JP2833037B2 - グルタチオン高含有酵母の製造方法 - Google Patents

グルタチオン高含有酵母の製造方法

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JP2833037B2 JP1212402A JP21240289A JP2833037B2 JP 2833037 B2 JP2833037 B2 JP 2833037B2 JP 1212402 A JP1212402 A JP 1212402A JP 21240289 A JP21240289 A JP 21240289A JP 2833037 B2 JP2833037 B2 JP 2833037B2
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【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明は、サッカロミセス属に属するグルタチオン生
産性酵母を培養してグルタチオン高含有酵母を製造する
ために、培養前段においては酵母増殖に適当な量の微量
のZnイオン、Feイオン及びCuイオンを含有する培地で培
養し(酵母増殖工程)、培養後段においては該微量金属
イオンを含有しないか菌体増殖に適当な量以下で含有す
る培地をフィードして更に培養を継続する(グルタチオ
ン生成工程)ことを特徴とする方法、に関する。
(従来の技術) 一般に、グルタチオン(GSH)は酵母や動物の肝臓な
どに広く分布しており、生体内での酸化還元反応に関与
しているトリペプチド(γ−グルタミルシスティニルグ
ルシン)で、肝機能回復作用や解毒作用などの重要な役
割を示す医療中極めて有用な物質であり、又、最近の研
究によればグルタチオンの添加によりコク味の増強され
た調味料や食品を製造することができ(特開昭60−9465
号)、食品のおいしさに寄与する有用な物質でもある。
このような作用を有するグルタチオンの工業的製造法
としては、合成法及びパン酵母、ビール酵母などの酵母
菌体からの抽出法が採用されている。しかして、合成法
によるときはDL−グルタチオンが生成する為生理的に有
用なL−体の精製に複雑な工程を要する。一方、酵母菌
体からの抽出法によるときは、所望のL−体のみが得ら
れる特徴を有する。
従来、経済的、技術的観点からより高含量のグルタチ
オンを含有する酵母の工業的製法が種々検討されてい
る。例えば、培養温度の制御(特開昭60−156,389
号)、エタノールの副生の制御、アミノ酸類の添加(特
開昭48−44,487号、特開昭52−10,480号、特開昭52−1
0,481号)変異株の採取(特開昭52−125,687号、特開昭
59−151,894号)、乳酸、乳酸菌の添加(特開昭60−24
4,284号)、抗生物質の添加(特開昭48−40,987号)、
酸素の供給(特公昭53−30,796号)等である。更に、ハ
ンゼヌラ属微生物の亜鉛イオン含量の制御下での培養
(特公昭52−8,397号)により、グルタチオン高含有酵
母を安価に効率よく製造しようとする試みがなされてい
るが、この方法では、工業的には、培地由来の亜鉛イオ
ン含量が一定でない為に当該イオンの制御が難しく、グ
ルタチオンの安定的な製造が困難である。
なおまた、サッカロミセス属に属する酵母を使用し
て、同じく培地の微量金属イオンすなわち亜鉛イオン、
鉄イオン及び銅イオンに着目し、これらを適当に制御す
ることによりグルタチオン高含有酵母菌体を工業的に有
利に製造することを目的とした方法(特開昭64−34,279
号)も知られているが、この方法によってもなおそのよ
うな目的が充分に達成されるとは云い難い。因みに、こ
の公開公報に記載の実施例の中で、培養槽の単位容積
(100ml)当り、最大グルタチオン量、最大菌体量(こ
こに、菌体量は乾燥菌体量(DCW)である)及び菌体の
最大グルタチオン含有率(GSH/DCW×100%)を与えるの
は、いずれも実施例2で、それぞれの最大量は16.6mg、
1.17g及び1.4%である。
(発明が解決しようとする問題点) 本発明は、従来の酵母エキスにおけるグルタチオン含
有量が低い点を解決し、グルタチオン含量の高い酵母エ
キスが得られる酵母菌体を発酵工業的に効率的に製造す
ることを目的とする。
(問題点を解決するための手段) 上記問題点を解決するべく本発明者は鋭意研究の結
果、酵母の増殖及び菌体内グルタチオン生成のいずれに
も微量金属イオンが著しい影響を及ぼし、ある量的範囲
内にある微量金属イオンに関しては、一般にその量が多
くなるに従い、酵母の増殖速度が高まり菌体増殖には有
利であるが、菌体内グルタチオン生成が阻害されるこ
と、換言すれば、酵母の増殖の場合と菌体内グルタチオ
ン生成の場合とでは微量金属イオンの至適量が異なって
いて、増殖のための至適量がグルタチオン生成のための
至適量より大なることを見い出し、この知見に基いて本
発明を完成した。すなわち、本発明は、サッカロミセス
属に属するグルタチオン生産性酵母を微量金属イオンで
あるZnイオン、Feイオン及びCuイオンより選ばれる2種
