CZ263392A3 - Process for preparing amino acids by fermentation - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu fermentační výroby aminokyselin, jako je například L-lysin nebo L-threonin. L-lysin je esenciální aminokyselina a ve velkém rozsahu se jí používá jako přísady do krmiv.

Dosavadní stav techniky

Rada aminokyselin se obvykle vyrábí biosyntetickým postupem, který je dlouhou dobu známý z dosavadního stavu techniky. Bakteriální kmeny používané jako produkční mikro organismy se vyznačují schopností vylučovat tyto aminokyseliny v krátké době a ve vysoké koncentraci do kultivačního media. Aby nebylo nutno používat vysoké počáteční koncentrace substrátu používá se zpravidla postupu Fed-Batch (dávkování vsázky).

Díky velmi vysoké kapacitě látkové výměny použitých r produkčních kmenů má rozhodující význam vést fermentační proces tak, aby maximální hodnota potřeby kyslíku a vývoje tepla vykazovala řádově velikost, která je hospodárná.

Byly proto používány různé strategie umožňující řídit metabolickou aktivitu mikroorganismů tak, aby bylo možno zajistit na jedné straně zásobování kyslíkem a odvádění tepla a na druhé straně aby bylo vyvážené rozdělení tvorby a biomasy produktu.

Z CS patentového spisu č. 212 558 je znám způsob diskontinuálního přikrmování, při němž se metabolická aktivita v růstové fázi nastavuje změnami pH a celkový obsah biomasy regulací alfa-aminického dusíku.

V SU - patentovém spise Č. 1 157 059 je popsán způsob diskontinuálního přikrmování, při němž slouží koncentrace threoninu jako kriterium pro přikrmování a při němž se obsah redukující sloučeniny udržuje na 3 až 5 %.

Velmi dobře vyladěný postup je znám z FR - patentového spisu č. 8 303 487. Při tomto postupu se používá dvou kontinuálně přidávaných násadových roztoků : roztoku leucin/fosfát, který se dávkuje tak, že se dodávkou přísady omezuje nejen intenzita látkové výměny, nýbrž také tvorba biomasy; a roztoku cukru, který se dávkuje tak, aby se okamžitá koncentrace cukru udržovala na hodnotě v rozmezí od 5 do 15 g/1.

Z toho je zřejmé, že v důsledku omezení přísadou leucin/fosfát v průběhu fáze přikrmování se v každém okamžiku spotřebuje méně cukru, než je v kultivačním médiu k dispozici. Tento výrobní postup je v souladu s několikrát dokumentovaným názorem, že je třeba se vyhnout jak omezení uhlíku tak silnému přebytku uhlíku (například DĎ - patentový spis 269 167) .

Hadj Sassi a další, Biotechn. Letters, sv. 10, č. 8,str. 583 až 586 (1988) k tomu navrhují dokonce použití glukózy v koncentraci 90 až 140 g/1. Metabolická aktivita se tedy vždy reguluje hodnotou jiné veličiny, než je zdroj uhlíku.

Úkolem vynálezu je vyvinout způsob fermentační výroby aminokyselin, který by probíhal s vyšším stupněm konverze nasazovaného zdroje uhlíku (cukru) a při němž by se docilovalo v suché hmotě, zbavené biomasy, vyšší koncentrace aminokyselin.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je způsob fermentační výroby aminokyselin, při němž se kultivuje kmen rodu Brevibacterium nebo Cory.nebacterium, produkující jednu nebo více aminokyselin, v živném prostředí a na konci fermentace se z kultivační kapaliny izoluje aminokyselina nebo aminokyseliny, jehož podstata spočívá v tom že bakteriální kultura má v návaznosti na fázi silného růstu, t.j. v produkční fázi, k dispozici méně využitelného zdroje uhlíku než, by mohla v důsledku konstrukce kmene a množství jinak potřebných přísad, přítomných v živném prostředí, metabolizovat.

Fermentační (živné) médium má jinak obecné známé složení. Vedle zdroje uhlíku, jako jsou asimilovatelné cukry, sacharoza, glukóza, melasa nebo škrobové hydrolyzáty a amonných iontů obsahuje u auxotrofních producentů komplexní složky, jakožto zdroj organických přísad, jichž je zapotřebí v důsledku jedné nebo více auxotrofií. Těmito složkami jsou například proteinové hydrolyzáty, jako zdroj alfa-aminokyselin, vitaminy a anorganické soli. Při silném růstu na počátku fermentace dochází zpravidla k logaritmickému růstu. Logaritmickou růstovou fázi je možno podle potřeby zkrátit omezením přísad a/nebo zdroje uhlíku.

I v návaznosti na tuto fázi dochází k růstu buněk. Jeho rozsah činí však jen nepatrný zlomek růstu probíhajícího ve fázi, která je označována termínem fáze rychlého růstu.

