CN1070687A - 发酵制备氨基酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及发酵制备氨基酸的方法。其中在营 养培养基中培养生产一种或多种氨基酸的短杆菌属 和棒状杆菌属菌株，并在发酵结束时从培养液中分离 氨基酸，特征在于在活跃生长期后，细菌培养物得有 供它自己使用的可吸收碳源，这个碳源量比基于该菌 株结构上可代谢的量少，并在营养培养基中提供一定 量的其它必需添加物。

Description

本发明涉及一种发酵制备氨基酸如L-赖氨酸或L-苏氨酸的改进方法。
L-赖氨酸是一种必需氨基酸并大量地被用作动物饲料添加剂。
通常通过生物合成生产大量的氯基酸，并且该方法是本领域专业人员熟知的。通过在短时间内以高浓度把这些氨基酸分泌到培养基中的能力来鉴别生产氨基酸的细菌菌株。通常为了避免底物的高起始浓度，一般采用分批进料的工艺。由于所用的生产菌株有很高的代谢能力，因此采用使最大需氧量和放热量保持在经济学上可接受的数量级这一发酵方法对于完成发酵过程是极其重要的。
因此，为了调节生物体的代谢活性，采用了各种手段，以确保氧气的供给和热量的释放以及在同一时间平衡生物量和产物形成的分布。
在CSFR-PS212558中公开了间歇供料的方法，其中在生长期通过改变pH并通过α-氨基氮调节生物量总量来调节代谢活性。SU-PS157059公开了一种间歇供料的方法，其中以苏氨酸浓度作为供料标准，并使还原化合物的比例保持在3到5%。在FR-PS8303487中公开了一种很精细地调节过程。在该过程中，连续加入两种供料溶液：以这样的速度加入磷酸亮氨酸溶液，即通过补充料加入的速度限制生物代谢强度和生物量的形成。以实际糖浓度保持在5到15g/l的速度加入第二种供料溶液，即糖溶液。这表明，由于在供料期由亮氨酸/磷酸盐补充物的限制，随后在任何一个时间，培养物可利用的糖均比在培养基中可得到的少。该方法与重复记载的应当避免C-限制和过度的C-超量（如，DD-PS269167）的观点是一致的。为了该目的，Hasj    Sassi等人在“Biotechn    Letters，Volume    10，No.8，pp.583-586（1988）”中甚至建议葡萄糖浓度保持在90到140g/l。因此，代谢活性总是由只有碳源以外的因素调节的。
本发明的目的是提供一种发酵制备氨基酸的生产方法，该方法以较高转化率转化所用的碳源（糖），并在不含生物量的干物质中得到高浓度的氨基酸。
本发明涉及一种发酵制备氨基酸物的生产方法，其中在营养培养基中培养产生一种或多种氨基酸的短杆菌属或棒状杆菌属的菌株，并在发酵结束时从培养液中分离氨基酸，特征在于在活跃的生长期（生产期期间）后，细菌培养基可得到的碳源量比以它在其菌株结构基础上可代射的量少并且在营养培养基中提供一定量的其它必需补充物。发酵（营养）培养基为常规培养基组合物。除含碳源如可同化的糖、蔗糖、葡萄糖，糖蜜或淀粉水解物及铵离子外，在自养型生产菌的情况下，由于一种或多种营养缺陷，它还含有复杂的成分作为所需的有机补充物源，如蛋白水解物作为α-氨基氮源，维生素及无机盐。在发酵开始时呈现的活跃生长通常是一个对数生长期。如果需要，可通过限制补充物和/或碳源来缩短对数生长期。
对数生长期之后是细胞生长，但这种生长的范围局限于活跃生长期的一小部分。优选地是使用生产L-赖氨酸和/或L-苏氨酸的菌株。选择发酵培养基，以使温度为25到40℃，最好是30到36℃，pH从6到8，最好为7到7.5，铵浓度从0.5到8g/l。搅拌发酵液并充分地供氧。可以通过改变加入的氨基酸量控制糖代谢，特别是在使用氨基酸营养缺陷型赖氨酸分泌菌的情况下。生长期后，这些补充物或其它必需补充物的浓度优选地是各自为0到0.1g/l，最好各自为0到0.05g/l。因此，例如在亮氨酸-营养缺陷型赖氨酸分泌菌中，在连续加料的培养基中选择糖/亮氨酸比率，以便通过添加亮氨酸限制生物量的形成，但同时所提供的糖数量仅仅是在给定的亮氨酸浓度下可被转化之糖的一部分。
在活跃生长期后，可利用之糖的浓度较好为0到＜3g/l，最好为0到1g/l。
