KR100254023B1 - 발효에 의한 아미노산의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 박테리아의 배양이 급격한 성장단계 후, 자양 배지에 제공되는 균주의 구조 및 다른 필수 보충물의 양을 기준으로 할 때, 물질대사할 수 잇는 양보다 적은 양의 이용가능한 동화할 수 잇는 탄소 공급원이 세균 배양에 사용됨을 특징으로 하여, 1개 이상의 아미노산을 생성하는 브레비박테리움(Brevibacterium)속 또는 코리네박테리움(Corynebacterium)속의 균주를 자양 배지에서 배양하고 아미노산(들)을 발효의 마지막에 배양액으로부터 분리시키는, 발효에 의한 아미노산의 제조방법에 관한 것이다.

Description

발효에 의한 아미노산의 제조 방법
본 발명은 L-리신 또는 L-트리오닌과 같은 아미노산을 발효에 의해 제조하는 개선된 방법에 관한 것이다. L-리신은 필수 아미노산이고 동물 사료 보충물로서 대량으로 사용한다.
일반적으로 많은 아미노산은 생합성으로 생산되며 이 방법은 당해 기술분야에 오래전부터 공지되어 왔다. 아미노산을 생산하는 세균성 균주는 단시간 내에 배양 배지로 당해 아미노산들을 고농도로 분비하는 능력을 특징으로 한다. 일반적으로 피드 배치식(feed batch) 공급 공정은 기질의 높은 초기농도를 방지하기 위해 수행된다. 사용되는 생산 균주의 물질 대사 능력이 매우 높기 때문에, 최대 산소 요구량 및 최대 열 방출량이 경제적으로 허용되는 정도의 양이 될 수 있는 방식으로 발효 공정을 수행하는 것이 결정적으로 중요하다. 따라서, 유기체의 물질 대사 활성을 조절하여 확실하게 산소의 공급과 열의 제거를 확실하게 하는 것과 동시에 바이오매스(biomass) 형성과 생성물 형성의 분포를 균형잡기 위한 각종 방법이 이용된다.
간헐적 공급 공정이 문헌[참조: CSFR-PS 제212 558호]에 기술되어 있는데, 이에 따르면 증식 단계 동안 물질 대사 활성은 pH의 변화에 의해 조절되고 바이오 매스 총량은 α-아미노니트로겐에 의해 조정된다. 문헌[참조: SU-PS 제157 059호]에는, 트레오닌의 농도가 공급 기준이 되고 감소된 화합물의 비가 3 내지 5%로 유지되는 간헐적 공급 공정이 기재되어 있다. 매우 정확하게 조절된 공정이 문헌[참조: FR-PS 제8303487호]에 기재되어 있다. 당해 공정에서는, 2개의 공급 용액을 연속적으로 가한다: 즉, 물질 대사의 세기 및 바이오매스의 형성 모두가 보충물의 첨가 속도에 의해 제한되는 속도로 가해지는 류신 포스페이트 용액 및 실제 슈가의 농도가 5 내지 15g/ℓ로 유지되는 속도로 공급되는 제2공급 용액인 슈가 용액. 이는, 공급 단계 동안 류신/포스페이트 보충물에 의한 제한으로 인해, 배양물이 모든 시점에서 배양 배지에서 이용 가능한 것보다 더 적은 양의 슈가를 사용한다는 것을 보여준다. 당해 과정은 C-제한 및 C-초과는 피해야 한다고 반복 보고되는 견해(예: DD-PS 제269 167호)와 일치한다. 문헌[참조: Hadj Sassi et al in "Biotechn. Letters, Volume 10, No. 8, pages 583-586 (1988)"]은 상기 목적을 위해 90 내지 140g/ℓ의 글루코스를 제안하고 있따. 따라서, 물질대사 활성은 항상 C의 공급원보다는 다른 요인에 의해 조절한다.