Přednostně se používá kmenů, které produkují L-lysin a/nebo L-threonin.

Fermentační prostředí se volí tak, aby teplota ležela v rozmezí od 25 d.o 40 °C přednostně od 30 do 36 °C, hodnota pH v rozmezí od 6 do 8, přednostně od 7 do 7,5 a koncentrace amonných iontů v rozmezí od 0,5 do 8 g/1. Suspenze se míchá a dostatečně zásobuje kyslíkem. Ze jména u producentů lysinu auxotrofních vůči aminokyselinám je možno metabolizaci.cukru řídit množstvím přidávané aminokyseliny. Její koncentrace, případně koncentrace jiných potřebných přísad je po růstové fázi s výhodou v rozmezí od 0 do 0,1 g/1, zejména od 0 do 0,05 g/1.

Tak například u produkčního mikroorganismu produkujícího lysin,který je auxotrofní vůči leucinu se volí poměr cukru k leucinu v kontinuálně přidávaném přikrmovacím médiu tak, aby se tvorba biomasy limitovala zásobováním leucinem, ale zároveň se dodává jenom zlomek cukru, který by mohl být při dané koncentraci leucinu konvergován.

Koncentrace využitelných cukrů po fázi silného růstu činí s výhodou 0 až méně než 3 g/1, zejména však 0 až 1 g/1.

Koncentrace 0 g/1 ve fermentačním médiu neznamená však ani ve vztahu k případné potřebným doplňkovým přísadám, ani ve vztahu ke zdroji uhlíku, že by se tyto látky kontinuálně nepřiváděly. Znamená to spíše, že se tyto sloučeniny přivádějí v množství, která jsou bakteriálními kulturami bezprotředně spotřebována.

Fermentační postup podle vynálezu vykazuje řadu rozhodujících výhod oproti běžným postupům, které byly uvedeny výše:

1) Metabolická aktivita a tím i potřeba kyslíku a vývoj tepla v kultuře mohou být ovlivňovány přímo a bez průtahů rychlostí dávkování přikrmovacího média a mohou být přizpůsobeny kapacitě fermentoru.

2) Fermentační suspenze obsahuje větší množství produktu v celkové sušině a má tedy vyšší čistotu . Tím, že bakeriální kultura má po celý časový úsek, v němž se provádí přikrmování k dispozici méně substrátu, než by mohla konvergovat, dochází k tomu, že zdroj uhlíku představuje hlavní omezení. Tím se zabraňuje konverzi na vedlejší produkty.

3) Oproti průběhu fermentace, při níž se hlavní ome zování provádí prostřednictvím doplňkových přísad, vykazuje fermentace podle vynálezu vyšší výtěžky.

4) Při monitorování produktu se může fermentace přímo a bez doběhu přerušit v optimální fázi, t.j. v oblasti plato; hrubý výtěžek přitom v každém časovém okamžiku odpovídá čistému výtěžku.

5) Při zpracování fermentačního produktu, které se pro vádí přímým odpařením vzniklé suspenze, se může při technických poruchách obsah fermentoru přímo vést na zpracování, aniž by došlo ke zhoršení kvality produktu vysokým zbytkovým obsahem cukru.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a v žádném ohledu neomezují rozsah vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 (srovnávací)

Do fermentační nádoby, která je vybavena míchadlem a provzdušňovacím systémem se předloží 5,1 kg sterilního roztoku obsahujícího následující složky.

voda		4 540
melasa		26
glukóza		125
hydrolyžovaný kukuřičný lepek (pomocí kyseliny sírové) ’* -	' *	35
hydrolyzát produkované biomasy (pomocí kyseliny sírové)		320

síran amonný 45 g kyselina fosforečná 85% 7 g síran hořečnatý 3 g další minerální soli, stopové látky, jakož i biotin a thiamin

Hodnota pH směsi se přídavkem roztoku amoniaku nastaví na 7,3. Ke vzniklému roztoku se při teplotě 33 až 35 °C přidá 0,6 1 očkovací kultury Corynebacterium glutamicum DM 346-1, která nese genetický markér leu , který je oxalysinrezistentní a aminoethylrezistentní. Očkovací kultura se připraví 15-ti hodinovou inkubací při 33 °C a pH Ί za míchání a provzdušňování v médiu obsahujícím 4,4 % hmotnostního melasy, přídavně 2 % sacharózy a dále 14 % hydrolyzované sojové mouky (pomocí kyseliny sírové), za přísady 3 % síranu amonného, 0,05 % kyseliny fosforečné a 0,02 % síranu hořečnatého, jakož i vitaminů biotinu a thiaminu.

