AS 3.4738、Fusarium redolens AS 3.2626、镳草镰孢Fusarium scirpi AS 3.3656、马特腐皮镰孢Fusarium solani var.martii AS 3.3639、茄病镰刀菌嗜石油变种Fusarium solani var.petroliphilumAS 3.4489、蚀脉镰孢Fusarium vasinfectum AS 3.1854、AS 3.4305、腹状镰孢Fusarium ventricosum AS 3.4610、藤仓赤霉G.fujikuroi AS 3.1756、AS3.4663、藤仓赤霉藤仓变种Gibberella fujikuroivar.fujikuroi AS3.4748、藤仓赤霉串珠变种Gibberella fujikuroi var.moniliformis3.4746、藤仓赤霉胶孢变种Gibberella fujikuroi var.subglutinans AS3.4744、玉蜀黍赤霉G.zeae ACCC31053等菌株。另外产黄色变色圈的微生物菌株还有泡盛曲霉Asp.awamori AS3.0078、黑曲霉Asp.nigerSW33、SW13-1、米曲霉Asp.oryzae SIM206、产黄青霉P.chrysogenum AF 93097、米根霉R.oryzae GIM3.207，华根霉R.chinesis AS3.0817、日本根霉R.japonesis JIM 3053、链孢粘帚霉Gliocladium catenulatum AS33655，出芽短梗霉Aureobasidium pullulansCGMCC 1244等菌株。
表1初筛平板呈变色圈的菌株
| 菌种名称 | 菌株号 | 变色圈 |
| Fusarium moniliforme | AS3.349 | ++ |
| 串珠镰孢Fusarium moniliforme | AS 3.2835 | ++ |
| 串珠镰孢Fusarium moniliforme | AS 3.2989 | ++ |
| 串珠镰孢Fusarium moniliforme | AS3.3489 | ++ |
| 串珠镰孢Fusarium moniliforme | AS 3.4722 | + |
| 串珠镰孢Fusarium moniliforme | SW 05H | ++ |
| 尖镰孢Fusarium oxysporum | AS3.1785 | ++ |
| Fusarium oxysporum | AS 3.1786 | ++ |
| 尖孢镰孢Fusarium oxysporum | AS 3.2830 | ++ |
| 尖孢镰孢Fusarium oxysporum | AS 3.4743 | ++ |
| 燕麦镰孢Fusarium avenaceum | AS 3.3628 | + |
| Fusarium annulatum | AS 3.4728 | + |
| Fusarium anthophilum | AS 3.4712 | ++ |
| Fusarium acuminatum | AS 3.4603 | + |
| 草燕麦镰孢Fusarium avenaceum var.herbarum | AS 3.3641 | + |
| Fusarium chlamydosporum | AS 3.3642 | + |
| 双胞镰孢Fusarium dimerum | AS 3.1831 | ++ |
| 链状镰刀菌Fusarium catenulatum | AS 3.4704 | + |
| 黄色镰孢Fusarium culmorum | AS 3.4734 | + |
| 大刀镰刀菌Fusarium culmorum | AS 3.4595 | + |
| Fusarium dlaminii | AS 3.4737 | + |
| 木贼镰孢Fusarium equiseti | AS 3.1815 | + |
| 木贼镰孢Fusarium equiseti | AS 3.1832 | + |
| Fusarium fujikuroi | AS 3.4716 | + |
| 禾本科镰孢Fusarium graminearum | AS 3.4521 | + |
| 禾谷镰孢Fusarium graminearum | AS 3.712 | + |
| 砖红镰刀菌Fusarium lateritium | AS 3.4599 | + |
| Fusarium moniliforme var.intermedium | AS 3.2966 | + |