본 발명의 목적은, 사용되는 탄소 공급원(슈가)의 전환율이 보다 높고 고농도의 아미노산이 바이오매스를 함유하지 않는 건조 매스중에 수득되는, 발효에 의한 아미노산의 제조 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명은 왕성한 증식 단계후(생성 단계 동안), 세균 배양물이, 영양 배지에 제공되는 균주의 구조 및 다른 필수 보충물의 양을 기준으로 하여 물질 대사할 수 있는 양보다 적은 양의 이용가능한 탄소 공급원을 함유함을 특징으로 하여, 1개 이상의 아미노산을 생산하는 브레비박테리움(Brevibacterium)속 또는 코리네박테리움(Corynebacteriun)속의 균주를 영양 배지에서 배양하고 아미노산(들)을 발효의 말기에 배양액으로부터 분리시키는, 발효에 의한 아미노산의 제조 방법에 관한 것이다. 발효(영양) 배지는 통상적인 조성과 다르다. 당해 배지는 동화할 수 있는 슈가, 사카로스, 글루코스, 당밀 또는 전분 가수분해물 및 암모늄 이온과 같은 탄소 공급원을 함유하는 이외에, 자가 영양 생산체의 경우, α-아미노니트로겐의 공급원으로서, 단백질 가수분해물, 비타민 및 무기염과 같은, 1개 이상의 영양 요구 변이 주로 인해 필요한 유기 보충물의 공급원으로서의 복합 성분을 함유한다. 발효 초기의 왕성한 증식은 일반적으로 대수 증식 단계이다. 이 단계는 필요한 경우 보충물 및/또는 탄소의 공급원을 제한하여 단축시킬 수 있다.
이와 같은 단계 후에 세포 증식이 뒤따르지만 당해 증식 정도는 왕성한 증식 단계중 소 부분으로 한정된다. 바람직하게는 L-리신 및/또는 L-트리오닌을 생성하는 균주를 사용한다. 발효 배지의 온도는 25 내지 40℃, 바람직하게는 30 내지 36℃이고, pH는 6 내지 8, 바람직하게는 7 내지 7.5이며, 암모늄 농도는 0.5 내지 8g/ℓ가 되도록 선택한다. 발효액을 교반하여 산소를 충분히 공급한다. 슈가의 물질 대사는 특히 아미노산-영양 요구성 리신 분비체의 경우, 첨가되는 아미노산의 양에 의해 조절될 수 있다. 증식 단계후 당해 보충물 또는 다른 필요 보충물의 농도는 유리하게 각각 0 내지 0.1g/ℓ, 특히 각각 0 내지 0.05g/ℓ이다. 따라서, 예를들면, 류신-영양 요구성 리신 분비체에 있어서, 연속적으로 첨가되는 공급 배지중의 슈가/류신의 비는, 바이오매스의 형성이 류신의 공급에 의해 제한되지만 이와 동시에 제공되는 슈가의 양은 단지 류신의 지정 농도에서 전환될 수 있는 이의 분획이도록 선택된다.
왕성한 증식 단계 후 사용할 수 있는 슈가의 농도는 유리하게 0 내지 3g/ℓ 미만, 특히 0 내지 1g/ℓ이다.
필요한 임의의 보충물 또는 탄소 공급원에 대해, 발효액중 0g/ℓ의 농도는 이들 물질들이 연속적으로 공급되지 않음을 의미하는 것이 아니다. 이것은 이들 화합물이 세균 배양물에 의해 즉시 섭취되는 양으로 공급되는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 방법에 의해 수행되는 발효는 상기 통상적인 방법에 비해 매우 중요한 다수의 잇점을 갖는다. 즉:
1. 물질 대사 활성 및 이에 따른 산소 요구량 및 배양 열의 방출은 공급물의 공급 속도에 의해 즉시 지체없이 영향받을 수 있고 발효기의 용량에 맞춰 조정될 수 있다.
2. 발효액은 전체 건조 매스의 높은 생성물 함량 및 이에 따른 보다 우수한 순도를 특징으로 한다. 부산물의 형성에 의한 손실은, 전체 공급 기간에 걸쳐 세균 배양물에 전환될 수 있는 것보다 더 적은 기질이 제공되어 탄소 공급원이 주요한 제한점을 구성함으로써 방지된다.
3. 발효는 보충물에 의해 일차적으로 제한되는 발효 보다 수율이 더 높다.
4. 생성물을 모니터링하는 방법에 있어서, 발효는 즉시 지체없이 최적에서 또는 고평부에서 중단될 수 있고 총수율은 모든 시점에서 순수율과 동일하다.
