RU2099423C1 - Способ получения лимонной кислоты - Google Patents

Abstract

Использование: изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения лимонной кислоты. Сущность изобретения: способ предусматривает выращивание продуцента Aspergillus niger и проведение ферментации в присутствии кристаллического пищевого сахара или сахара-сырца. Возможно введение кристаллического пищевого сахара или сахара-сырца через сутки от начала ферментации. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

Description

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к технологии получения пищевых органических кислот, в частности лимонной кислоты, ферментацией углеводсодержащего сырья погруженной культурой плесневого гриба Aspergillus niger.

Целью изобретения является интенсификация процесса получения лимонной кислоты и улучшение экологии производства за счет использования наряду с традиционным сырьем мелассой сахарсодержащего сырья, не требующего обработки гексацианоферроатом калия и нивелирующего ингибирующее действие компонентов мелассы, что позволяет поднять продуктивность процесса по лимонной кислоте, усилить конверсию сахаров и сократить отходы производства.

Известен способ получения лимонной кислоты из кристаллического сахара, применяемого в качестве основного сырья, в период становления производства лимонной кислоты в России [1, 2] Для роста и кислотообразования гриба A. niger шт. 82 (Д) служила среда А₄, в литре которой содержалось 2,5 г нитрата аммония, 0,16 г дигидроортофосфата калия, 0,25 г сульфата магния, гидрата, 140 150 г сахара. Среда подкислялась соляной кислотой до pH 3 - 3,2. Конверсия сахара в лимонную кислоту на такой среде достигала 52% при длительности ферментации 6,5 сут. Низкий выход кислоты от сахара следует, по-видимому, отнести за счет малой продуктивности используемого в то время продуцента шт. A. niger 82 (Д).

Следует отметить, что применение в производстве лимонной кислоты в качестве единственного источника углерода кристаллического сахара, несмотря на его высокую эффективность при ферментации новыми селекционированными штаммами, ведет к значительному удорожанию целевого продукта и требует внесения большого количества минеральных компонентов.

Именно эта причина заставила в 60-е годы заменить кристаллический сахар мелассой, являющейся отходом свеклосахарного производства. Описан способ получения лимонной кислоты из свекловичной мелассы с помощью того же продуцента A. niger шт. 82 [3] Данный способ предусматривает использование для приготовления инокулюма мелассного раствора с концентрацией по сахару 30 г/дм³, обработанного гексацианоферроатом калия, с добавками 2,5 г/дм³ нитрата аммония (или соответственное по азоту количество хлорида аммония), 0,16 г/дм³ дигидроортофосфата калия, 0,25 г/дм³ сульфата магния, гидрата и 0,005 г/дм³ сульфата цинка, гидрата, pH среды 6,8 7,0. Для ферментации приготавливали мелассный раствор того же состава, исключив сульфат магния. Для подпитки культуры применяли мелассный раствор с концентрацией по сахару 250 г/дм³, обработанный гексацианоферроатом калия. При ведении процесса этим способом конверсия сахаров в лимонную кислоту не превышала 58,6%
Другой известный способ предлагает обязательную дополнительную обработку мелассы щавелевокислым аммонием до полного осаждения солей кальция с последующей обработкой раствора мелассы при определенном pH гексацианоферроатом калия для освобождения от тяжелых металлов и добавкой минеральных солей [4] Этот способ практически без изменений используется на заводах, выпускающих лимонную кислоту, до настоящего времени и взят в качестве прототипа.

Известен способ получения лимонной кислоты, позволяющий ферментировать мелассные растворы с начальной концентрацией по сахару 85 100 г/дм³, по которому выращивание кислотообразующего мицелия осуществляется в три стадии: на первой используют питательный мелассный субстрат с исходной концентрацией по сахару 25 35 г/дм³, на второй 45 55 г/дм³ и на третьей 65 75 г/дм³. Однако этот способ требует длительной подготовки инокулюма (3 сут.) и дополнительных подпиток культуры в процессе ферментации, что не снижает трудоемкость процесса и повышает возможность его инфицирования [5]
Известен также способ, позволяющий ферментировать мелассную среду с более высокой исходной концентрацией по сахару (до 140 г/дм³) с помощью осмофильного продуцента шт. A. niger Л-4. В этом случае выращивание инокулюма осуществляют в мелассной среде с содержанием сахара 45 60 г/дм³ в течение 24 36 ч. Данный способ требует достаточно высоких концентраций комплексообразователей, в частности гексацианоферроата калия. Кроме того, высокая начальная концентрация мелассы в среде способствует нарастанию большого количества биомассы [6]
Целью изобретения является повышение эффективности процесса биосинтеза лимонной кислоты за счет подпитки культуры в процессе ферментации растворами кристаллического пищевого сахара или сахара-сырца, что позволяет свести к минимуму негативное действие ингибиторов, содержащихся в мелассе, значительно сократить расход минеральных солей и комплексообразователей, в частности гексацианоферроата калия, снизить трудоемкость процесса и сократить расход электроэнергии, воды и пара. Предлагаемый способ позволяет довести конверсию сахаров в лимонную кислоту до 88,7% и на 25 35% повысить продуктивность процесса по лимонной кислоте.

Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами.

Пример 1. Выращивание инокулюма и ферментацию осуществляли в лабораторных условиях на качалке с числом качаний 160±5 мин^-1 в колбах емкостью 700 см³ при 32±1^oC. Выращивание инокулюма производили путем засева 50 см³ питательной среды гомогенной суспензией конидий гриба A. niger ВКПМ F-326 из расчета 0,001 г конидий на 1 см³. Длительность выращивания инокулюма составляет 24 ч.

Для приготовления сред использовали свекловичную мелассу, содержащую, г/100 г: сахар 48,0, кальций в пересчете на CaO 1,3, pH 6,2.

Для выращивания посевного мицелия приготавливали мелассный раствор следующего состава, г/дм³:
Меласса 65,0
Оксалат аммония, гидрат 1,9
Сульфат магния, гидрат 0,25
Дигидроортофосфат калия 0,16
Вода водопроводная До 1 дм³
pH 6,1 6,2
Для ферментации применяли мелассную среду по рецептуре, приведенной выше, исключив сульфат магния и добавив сульфат цинка, 7-водный (0,005 г/дм³). 50 см³ ферментационной среды засевали 10 см³ инокулюма. Длительность ферментации 5 сут. В процессе ферментации проводили подпитку культуры в два приема: первую через 24 ч ферментации, добавляя в культуральную среду 10 см³ раствора I (см. ниже), вторую через 6 ч после первой подпитки раствором II в количестве 9 см³ (табл. 1, пример 1).

Состав среды для подпитки культуры, г/дм³:
I раствор (прототип):
Свекловичная меласса 520,0
Гексацианоферроат калия, гидрат 1,73
Вода водопроводная До 1 дм³
pH 6,5
II раствор:
Кристаллический пищевой сахар 250,0
Вода водопроводная До 1 дм³
pH 7,2
В качестве контроля (прототип) служил существующий способ ведения процесса, согласно которому выращивание инокулюма и ферментацию вели, как описано выше [4] Отличие от предлагаемого способа состояло в том, что на первую и вторую подпитки использовали мелассный раствор (1), приготовленный согласно вышеприведенной рецептуре, но с добавлением в мелассные среды для ферментации и подпитки гексацианоферроата в количестве 0,3 г на 100 г мелассы.

Результаты, представленные в табл. 1, показывают, что замена части мелассного раствора при подпитке культуры на сахарный позволяет за тот же период времени получить на 15,1% больше лимонной кислоты по массе при увеличении на 9,2% конверсии сахаров в лимонную кислоту за счет снижения на 12,2% затрат на синтез биомассы. Одновременно снижается расход гексацианоферроата калия.

Пример 2. Условия проведения процесса те же, что в примере 1 (табл. 1). Отличие состоит в том, что подпитка культуры проводится однократно сахарным раствором II. Результаты, представленные в табл. 1, показывают, что при таком способе ведения процесса значительно возрастает синтез лимонной кислоты. За процесс с колбы получено на 41,9% больше лимонной кислоты по сравнению с прототипом, конверсия сахаров в лимонную кислоту возросла на 25,4% и на 28,2% сократился синтез биомассы. Кроме того, из состава среды также, как и в примере 1, исключается гексацианоферроат калия, что позволяет получать мицелий без цианидов, т. е. пригодный на корм скоту. Одноразовая подпитка культуры, во-первых, сокращает трудозатраты, а, во-вторых, снижает возможность инфицирования процесса.

Пример 3. Условия проведения процесса те же, что в примере 2. Отличие состоит в том, что для подпитки вместо раствора пищевого сахара использовали раствор сахара-сырца в той же концентрации.

Результаты, представленные в табл. 1, показывают, что при таком ведении процесса синтез лимонной кислоты несколько снижается по сравнению с примером 2, но значительно увеличивается по сравнению с прототипом и примером 1 (табл. 1). В условиях данного примера за цикл синтезируется на 36,9% больше лимонной кислоты, конверсия сахаров в лимонную кислоту возрастает на 22,3% по сравнению с прототипом.