就任何所需的补充物或碳源来说，在发酵液中的浓度为0g/l并不意味着不连续提供这些物质。它意味着这些化合物是以立刻被细菌培养物摄取的量提供的。按照本发明的方法完成上述发酵与上述的常规方法相比有许多很重要的优点，即：
1.可以直接影响并没有因供料速度而延缓代谢活性和由此导致的培养物需氧量及热释放改变，且适应于发酵罐的能力。
2.由整体地干物质的较高产物含量和较高的纯度区别发酵液。通过在整个供料期间，给细菌培养物提供比它所能转化的量较少的底物来阻制因副产品形成而造成的损耗，因而碳源构成了初级限制。
3.发酵的产率比主要由添加方式限制的发酵高。
4.在监测产物的过程中，在最佳或平稳期，可直接地并且没有任何延迟地停止发酵，并且在全部时间内的粗产率等于净产率。
5.在完成包括经蒸发而直接浓缩发酵液的方案中，发酵罐中的内含物可以在出现技术故障的情况下直接继续加工，而不会因高残余糖含量损坏产品的质量。
下列实施例记载根据本发明之方法的可能的实施方案。
实施例1（比较实施例）
把5.1kg含下列成分的无菌溶液引在带搅拌器和通气系统的发酵罐中：
水    4540g
糖蜜    26g
葡萄糖    125g
谷物谷蛋白水解物（用硫酸水解）    35g
生产菌生物量的水解物（用硫酸水解）    320g
硫酸铵    45g
磷酸（85%）    7g
硫酸镁    3g
其它无机盐，微量元素和生物素及硫胺素。用铵溶液把溶液的pH调至7.3。在33到35℃，把带遗传标记leu-，恶溶菌素抗性和氨乙基抗性的0.6l谷氨酸棒杆菌DM346-1的接种物加到上述溶液中。经33℃，pH7，在搅拌和通气条件下在培养基上培养15小时制备接种物，所述培养基含4.4%（质量）糖蜜，另外还有2%蔗糖以及14%大豆粉水解物（用硫酸水解），附加的还有3%硫酸铵，0.05%磷酸和0.02%硫酸镁以及维生素，生物素和硫胺素。
伴随强烈搅拌，通风以及用氨水溶液把pH调到7.3，将用氨水溶液中和的下列培养基在对数生长期结束后的32小时之内按常规方法连续加到主发酵罐中，以使在发酵液中可测量的糖浓度为5到35g/l（以蔗糖和葡萄糖为基础的酶法测定）：
水    1250g
糖蜜    94g
葡萄糖    1456g
玉米谷蛋白水解物（用硫酸水解）    39g
生产菌生物量的水解物（用硫酸水解）    265g
硫酸铵    31g
磷酸（85%）    4g
硫酸镁    2g
其它无机盐，微量元素和生物素及硫胺素。
在发酵结束时，当用完发酵培养基中的所有可同化糖时，糖转化成赖氨酸的转化率是35%，按LysxHCl计算，并且，没有生物量的浓缩发酵液中的赖氨酸基本含量是45%。
实施例2
制备接种物，把培养基引入主发酵罐并且使用与实施例1相似的培养条件。
培养基2也有除下列改变外的同样组成：
水    1560g
糖蜜    25g
葡萄糖    1170g
在本实验中，以与实施例1中同样的速度加入供料培养基。对以可同化糖为基础的进展所作分析表明，与本发明在本文中所说的一致，在整个供料期间，可测量的可同化糖的浓度保持在3g/l，并几乎总是保持低于1g/l。使用氨基酸分析仪，以发酵液中的亮氨酸为基础的分析表明，在培养基1中提供的亮氨酸量用完后，供料期间亮氨酸的浓度没有大于0.05g/l的点。
发酵结束后，糖转化成赖氨酸的转化率（按LysxHCl计算）为40%，并且，无生物量之浓缩发酵液的赖氨酸基本含量为54%。
实施例3
把含下列组分的3980kg无菌培养基引入10m3的反应容器中：
蔗糖    320kg
糖蜜    20kg
玉米谷蛋白水解物    230kg
25%含水硫酸铵    150kg
柠檬酸·H2O 2.3kg
磷酸（89%）    6.6kg
MgSO4·7H2O 2.8kg
CaCl2·2H2O 75g
FeSO4·H2O 113g
MnSO4·H2O 113g
ZnSO4·7H2O 5.6g
CuSO4·5H2O 0.6g
生物素    1.1g
硫胺素·HCl    0.8g
NH4OH（2-3%） 1010kg
水    2258kg
pH：7.0
