CN107523559B - 利用尖镰孢霉菌发酵生产d-泛解酸内酯水解酶的培养基 - Google Patents

利用尖镰孢霉菌发酵生产d-泛解酸内酯水解酶的培养基 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用尖镰孢霉菌生产D‑泛解酸内酯水解酶的培养基，包括种子培养基及发酵培养基，该培养基中使用了植酸，提高菌种活力，促进菌丝生长和代谢，提高种子液质量，提高发酵产酶能力；发酵培养基中使用了糠醛，有利于诱导发酵产生D‑泛解酸内酯水解酶，提高发酵生。采用本发明的培养基发酵生物量≥7.8g/L干菌丝体，同国内技术相比，发酵生物量提高8.3%以上;生产D‑泛解酸内酯水解酶活力达到1.29u/g（菌丝干燥体）以上，同国内技术相比，酶活力提高了30%以上。

Description

利用尖镰孢霉菌发酵生产D-泛解酸内酯水解酶的培养基
技术领域
本发明属于发酵技术领域，特别是涉及一种利用尖镰孢霉菌（ fusarum oxysporm ）发酵生产D-泛解酸内酯水解酶的培养基。
背景技术
D-泛酸钙，也称VB5，化学名称D-N-(2，4-二羟基-3，3-二甲基丁酰基)-β-氨基丙酸钙），相对分子量：476.54。泛酸钙可以分为DL-型（混旋体）、D-型（右旋体）、L-型（左旋体）三种型式，其中，只有D-型（右旋体）具有生物活性。D-泛酸钙进入人体释放出钙元素和泛酸，而泛酸是辅酶A前体物质，进而转化为辅酶A而产生生理作用，参与碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢作用，是人体和动物维持正常生理机能不可缺少的微量物质。主要用于医药、食品及饲料添加剂。
根据D-泛酸钙具有手性特征，现行制备D-泛酸钙的技术，主要有两种:第一种是化学合成法，即将β-氨基丙酸钙和DL-泛解酸内酯直接进行合成反应，再根据泛酸钙混旋体溶解度比D-泛酸钙和L-泛酸钙大的特性，采用晶种诱导法结晶，将D-泛酸钙和L-泛酸钙分别析出，所得L-泛酸钙经碱催化消旋，反复拆分转化为D-泛酸钙。第二种是生物发酵法，即采用尖镰孢霉菌（ fusarum oxysporm ）等微生物生物发酵产生D-泛解酸内酯水解酶（存在菌丝体中），将这种酶作催化剂加入到DL-泛解酸内酯液中，选择性地不对称水解DL-泛解酸内酯中的D-泛解酸内酯，将DL-泛解酸内酯拆分成 D-泛解酸和L-泛解酸内酯，分离后的 D-泛解酸，经内酯化处理，得到 D-泛解酸内酯，再与β-氨基丙酸钙反应，合成D-泛酸钙。
上述生物发酵法以其所具有的生产成本低、毒性小、污染少等特点，成为现今VB5工业化生产的主要发展方向。
目前，国内采用尖镰孢霉菌二级发酵生产D-泛解酸内酯水解酶，存在的主要问题有以下几点：
1发酵原材料成本高。一般D-泛解酸内酯水解酶的培养基中，氮源物质需加入蛋白胨、酪蛋白，这类原材料价格较高，导致生产成本增加。
2 传统酶产生培养基处方中，缺少适宜酶合成的诱导物以及产酶促进剂，使得发酵生物量较低，一般在7.2g干菌丝体/L发酵液左右；酶活力不高，一般在1.0U/g干菌丝体左右。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种有效提高发酵生物量，增强酶活力，降低生产成本的利用尖镰孢霉菌生产D-泛解酸内酯水解酶的培养基。
为实现上述目的所采取的技术方案为：
1、一种利用尖镰孢霉菌生产D-泛解酸内酯水解酶的培养基，其特征在于包括种子培养基和发酵培养基，其中
所述种子培养基组成为：甘油10～16g/L、玉米蛋白粉12～15g/L、玉米浆3～5g/L、酵母浸粉6～8g/L、玉米粉20～24 g/L、葡萄糖20～23g/L、(NH4)2SO4 9～12g/L、轻质碳酸钙6～9g/L、植酸0.06～0.12g/L；
