CN115747268A - D-泛酸的发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种D‑泛酸的发酵方法，该D‑泛酸的发酵方法包括以下步骤：采用发酵培养基培养重组大肠杆菌，重组大肠杆菌为表达D‑泛酸的大肠杆菌，培养的条件包括：在发酵培养基的溶氧值大于预设值时，向发酵培养基中添加补料直至发酵培养基的溶氧值不超过所述预设值，预设值的取值范围为1％～10％，补料包含质量百分含量为30％～80％的葡萄糖和质量百分含量为0.1％～10％的氮源。上述发酵方法能够使得重组大肠杆菌更好地利用发酵培养基产生更多的D‑泛酸，且产生的乙酸不影响产物合成。
Description
技术领域
本发明涉及发酵技术领域，特别是涉及一种D-泛酸的发酵方法。
背景技术
D-泛酸，也称作维生素B5，是水溶性维生素B族物质。作为辅酶A的前体，D-泛酸参与碳水化合物、蛋白质和脂肪的代谢作用，是人体和动物维持正常生理机能不可或缺、不可替代的物质，是一种重要的饲料添加剂、食品添加剂、化妆品添加剂和医药保健品。D-泛酸几乎存在于所有的活细胞中，在原核生物、真菌、霉菌和植物细胞内可以通过酶促反应合成。其中富含泛酸的食物有动物内脏、牛肉、猪肉、未经精加工的谷类、豆类、坚果、啤酒酵母、蜂王浆、蘑菇、绿叶蔬菜等。尽管大自然一再对人类进行“暗示”，遗憾地是目前工业化生产泛酸和泛酸钙主要方法还是以化学合成为主。
然而化学合成法比较复杂，涉及多个中间体和拆分工艺，生产过程还会产生对环境有严重污染的含氰废水。为了寻找更加绿色的生产工艺，生物学家们发明了以葡萄糖为原料的微生物发酵法，例如浙江工业大学2019年申请的CN109868254A专利报道构建了能够发酵生产D-泛酸的重组大肠杆菌菌株。尽管有菌种能够发酵生产泛酸，但是其发酵控制工艺还不够完善，例如副产物乙酸积累，导致泛酸含量少转化率低，鉴于此，开发一种解决副产物乙酸积累导致泛酸转化率降低的问题是非常必要的。
发明内容
基于此，本申请提供一种基于大肠杆菌的产乙酸较少的D-泛酸的发酵方法。
一种D-泛酸的发酵方法，所述D-泛酸的发酵方法包括以下步骤：
采用发酵培养基培养重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌为CN2022102145885专利所构建的大肠杆菌E.coli MG1655avtA:panDBl-ilvG+M-aspDH/pACYC184-panBCE，所述培养的条件包括：在发酵培养的溶氧值大于预设值时，向所述发酵培养基中添加补料直至所述发酵培养基的溶氧值不超过所述预设值，所述预设值的取值范围为1％～10％，所述补料包含质量百分含量为30％～80％的葡萄糖和质量百分含量为0.1％～10％的氮源。
上述D-泛酸的发酵方法，通过在发酵培养过程中当溶氧值大于预设值(1％～10％)时，向发酵培养基中添加包含质量百分含量为30％～80％的葡萄糖和质量百分含量为0.1％～10％的氮源进行补料，直至发酵培养基的溶氧值不超过预设值，能够很好地避免发酵过程中补糖过多或溶氧供应不足而产生乙酸的现象，能够使得重组大肠杆菌更好地利用葡萄糖产生D-泛酸而不易产生对其生长及D-泛酸的生产有影响的乙酸副产物，能够大大提高D-泛酸的产量。
在其中一个实施例中，所述预设值为1％～8％中的任一值。
在其中一个实施例中，所述氮源包括酵母和蛋白胨中的一种或两种。
在其中一个实施例中，所述补料包含质量百分含量为40％～60％的葡萄糖、质量百分含量为0.1％～3％的酵母和质量百分含量为0.1％～3％的蛋白胨，其余为水。
在其中一个实施例中，所述发酵培养基包括以下组分：
在其中一个实施例中，所述微量元素混合液包括以下组分：
在其中一个实施例中，所述培养的条件还满足培养温度为30℃～45℃。
在其中一个实施例中，所述培养的条件还满足发酵培养基的pH为6～7.5。
在其中一个实施例中，所述培养的条件还满足：罐压为0.01MPa～0.1MPa；和或，风量为0.3vvm～4vvm。
在其中一个实施例中，所述培养的条件还满足：培养温度为35℃～39℃；发酵培养基的pH为6.6～7.2，罐压为0.02MPa～0.06MPa，风量为0.4vvm～2vvm。
附图说明
图1实施例1发酵液中的乙酸和D-泛酸的液相图谱。