| 节孢镰刀菌木菠萝变种Fusarium merismoides var.artocarpum | AS 3.4491 | + |
| 雪腐镰孢Fusarium nivale | AS 3.1852 | ++ |
| 幼角镰孢Fusarium neoceras | AS 3.1818 | ++ |
| Fusarium neoceras | AS 3.4736 | ++ |
| Fusarium nygamai | AS 3.713 | ++ |
| Fusarium napiforme | AS 3.4735 | ++ |
| 球茎状镰Fusarium oxysporum | AS 3.3633 | ++ |
| Fusarium proliferatum var.proliferatum | AS 3.4738 | ++ |
| Fusarium proliferatum var.minus | AS 3.4726 | ++ |
| Fusarium proliferatum | AS 3.1777 | + |
| 早熟禾镰孢Fusarium poae | AS 3.3805 | + |
| 早熟镰刀菌Fusarium poae | AS 3.4601 | + |
| 接骨木镰孢Fusarium sambucinum | AS 3.1844 | + |
| Fusarium sacchari var.elongatum | AS 3.4727 | + |
| Fusarium semitectum | AS 3.719 | + |
| Fusarium tricinctum | AS 3.4731 | + |
| 蚀脉镰孢Fusarium vasinfectum | AS 3.4305 | ++ |
| 多枝镰孢Fusarium reticulatum | AS 3.708 | + |
| Fusarium redolens | AS 3.2626 | ++ |
| 镳草镰孢Fusarium scirpi | AS 3.3656 | ++ |
| 腐皮镰孢菌Fusarium solani | AS 3.2889 | ++ |
| 茄病镰刀菌嗜石油变种Fusarium solani var. | AS 3.4489 | ++ |
| petroliphilum | ||
| 马特腐皮镰孢Fusarium solani var.martii | AS 3.3639 | ++ |
| 胶孢镰孢Fusarium subglutinans | AS 3.4725 | + |
| 腹状镰孢Fusarium ventricosum | AS 3.4610 | ++ |
| 蚀脉镰孢Fusarium vasinfectum | AS 3.1854 | ++ |
| 藤仓赤霉G.fujikuroi | AS 3.4663 | ++ |
| 藤仓赤霉Gibberella fujikuroi | AS 3.1756 | ++ |
| 藤仓赤霉串珠变种Gibberella fujikuroi var.moniliforme | AS 3.4714 | + |
| 藤仓赤霉串珠变种Gibberella fujikuroi var.moniliformis | AS 3.4746 | ++ |
| 藤仓赤霉藤仓变种Gibberella fujikuroi var.fujikuroi | AS3.4748 | ++ |
| 藤仓赤霉间型变种Gibberella fujikuroi var.intermedia | AS 3.4717 | + |
| 藤仓赤霉胶孢变种Gibberella fujikuroi var.subglutinans | AS 3.4744 | ++ |
| 小麦赤霉Gibberella saubinetii | AS 3.4288 | + |
| 玉蜀黍赤霉Gibberella zeae | ACCC31053 | + |
| 黑曲霉(Aspergillus niger) | SW SW33 | + |
| 黑曲霉(Aspergillus niger) | SW13-1 | + |
| 黑曲霉(Aspergillus niger) | SW Zzq-18 | - |
| 黑曲霉(Aspergillus niger) | SW Zzq-19 | + |
| 黑曲霉(Aspergillus niger) | SW Zzq-20 | - |
| 黑曲霉(Aspergillus niger) | SW 3.11 | - |