所述发酵培养基组成为：甘油12～18g/L、玉米蛋白粉13～16g/L、糠醛0.6～0.8g/L、玉米浆4～7g/L、酵母浸粉8.8～10.2g/L、玉米粉20～23g/L、(NH4)2SO4 5.5～6.0g/L、轻质碳酸钙4.0～4.6g/L、KH2PO4 4.4～4.7g/L、NaCL4.0～4.5g/L、植酸0.04～0.08g/L、聚醚改性硅0.08～0.12g/L。
2、按照权利要求1所述的利用尖镰孢霉菌生产D-泛解酸内酯水解酶的培养基，其特征在于所述种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮90～110mg/100ml、总糖3.0～3.5g/100ml、pH6.5～7.5。
3、按照权利要求1所述的利用尖镰孢霉菌生产D-泛解酸内酯水解酶的培养基，其特征在于所述发酵培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮60～140mg/100ml、总糖3.2～4.0g/100ml、pH6.8～7.5。
本发明的技术优势体现在：
1本发明确认了利用尖镰孢霉菌发酵生产D-泛解酸内酯水解酶的种子、发酵罐培养基的碳源、氮源最佳配伍比例，且培养基中使用了植酸，有利于提高菌种活力，促进菌丝生长和代谢，提高种子液质量，提高发酵产酶能力。
2本发明发酵培养基中使用了糠醛，其结构类似D-泛解酸内酯，有利于诱导发酵产生D-泛解酸内酯水解酶，提高发酵酶产量，本发明培养基发酵生物量≥7.8g/L干菌丝体，同国内技术相比，发酵生物量提高8.3%以上。
3采用本发明的培养基生产D-泛解酸内酯水解酶，最终使得D-泛解酸内酯水解酶活力达到1.29u/g（菌丝干燥体）以上，同国内技术相比，酶活力提高了30%以上。
具体实施方式
下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
下述实施例的菌种选用种子液的质量要求为：菌体浓度25～32%、pH值6.8～7.8，移种比例为1:0.12～0.15（V/V）。
发酵培养工艺：
发酵温度：28±0.5℃；空气流量1600-1800m3/h；搅拌转速140-160r/min；pH控制在6.8-7.6，菌体浓度28-35%（g/L）。
发酵补料工艺：发酵罐移种30hr后开始补料，发酵截止前20hr左右，停止补料。采用流加补料方式，补料量1500～2600L/h（180立方发酵罐）。补料液为已消毒，温度30～35℃的12～15%（g/g)液化葡萄糖液。
发酵过程监测并控制：糖浓度1.0～3.0g/100ml，氨基氮30～110mg/100ml
发酵培养结束要求：
发酵生物量≥7.8g/L干菌丝体，D-泛解酸内酯水解酶活力≥1.29u/g（菌丝干燥体），发酵周期控制在72～80h。
发酵生产酶工艺的重要技术指标主要发酵生物量和酶活力，其中，发酵生物量指单位体积发酵液中菌丝体折干重量（g/L），酶活力指酶催化一定化学反应的能力，酶活力单位U，表示在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物所需的酶量为一个活力单位(U)。
实施例1
种子培养：种子培养基有效体积2m3。
种子培养基：甘油20kg、玉米蛋白粉24kg、玉米浆6kg、酵母浸粉12kg、玉米粉40kg、葡萄糖40kg、(NH4)2SO4 18kg、轻质碳酸钙12kg、植酸0.12kg。
首先，将种子培养基121℃灭菌，保压30分钟，冷却至30℃，用无菌空气保压，种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮64mg/100ml、总糖3.2g/100ml、pH6.9。然后在火焰保护下，将已经培养好的尖镰孢霉菌母瓶菌丝按照0.1L的接种量接入种子培养基中进行种子培养，种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28±0.5℃；空气流量180m3/h；搅拌转速220r/min，至菌体浓度25.2%、pH值6.6，培养时间32h移种。
发酵培养：发酵培养基有效体积90m3。