(其中，14.110min的峰是D-泛酸，15.567min的峰是乙酸)。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以有许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体实施例的目的，不是旨在于限制本发明。术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。在本文中“MOPS”是3-吗啉丙磺酸的简称。
本文中的重组大肠杆菌是指CN2022102145885专利所构建的大肠杆菌E.coliMG1655avtA:panDBl-ilvG+M-aspDH/pACYC184-panBCE。
在本文中“溶氧”是指发酵培养基中的溶解氧；“溶氧值”是指在发酵培养过程中的溶解氧的相对含量。
本申请一实施方式提供了一种D-泛酸的发酵方法，该D-泛酸的发酵方法包括以下步骤：采用发酵培养基培养重组大肠杆菌，重组大肠杆菌为表达D-泛酸的大肠杆菌，培养条件包括：在发酵培养基的溶氧值大于预设值时，向发酵培养基中加补料直至发酵培养基的溶氧值不超过预设值，预设值的取值范围为1％～10％，补料包含质量百分含量为30％～80％的葡萄糖和质量百分含量为0.1％～10％的氮源。
上述D-泛酸的发酵方法采用代谢产出D-泛酸的大肠杆菌(或称重组大肠杆菌)生产D-泛酸，通过在发酵培养基的溶氧值大于预设值(1％～10％)时，向发酵培养基中添加包含质量百分含量为30％～80％的葡萄糖和质量百分含量为0.1％～10％的氮源的补料，直至发酵培养基的溶氧值不超过预设值。在发酵过程中，向发酵培养基中添加含有葡萄糖的补料，使得重组大肠杆菌对发酵培养基中的溶氧的消耗增加，进而使发酵体系的溶氧降低，在溶氧值低于预设值时停止补料添加，此时重组大肠杆菌继续消耗发酵培养基中的葡萄糖；在补加的葡萄糖消耗完全后，溶氧值开始回升，在溶氧值回升到高于预设值时，开始下一个循环的补料添加，循环执行添加补料、停止补料，从而使得重组大肠杆菌连续发酵且产乙酸量少。经本申请发明人验证，将溶氧值的预设值设置为1％～10％范围内的任一数值，在溶氧值大于预设值，则添加补料直至溶氧值不超过该预设值时，能够很好地避免发酵过程中因补糖过多或溶氧供应不足等因素导致产生乙酸的现象，能够使得重组大肠杆菌不易产生乙酸，能够大大提高重组大肠杆菌的产量。
在一些实施例中，重组大肠杆菌为CN2022102145885专利所构建的大肠杆菌E.coli MG1655avtA:panDBl-ilvG+M-aspDH/pACYC184-panBCE。
在一些可选地具体示例中，预设值为1％、4％、6％或10％。进一步地，在一些实施例中，预设值的取值范围为1％～8％。在预设值为1％～8％中的任一数值时，重组大肠杆菌的产量更高。
补料包含质量百分含量为30％～80％的葡萄糖和质量百分含量为0.1％～10％的氮源，补料中的葡萄糖补充发酵培养基中被消耗的葡萄糖，利于重组大肠杆菌消耗氧气而使得溶氧值下降；补料中的氮源利于重组大肠杆菌的生长。在一个可选地具体实施例中，以质量百分含量计，补料中的葡萄糖的含量为30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％或75％。进一步地，以质量百分含量计，补料中的葡萄糖的含量为40％～70％。更进一步地，以质量百分含量计，补料中的葡萄糖的含量为40％～60％。
在一些实施例中，氮源包括酵母和蛋白胨中的一种或两种。在一个可选地具体示例中，酵母为酵母粉或酵母浸粉。酵母浸粉即粉状酵母浸出物(Yeast extract)，是以高蛋白面包酵母或啤酒酵母为原料，经自溶、酶解、浓缩、干燥等工艺制成的一种富含蛋白质、氨基酸、肽、多肽、核酸、维生素及微量元素等营养成分的产品。可以理解的是，在其他实施例中，氮源不限于上述的酵母和/或蛋白胨，还可以是其他物质。在一个可选地具体示例中，以质量百分含量计，补料中的氮源的含量为0.1％、0.5％、1％、3％、5％、8％或10％。进一步地，以质量百分含量计，补料中的氮源的含量为0.1％～5％。更进一步地，以质量百分含量计，补料中的氮源的含量为0.2～2％。
在一些实施例中，补料包含质量百分含量为40％～60％的葡萄糖、质量百分含量为0.1％～10％的酵母和质量百分含量为0.1％～10％的蛋白胨，其余为水。进一步地，补料包含质量百分含量为45％～55％的葡萄糖、质量百分含量为0.2％～1.5％的酵母粉或酵母浸粉、和质量百分含量为0.2％～1.5％的蛋白胨，，其余为水。
在一些实施例中，发酵培养基包括以下组分：
在一个可选地具体示例中，发酵培养基包括以下组分：