| 米曲霉(Aspergillus oryzae) | SW Zzq-1 | - |
| 米曲霉(Aspergillus oryzae) | SW Zzq-2 | - |
| 米曲霉(Aspergillus oryzae) | SW Zzq-3 | - |
| 米曲霉(Aspergillus oryzae) | SW Zzq-4 | - |
| 米曲霉(Aspergillus oryzae) | SW 3.4 | - |
| 米曲霉Asp.oryzae | SIM206 | + |
| 泡盛曲霉Asp.awamori | AS3.0078 | + |
| 红曲霉(Monascus) | SW Zzq-5 | - |
| 红曲霉(Monascus ankn) | SW 3.15 | - |
| 红曲霉(Monascus) | SW 3.17 | - |
| 土曲霉(Aspergillus terrus) | SW 3.19 | + |
| 土曲霉(Aspergillus terrus) | SW 3.20 | + |
| 产黄青霉Penicillium chrysogenum | AF 93097 | + |
| 米根霉Rhizopu oryzae | GIM3.207 | + |
| 华根霉Rhizopu chinesis | AS3.0817 | + |
| 日本根霉Rhizopu japonesis | JIM 3053 | + |
| 根霉(Rhizopus) | SW Zzq-9 | - |
| 根霉(Rhizopus) | SW Zzq-10 | - |
| 根霉(Rhizopus) | SW Zzq-12 | - |
| 根霉(Rhizopus) | SW Zzq-14 | - |
| 根霉(Rhizopus) | SW Zzq-15 | - |
| 根霉(Rhizopus) | SW Zzq-16 | - |
| 根霉(Rhizopus) | SW Zzq-21 | - |
| 生香毛霉(Mucor aromaiticus) | SW 3.1 | - |
| 鲁氏毛霉(Mucor rouxianicus) | SW 3.2 | - |
| 链孢粘帚霉Gliocladium catenulatum | AS33655 | + |
| 出芽短梗霉Aureobasidium pullulans | CGMCC 1244 | + |
注：++表示变色圈大；+表示有变色圈；-表示无变色圈
实施例2
产D-泛解酸内酯酶的菌种的复筛
将有变色反应且黄色变色圈大的上述镰孢霉属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)、粘帚霉属(Gliocladium)以及短梗霉属(Aureobasidium)等属的菌株，接种到以下组分的灭菌产酶液体培养基中：甘油2％、蛋白胨1％、酵母膏0.5％、玉米浆0.2％、pH值6.5、三角瓶装液量100mL/500mL、摇瓶转速120r/min、控制温度28℃、培养5d后抽滤，收集湿菌丝体。取1g湿菌丝体，置于500ml三角瓶中，加入反应底物50ml A液和50ml B液(A液：20％DL-泛解酸内酯溶液，B液：1mol/L Tris-HCl缓冲液，pH为7.5)。30℃摇床150r/min条件下反应60分钟，滤除菌丝体，测定水解液旋光值，结果见表2。
表2产D-泛解酸内酯酶菌种的酶水解试验
| 菌株名称 | 菌株号 | 水解液旋光值α |
| F.moniliforme(对照) | CGMCC0536 | +0.110 |
| F.moniliforme | AS3.349 | +0.115 |
| 串珠镰孢Fusarium moniliforme | AS3.2835 | +0.015 |
| F.moniliforme | AS3.2989 | +0.060 |
| F.moniliforme | AS3.3489 | +0.105 |
| F.moniliforme | AF 93271 | +0.040 |
| F.moniliforme | SW05H | +0.120 |
| 尖孢镰孢F.oxysporum | AS3.1785 | +0.105 |
| 尖孢镰孢F.oxysporum | AS3.1786 | +0.110 |
| 尖孢镰孢F.oxysporum | AS3.4743 | +0.085 |
| F.oxysporum | AS3.2830 | +0.040 |
| F.oxysporum | AF93327 | +0.105 |