甘油1080kg、玉米蛋白粉1170kg、糠醛54kg、玉米浆360kg、酵母浸粉792kg、玉米粉1800kg、(NH4)2SO4 495kg、轻质碳酸钙360kg、KH2PO4 396kg、NaCL360kg、植酸3.6kg、聚醚改性硅7.2kg。发酵培养基灭菌后的质量为：氨基氮82mg/100ml、总糖3.6g/100ml、pH7.1。
发酵过程中，温度28±0.5℃；空气流量1600-1800m3/h；搅拌转速140-160r/min；发酵罐移种32hr开始流加补料，补料速度1500～1800L/h，补料液12%（g/g)液化葡萄糖液（已消毒，温度30～35℃），发酵60hr停止补料。pH控制在6.8-7.6，菌体浓度28-35%（g/L）。
发酵培养结束，发酵生物量7.8g/L干菌丝体，D-泛解酸内酯水解酶活力达到1.33u/g（菌丝干燥体），发酵周期78h。
实施例2
种子培养：种子培养基有效体积2m3。
种子培养基：甘油24kg、玉米蛋白粉26kg、玉米浆8kg、酵母浸粉14kg、玉米粉42kg、葡萄糖42kg、(NH4)2SO4 20kg、轻质碳酸钙14kg、植酸0.16kg。
首先，将种子培养基121℃灭菌，保压30分钟，冷却至30℃，用无菌空气保压，种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮69mg/100ml、总糖3.4g/100ml、pH7.3。然后在火焰保护下，将已经培养好的尖镰孢霉菌母瓶菌丝按照0.1L的接种量接入种子培养基中进行种子培养，种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28±0.5℃；空气流量180m3/h；搅拌转速220r/min，至菌体浓度26.6%、pH值6.9，培养时间34h移种。
发酵培养：发酵培养基有效体积90m3。
甘油1260kg、玉米蛋白粉1260kg、糠醛58.5kg、玉米浆450kg、酵母浸粉810kg、玉米粉1890kg、(NH4)2SO4 504kg、轻质碳酸钙378kg、KH2PO4 405kg、NaCL369kg、植酸4.5kg、聚醚改性硅8.1kg。发酵培养基灭菌后的质量为：氨基氮88mg/100ml、总糖3.4g/100ml、pH7.0。
发酵过程中，温度28±0.5℃；空气流量1600-1800m3/h；搅拌转速140-160r/min；发酵罐移种34hr开始流加补料，补料速度1800～2000L/h，补料液13%（g/g)液化葡萄糖液（已消毒，温度30～35℃），发酵55hr停止补料。pH控制在6.8-7.6，菌体浓度28-35%（g/L）。
发酵培养结束，发酵生物量8.3g/L干菌丝体，D-泛解酸内酯水解酶活力达到1.31u/g（菌丝干燥体），发酵周期76h。
实施例3
种子培养：种子培养基有效体积2m3。
种子培养基：甘油28kg、玉米蛋白粉28kg、玉米浆10kg、酵母浸粉16kg、玉米粉44kg、葡萄糖44kg、(NH4)2SO4 22kg、轻质碳酸钙16kg、植酸0.2kg。
首先，将种子培养基121℃灭菌，保压30分钟，冷却至30℃，用无菌空气保压，种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮75mg/100ml、总糖3.5g/100ml、pH7.4。然后在火焰保护下，将已经培养好的尖镰孢霉菌母瓶菌丝按照0.1L的接种量接入种子培养基中进行种子培养，种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28±0.5℃；空气流量180m3/h；搅拌转速220r/min，至菌体浓度27.6%、pH值6.9，培养时间35h移种。
发酵培养：发酵培养基有效体积90m3。
甘油1440kg、玉米蛋白粉1350kg、糠醛63kg、玉米浆540kg、酵母浸粉828kg、玉米粉1980kg、(NH4)2SO4 513kg、轻质碳酸钙396kg、KH2PO4 414kg、NaCL378kg、植酸5.4kg、聚醚改性硅9kg。发酵培养基灭菌后的质量为：氨基氮110mg/100ml、总糖3.7g/100ml、pH7.4。
