CN111733101B - 一种聚唾液酸发酵培养基及大肠杆菌发酵生产聚唾液酸的方法 - Google Patents

一种聚唾液酸发酵培养基及大肠杆菌发酵生产聚唾液酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种聚唾液酸发酵培养基及大肠杆菌发酵生产聚唾液酸的方法。本发明所涉及的聚唾液酸发酵培养基是一种全合成发酵培养基，创造性地用复合氨基酸作为发酵培养基的氮源，避免了传统天然有机物例如玉米浆干粉中乳酸含量较高，在发酵尤其是大规模发酵过程中给予大肠杆菌的代谢压力，使得大肠杆菌在发酵过程中提前凋亡等问题；另外，复合氨基酸培养基可以提高物料转化率，防止大肠杆菌的代谢异常；最终使聚唾液酸的产量在生产规模放大后能够得到提升，并且具有良好的工艺一致性。

Description

一种聚唾液酸发酵培养基及大肠杆菌发酵生产聚唾液酸的 方法
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，涉及一种聚唾液酸发酵培养基及其应用，尤其涉及一种聚唾液酸发酵培养基及大肠杆菌发酵生产聚唾液酸的方法。
背景技术
唾液酸(Sialic acids)是9碳糖的衍生物，其中最常见的是N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac)。Neu5Ac参与细胞识别、信号转导、肿瘤发生、受精等多个生理过程，还能调节IgG的抗炎活性，增强婴儿免疫力，影响神经细胞的完整性、渗透性及活性，促进婴儿大脑的发育。
聚唾液酸PSA是N-乙酰神经氨酸以α-2,8和(或)α-2,9糖苷键连接而成的线性同聚物，经酸水解后可得到终产物唾液酸。目前，生产PSA的主要方法是通过微生物发酵，之后从发酵液中提取、纯化来制备。
发酵培养基可分为天然培养基、半合成培养基和全合成培养基。天然培养基由天然有机物(例如大豆蛋白粉、玉米浆干粉、酵母粉等)配制而成；半合成培养基由天然有机成分和已知成分的化学物质组成；全合成培养基由各种已知成分的化学物质组成，成分精确，可调节，重复性强，可避免被动植物提取物污染。目前发酵生产PSA的所用培养基大部分为半合成培养基，发酵产量水平有限、合成效率及物料转化率较低，并且批次之间的波动较大，尤其是规模放大后，不同批次间的波动更为明显，进而限制了N-乙酰神经氨酸的应用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种聚唾液酸发酵培养基及其应用，尤其提供一种聚唾液酸发酵培养基及大肠杆菌发酵生产聚唾液酸的方法。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种聚唾液酸发酵培养基，所述聚唾液酸发酵培养基中氮源为复合氨基酸，所述复合氨基酸包括谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、精氨酸或脯氨酸中的至少两种的组合。
所述至少两种的组合例如谷氨酸、天冬氨酸和苏氨酸的组合、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和精氨酸的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。优选谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、精氨酸和脯氨酸的组合。本发明选择上述特定九种氨基酸中的任意一种或至少两种的组合作为复合氨基酸成分，使得聚唾液酸的产量及工艺一致性得到进一步优化。
本发明所涉及的聚唾液酸发酵培养基是一种全合成发酵培养基，根据菌株的营养要求及生产代谢途径，创造性地用复合氨基酸作为发酵培养基的氮源，避免了传统天然有机物例如玉米浆干粉中乳酸含量较高，在发酵过程中给予大肠杆菌的代谢压力，使得大肠杆菌在发酵过程中提前凋亡、产量难以提高、批次间发酵产量波动较大等问题；另外，本发明的前期研究中发现，逐渐扩大发酵规模后，发酵液中尸胺和缬氨酸成分占比产物PSA的产量有明显升高，说明大肠杆菌的代谢方向出现异常，而选用复合氨基酸可以维持发酵液中尸胺和缬氨酸的含量相对较低，防止大肠杆菌的代谢异常，尤其是生产规模放大后，能够有效提高培养基的物料转化。
优选地，所述聚唾液酸发酵培养基还包括碳源、无机盐、维生素和水。
优选地，所述聚唾液酸发酵培养基还包括消泡剂。
优选地，所述复合氨基酸以重量份数计包括谷氨酸4-4.7份、天冬氨酸1.5-1.8份、苏氨酸1-1.2份、丝氨酸1.2-1.5份、甘氨酸1.4-1.7份、丙氨酸2.5-2.9份、亮氨酸2.2-2.6份、精氨酸1.5-1.8份或脯氨酸2.5-3.0份中的至少两种的组合。