以上の金属イオン菌体増殖に適当な量で含有する培地で
培養し(酵母増殖工程)、ついで該微量金属イオンを含
有しないか菌体増殖に適当な量以下で含有する培地をフ
ィードして更に培養を継続する(グルタチオン生成工
程)ことを特徴とするグルタチオン高含有酵母の製造法
に関する。
以下、本発明の方法について詳細に説明する。
本発明で使用する酵母は、サッカロミセス属に属する
グルタチオン生産性酵母であれば良く、例えばサッカロ
ミセス・セレビシエFERM−P1859(AJ4005)、CBC1523、
FERM−P5705(AJ14502)、CBS1172等をパン酵母、サッ
カロミセス・セレビシエCBS1771、CBS1230等のビール酵
母またはサッカロミセス・ルキシイCBS4632等の酵母やZ
nイオン耐性変異株(特願平1−115,295号)を挙げるこ
とができる。
培養条件は、後述する微量金属イオンに関する以外
は、グルタチオン生産性酵母の培養に用いられる培養条
件でよい。
すなわち、培地については、通常の炭素源、窒素源お
よび当該酵母の必要とする無機並びに有機栄養素を含有
する培地を用いればよい。具体的には、用いられる炭素
源としては、例えば、グルコース、フラクトース、澱粉
加水分解物、糖密等の糖質、グリセロール、エタノール
等のアルコール、酢酸、クエン酸、α−ケトグルタール
酸等の有機酸また菌株によっては炭化水素を用いてもよ
く、窒素源としては、例えば、塩安、燐安、尿素硫安等
の無機窒素源、大豆酸加水分解物、C.S.L.(コーン・ス
チープ・リカー)、カザミノ酸、ペプトン、肉エキス、
酵母エキス、麦芽エキス等の有機窒素源を用いることが
でき、無機栄養素としては、例えば、燐酸塩、硫酸塩、
マグネシウム塩、カリウム塩、鉄塩、マンガン塩を用い
ることができ、そして有機栄養素としては、例えば、ビ
タミンB1、ビオチン等のビタミン類を用いることができ
る。
培養は、pH3〜8、好ましくは4〜7の範囲で、温度
は18〜40℃、好ましくは25〜35℃の範囲で行なわれる。
これらのpH及び温度範囲は酵母の増殖及びグルタチオン
生成の観点から定められる。培養中にpHが例えば炭素源
質化に伴う副生有機酸生成等のために上記範囲を外れる
ときは、アンモニアガス等を使用して所定のpH範囲内に
戻す。
さて、微量金属イオンについて説明すれば、酵母の増
殖及び菌体内におけるグルタチオンの生成に著しい影響
を及ぼす微量金属イオンは前述のようにZnイオン、Feイ
オン及びCuイオンであるが、Znイオンは例えば硫酸亜
鉛、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、乳酸亜鉛、燐酸亜鉛、ステア
リン酸亜鉛の形で培地に加えられ、Feイオンは例えば塩
化鉄、硝酸鉄、硫酸鉄、燐酸鉄の形で加えられ、Cuイオ
ンは例えば塩化銅、硝酸銅、硫酸銅、燐酸銅の形で加え
られる。
菌体増殖に適当な微量金属イオンの種類は、次の実験
から裏付けられる。
実験例1 3%のグルコース、0.03%のCaCl2・2H2O、1.5ml/dl
の「味液」(味の素(株)製の大豆蛋白加水分解液)、
0.15%のKH2PO4、0.1%のNa2SO4、0.4%の尿素(別
殺)、0.05%のMgSO4・7H2O及び0.05ppmのビオチンの組
成を有する培地(pH5.0)を基礎培地とし、これに第1
表に示すように金属イオンの種類を種々に変えて添加し
た培地にリフレッシュした酵母菌体(サッカロミセス・
セレビシエFERM−P1859(AJ4005))を接種し、30℃で4
0時間振とう培養した後遠心分離により菌体を得た。菌
体洗浄後、その菌体に等容量の水を加え懸濁し精秤し
た。この懸濁液を用いて乾燥減量法(105℃、4時間)
にて乾燥菌体量(DCW(g))を求めた。又、この懸濁
液に更に等量の水を加えて撹拌混合後、70℃で10分加熱
してグルタチオンを抽出した。この抽出液を前処理した
後液体クロマト分析(NAM法)によりグルタチオン量(G
SH(mg))を求めた。
この実験結果を第1表に示す。
第1表において、添加金属イオン量が0の場合でも、
「味液」に由来するZnイオン、Feイオン及びCuイオン
が、それぞれ、0.009ppm、0.005ppm及び0.001ppm含有さ
れている。
第1表から、3種の金属イオンがそれぞれ単独では、
3種類の金属イオンより選ばれる2種以上の金属イオン
を併用した場合に較べて、菌体増殖効果が格段に劣るこ
とがわかる。
グルタチオンの菌体内産生に適当な微量金属イオンの
量と菌体増殖に適当な微量金属イオンの量とは異なるこ
とは、次の実験例2から裏付けられる。
実験例2 金属イオンの添加量を種々に変えた以外は実験例1と
同様の実験を行なった。
この実験結果を第2表に示す。
第2表から、金属イオン濃度を高めると菌体量(DC
W)は増加するが、菌体内グルタチオン(GSH/DCW)は減
少し、結局、発酵ブロス単位量(dl)当りのグルタチオ
ン生成量ひいては発酵槽単位容量当りのグルタチオン生
成量が顕著に低下することがわかる。
本発明の実施は、上記のように、微量金属イオンの酵
母増殖に適当な量が菌体内におけるグルタチオン生成に