Следует считать использование сахара-сырца вместо мелассы для подпитки культуры целесообразным, т.к. сохраняя все преимущества примера 2, прибавляется фактор более низкой его рыночной цены, что скажется на стоимости готового продукта.

Пример 4. Процесс вели, как описано выше в примере 1, но на всех стадиях в качестве сахарсодержащего сырья использовали тростниковую мелассу. Образец используемой Индийской тростниковой мелассы имел следующую характеристику, г/100 г: содержание ферментируемого сахара 37,6, кальция в пересчете на CaO 1,3, pH 5,2.

Для выращивания посевного мицелия приготавливали мелассный раствор по следующей рецептуре, г/дм³:
Тростниковая меласса 81,0
Оксалат аммония, гидрат 2,65
Трилон Б 0,0245
Гексацианоферроат калия, гидрат 0,45
Дигидроортофосфат калия 0,08
Сульфат цинка, 7-водный 0,005
Вода водопроводная До 1 дм³
pH 6,8
Для ферментации приготавливали мелассную среду по рецептуре, приведенной выше, исключив дигидроортофосфат калия.

Состав среды для подпитки культуры, г/дм³:
Тростниковая меласса 540,0
Гексацианоферроат калия, гидрат 2,7
Вода водопроводная До 1 дм³
pH 5,3
Результаты, приведенные в табл. 1 (пример 4), показывают, что при использовании тростниковой мелассы возрастает синтез биомассы гриба, и снижается массовая доля лимонной кислоты в сумме синтезируемых кислот. Так, если при использовании свекловичной мелассы (прототип) массовая доля лимонной кислоты составляла 88,4% то при применении тростниковой 69,6% остальное - глюконовая. В результате общая масса лимонной кислоты и конверсия сахаров в лимонную кислоту по сравнению с прототипом снизились на 39,2 и 23,6% соответственно.

Пример 5. Условия проведения процесса те же, что в опыте 4. Отличие состоит в том, что на второй подлив использовали сахарный раствор II (рецептура в примере 1). Результаты табл. 1 показывают, что использование на подлив сахарного раствора вместо мелассного позволяет интенсифицировать процесс, улучшить состав синтезируемых кислот, повысить до 46,7% конверсию сахаров в лимонную кислоту, получить за цикл на 16,5% больше лимонной кислоты по сравнению с результатами примера 4.

Пример 6. Условия проведения процесса, как в примере 5. Отличие состоит в том, что подпитка культуры проводилась в один прием и только сахарным раствором II (рецепт в примере 1).

При таких условиях ведения процесса за счет значительного разбавления ферментируемого мелассного раствора сахарным без добавления минеральных солей снижается концентрация ростовых веществ, с одной стороны, и комплекс ингибиторов, с другой, что позволяет получить результаты, близкие к тем, которые достигаются при ферментации свекловичной мелассы (табл. 1, прототип).

Пример 7. Условия проведения процесса, как в примере 6. Отличие состоит в том, что вместо пищевого сахара для подпитки применяется раствор сахара-сырца той же концентрации.

Результаты опыта, представленные в табл. 1, показывают, что в условиях примера 7 процесс идет несколько менее активно, чем при использовании пищевого сахара (табл. 1, пример 6), однако значительно активнее, чем при использовании на всех стадиях только тростниковой мелассы (табл. 1, пример 4) или при подпитках тростниковой мелассой и кристаллическим сахаром (табл. 1, пример 5).

Пример 8. Выращивание инокулюма и ферментацию сахарсодержащих сред в лимонную кислоту осуществляют методом погруженной культуры в производственных условиях. Для выращивания инокулюма, ферментации и на подпитку приготавливали мелассные и сахарные растворы по рецептам примера 1.

Инокулюм выращивали в посевных ферментаторах емкостью 5 м³. Объем мелассной среды 3 м³, длительность выращивания 24 ч. Инокулюм переводили в ферментатор емкостью 50 м³ с 27 м³ мелассного раствора. Через 24 ч ферментации проводили основную подпитку культуры, вводя одноразово 10,6 м³ раствора кристаллического сахара. С подпиткой введено 2650 кг сахара.

На 5-е и 6-е сут. процесса проводили отъем сферментированного раствора по 4,5 м³ и в таком же количестве вводили мелассный раствор для подпитки культуры. Процесс закончили через 7,3 сут. За контроль принят цикл, проведенный по технологии прототипа, согласно которому через 24 ч ферментации проводили подпитку мелассным раствором, содержащим 225 г/дм³ сахара, по одному кубометру через каждые 1,5 ч. В итоге с первой, основной подпиткой внесено 2225 кг сахара.