5. 증발에 의한 발효액의 직접적인 농축을 포함하는 후처리 프로젝트에 있어서, 발효가 내용물은 기술적 고장이 나는 경우, 생성물의 질이 고함량의 잔류 슈가에 의해 손상됨 없이 즉시 후처리에 사용될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명에 따른 방법의 가능한 실시양태이다.
[실시예]
[실시예 1 (비교 실시예)]
하기 성분을 함유하는 멸균 용액 5.1㎏을 교반기 및 통기 시스템이 장착된 발효 용기에 도입한다:
용액은 암모니아 용액을 사용하여 pH 7.3으로 조정한다. 유전 마커 leu-, 옥살리신 내성 및 아미노에틸 내성을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) DM 346-1의 종균 0.6ℓ를 33 내지 35℃에서 상기 용액에 가한다. 종균은, 3% 황산암모늄, 0.05% 인산 및 0.02% 황산마그네슘 및 비타민, 바이오틴 및 티아민을 첨가하면서 2% 수크로스 및 14% 콩가루 가수분해물(황산으로 가수분해) 이외에 4.4매스% 당밀을 함유하는 배지에서 교반 및 통기시키면서 15시간 동안 33℃, pH 7에서 배양시켜 제조된 것이다.
격렬하게 교반하고, 통기시키고 암모니아 수용액으로 pH를 약 7.3으로 조절하면서 암모니아 수용액으로 중화시킨 하기 배지를, 주발효기에서의 대수 증식 단계의 종결 후 32시간 이내에 통상적인 방법으로 연속해서 가하여 발효액중의 측정 가능한 슈가의 농도가 5 내지 35g/ℓ (수크로스 및 글루코스를 기준으로 하는 효소적 측정)가 되도록 한다:
발효 말기에, 발효 배지중의 모든 동화성 슈가가 소모된 경우, LysxHCl로 측정된, 리신으로 전환된 슈가의 농도는 35%였고, 바이오매스를 함유하지 않은 농축된 발효 용액의 리신 기본 함량은 45%였다.
[실시예 2]
종균 제조, 주발효기에 도입되는 배지 및 배양 조건은 실시예 1과 유사하다. 또한 배지 2는 하기 성분의 변화를 제외하고는 동일한 조성을 갖는다.
당해 실험에 있어서, 공급 배지를 실시예 1과 동일한 비로 가한다. 동화성 슈가를 기본으로 하여 과정을 분석한 결과, 본원에서 청구된 본 발명에 따른 방법에 따라, 측정가능한 동화성 슈가의 농도가 전체 공급시간 동안 3g/ℓ로 유지되고 거의 항상 1g/ℓ 미만으로 유지되는 것으로 나타났다. 아미노산 분석기를 사용하여 발효액중 류신을 기본으로 하여 분석한 결과, 배지 1에 공급된 류신이 전량 소모된 후, 공급 시간 동안 류신의 농도는 0.05g/ℓ 이하인 것으로 나타났다.
발효의 종결 후, 리신으로 전환된 슈가의 농도(LysxHCl로 측정)는 40%였고 바이오매스를 함유하지 않은 발효액의 리신 기본 함량은 54%였다.
[실시예 3]
10㎥의 반응기에 하기 조성의 멸균 배지 3980㎏을 도입한다 :
반응기 내용물을 33℃에서 교반한 다음 격렬하게 통풍시킨다. 유전 마커 류신 영양 요구성 및 아미노에틸시스테인 내성이 있는 균주 DM 282-2의 종균(16시간 동안 pH 7 및 30℃에서 6% 당밀, 14% 콩가루 가수분해물, 1% 황산암모늄 및 0.1% 인산을 함유하는 배지중에서 배양) 250ℓ를 10㎣의 반응기로 이동시킨 후, 수성 암모니아를 사용하여 pH를 7.0으로 유지하고 용해되지 않은 산소 함량은 항상 15% 이상의 포화량이 되도록 통기 속도를 조정한다.
배양물이 약 30의 흡광도(535㎚)로 증식된 후, 하기 조성을 갖는 생산 배지를 30ℓ/시간으로 가한다:
생산 단계 동안 pH는 7.3으로 유지한다. 본원에서 청구된 본 발명에 따라, 증식 배지에 제공된 슈가가 소모된 후 공급 단계 동안 동화성 슈가의 농도는 1g/ℓ를 초과하지 않았고, 측정가능한 류신의 농도는 0.05g/ℓ 미만이었다. 발효 말기에 리신(Lys.HCl의 형태)으로의 슈가의 전환율은 32.3%였고 바이오매스를 함유하지 않은 농축된 발효액의 리신 기본 함량 54.7%였다.