| 球茎状镰孢F.oxysporum | AS3.3633 | +0.090 |
| 双胞镰孢F.dimerum | AS3.183l | +0.115 |
| F.dimerum | AF93237 | +0.105 |
| 禾谷镰孢F.graminearum | AS3.4712 | +0.085 |
| 幼角镰孢F.neoceras | AS3.1818 | +0.060 |
| F.neoceras | AS3.4736 | +0.055 |
| F.nygamai | AS3.713 | +0.110 |
| F.neoceras | AS3.4736 | +0.055 |
| 雪腐镰孢F.nivale | AS3.1852 | +0.090 |
| F.proliferatum var.minus | AS3.4726 | +0.110 |
| F.proliferatum var.proliferatum | AS3.4738 | +0.130 |
| F.redolens | AS3.2626 | +0.095 |
| 镳草镰孢F.scirpi | AS3.3656 | +0.080 |
| 腐皮镰孢菌F.solani | AS3.2889 | +0.060 |
| 茄病镰刀菌嗜石油变种F.solani var.petroliphilum | AS3.4489 | +0.115 |
| 马特腐皮镰孢F.solani var.martii | AS3.3639 | +0.010 |
| 腹状镰孢F.ventricosum | AS3.4610 | +0.090 |
| 蚀脉镰孢F.vasinfectum | AS3.4305 | +0.030 |
| 藤仓赤霉G.fujikuroi | AS3.1756 | +0.105 |
| 藤仓赤霉Gibberella fujikuroi | AS3.4663 | +0.100 |
| 藤仓赤霉胶孢变种G.fujikuroi var.subglutinans | AS3.4744 | +0.080 |
| 藤仓赤霉串珠变种G.fujikuroi var.moniliformi | AS3.4746 | +0.095 |
| 藤仓赤霉藤仓变种G fujikuroivar.fujikuro | AS3.4748 | +0.100 |
| 米曲霉Asp.oryzae | JSM3008 | +0.070 |
| 泡盛曲霉Asp.awamori | AS3.0078 | +0.075 |
| 出芽短梗霉Aureobasidium pullulans | CGMCC 1244 | +0.080 |
实施例3～20
微生物的培养及选择性酶水解拆分
配制产酶培养基为甘油2％、蛋白胨1％、酵母膏0.5％、玉米浆0.2％、pH值6.5、分装于三角瓶装液量100mL/500mL中，用灭菌锅热灭菌20分钟，温度为121℃。将表1、表2中列出的湿菌体变色圈大、旋光值高的菌株串珠镰孢F.moniliformeAS3.349、F.moniliforme AS3.3489、F.moniliforme SW-05H、尖镰孢F.oxysporumAS3.1785、F.oxysporum AS3.1786、F.oxysporum AF93327、双胞镰孢F.dimerumAS 3.1831、F.dimerum Penz.AF 93237、F.nygamai AS 3.713、F.proliferatumvar.minusAS 3.4726、F.proliferatum var.proliferatumAS 3.4738、F.redolensAS 3.2626、茄病镰刀菌嗜石油变种F.solani var.petroliphilumAS3.4489、藤仓赤霉G.fujikuroi AS3.1756、G.fujikuroi AS3.4663、藤仓赤霉串珠变种G.fujikuroi var.moniliformis AS3.4746、藤仓赤霉藤仓变种G.fujikuroi var.fujikuroi AS3.4748等菌株，分别接种到培养基中，在28℃摇瓶培养5天。培养结束后过滤收集菌体。配制含0.05mol/L CaCl2、pH为7.0的10％DL-泛解酸内酯溶液，在100ml DL-泛解酸内酯溶液中加入4g湿菌体进行水解反应，控制温度30℃、搅拌转速200r/min，氨水自动流加调节pH 7.0，水解10小时后测定水解率和产物光学纯度(对映体过量值％e.e.)，结果见表3。
表3产D-泛解酸内酯酶菌种的选择性酶水解试验
| 实施例号 | 菌株种名 | 菌株号 | 水解率(％) | 光学纯度(％e.e.) |