本发明特定选择的上述九种氨基酸需以上述特定重量配比进行组合，才能使聚唾液酸的产量及工艺一致性得到进一步优化。
所述谷氨酸的重量份数可以为4份、4.1份、4.2份、4.3份、4.4份、4.5份、4.6份或4.7份等，范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述天冬氨酸的重量份数可以为1.5份、1.6份、1.7份或1.8份等，范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述苏氨酸的重量份数可以为1份、1.1份或1.2份等，范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述丝氨酸的重量份数可以为1.2份、1.3份、1.4份或1.5份等，范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述甘氨酸的重量份数可以为1.4份、1.5份、1.6份或1.7份等，范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述丙氨酸的重量份数可以为2.5份、2.6份、2.7份、2.8份或2.9份等，范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述亮氨酸的重量份数可以为2.2份、2.3份、2.4份、2.5份或2.6份等，范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述精氨酸的重量份数可以为1.5份、1.6份、1.7份或1.8份等，范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述脯氨酸的重量份数可以为2.5份、2.6份、2.7份、2.8份、2.9份或3.0份等，范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述碳源包括葡萄糖。
优选地，所述无机盐包括硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁和无机微量元素添加剂。所述无机微量元素添加剂例如硫酸亚铁、氯化锰、氯化钴等。
优选地，所述聚唾液酸发酵培养基以质量浓度计包括硫酸铵4.5-5g/L、磷酸二氢钾5.5-6g/L、复合氨基酸1.5-2g/L、消泡剂0.1-0.2g/L、葡萄糖15-25g/L、维生素0.8-1.2g/L、硫酸镁0.8-1.2g/L、无机微量元素添加剂0.8-1.2g/L，溶剂为水。
所述无机微量元素添加剂以溶液的形式进行添加，包括以下成分：1-4g/L的FeSO4、0.01-0.1g/L的KIO3、0.5-1g/L的MnCl2、0.1-0.5g/L的CoCl2、0.01-0.1g/L的CrCl3、0.01-0.2g/L的ZnSO4、0.01-0.05g/L的Na2MoO4以及1-2g/L的H3BO3，溶剂为水。
所述维生素以溶液的形式进行添加，包括：0.3-0.6g/L的VB1、3-3.5g/L的VB5、0.001-0.01g/L的VBh以及0.1-0.2g/L的VB12，溶剂为水。
本发明所涉及的发酵培养基中各组分以上述特定重量配比进行组合时，能使聚唾液酸的产量及工艺一致性得到进一步优化。
所述硫酸铵的质量浓度可以选择4.5g/L、4.6g/L、4.7g/L、4.8g/L、4.9g/L或5g/L等，上述范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述磷酸二氢钾的质量浓度可以选择5.5g/L、5.6g/L、5.7g/L、5.8g/L、5.9g/L或6g/L等，上述范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述复合氨基酸的质量浓度可以选择1.5g/L、1.6g/L、1.7g/L、1.8g/L、1.9g/L或2g/L等，上述范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述消泡剂的质量浓度可以选择0.1g/L、0.12g/L、0.14g/L、0.15g/L、0.18g/L或0.2g/L等，上述范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述葡萄糖的质量浓度可以选择15g/L、18g/L、