CN110004192A - 一种制取颗粒型苏氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于氨基酸生产技术领域，公开了一种制取颗粒型苏氨酸的方法，其包括如下步骤：步骤1）发酵，步骤2）离心，步骤3）制备颗粒型苏氨酸。本发明方法能够提高颗粒苏氨酸的含量，工艺简单可行，应用前景广阔。

Description

一种制取颗粒型苏氨酸的方法

技术领域

本发明属于氨基酸生产领域，具体涉及一种制取颗粒型苏氨酸的方法。

背景技术

苏氨酸（Threonine，简写为Thr），学名2-氨基-3-羟基丁酸，1935年由 W.C.Rose在纤维蛋白水解物中分离和鉴定出来，1936 年 Meger 对它的空间结构进行了研究，因其结构与苏糖相似，故将其命名为苏氨酸。苏氨酸属于脂肪族氨基酸，微甜，是构成人和动植物蛋白质的一种必需氨基酸，主要用于医药、化学试剂、营养强化剂，可以强化乳制品，具有恢复人体疲劳，促进生长发育的效果。近年来，随着经济的发展，市场对苏氨酸需求持续稳定增长，是需求增长最快的氨基酸品种之一，特别是在化学及生化、食品添加剂、饲料添加剂等方面的用量增长迅速，大有取代色氨酸而成为除赖氨酸、蛋氨酸以外的发展最迅速的第三大氨基酸。在配合饲料中加入L-苏氨酸，具有如下的特点：①可以调整饲料的氨基酸平衡，促进禽畜生长；②可改善肉质；③可改善氨基酸消化率低的饲料的营养价值；④可降低饲料原料成本；因此在中国、欧盟国家和美洲国家，已广泛地应用于饲料行业。

目前，苏氨酸的生产方法主要有发酵法、蛋白质水解法和化学合成法3种，微生物发酵法生产苏氨酸，因其工艺简单，成本低廉等优点已成为目前主流方法。L-苏氨酸的主要生产菌株有谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌和大肠杆菌。苏氨酸发酵技术目前主要存在发酵效率低下以及纯度不达标的缺陷。人们一直通过各种方法改造菌株以提高氨基酸的产量，早期应用最广泛的为各种条件下的诱变育种，而随着氨基酸生物代谢途径的揭秘，有目的的在分子水平上对代谢途径进行改造也渐渐显露其优势，另外，中游的发酵条件优化过程以及下游的回收净化过程也是一个重点。

大肠杆菌工程菌株是微生物工业发酵生产苏氨酸的主要菌株，在发酵产生 L-苏氨酸的同时，还会生成乙酸、丙氨酸、缬氨酸和精氨酸等代谢副产物，在一定程度上影响菌体生长及 L-苏氨酸的合成与积累。其中，乙酸的抑制效果尤为明显，当乙酸积累到一定浓度时，菌体的比生长速率迅速下降，产物合成大大降低，并形成恶性循环，同时外源基因的表达也受到严重影响。乙酸积累对细胞代谢造成的不利影响，是利用大肠杆菌作为宿主菌表达外源蛋白的一个不可忽视的问题。如何降低乙酸的含量，从而提高生物量以及苏氨酸产量是我们研究的重点。文献“L-苏氨酸发酵过程中乙酸的控制，发酵科技通讯2012年”在大肠杆菌发酵制备苏氨酸过程中，通过选择合适的发酵条件来控制其副产物乙酸的生成，能够降低乙酸的生成，但是降低幅度降为不明显，不能大幅提高苏氨酸的产量，并没有工业化推广的价值。申请人之前的专利技术“一种超低水分苏氨酸生产方法”记载的培养基：葡萄糖80g/L，玉米浆20g/L，硫酸铵2g/L，碳酸钙0.75g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，K₂HPO₄ 0.2g/L，NaCl0.2g/L，pH值6.5；发酵液中苏氨酸的含量最高可达到10g/100ml，但是菌株在发酵后期死亡率较高，而且葡萄糖消耗量较大，发酵液中苏氨酸产率也有待提升。

发明内容

为了解决现有技术的缺陷，本发明提出了一种制取颗粒型苏氨酸的方法。本发明工艺能够提高颗粒型苏氨酸含量，工艺简单可行，应用前景广阔。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种制取颗粒型苏氨酸的方法，其包括如下步骤：步骤1）发酵，步骤2）离心，步骤3）制备颗粒型苏氨酸。

进一步地，所述步骤1）发酵，包括如下步骤：将产苏氨酸的大肠杆菌工程菌按照6-10%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，温度30-32℃，罐压为0.04-0.05MPa，通气量为0.3-0.5vvm，转速为100rpm，发酵时间为36-48h，然后按照6-10%的接种量接入莱茵衣藻，继续发酵培养36-48h，停止发酵，收集发酵液。