Po skončení logaritmické růstové fáze v hlavním fermentoru se za dostatečného míchání, provzdušňování a upravování hodnoty pH na přibližně 7,3 pomocí vodného roztoku amoniaku obvyklým způsobem po dobu 32 hodin kontiunálně přidává následující médium , které je neutralizováno vodným roztokem amoniaku tak, aby měřitelná koncentrace cukru ve fermentační suspenzi ležela v rozmezí od 5 do 35 g/1 (podle enzymatického stanovení na sachorózu a glukózu):

voda 1 250 g melasa 94 g glukóza 1 465 g hydrolyzovaný kukuřičný lepek (pomocí kyseliny sírové) 39 g hydrolyzát produkované biomasy (pomocí kyseliny sírové) 265 g síran amonný kyselina fosforečná 85% síran hořečnatý další minerální soli, stopové látky, jakož i biotin a thiamin.

g 4 g 2 g

Na konci fermentace, po spotřebování celého množství asimilovatelného cukru ve fermentačním médiu činí stupeň konverze cukru na lysin přibližně 35 %, počítáno jako hydrochlorid lysinu. Obsah lysinové báze v odpařeném fermentačním roztoku ,zbaveném biomasy, je přibližně 45 %.

Příklad 2

Příprava inokula, složení média v hlavním fermentoru a kultivační podmínky jsou stejné jako v příkladu 1. Také médium 2 je tvořeno stejnými složkami, s výjimkou následujících modifikací.

voda 1 560 g melasa 75 g glukóza 1 170 g

Při tomto pokusu se přikrmovací médium přivádí stejnou rychlostí dávkování jako v příkladu 1. Průběžné analýzy na asimilovatelný cukr ukazují, že je.vsouladu se znaky tohoto vynálezu po celou dobu přikrmování udrž ována měřitelná koncentrace asimilovatelných cukrů nižší'než 3 g/1, dokonce téměř výlučně nižší než 1 g/1 . Analýzy na leucin ve fermentační suspenzi, které se provádějí pomocí analyzátoru aminokyselin, ukazují, že v průběhu přikrmování není po spotřebování leucinu, který byl předložen v médiu 1, v žádném okamžiku koncentrace leucinu vyšší než 0,05 g/1.

Na konci fermentace činí stupeň konverze cukru na lysin (počítáno jako hydrochlorid lysinu) 40 %. Obsah lysinové báze v odpařeném fermentačním roztoku, který byl zbaven biomasy, je přibližně 54 %.

Příklad3

Do reaktoru o objemu 10 m^ se předloží 3 980 kg sterilního média, které má následující složení:

sacharoza	320	kg
melasa	20	kg
hydrolyzovaný kukuřičný škrob	230	kg
25% vodný síran amonný	150	kg
monohydrát kyseliny citrónové	2,3	kg
kyselina fosforečná 89%	6,6	kg
síran hořečnatý - heptahydrát	2,8	kg
chlorid vápenatý - dihydrát	75	g
síran železnatý - monohydrát	113	g
síran manganatý - monohydrát	113	g
síran zinečnatý - heptahydrát	5,6	g
síran mednatý - pentahydrát	0,6	g
biotin	1,1	g
thiaminhydrochlorid	0,8	g
hydroxid amonný (2 až 3%)	1 010	kg
voda	2 258	kg

pH : 7,0

Obsah reaktoru se michá při 33 °C a dostatečně provzduš ňuje. Po přidání 250 1 inokula kmene DM 282-2, který nese leucinauxotrofní a aminoethylcysteinrezistentní genetický markér (po 16 hodinách inkubace v médiu se 6 % melasy, % hydrolyzátu sojové mouky, 1 % síranu amonného a 0,1 % kyseliny fosforečné, při pH 7 a 30 °C) do reaktoru o objemu 10 ir2 se hodnota pH udržuje přidáváním vodného amoniaku na 7,0 a provzdušňování se nastaví tak, aby obsah rozpuštěného kyslíku byl vždy vyšší než odpovídá 15% nasycení.

Když kultura naroste na optickou hustotu (při 535 nm) přibližně 30’, přidává se produkční médium následujího složení rychlostí 30 1/h: “ “

sacharóza	940	kg
melasa	50	kg
hydrolyžovaný kukuřičný lepek	180	kg
25% vodný síran amonný	80	kg
kyselina citrónová - monohydrát	1	kg
kyselina fosforečná 89%	2,8	kg
síran hořečnatý - heptahydrát	1,2	kg
síran železnátý - monohydrát	48	g
síran manganatý - monohydrát	48	g
síran zinečnatý - heptahydrát	2,4	g
síran mědnatý - pentahydrát	0,3	g
biotin	0,6	g
thiaminhydrochlorid	0,4	g
hydroxid amonný 25%	80	kg
voda	740	kg

ph : 7,5

V průběhu produkční fáze se hodnota pH udržuje na 7,3. Po spotřebování cukru předloženého do růstového média se 'ik v souladu s charakteristikou tohoto vynálezu v průběhu fáze přikrmování udržuje koncentrace asimilovatelného cukru na hodnotě nižší než 1 g/1, přičemž měřitelná koncentrace lučinu je nižší než 0,05 g/1.