20g/L、22g/L、24g/L或25g/L等，上述范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述维生素的质量浓度可以选择0.8g/L、0.9g/L、1.0g/L、1.1g/L或1.2g/L等，上述范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述硫酸镁的质量浓度可以选择0.8g/L、0.9g/L、1.0g/L、1.1g/L或1.2g/L等，上述范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述无机微量元素添加剂的质量浓度可以选择0.8g/L、0.9g/L、1.0g/L、1.1g/L或1.2g/L等，上述范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
在进行实际应用时，本发明所涉及的发酵培养基中葡萄糖和硫酸镁在115-125℃下单独进行灭菌20-40min，接种前倒入发酵罐内；维生素和无机微量元素添加剂进行过滤除菌，接种前倒入发酵罐内；其他组分混合后直接在发酵罐内在115-125℃下灭菌20-40min。
另一方面，本发明提供一种大肠杆菌发酵生产聚唾液酸的方法，所述方法包括：将大肠杆菌接种于如上所述的聚唾液酸发酵培养基中进行发酵，生产聚唾液酸。
所述大肠杆菌优选为大肠埃希氏菌CASOV-09，保藏号为CCTCC NO:M2020025；或CASOV-8保藏号为CCTCCNO：M 2018103。
优选地，所述大肠杆菌在所述聚唾液酸发酵培养基中的接种量为0.05-3％，例如0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％或3％等，上述范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述发酵的温度控制在35-40℃，例如35℃、36℃、37℃、38℃或40℃等，上述范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述发酵的时长为75-85h，例如75h、78h、80h、82h、84h或85h等，上述范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述发酵的pH值控制在6.0-6.6，例如pH＝6.0、pH＝6.2、pH＝6.3、pH＝6.4、pH＝6.5或pH＝6.6等，上述范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述发酵的pH值利用的氨水进行控制。
优选地，所述发酵的通气量为0.5-2vvm，例如0.5vvm、1vvm、1.5vvm或2vvm等，上述范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述发酵过程中根据溶氧情况适当调整通气量控制溶氧不低于30％，通气量最大为2vvm。
优选地，所述发酵的转速为200-300rpm，例如200rpm、220rpm、250rpm、280rpm或300rpm等，上述范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述发酵过程中根据溶氧情况适当调整搅拌速度控制溶氧不低于30％，转速最大为300rpm。
优选地，在所述发酵过程中以1-5g/L·h(例如1g/L·h、1.5g/L·h、2g/L·h、3g/L·h、3.5g/L·h、4g/L·h或5g/L·h等)的速率补加碳源。
当发酵进行到一定程度，发酵液的溶氧量和pH值开始回升，此时应根据情况按1-5g/L·h的速率补加碳源。
优选地，所述碳源为质量分数为40-60％(例如40％、45％、50％、55％或60％等)的葡萄糖溶液。
优选地，在所述发酵过程中补加氮源。
当发酵进行到一定程度，培养基中的氮源消耗较快，此时应补加氮源。
优选地，所述氮源为0.25-0.5g/L(例如0.25g/L、0.3g/L、0.35g/L、0.4g/L、0.45g/L或0.5g/L等)的谷氨酸溶液和/或0.15-0.3g/L(例如0.15g/L、0.2g/L、0.25g/L或0.3g/L等)的丙氨酸溶液。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明所涉及的聚唾液酸发酵培养基是一种全合成发酵培养基，创造性地用复合氨基酸作为发酵培养基的氮源，避免了传统天然有机物例如玉米浆干粉中乳酸含量较高，在发酵尤其是大规模发酵过程中给予大肠杆菌的代谢压力，使得大肠杆菌在发酵过程中提前凋亡等问题，能够使聚唾液酸的产量在扩大发酵规模后得以提升，且工艺一致性较高；另外，本发明选用的复合氨基酸培养基在生产规模放大后可以防止大肠杆菌的代谢异常，减少尸胺和缬氨酸在产物中的占比，提高物料转化率。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