需要说的是，在本实施方式中，发酵培养基的酵母为干酵母粉。
在一些实施例中，上述任一实施例的微量元素混合液包括以下组分：
在一些实施例中，上述任一实施例的D-泛酸的发酵方法的培养条件还满足培养温度为30℃～45℃。在一个可选地具体示例中，培养温度为30℃、35℃、37℃、39℃、40℃、42℃或45℃。进一步地，培养温度为35℃～39℃。
在一些实施例中，上述任一实施例的D-泛酸的发酵方法的培养条件还满足发酵培养基的pH为6～7.5。在一个可选地具体示例中，发酵培养基的pH为6、6.3、6.6、7、7.2或7.5。进一步地，发酵培养基的pH为6.6～7.2。
在一些实施例中，上述任一实施例的D-泛酸的发酵方法的培养条件还满足罐压为0.01MPa～0.1MPa。在一个可选地具体示例中，罐压为0.01MPa、0.03MPa、0.05MPa、0.07MPa、0.08MPa或0.1MPa。进一步地，罐压为0.02MPa～0.06MPa。
在一些实施例中，上述任一实施例的D-泛酸的发酵方法的培养条件还满足风量为0.3vvm～4vvm。在一个可选地具体示例中，风量为0.3vvm、0.5vvm、1vvm、1.5vvm、2vvm、3vvm或4vvm。
在一些实施例中，D-泛酸的发酵方法的培养条件还满足：培养温度为35℃～39℃；发酵培养基的pH为6.6～7.2，罐压为0.02MPa～0.06MPa，风量为0.4vvm～2vvm。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
1.取生产菌株(大肠杆菌E.coli MG1655avtA:panDBl-ilvG+M-aspDH/pACYC184-panBCE)，划线接种于含34mg/L氯霉素的固体LB培养基平板，37℃静置培养12h。
2.挑取平板上的菌苔，接种至LB培养基斜面中，37℃静置培养12h。挑取斜面上的菌苔，接种至液体LB培养基中，37℃、220rpm振荡培养12h，得到种子液。
3.将种子液按照体积百分含量为3％的接种量接种至含有无菌发酵培养基的发酵罐中，37℃、2vvm、500rpm培养。其中：发酵培养基的组成为：MOPS 80.0g/L，葡萄糖20.0g/L、硫酸铵10.0g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、七水硫酸镁2.0g/L、酵母粉5.0g/L、微量元素混合液5mL/L和水，微量元素混合液：FeSO4·7H2O10g/L、CaCl21.35g/L、ZnSO4·7H2O 2.25g/L、MnSO4·4H2O 0.5g/L、CuSO4·5H2O 1g/L、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.106g/L、Na2B4O7·10H2O0.23g/L、CoCl2·6H2O 0.48g/L、35％HCl 10mL/L和水。在培养过程中，用氨水调节反应体系的pH值使其维持在6.8～7.0。在溶氧开始回升后开始添加补料：当溶氧值降至接近4％时启动溶氧反馈补料策略进行补料，直至溶氧值不超过4％。补料由葡萄糖、酵母浸粉和水组成，以质量百分含量计，葡萄糖的浓度50％，酵母浸粉的1％、蛋白胨1.5％。
4.在发酵2天后，采用液相方法检测发酵液中的乙酸和D-泛酸浓度，结果如表1所示。
检测发酵液中的乙酸和D-泛酸(以D-泛酸钙计，下同)的液相法为：取发酵液5mL，10000r/min，离心5min，取上清液，用纯化水将上清液稀释40倍再过0.22μm滤膜后进行液相分析。色谱柱为Aglient MetaCarb 87H 300×7.8mm，流动相为12.5mmol/L硫酸溶液，流速0.6mL/min，紫外检测器，波长215nm，进样量20μL；柱温50℃。以D-泛酸钙为标品定量发酵液中D-泛酸的含量。液相检测图谱见图1。
实施例2
本实施例的采用重组大肠杆菌发酵的方法与实施例1大致相同，其不同在于，在将重组大肠杆菌接种中发酵罐之后的发酵培养过程中，开始向发酵培养基中添加补料的溶氧值为6％，也即是，当溶氧值升至大于6％时向发酵培养基中添加补料，直至溶氧值不超过6％。
同样地，在发酵2天后，采用液相方法检测发酵液中的乙酸和D-泛酸钙浓度，结果如表1所示。
实施例3
本实施例的采用重组大肠杆菌发酵的方法与实施例1大致相同，其不同在于，在将重组大肠杆菌接种中发酵罐之后的发酵培养过程中，开始向发酵培养基中添加补料的溶氧值为8％，也即是，当溶氧值升至大于8％时向发酵培养基中添加补料，直至溶氧值不超过8％。