[실시예 4 (비교 실시예)]
종균을 제조하기 위한, 증식 단계와 생산 단계에서의 공정 파라미터 및 배지는 실시예 3에 제시된 조건에 상응하고, 공급 속도는 약 100ℓ/시간으로 수행한다. 그 결과, 증식 배지에 제공된 슈가가 소모된 후 공급 기간 중에 동화성 슈가의 농도는 독특하게 항상 5g/ℓ 이상이었지만, 잔류된 류신의 농도는 0.05g/ℓ 미만이었다. 발효 말기에 슈가의 리신 (Lys.HCl로 계산)으로의 전환율은 30.9%였고 바이오매스를 함유하지 않는 발효액의 리신 기본 함량은 43.5%였다.
[실시예 5 (비교 실시예)]
배양, 증식 및 생산을 위한 배지는, 증식 배지중의 글루코스를 사카로스 25g/ℓ로 대체하고 생산 배지중의 글루코스를 사카로스 564g/ℓ로 대체하는 것을 제외하고는 실시예 1의 배지의 조성과 유사하다. 또한 종균의 제조에 포함되는 배양 파라미터는 동일하다. 멸균 증식 배지 0.82㎏(0.8ℓ)을 교반기 및 통기 수단이 장착된 소형 발효기에 도입한다. 이 용액에 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM 5717의 종균 1.1ℓ를 33 내지 35℃에서 가한다. 흡광도가 약 30(535㎚)에 도달한 경우, 생산 배지 533g(430㎖)을 24시간 이내에 연속해서 가한다.
공급 시간 동안, 발효 배지중의 측정가능한 슈가의 함량은 항상 5g/ℓ 이상이었고 증식 배지에 제공된 양을 소모한 후의 류신 함량은 항상 0.05g/ℓ 미만이었다. 발효 말기에, 74g의 리신이 Lys.HCl 로서 배지중에서 검출되었으며, 이 경우 사카로스 275g의 전체 도입량에 대한 전환율은 27%에 상응한다. 전체 건조 바이오매스중의 리신 함량은 30.5%였다.
[실시예 6]
1991년 7월 4일자로 공개된 독일연방공화국 특허원 제P39 43 117.7호에 기재된 균주 DSM 5715를 사용하는 또 다른 실험에 있어서, 배지 및 배양의 모든 파라미터는 실시예 5와 동일하고, 생산 배지를 39시간 이내에 연속적으로 공급한다. 본원에서 청구된 방법에 따라, 증식 배지에 제공된 C 및 류신의 공급원이 소모된 후 공급 기간 동안 사카로스의 실농도는 1g/ℓ 미만이었고 류신 농도는 0.05g/ℓ 미만이었다. 발효 말기에, 89g의 리신(Lysin.HCl의 형태로) 배지중에서 검출되었고, 전환율은 32%였다. 전체 건조 매스중의 리신 기본 함량은 36.3%였다.

Claims (5)

  1. 리신을 생산하는 브레비박테리움(Brevibacterium)속 또는 코리네 박테리움(Corynebacterium) 속의 균주를 대수 증식시킨후, 이러한 세균 배양물이 균주의 구조 및 영양 배지에 제공되는 다른 필수 보충물의 양을 기준으로 하여 균주가 물질 대사할 수 있는 양보다 적은 양인 0 내지 3g/ℓ 미만의 이용가능한 동화성 탄소 공급원을 함유함을 특징으로 하여, 상기 균주를 영양 배지에서 배양하고 발효 말기에 리신을 배양액으로부터 분리시키는, 발효에 의한 리신의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 영양 요구성의 세균성 균주를 사용하고, 단일 또는 다수의 영양 요구로 인해 첨가되는 1개 이상의 유기 화합물이 대수 증식 단계 후, 0 내지 0.1g/ℓ농도로 제한됨을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, L-리신 또는 L-리신과 L-트레오닌을 생산하는 균주가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 류신-영양 요구성 균주가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 바이오매스의 형성이 류신의 공급에 의해 제한됨을 특징으로 하는 방법.
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