下述应用例1-8及对比应用例1中所涉及的大肠杆菌为大肠埃希氏菌CASOV-09，保藏号为CCTCC NO:M 2020025；应用例9所涉及的大肠杆菌为保藏编号为CCTCCNO：M2018103。
依次经过(1)菌种活化：取冻存的大肠杆菌，解冻后，接种于液体LB培养基，37℃，220rpm，培养6h，得到一级种子液；(2)种子培养：取上述一级种子液再次接种至新鲜的液体LB培养基中，35℃，150rpm，培养15h，得到二级种子液；之后接种于发酵培养基中用于发酵。
下述实施例的配方表中维生素是指维生素溶液，含有以下组分：0.5g/L的VB1、3.2g/L的VB5、0.006g/L的VBh以及0.15g/L的VB12；表中无机微量元素添加剂是指微量元素溶液，含有以下组分：2g/L的FeSO4、0.06g/L的KIO3，0.8g/L的MnCl2、0.2g/L的CoCl2、0.08g/L的CrCl3、0.09g/L的ZnSO4、0.03g/L的Na2MoO4以及1.75g/L的H3BO3。
实施例1
本实施例提供一种聚唾液酸发酵培养基，其组成配方如下表所示：
Figure BDA0002560733250000081
实施例2
本实施例提供一种聚唾液酸发酵培养基，其组成配方与实施例1的区别仅在于各成分的配比有所调整，具体如下表所示：
Figure BDA0002560733250000082
Figure BDA0002560733250000091
实施例3
本实施例提供一种聚唾液酸发酵培养基，其组成配方与实施例1的区别仅在于9种氨基酸的配比有所调整，具体如下表所示：
Figure BDA0002560733250000092
Figure BDA0002560733250000101
实施例4
本实施例提供一种聚唾液酸发酵培养基，其组成配方与实施例1的区别仅在于复合氨基酸中缺少谷氨酸，但氨基酸总量保持不变，具体如下表所示：
Figure BDA0002560733250000102
Figure BDA0002560733250000111
实施例5
本实施例提供一种聚唾液酸发酵培养基，其组成配方与实施例1的区别仅在于复合氨基酸中缺少丙氨酸，但氨基酸总量保持不变，具体如下表所示：
Figure BDA0002560733250000112
实施例6
本实施例提供一种聚唾液酸发酵培养基，其组成配方与实施例1的区别仅在于复合氨基酸中缺少苏氨酸和丝氨酸，但氨基酸总量保持不变，具体如下表所示：
Figure BDA0002560733250000113
Figure BDA0002560733250000121
实施例7
本实施例提供一种聚唾液酸发酵培养基，其组成配方与实施例1的区别仅在于复合氨基酸的整体含量过高，具体如下表所示：
Figure BDA0002560733250000122
Figure BDA0002560733250000131
实施例8
本实施例提供一种聚唾液酸发酵培养基，其组成配方与实施例1的区别仅在于复合氨基酸的整体含量过低，具体如下表所示：
Figure BDA0002560733250000132
对比例1
本对比例提供一种聚唾液酸发酵培养基，其组成配方如下表所示：
Figure BDA0002560733250000141
应用例1-9和对比应用例1
按照实施例1-9和对比例1中的培养基配方配制完成后，将大肠杆菌以1％的接种量接种于上述发酵培养基中在发酵罐中进行发酵(小试发酵体积100L或中试发酵体积12m3，其中中试发酵每个工艺进行三个批次的发酵，应用例9培养基配方与应用例1相同，仅菌种类型不同)，发酵条件如下：
(1)培养温度全程控制在37℃；
(2)采用25％的氨水控制发酵液的pH值为6.4；
(3)发酵初始通气量为0.5vvm，后续根据溶氧情况调整通气量控制溶氧量不低于30％；发酵初始转速200rpm，后续根据溶氧情况适当调整搅拌控制溶氧量不低于30％；
(4)在发酵至10h时溶氧和pH开始回升，根据残糖或溶氧具体情况补充质量分数为50％的葡萄糖溶液；
(5)在发酵至19h时氮源消耗较快，此时补加谷氨酸和丙氨酸溶液；
(6)发酵到82h放罐。