在33℃搅拌反应器的内含物并充分通气。把250l携带遗传标记亮氨酸营养缺陷型和氨乙基半胱氨酸抗性的菌株DM282-2的接种物（在含6%糖蜜，14%大豆粉水解物，1%硫酸铵和0.1%磷酸的培养基中，于30℃，pH7条件下培养16小时后）转移到10m3的反应器中，加入氨水使pH保持在7.0，并调整通气速度以使氧含量总是15%以上的饱和度。
在培养物生长到约为30的光密度（535nm）后，以30l/h的速度加入有下列组成的生产培养基：
蔗糖    940kg
糖蜜    50kg
玉米谷蛋白水解物    180kg
25%含水硫酸铵    80kg
柠檬酸·H2O 1kg
磷酸（89%）    2.8kg
MgSO4·7H2O 1.2kg
FeSO4·H2O 48g
MnSO4·H2O 48g
ZnSO4·7H2O 2.4g
CuSO4·5H2O 0.3g
生物素    0.6g
硫胺素·HCl    0.4g
NH4OH（25%） 80kg
水    740kg
pH：7.5
生产期间pH保持在7.3。根据本发明的描述，生长培养基中提供的糖用完后，供料期间可同化糖的浓度不超过1g/l，可测定的亮氨酸浓度低于0.05g/l。在发酵结束时，糖转化成赖氨酸（以Lys·HCl的形式）的转化率是32.3%，不含生物量的浓缩发酵液不的赖氨酸含量是54.7%。
实施例4（比较实施例）
制备接种物，方法参数，以及生长期和生产期的培养基与在实施例3中说明的条件相一致，但在这种情况下以大约100l/h的速度完成供料。结果，在生长培养基中提供的糖用完后，供料期间可测量的可同化糖浓度明显高于5g/l，但亮氨酸浓度保持低于0.05g/l。在发酵结束时，糖转化成赖氨酸（以Lys·HCl计算）的转化率是30.9%，且不含生物量的发酵液中赖氨酸基本含量为43.5%。
实施例5（比较实施例）
除了在生长培养基中用25g/l的蔗糖代替葡萄糖，在生产培养基中用564g/l的蔗糖代替葡萄糖外，培养生长以及生产所用的培养基均与实施例1所述者相似。包括制备接种物在内的培养参数也完全相同。把0.82kg（0.8l）无菌培养基引入一配有搅拌器和通气装置的小发酵罐中。在33到35℃向该溶液中加入1.1l的谷氨酸棒杆菌DSM5717的接种物。当光密度达到约30（535nm）时，在24小时内连续加入533g（430ml）的生产培养基。
供料期间，发酵培养基中可测量的糖含量总是大于5g/l，且在生长培养基中提供的糖用完后，亮氨酸含量总是低于0.05g/l。发酵结束时，在培养基中检测到作为Lys·HCl的赖氨酸为74g，在蔗糖总输入量为275g的情况下，相应的转化率是27%。总干生物量的赖氨酸含量是30.5%。
实施例6
在另一实验中也使用DSM5715菌株，其中所有培养基和培养条件的参数与实施例5的相同，在39小时内连续加入生产培养基。与本发明所述的一致，生长培养基中提供的碳源和亮氨酸用完后，在供料期间，实际的蔗糖浓度低于1g/l且亮氨酸浓度低于0.05g/l。在发酵结束时，在培养基中检测到89g赖氨酸（以Lys·HCl的形式），且转化率为32%。在全部干物质中赖氨酸含量为36.3%。

Claims (5)

1、一种发酵制备氨基酸的方法，其中，在营养培养基中培养生产一种或多种氨基酸的短杆菌属和棒状杆菌属菌株，并在发酵结束时，从培养液中分离氨基酸，其特征在于在活跃生长期后，细菌培养物可以得到比基于该菌株之结构可以被其代谢的较小量碳源，并在营养培养基中提供一定量的其他必要添加物。
2、根据权利要求1的方法，其特征在于活跃生长期后，碳源的浓度是从0到＜3g/l。
3、根据权利要求1和2的方法，其特征在于，使用营养缺陷型细菌菌株并且在一些多菌株营养缺陷情况下，至少加入一种有机化合物，在活跃生长期后，把其浓度限制到0到0.1g/l。
4、根据权利要求1到3之任一项的方法，其特征在于使用生产L-赖氨酸和/或L-苏氨酸的菌株。
5、根据权利要求4的方法，其特征在于使用谷氨酸棒状杆菌的亮氨酸营养缺陷型菌株。
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