| 3 | F.moniliforme(对照) | CGMCC0536 | 25.03 | 98.6 |
| 4 | F.moniliforme | AS3.349 | 27.85 | 96.5 |
| 5 | F.moniliforme | AS3.3489 | 22.03 | 89.6 |
| 6 | F.moniliforme | SW05H | 28.02 | 93.4 |
| 7 | F.oxysporum | AS3.1785 | 28.63 | 94.3 |
| 8 | F.oxysporum | AS3.1786 | 27.53 | 93.6 |
| 9 | F.oxysporum | AF93327 | 28.75 | 94.8 |
| 10 | F.dimerum | AS3.1831 | 29.07 | 95.8 |
| 11 | F.dimerum Penz. | AF93237 | 28.76 | 92.3 |
| 12 | F.nygamai | AS3.713 | 22.13 | 88.5 |
| 13 | F.proliferatum var.minus | AS3.4726 | 16.48 | 91.3 |
| 14 | F.proliferatum var.proliferatum | AS3.4738 | 30.19 | 93.5 |
| 15 | F.redolens | AS3.2626 | 17.00 | 90.5 |
| 16 | F.solani var.petroliphilum | AS3.4489 | 27.00 | 95.2 |
| 17 | G.fujikuroi | AS3.1756 | 26.85 | 95.3 |
| 18 | G.fujikuroi | AS3.4663 | 28.07 | 94.4 |
| 19 | G.fujikuroi var.moniliformis | AS3.4746 | 28.58 | 88.1 |
| 20 | G.fujikuroi var.fujikuroi | AS3.4748 | 29.04 | 90.6 |
实施例21～35
为了考察产D-泛解酸内酯酶稳定性，按实施例3～20的方法，对以下菌株进行DL-泛解酸内酯的选择性拆分之游离细胞酶反复分批酶水解试验，水解10小时后测定水解率，并过滤收集菌体，过滤的菌体再用于水解反应，反复3次。试验结果如表4。
选择的菌株为：串珠镰孢F.moniliforme AS3.349、F.moniliforme AF93271、F.moniliforme SW-05H、尖镰孢F.oxysporum AS3.1785、F.oxysporumAS3.1786、F.oxysporum AF93327、双胞镰孢F.dimerum AS 3.1831、F.dimerumPenz.AF 93237、F.proliferatum var.proliferatumAS 3.4738、茄病镰刀菌嗜石油变种F.solani var.petroliphilumAS 3.4489、藤仓赤霉G.fujikuroiAS3.1756、G.fujikuroi AS3.4663、藤仓赤霉串珠变种G.fujikuroi var.moniliformis AS3.4746、藤仓赤霉藤仓变种G.fujikuroi var.fujikuroiAS3.4748等菌株。
表4产D-泛解酸内酯酶菌种的游离细胞反复分批酶水解试验
| 实施例号 | 菌种及菌号 | 1次水解率％ | 2次水解率％ | 3次水解率％ |
| 21 | F.moniliforme CGMCC0536(对照) | 31.3％ | 34.5％ | 25％ |
| 22 | F.moniliforme AS3.349 | 28.0％ | 32.8％ | 23.0％ |
| 23 | F.moniliforme AF 93271 | 25.4％ | 23.2％ | 22.6％ |
| 24 | F.moniliforme SW05H | 27.3％ | 23.4％ | 25.3％ |
| 25 | F.oxysporum AS3.1785 | 30.8％ | 30.0％ | 20.8％ |
| 26 | F.oxysporum AS3.1786 | 30.0％ | 30.0％ | 24.8％ |
| 27 | F.oxysporum AF93327 | 29.8％ | 29.8％ | 22.0％ |
| 28 | F.dimerum AS3.1831 | 28.0％ | 28.0％ | 21.8％ |