发酵过程中，温度28±0.5℃；空气流量1600-1800m3/h；搅拌转速140-160r/min；发酵罐移种31hr开始流加补料，补料速度2000～2200L/h，补料液14%（g/g)液化葡萄糖液（已消毒，温度30～35℃），发酵50hr停止补料。pH控制在6.8-7.6，菌体浓度28-35%（g/L）。
发酵培养结束，发酵生物量8.4g/L干菌丝体，D-泛解酸内酯水解酶活力达到1.34u/g（菌丝干燥体），发酵周期72h。
实施例4
种子培养：种子培养基有效体积2m3。
种子培养基：甘油32kg、玉米蛋白粉30kg、玉米浆8kg、酵母浸粉14kg、玉米粉48kg、葡萄糖46kg、(NH4)2SO4 24kg、轻质碳酸钙18kg、植酸0.24kg。
首先，将种子培养基121℃灭菌，保压30分钟，冷却至30℃，用无菌空气保压，种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮69mg/100ml、总糖3.4g/100ml、pH7.3。然后在火焰保护下，将已经培养好的尖镰孢霉菌母瓶菌丝按照0.1L的接种量接入种子培养基中进行种子培养，种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28±0.5℃；空气流量180m3/h；搅拌转速220r/min，至菌体浓度28.5%、pH值6.8，培养时间31h移种。
发酵培养：发酵培养基有效体积90m3。
甘油1620kg、玉米蛋白粉1440kg、糠醛67.5kg、玉米浆630kg、酵母浸粉864kg、玉米粉2070kg、(NH4)2SO4 522kg、轻质碳酸钙414kg、KH2PO4 423kg、NaCL387kg、聚醚改性硅9.9kg。发酵培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮122mg/100ml、总糖3.8g/100ml、pH7.4。
发酵过程中，温度28±0.5℃；空气流量1600-1800m3/h；搅拌转速140-160r/min；发酵罐移种34hr开始流加补料，补料速度2200～2400L/h，补料液15%（g/g)液化葡萄糖液（已消毒，温度30～35℃），发酵58hr停止补料。pH控制在6.8-7.6，菌体浓度28-35%（g/L）。
发酵培养结束，发酵生物量8.6g/L干菌丝体，D-泛解酸内酯水解酶活力达到1.31u/g（菌丝干燥体），发酵周期80h。
实施例5
种子培养：种子培养基有效体积2m3。
种子培养基：甘油26kg、玉米蛋白粉28kg、玉米浆8kg、酵母浸粉14kg、玉米粉48kg、葡萄糖44kg、(NH4)2SO4 22kg、轻质碳酸钙16kg、植酸0.18kg。
首先，将种子培养基121℃灭菌，保压30分钟，冷却至30℃，用无菌空气保压，种子培养基灭菌后的质量为：氨基氮71mg/100ml、总糖3.4g/100ml、pH7.4。然后在火焰保护下，将已经培养好的尖镰孢霉菌母瓶菌丝按照0.1L的接种量接入种子培养基中进行种子培养，种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28±0.5℃；空气流量180m3/h；搅拌转速220r/min，至菌体浓度30.6%、pH值7.4，培养时间33h移种。
发酵培养：发酵培养基有效体积90m3。
甘油1620kg、玉米蛋白粉1260kg、糠醛72kg、玉米浆540kg、酵母浸粉918kg、玉米粉1980kg、(NH4)2SO4 540kg、轻质碳酸钙396kg、KH2PO4 405kg、NaCL405kg、聚醚改性硅10.8kg。发酵培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮118mg/100ml、总糖3.9g/100ml、pH6.9。