发酵结束后，通过GC-MSD质谱分析各组发酵液中尸胺和缬氨酸的含量，各组发酵液中聚唾液酸的浓度用中国药典中间苯二酚法测定，所述聚唾液酸采用高效液相进行测定，检测条件：岛津Lc-15c；检测柱Bio-Rad AMINEX HPX87H Organic Analysis Column(300×7.8mm)；柱温60℃；流动相是6mmol硫酸，流速是0.6mL/min；检测波长210nm，结果如表1所示(其中，不同发酵批次的数据结果用“/”隔开)：
表1
组别 缬氨酸(mg/L) 尸胺(mg/L) 聚唾液酸(g/L)
应用例1(100L) 0.5 0.09 15.0
应用例1(12m<sup>3</sup>) 1/0.8/1 0.5/0.6/0.8 19.3/18.0/17.2
应用例2(100L) 0.7 0.08 14.3
应用例2(12m<sup>3</sup>) 1.2/1/0.9 0.6/0.8/1 16.5/18.4/18.6
应用例3(100L) - - 10.0
应用例4(100L) - - 6.5
应用例5(100L) - - 8.3
应用例6(100L) - - 9.2
应用例7(100L) - - 8.8
应用例8(100L) - - 5.7
应用例9(100L) - - 14.5
应用例9(12m<sup>3</sup>) - - 15.4/16.6/14.5
对比例1(100L) 0.7 0.08 13.7
对比例1(12m<sup>3</sup>) 6/10/2 5/20/10 7.2/16.4/9.8
由表1数据可知：本发明所涉及的聚唾液酸发酵培养基小试结果显示采用全合成培养基聚唾液酸的产量正常，缬氨酸和尸胺含量依然能够保持在较低水平，扩大发酵规模后，聚唾液酸的产量得到提升，且三批次间的发酵结果一致性较高，产量能够稳定在15-19g/L左右，发酵液中缬氨酸和尸胺的含量明显降低，物料转化率得到提升。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种聚唾液酸发酵培养基及大肠杆菌发酵生产聚唾液酸的方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (12)

1.一种大肠杆菌发酵生产聚唾液酸的方法，其特征在于，所述方法包括：将大肠杆菌接种于聚唾液酸发酵培养基中进行发酵，生产聚唾液酸；
所述聚唾液酸发酵培养基中氮源为复合氨基酸，所述复合氨基酸以重量份数计为谷氨酸4-4.7份、天冬氨酸1.5-1.8份、苏氨酸1-1.2份、丝氨酸1.2-1.5份、甘氨酸1.4-1.7份、丙氨酸2.5-2.9份、亮氨酸2.2-2.6份、精氨酸1.5-1.8份和脯氨酸2.5-3.0份的组合；
所述聚唾液酸发酵培养基以质量浓度计由以下组分组成：硫酸铵4.5-5g/L、磷酸二氢钾5.5-6g/L、复合氨基酸1.5-2g/L、消泡剂0.1-0.2g/L、葡萄糖15-25g/L、维生素0.8-1.2g/L、硫酸镁0.8-1.2g/L、无机微量元素添加剂0.8-1.2g/L，溶剂为水。
2.如权利要求1所述的大肠杆菌发酵生产聚唾液酸的方法，其特征在于，所述大肠杆菌在所述聚唾液酸发酵培养基中的接种量为0.05-3％。
3.如权利要求1所述的大肠杆菌发酵生产聚唾液酸的方法，其特征在于，所述发酵的温度控制在35-40℃。
4.如权利要求1所述的大肠杆菌发酵生产聚唾液酸的方法，其特征在于，所述发酵的时长为75-85h。
5.如权利要求1所述的大肠杆菌发酵生产聚唾液酸的方法，其特征在于，所述发酵的pH值控制在6.0-6.6。
6.如权利要求1所述的大肠杆菌发酵生产聚唾液酸的方法，其特征在于，所述发酵的pH值利用氨水进行控制。
7.如权利要求1所述的大肠杆菌发酵生产聚唾液酸的方法，其特征在于，所述发酵的通气量为0.5-2vvm。
8.如权利要求1所述的大肠杆菌发酵生产聚唾液酸的方法，其特征在于，所述发酵的转速为200-300rpm。
9.如权利要求1所述的大肠杆菌发酵生产聚唾液酸的方法，其特征在于，在所述发酵过程中以1-5g/L·h的速率补加碳源。
10.如权利要求9所述的大肠杆菌发酵生产聚唾液酸的方法，其特征在于，所述碳源为质量分数为40-60％的葡萄糖溶液。
11.如权利要求1所述的大肠杆菌发酵生产聚唾液酸的方法，其特征在于，在所述发酵过程中补加氮源。
12.如权利要求11所述的大肠杆菌发酵生产聚唾液酸的方法，其特征在于，所述补加的氮源为0.25-0.5g/L的谷氨酸溶液和/或0.15-0.3g/L的丙氨酸溶液。
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