Результаты испытаний, представленные в табл. 2, показывают, что использование на основную подпитку пищевого сахара позволяет повысить удельную продуктивность процесса по сравнению с прототипом на 40,6% а конверсию сахаров на 17,9% Массовая доля лимонной кислоты в составе синтезируемых кислот возросла на 11,3% (абсолютных). Цикл удлиняется на 0,4 сут.

При предлагаемом способе значительно сокращаются трудоемкость процесса и вероятность инфицирования, уменьшается более чем в 2 раза расход гексацианоферроата калия, исключается использование питательных солей при приготовлении сахарного раствора для подпитки, сокращается расход пара, воды и электроэнергии.

Пример 9. Условия проведения опыта те же, что в примере 8 (табл. 2). Отличие состоит в том, что подпитку культуры проводят однакратно, вводя через 24 ч ферментации 11,0 м³ раствора кристаллического сахара без последующих доливов сахарсодержащих растворов. В условиях данного опыта длительность цикла составила 6 сут. Удельная продуктивность процесса по сравнению с прототипом повысилась на 48,8% а конверсия сахаров в лимонную кислоту на 13,6% Массовая доля лимонной кислоты в составе синтезируемых кислот возросла на 6,7% (табл. 2). При таком способе ведения процесса полностью исключено использование гексацианоферроата калия.

Пример 10. Условия проведения опыта, как в примере 9 (табл. 2). Отличие состояло в том, что на второй стадии процесса применили ферментационную среду, состоящую из смеси мелассного раствора для ферментации и сахарного (II), т.е. введя в ферментатор весь сахар, затрачиваемый на процесс, исключив полностью подпитки. Общий расход сахаров, затраченных на процесс, такой же, как в примере 9, и составил 4072 кг. Техника подготовки ферментационной среды заключалась в следующем. Сначала приготавливали мелассную среду и переводили ее в ферментатор, затем подготавливали раствор пищевого сахара и добавляли его к мелассному раствору. Приготовленную таким образом ферментационную среду засевали инокулюмом, как в примерах 8, 9.

Результаты опыта не уступали результатам примера 9, но в условиях предлагаемого примера, как упомянуто выше, исключены подпитки культуры, что снижало трудоемкость и возможность инфицирования процесса с подливами посторонней микрофлорой.

Таким образом, проведенные лабораторные и производственные испытания показывают, что предлагаемый способ эффективен при применении как традиционного сырья свекловичной мелассы, так и тростниковой мелассы, при использовании которой в настоящее время не удавалось получить технико-экономические показатели, сравнимые с достигнутыми при использовании свекловичной мелассы.

Применение предлагаемой технологии позволяет увеличить удельную продуктивность процесса, повысить конверсию сахаров в лимонную кислоту, сократить расход комплексообразователей и минеральных компонентов, уменьшить трудоемкость процесса и вероятность его инфицирования посторонней микрофлорой, сократить отходы производства и вредные выбросы при варке сред, а также расход воды, пара и электроэнергии.

Источники информации
1. Журавский Г. И. Глубинный способ производства лимонной кислоты при помощи гриба Aspergillus niger. Микробиология, 1955, т. 24, вып. 3, с. 281 - 291.

2. Журавский Г. И. Шкопоров А.Н. Краснощеков Д.П. и др. Получение лимонной кислоты глубинным способом брожения в производственных условиях. Пищевые кислоты: Труды ВНИИ кондит. промышленности. М. Пищепромиздат, 1958, с. 4 19.

3. SU, авторское свидетельство, 153707, кл. C 12 P 7/48, 1963.

4. SU, авторское свидетельство, 242091, кл. C 12 P 7/48, 1969.

5. SU, авторское свидетельство, 659609, кл. C 12 P 7/48, 1979.

6. SU, авторское свидетельство, 1221241, кл. C 12 P 7/48, опубл. 1986.

Claims (2)

1. Способ получения лимонной кислоты, предусматривающий выращивание продуцента Aspergillus niger и проведение ферментации на мелассной среде до накопления целевого продукта, отличающийся тем, что ферментацию проводят в присутствии кристаллического пищевого сахара или сахара-сырца.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что кристаллический пищевой сахар или сахар-сырец вводят однократно через сутки от начала ферментации в виде раствора с концентрацией 250 г/дм³, взятого в количестве из расчета от всей необходимой для ферментации массы сахара, и процесс ведут в течение 4 5 суток.

Images