適当な量より大なることを考慮して、まず、菌体増殖に
適当な量の微量金属イオンを含有する培地で菌体増殖を
行ない、ついで該微量金属イオンを含有しないか又は含
有していても菌体増殖に適当な量以下で含有する培地を
フィードして更に培養を継続し、菌体の更なる増殖とと
もに菌体内でのグルタチオンの生成を図る。
実際に本発明を実施するに際しての金属イオンの添加
量や培地を切換えるべき時点は発酵槽の容量や複数の発
酵槽の活用状況にもよるが、当業者であれば、前記実験
例及び後記実施例のデータをも考慮して、若干の予備実
験により容易に定めうる。
因みに、本発明の方法を理論的に説明すれば、前記微
量金属イオンは菌体内に吸収・保持され、菌体の増殖と
菌体内グルタチオン生成の両者を規制していて、菌体内
金属イオンのレベルが高いほど菌体の増殖が促進される
反面グルタチオンの生成が阻害される。逆に、微量金属
イオンを含有しない培地をフィードして培養を継続する
と菌体内金属イオンのレベルが低くなって菌体の増殖促
進作用が発揮され難くなる反面グルタチオンの生成阻害
が解除されるものと理解される。
培養液からの酵母菌体の分離は、例えば遠心分離など
の常法でよい。
得られたグルタチオン高含有酵母は、酵母エキスの製
造に使用できる他に医薬、食品、機能性食品等に使用で
きる。
更に、酵母菌体からのグルタチオンの単離は、必要に
応じて行なうことができる。グルタチオンの単離は、常
法を用いれば良い。例えば遠心分離により集めた菌体の
グルタチオンを、熱水抽出処理やクロマト処理等を用い
て単離することができる。
(実施例) 以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例1〜5 0.5g/dlのグルコース、0.6g/dlのKH2PH4、0.1g/dlのM
gSO4、0.05g/dlのCaCl2、1.0g/dlの(NH42SO4、5γ/
dlのビオチン、0.05ml/dlの消泡剤、7.5ml/dlの「味
液」の組成の培地(pH5.0)300mlに第3表の各実施例に
示す微量金属イオンを同時に示す量(この量は、「味
液」由来のZnイオン、Feイオン及びCuイオンも含めたも
のである)を添加し、オートクレーブにて120℃で10分
間加熱して減菌した。
このようにして調製した培地(酵母増殖用培地)を1
容の小型ジャーに移し、25℃で3日間YM培地のスラン
ト上でリフレッシュさせた酵母菌体(前出サッカロミセ
ス・セレビシエFERM−P1859)を接種し、通気量1/1VV
M、撹拌700rpm、温度30℃で12時間培養したところで、
減菌したグルタチオン生成用培地(この組成は、前出酵
母増殖用培地で0.5g/dlのグルコースを45g/dl濃度のに
変え、かつ「味液」も金属イオンも加えないもの)を20
0mlフィードして培養を継続した。フィード方法は通常
の流加培養方式によりエタノールの濃度を制後しながら
行った。
培養24時間目と48時間目に発酵ブロスをサンプリング
し、このサンプルを実験例1と同様にして分析した。結
果を第3表に示す。
第3表から、グルタチオンの菌体内生成を阻害する微
量金属イオンの濃度の高い酵母増殖用培地で先ず酵母を
培養してその増殖を図り、ついで微量金属イオンを含ま
ないグルタチオン生成用培地をフィードして培養を継続
すると、菌体は更に増殖すると同時に菌体内グルタチオ
ンの生成量も増大してくることがわかる。かくして、高
菌体かつ高グルタチオンの培養物が得られることがわか
る。
(発明の効果) 本発明によれば、グルタチオン高含有酵母菌体を極め
て効率的に発酵工業的に製造することができ、すなわ
ち、発酵ブロス単位量当りの乾燥菌体量(DCW)が多く
かつ菌体のグルタチオン含有率(GSH/DCW)が高いの
で、両者の積である発酵ブロス単位量当りのグルタチオ
ン生成量が多く、また、得られたグルタチオン高含有酵
母菌体から例えばグルタチオン含量の高い高品質酵母エ
キスやさらにはグルタチオンを有利に抽出製造すること
ができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI C12R 1:865) (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) C12N 1/16 C12P 21/02 WPI(DIALOG) BIOSIS(DIALOG)

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】サッカロミセス属に属するグルタチオン生
    産性酵母を微量金属イオンであるZnイオン、Feイオン及
    びCuイオンより選ばれる2種以上の金属イオン菌体増殖
    に適当な量で含有する培地で培養増殖し、ついで該微量
    金属イオンを含有しないか菌体増殖に適当な量以下で含
    有する培地をフィードして更に培養を継続することを特
    徴とするグルタチオン高含有酵母の製造法。
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