进一步地，所述步骤2）离心，包括如下步骤：发酵液首先经过碟片离心机以4000rpm离心5min，收集上层液体和沉淀。

进一步地，所述步骤3）制备颗粒苏氨酸，包括如下步骤：将步骤2）所得上层液体经过陶瓷膜过滤，收集滤过液，将滤过液经卧螺离心机分离，离心速度为5000rpm，离心时间为3min，收集上清液；然后经过超滤膜过滤，收集滤过液，将滤过液用间歇式单效浓缩结晶锅结晶，离心收集晶体，然后120℃干燥，压缩成片状，再投入造粒塔中，在热气流的作用下呈沸腾状态；65℃流化床干燥，再经破碎整粒，依次通过20目和50目筛，筛去过粗、过细的颗粒，收集目标粒径的颗粒剂，包装即得。

进一步地，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖20-30g/L，甘油20-30g/L，玉米浆20-30g/L，硫酸铵2-3g/L，磷酸二氢钾0.2-0.3g/L，磷酸氢二钾0.2-0.3g/L，七水硫酸镁0.1-0.2g/L，七水硫酸亚铁 0.01-0.02g/L，一水硫酸锰0.01-0.02g/L，pH值6.5-6.8。

本发明研究的出发点以及取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

大肠杆菌好气培养时，氧气分子是电子传递最终受体，随着细胞生长，氧消耗不断增加，发生供氧不足，使得TCA循环受阻，苏氨酸产率降低，而碳源代谢途径更多地流向乙酸途径，乙酸积累迅速增加。

菌体浓度对乙酸的生成有直接影响，发酵前期，菌体密度不高，需氧量相对较少，发酵中后期，当菌体浓度增加，耗氧量增加，容易导致乙酸的过快生成，当菌体浓度过低，又会降低目的产物的合成。

本发明发酵碳源选择葡萄糖和甘油，发酵前期，菌体密度低，供氧量充足，大肠杆菌优先利用葡萄糖作为碳源，可以促进菌体增殖和苏氨酸的产生；发酵中后期，葡萄糖被耗尽，此时大肠杆菌利用甘油作为碳源，由于细胞吸收甘油的速率较低，进入糖酵解的碳流下降，从而降低了乙酸的积累量，同时提高了苏氨酸的产量；

本发明通过在发酵接种莱茵衣藻，能够利用发酵液中的乙酸作为碳源进行非光和作用，而较难利用甘油作为碳源，从而解除了对大肠杆菌产苏氨酸的抑制作用，还能够进行微量的光合作用释放氧气，供大肠杆菌发酵产苏氨酸来使用。通过添加莱茵衣藻，不但能够提高苏氨酸的产量，并且菌体蛋白产量也相应提高。

本发明将粉末状苏氨酸制备成颗粒型苏氨酸，能够改善流动性、便于保藏和运输、控制溶解度，提高了苏氨酸的品质和附加值。

附图说明

图1：各组别在不同时间点的乙酸产量。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种制取颗粒型苏氨酸的方法，其包括如下步骤：

步骤1）将大肠杆菌工程菌K12△dapA种子液（种子液的浓度为1×10⁸cfu/mL）按照10%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，温度30℃，罐压为0.04MPa，通气量为0.5vvm，转速为100rpm，发酵时间为36h，然后按照10%的接种量接入莱茵衣藻（莱茵衣藻的浓度为1×10⁵cfu/mL），继续发酵培养48h，停止发酵，收集发酵液；

所述发酵培养基的组分为：葡萄糖20g/L，甘油20g/L，玉米浆20g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，七水硫酸镁0.1g/L，七水硫酸亚铁 0.01g/L，一水硫酸锰0.01g/L，pH值6.5；

步骤2）发酵液首先经过碟片离心机以4000rpm离心5min，收集上层液体和沉淀；

步骤3）上层液体经过陶瓷膜（1万Da截留分子量）过滤，收集滤过液，将滤过液经卧螺离心机分离，离心速度为5000rpm，离心时间为3min，收集上清液（蛋白含量小于0.5%）；然后经过超滤膜过滤，收集滤过液，超滤膜截留分子量为300Da；将滤过液用间歇式单效浓缩结晶锅结晶，离心收集晶体，然后120℃干燥至水分含量为0.8％，压缩成片状，再投入造粒塔中，在热气流的作用下呈沸腾状态；65℃流化床干燥，再经破碎整粒，依次通过20目和50目筛，筛去过粗、过细的颗粒，收集目标粒径的颗粒剂，包装即得。

实施例2

一种制取颗粒型苏氨酸的方法，其包括如下步骤：

步骤1）将大肠杆菌工程菌K12△dapA种子液（种子液的浓度为1×10⁸cfu/mL）按照6%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，温度32℃，罐压为0.04MPa，通气量为0.4vvm，转速为100rpm，发酵时间培养为48h，然后按照8%的接种量接入莱茵衣藻（莱茵衣藻的浓度为1×10⁵cfu/mL），继续发酵培养48h，停止发酵，收集发酵液；