| 29 | F.dimcrum Pcnz.AF 93237 | 30.0％ | 29.8％ | 21.0％ |
| 30 | F.moniliforme AS3.4738 | 27.5％ | 30.5％ | 23.3％ |
| 31 | F.solani var.petroliphilum AS3.4489 | 34.2％ | 31.3％ | 25.9％ |
| 32 | G.fujikuroi AS3.1756 | 28.0％ | 30.8％ | 22.0％ |
| 33 | G.fujikuroi AS3.4663 | 29.8％ | 28.0％ | 23.8％ |
| 34 | G.fujikuroi var.moniliformis AS3.4746 | 30.8％ | 30.0％ | 24.8％ |
| 35 | G.fujikuroi var.fujikuroi AS3.4748 | 30.0％ | 29.8％ | 24.0％ |
实施例36～42
为了进一步考察产D-泛解酸内酯酶稳定性，对部分菌株进行固定化细胞反复分批酶水解试验。
称取按实例1培养的F.moniliforme AS3.349、SW05H、AS3.4738、AS3.4489、F.oxysporum AF93327、G.fujikuroi AS3.1756菌丝体，用去离子水配制成菌悬液，加入一定量的戊二醛溶液，用机械搅拌器搅拌均匀后于室温下静置2小时，抽滤，用去离子水充分洗涤，去除未作用的戊二醛，得到交联固定化细胞。将上述不同菌株的交联固定化细胞，用于反复分批水解拆分，反复3次，结果如表5。
表5产D-泛解酸内酯酶菌种的固定化细胞反复分批酶水解试验
| 实施例号 | 菌种及菌号 | 1次水解率％ | 2次水解率％ | 3次水解率％ |
| 36 | F.moniliforme CGMCC0536(对照) | 35.8％ | 36.3％ | 36.3％ |
| 37 | F.moniliforme AS3.349 | 31.6％ | 32.0％ | 31.5％ |
| 38 | F.moniliforme SW05H | 43.6％ | 42.5％ | 43.8％ |
| 39 | F.moniliforme AS3.4738 | 31.8％ | 35.1％ | 32.8％ |
| 40 | F.oxysporum AS3.4489 | 45.8％ | 44.2％ | 42.5％ |
| 41 | F.oxysporum AF93327， | 29.6％ | 30.1％ | 30.3％ |
| 42 | G.fujikuroi AS3.1756 | 33.2％ | 33.0％ | 32.6％ |
通过以上实施例得出结论：所选的镰孢霉属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)、粘帚霉属(Gliocladium)以及短梗霉属(Aureobasidium)等属菌株及其突变株，对生产D-泛解酸内酯均有效，无论是其光学纯度，还是选择性水解率，乃至游离细胞、固定化细胞反复水解试验也得出较好的结果。因此这些菌株可用于选择性拆分DL-泛解酸内酯，进而生产D-泛酸钙。
Claims (3)
1、一种筛选产D-泛解酸内酯水解酶微生物的方法，所述方法包括对产D-泛解酸内酯酶、具有水解D-泛解酸内酯能力的丝状真菌进行初筛和复筛；
其中：
所述初筛培养基的组成为：甘油0.5％～1％、蛋白胨0.5％～1％、酵母膏0.5％～1％、玉米浆0.5％～1％、pH值6.0～7.5、琼脂1.5％～2.5％，并加入1％～3％D-泛解酸内酯和0.001％～0.01％的溴百里酚蓝；在温度25～30℃下培养时间5～8天，挑取菌落中产生黄色变色圈大的菌珠，接种到马铃薯浸汁中斜面培养；
所述复筛培养基的组成为：甘油1％～8％、蛋白胨0.5％～3％、酵母膏0.5％～3％、玉米浆0.2％～3％、pH值6.0～8.0、在摇瓶转速为100～200r/min、温度为25～35℃下、培养2～7天，收集菌体测定其D-泛解酸内酯酶粗酶活力。
2、根据权利要求1所述的方法，其中丝状真菌为串珠镰孢霉，尖镰孢霉，球茎状镰孢霉，尖喙镳草镰孢霉，双胞镰孢霉，雪腐镰孢霉，早熟镰刀菌，镳草镰孢霉，茄病镰刀菌嗜石油变种，腹状镰孢霉，藤仓赤霉，藤仓赤霉藤仓变种，藤仓赤霉串珠变种，藤仓赤霉胶孢变种或泡盛曲霉。
3、权利要求2所述方法筛选出的丝状真菌在制备D-泛解酸中的用途。
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