发酵过程中，温度28±0.5℃；空气流量1600-1800m3/h；搅拌转速140-160r/min；发酵罐移种31hr开始流加补料，补料速度2400～2600L/h，补料液15%（g/g)液化葡萄糖液（已消毒，温度30～35℃），发酵53hr停止补料。pH控制在6.8-7.6，菌体浓度28-35%（g/L）。
发酵培养结束，发酵生物量8.4g/L干菌丝体，D-泛解酸内酯水解酶活力达到1.32u/g（菌丝干燥体），发酵周期74h。
对比案例1
种子培养：种子培养基有效体积2m3。
种子培养基：甘油20kg、蛋白胨20kg、玉米浆20kg、酵母膏20kg。
首先，将种子培养基121℃灭菌，保压30分钟，冷却至30℃，用无菌空气保压，种子培养基灭菌后的质量为：氨基氮75mg/100ml、总糖3.2g/100ml、pH7.6。然后在火焰保护下，将已经培养好的尖镰孢霉菌母瓶菌丝按照0.1L的接种量接入种子培养基中进行种子培养，种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28±0.5℃；空气流量180m3/h；搅拌转速220r/min，至菌体浓度30.6%、pH值7.4，培养时间33h移种。
发酵培养：发酵培养基有效体积90m3。
甘油1800kg、蛋白胨720kg、酵母膏450kg、玉米浆360kg、酪蛋白63kg、(NH4)2SO4 495kg、轻质碳酸钙360kg、KH2PO4 396kg、NaCL360kg、聚醚改性硅10.8kg。发酵培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮118mg/100ml、总糖3.9g/100ml、pH6.9。
发酵过程中，温度28±0.5℃；空气流量1600-1800m3/h；搅拌转速140-160r/min；发酵罐移种31hr开始流加补料，补料速度2400～2600L/h，补料液15%（g/g)液化葡萄糖液（已消毒，温度30～35℃），发酵55hr停止补料。pH控制在6.8-7.6，菌体浓度28-35%（g/L）。
发酵培养结束，发酵生物量7.2g/L干菌丝体，D-泛解酸内酯水解酶活力达到0.92u/g（菌丝干燥体），发酵周期76h。

Claims (3)

1.一种利用尖镰孢霉菌生产D-泛解酸内酯水解酶的培养基，其特征在于包括种子培养基和发酵培养基，其中
所述种子培养基组成为：甘油10～16g/L、玉米蛋白粉12～15g/L、玉米浆3～5g/L、酵母浸粉6～8g/L、玉米粉20～24 g/L、葡萄糖20～23g/L、(NH4)2SO4 9～12g/L、轻质碳酸钙6～9g/L、植酸0.06～0.12g/L；
所述发酵培养基组成为：甘油12～18g/L、玉米蛋白粉13～16g/L、糠醛0.6～0.8g/L、玉米浆4～7g/L、酵母浸粉8.8～10.2g/L、玉米粉20～23g/L、(NH4)2SO4 5.5～6.0g/L、轻质碳酸钙4.0～4.6g/L、KH2PO4 4.4～4.7g/L、NaCL4.0～4.5g/L、植酸0.04～0.08g/L、聚醚改性硅0.08～0.12g/L。
2.按照权利要求1所述的利用尖镰孢霉菌生产D-泛解酸内酯水解酶的培养基，其特征在于所述种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮90～110mg/100ml、总糖3.0～3.5g/100ml、pH6.5～7.5。
3.按照权利要求1所述的利用尖镰孢霉菌生产D-泛解酸内酯水解酶的培养基，其特征在于所述发酵培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮60～140mg/100ml、总糖3.2～4.0g/100ml、pH6.8～7.5。
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