Po skončení fermentace činí stupeň konverze cukru na lysin (počítáno jako hydrochlorid lysinu) přibližně 32,3 %. Obsah lysinové báze v odpařeném fermentačním roztoku, který se získá oddělením biomasy, je 54,7 %.

Příklad 4 (srovnávací)

Výroba inokula, parametry postupu a média použitá v růstové fázi a v produkční vádzi jsou stejná jako v příkladu 3. Rychlost dávkování ve fázi přikrmování je přibližně 100 1/h . Tím se dosáhne, že po spotřebování cukru, přítomného v předloženém růstovém médiu je měřitelná koncentrace asimilovatelného cukru v průběhu doby přikrmování vždy výrazně nižší než 5 g/1. Měřitelná koncentrace leucinu však zůstává na hodnotě nižší než 0,05 g/1. Stupeň konverze cukru na lysin (vztaženo na hydrochorid lysinu je na konci fermentace přibližně 30,9 %). Obsah lysinové báze v roztoku získaném po oddělení biomasy je 43,5 %.

Příklad 5 (srovnávací)

Média pro výrobu inokula, pro růstovou fázi a pro produkční fázi mají stejné složení jako média použitá v příkladu 1 , s tím rozdílem, že se glukóza nahradí v růstovém médiu sacharózou v množství 25 g/1 a v produkčním médiu sacharózou v množství 564 g/1. Podmínky inkubace, včetně přípravy inokula, jsou rovněž stejné. V malém fermentoru s míchadlem a zavzduš11 ňováním se předloží 0,82 kg (0,8 1) sterilního růstového média.

K tomuto roztoku se při teplotě 33 až 35 °C přidá . 0,11 očkovací kultury Corynebacterium Glutamicum DSM 5715.

v Po dosažení optické hustoty přibližně 30 (535 nm) se v průběhu 24 hodin kontinuálně přidává produkční médium (celkem 533 g, t.j. 430 ml).

Během fáze přikrmování leží měřitelnýobsah cukru ve fermentačním médiu vždy pod 5 g/1 a obsah leucinu je po spotřebování leucinu předloženého v růstovém prostředí vždy nižší než 0,05 g/1.

Na konci fermentace se v médiu zjistí 74 g lysinu (vyjádřeno jako hydrochlorid lysinu) , což při celkové násadě sacharózy 275 g odpovídá stupni konverze 27 %. Obsah lysinu v celkové sušině je přibližně 30,5 %.

Příklad 6 ^u · Opakuje se pokus s kmenem DSM 5715, přičemž všechna * média a všechny parametry inkubace jsou shodné s podmínkami uvedenými v přikladu 5. Produkční médium se v tomto případě kontinuálně dávkuje po dobu 39 hodin.

V souladu s charakteristikou tohoto vynálezu je v průběhu doby přikrmování, po spotřebování zdroje uhlíku a zdroje leucinu, které byly předloženy v růstovém prostředí, okamžitá koncentrace sacharózy vždy nižší než 1 g/1 a okamžitá koncentrace leucinu vždy nižší než 0,05 g/1.

Na konci fermentace je v médiu obsaženo 89 g lysinu (vyjádřeno jako hydrochlorid lysinu), což odpovídá stupni konverze 32 %. Obsah lysinové báze v celkové sušině činí

Claims (5)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob fermentační výroby aminokyselin, při němž se kultivuje kmen rodu Brevibacterium nebo Corynebacterium, | produkující jednu nebo více aminokyselin v živném prostře- ’ dí a na konci fermentace se z kultivační kapaliny izoluje aminokyselina nebo aminokyseliny, vyznačuj ící se t í m, že bakteriální kultura má po fázi silného růstu k dispozici méně využitelného zdroje uhlíku, než by mohla v důsledku konstrukce kmene a množství jiných potřebných doplňkových přísad,: které jsou přítomny v živném prostředí, metabolizovat.
2. 2. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že po fázi silného růstu je koncentrace zdroje uhlíku v rozmezí od 0 do méně než 3 g/1.
3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se t í m, že se používá auxotrofních kmenů bakterií a koncentrace alespoň jedné organické látky, která se přidává v důsledku popřípadě vícenásobné auxotrofie kmene, se po fázi silného růstu udržuje na hodnotě omezené na rozmezí 0 až ¹

   0,1 g/1. ' *
4. 4. Způsob podle některého z nároků 1 až 3, vyznáčující se tí m, že se používá kmene produkujícího L-lysin a/nebo L-threonin.
5. 5. Způsob podle nároku 4,vyznačuj ící se tím, že se používá leucin-auxotrofního kmene Corynebacterium glutamicum.