同样地，在发酵2天后，采用液相方法检测发酵液中的乙酸和D-泛酸钙浓度，结果如表1所示。
实施例4
本实施例的采用重组大肠杆菌发酵的方法与实施例1大致相同，其不同在于，在将重组大肠杆菌接种中发酵罐之后的发酵培养过程中，开始向发酵培养基中添加补料的溶氧值为10％，也即是，当溶氧值升至大于10％时向发酵培养基中添加补料，直至溶氧值不超过10％。
同样地，在发酵2天后，采用液相方法检测发酵液中的乙酸和D-泛酸钙浓度，结果如表1所示。
对比例1
本实施例的采用重组大肠杆菌发酵的方法与实施例1大致相同，其不同在于，在将重组大肠杆菌接种中发酵罐之后的发酵培养过程中，开始向发酵培养基中添加补料的溶氧值为20％，也即是，当溶氧值升至大于20％时向发酵培养基中添加补料，直至溶氧值不超过20％。
同样地，在发酵2天后，采用液相方法检测发酵液中的乙酸和D-泛酸钙浓度，结果如表1所示。
对比例2
本实施例的采用重组大肠杆菌发酵的方法与实施例1大致相同，其不同在于，在将重组大肠杆菌接种中发酵罐之后的发酵培养过程中，开始向发酵培养基中添加补料的溶氧值为30％，也即是，当溶氧值升至大于30％时向发酵培养基中添加补料，直至溶氧值不超过30％。
同样地，在发酵2天后，采用液相方法检测发酵液中的乙酸和D-泛酸钙浓度，结果如表1所示。
对比例3
本实施例的采用重组大肠杆菌发酵的方法与实施例1大致相同，其不同在于，在将重组大肠杆菌接种中发酵罐之后的发酵培养过程中，溶氧关联搅拌转速控制恒定溶氧20％，补料量同对比例1。
同样地，在发酵2天后，采用液相方法检测发酵液中的乙酸和D-泛酸钙浓度，结果如表1所示。
表1
其中，D-泛酸钙(％)：是以对比例1的含量为基准，其他实施例/对比例相对于其的比值。
由表1的实施例1和对比例1的乙酸和D-泛酸钙浓度的结果可知，通过采用本申请中的溶氧反馈补料策略控制加料条件及停止加料的条件，发酵液中的D-泛酸钙浓度比对照提高42.8％，而直接恒定溶氧控制发酵液中的D-泛酸钙浓度反而更低。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.一种D-泛酸的发酵方法，其特征在于，所述D-泛酸的发酵方法包括以下步骤：
采用发酵培养基培养重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌为产D-泛酸的大肠杆菌，所述培养的条件包括：在发酵培养的溶氧值大于预设值时，向所述发酵培养基中添加补料直至所述发酵培养基的溶氧值不超过所述预设值，所述预设值的取值范围为1％～10％，所述补料包含质量百分含量为30％～80％的葡萄糖和质量百分含量为0.1％～10％的氮源。
2.根据权利要求1所述的D-泛酸的发酵方法，其特征在于，所述预设值的取值范围为1％～8％。
3.根据权利要求1所述的D-泛酸的发酵方法，其特征在于，所述氮源为酵母、蛋白胨和牛肉膏等中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的D-泛酸的发酵方法，其特征在于，所述补料包含质量百分含量为40％～60％的葡萄糖、质量百分含量为0.1％～3％的酵母和质量百分含量为0.1％～3％的蛋白胨等其他氮源。
5.根据权利要求1～4任一项所述的D-泛酸的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基包括以下组分：
6.根据权利要求5所述的D-泛酸的发酵方法，其特征在于，所述微量元素混合液包括以下组分：
7.根据权利要求1～4和6任一项所述的D-泛酸的发酵方法，其特征在于，所述培养的条件还满足培养温度为30℃～45℃。
8.根据权利要求1～4和6任一项所述的D-泛酸的发酵方法，其特征在于，所述培养的条件还满足发酵培养基的pH为6～7.5。
9.根据权利要求1～4和6任一项所述的D-泛酸的发酵方法，其特征在于，所述培养的条件还满足：罐压为0.01MPa～0.1MPa；风量为0.3vvm～4vvm。
10.根据权利要求1～4和6任一项所述的D-泛酸的发酵方法，其特征在于，所述培养的条件还满足：培养温度为35℃～39℃；发酵培养基的pH为6.6～7.2，罐压为0.02MPa～0.06MPa，风量为0.4vvm～2vvm。
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