所述发酵培养基的组分为：葡萄糖30g/L，甘油30g/L，玉米浆30g/L，硫酸铵3g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，七水硫酸镁0.2g/L，七水硫酸亚铁0.02g/L，一水硫酸锰0.02g/L，pH值6.8；

步骤2）发酵液首先经过碟片离心机以4000rpm离心5min，收集上层液体和沉淀；

步骤3）上层液体经过陶瓷膜（1万Da截留分子量）过滤，收集滤过液，将滤过液经卧螺离心机分离，离心速度为5000rpm，离心时间为3min，收集上清液（蛋白含量小于0.5%）；然后经过超滤膜过滤，收集滤过液，超滤膜截留分子量为300Da；将滤过液用间歇式单效浓缩结晶锅结晶，离心收集晶体，然后120℃干燥至水分含量为0.8％，压缩成片状，再投入造粒塔中，在热气流的作用下呈沸腾状态；65℃流化床干燥，再经破碎整粒，依次通过20目和50目筛，筛去过粗、过细的颗粒，收集目标粒径的颗粒剂，包装即得。

实施例3

本发明工艺中不同因素对苏氨酸产量和乙酸产量的影响：

设置组别：

实验组：实施例1；

对照组1：不添加莱茵衣藻，其余同实施例1；

对照组2：将甘油替换为同等质量的葡萄糖，其余同实施例1；

对照组3：不添加莱茵衣藻，同时将甘油替换为同等质量的葡萄糖，其余同实施例1。

各组别最终发酵液中苏氨酸和乙酸的含量见表1所示：

表1

组别	苏氨酸g/L	乙酸g/L
			实验组	137.1	0.6
对照组1	102.5	13.9
			对照组2	118.2	4.7
对照组3	96.4	15.6

结论：实验组通过对莱茵衣藻进行辅助发酵处理，能够在利用苏氨酸发酵液中的乙酸作为碳源进行非光和作用，从而解除了对大肠杆菌产苏氨酸的抑制作用，还能够进行微量的光合作用释放氧气，供大肠杆菌发酵产苏氨酸来使用；同时通过甘油替代部分葡萄糖，随着葡萄糖的消耗，大肠杆菌利用甘油作为碳源，由于细胞吸收甘油的速率较低，降低了乙酸的积累量，同时提高了苏氨酸的产量，通过各组别比较试验发现，与对照组1-3相比，本发明实验组的苏氨酸产量分别提高33.76%、15.99%、42.22%；而实验组乙酸含量仅为0.6g/L，相当于对照组1的3.85%。

本发明还检测了各组别在不同时间点的乙酸产量，以实施例1为例，分别选取发酵后，第36h，第48h，第60h，第72h，第84h，共5个时间点进行检测，具体结果见图1。实验组中，随着发酵时间的增加，乙酸含量迅速降低，解除了对苏氨酸的合成抑制，从而提高了苏氨酸的分泌量；而对照组1和3中，由于没有不添加莱茵衣藻，导致乙酸含量继续增加；对照组2中，由于添加了莱茵衣藻，使得乙酸含量逐步下降，但是下降幅度低于实验组，可能是因为实验组添加了甘油作为碳源，进入乙酸途径的碳源降低，而且莱茵衣藻较难利用甘油作为碳源，仅能利用乙酸，进而导致实验组乙酸的下降幅度更加明显。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然而，并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当然会利用揭示的技术内容作出些许更动或修饰，成为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (6)

1.一种制取颗粒型苏氨酸的方法，其包括如下步骤：步骤1）发酵，步骤2）离心，步骤3）制备颗粒型苏氨酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）发酵，包括如下步骤：将产苏氨酸的大肠杆菌工程菌按照6-10%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，发酵条件为：温度30-32℃，罐压0.04-0.05MPa，通气量0.3-0.5vvm，转速100rpm；发酵培养时间为36-48h，然后按照6-10%的接种量接入莱茵衣藻，继续发酵培养36-48h，停止发酵，收集发酵液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2）离心，包括如下步骤：发酵液经过碟片离心机以4000rpm离心5min，收集上层液体和沉淀。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤3）制备颗粒苏氨酸，包括如下步骤：将步骤2）所得上层液体经过陶瓷膜过滤，收集滤过液，将滤过液离心，收集上清液；然后经过超滤膜过滤，收集超滤液，将超滤液浓缩结晶，离心收集晶体，然后120℃干燥，压缩成片状，再投入造粒塔中，在热气流的作用下呈沸腾状态；65℃流化床干燥，再经破碎整粒，过筛，包装即得。

5.根据权利要求2-3任其一所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖20-30g/L，甘油20-30g/L，玉米浆20-30g/L，硫酸铵2-3g/L，磷酸二氢钾0.2-0.3g/L，磷酸氢二钾0.2-0.3g/L，七水硫酸镁0.1-0.2g/L，七水硫酸亚铁 0.01-0.02g/L，一水硫酸锰0.01-0.02g/L，pH值6.5-6.8。

6.按照权利要求1-5所述的方法制备的颗粒型苏氨酸。