KR102270890B1 - 락토바실러스 플란타룸 균주의 배양을 위한 배지 조성물 및 이를 이용한 gaba의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 글루코스, 효모 추출물 및 MSG의 함량 비율을 최적화함으로써 락토바실러스 플란타룸 균주의 GABA 생산량을 증가시키는 배지 조성물 및 이를 이용한 GABA 생산 방법에 대한 것이다.

Description

락토바실러스 플란타룸 균주의 배양을 위한 배지 조성물 및 이를 이용한 GABA의 생산 방법{COMPOSITION OF CULTURE MEDIUM FOR CULTIVATION OF LACTOBACILLUS PLANTARUM AND METHOD FOR PRODUCING GABA USING THE SAME}

본 발명은 글루코스, 효모 추출물 및 MSG(monosodium glutamate)의 함량 비율을 최적화함으로써 락토바실러스 플란타룸 균주의 GABA 생산량을 증가시키는 배지 조성물 및 이를 이용한 GABA 생산 방법에 관한 것이다.

감마 아미노부티르산(gama amino butyric acid; GABA)은 4-아미노부틸산으로써 L-글루타메이트(L-glutamate) 기질이 탈탄산 반응에 의해 생성되며, 이에 관여하는 효소로는 글루타메이트 디카르복실라제(glutamate decarboxylase; GAD)가 있으며 피리독시드-5'-포스페이트(pyridoxid-5'-phosphate) 의존성 경로로 합성된다. GABA는 단백질에서는 발견이 되지 않는 비단백질성 아미노산으로 뇌나 척수에 존재하는 신경전달물질로 혈류를 개선하며 뇌의 산소공급을 증가시켜 뇌의 대사촉진 및 뇌 기억을 증진시키는 뇌의 영양제로 알려져 있다. GABA는 글루타메이트(glutamate)가 신경을 활성화시키는 것과는 달리 신경활성을 억제하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 기능은 신경세포의 기능과 정보처리에 지대한 영향을 미치게 되는데 특히 감각 뇌에서 방향 민감성, 각도 민감성 반응 등을 결정하며 정교한 운동기능도 조율하는 것으로 알려져 있다. GABA의 뇌혈류 촉진 효과와 산소공급 증가효과는 뇌세포의 대사를 촉진시킴으로써 뇌졸중의 후유증 및 뇌동맥경화증 등에 개선효과가 나타나 의약품으로 사용되고 있다. GABA의 기능성이 알려지면서 의약품으로서 뿐만 아니라 기능성 식품소재로 이용하고자 하는 연구가 많이 시도되고 있으며, 이들 연구들은 현미, 녹차, 맥아, 배추 등에 자연적으로 약간 함유되어 있는 GABA의 함량을 증대시키는 데 집중되어 있다. 그러나 자연계의 식물을 원재료로 한 GABA의 생산에는 한계가 있으므로 대량 생산하기 위해서는 미생물을 이용한 연구가 필요한 실정이다.

대한민국 등록특허 제 10-1679121호

이에 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 글루코스, 효모 추출물 및 MSG의 함량 비율을 최적화함으로써 락토바실러스 플란타룸 균주의 GABA 생산량을 증가시킬 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은, 글루코스, 효모 추출물 및 MSG의 함량 비율이 최적화된 락토바실러스 플란타룸 균주의 배양을 위한 배지 조성물 및 이를 이용한 GABA의 생산 방법을 제공하는 것이다.

전술한 목적을 달성하기 위해 본 발명은 1% (w/v) 글루코스, 10% (w/v) 효모 추출물 및 2.25% (w/v) MSG를 포함하는, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주의 배양을 위한 배지 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 배지 조성물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주를 접종한 후 28 내지 32℃에서 72시간 동안 배양하는 것을 포함하는, GABA(Gamma-amino butyric acid)를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 배지 조성물은 글루코스, 효모 추출물 및 MSG의 함량 비율을 최적화함으로써 종래 배지 조성물에 비해 GABA의 생산량을 현저하게 증가시킬 수 있다. 또한, 배양시 온도 및 시간 등을 최적화시킴으로써, MSG의 80% 이상을 GABA로 전환시킬 수 있어 GABA의 대량 생산을 가능하게 한다.

이상에서의 본 발명에 따른 효과는 상기에 한정되는 것은 아니며, 기타 본 발명의 효과들은 후술할 실시예 및 청구범위에 기재된 사항을 통하여 본 발명이 속하는 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 분명하게 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 배지 조성에 따른 락토바실러스 플란타룸 균주의 생장률(A, B) 및 pH(C, D)을 나타낸 것이다.
도 2는 효모 추출물의 농도에 따른 락토바실러스 플란타룸 균주의 생장률(A) 및 pH(B)를 나타낸 것이다.
도 3은 효모 추출물의 농도에 따른 락토바실러스 플란타룸 균주의 TLC 프로파일을 나타낸 것이다.
도 4는 MSG의 농도에 따른 락토바실러스 플란타룸 균주의 생장률 및 pH를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 배지 조성물에서 배양된 락토바실러스 플란타룸 균주의 GABA 생산량을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명은 다양한 형태로 변경되어 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 구현예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다.

배지는 특정 미생물을 배양하기 위하여 배양대상 즉 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 대상 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.

본 발명은 1% (w/v) 글루코스, 10% (w/v) 효모 추출물 및 2.25% (w/v) MSG를 포함하는, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주의 배양을 위한 배지 조성물에 관한 것이다.

상기 배지 조성물은 글루코스, 효모 추출물 및 MSG의 함량 비율을 최적화하여 락토바실러스 플란타룸 균주의 GABA(Gamma-amino butyric acid) 생산을 증가시킬 수 있다.

상기 락토바실러스 플란타룸 균주는 GABA 생산능이 있는 락토바실러스 플란타룸 균주라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 락토바실러스 플란타룸 EJ2014(KCCM11545P) 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주 배양용 배지 조성물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주를 접종한 후 28 내지 32℃에서 72시간 동안 배양하는 것을 포함하는, GABA(Gamma-amino butyric acid)를 생산하는 방법에 관한 것이다.

상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주는 약 30℃에서 배양될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 락토바실러스 플란타룸 균주는 GABA 생산능이 있는 락토바실러스 플란타룸 균주라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 락토바실러스 플란타룸 EJ2014(KCCM11545P) 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 MSG의 약 70% 이상, 예를 들어, 70 내지 90% 또는 88%가 GABA로 전환되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참고하여 보다 상세하게 설명하도록 한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아닐 것이다.

<실시예 1>

MSG 유무에 따른 락토바실러스 플란타룸 균주의 세포 성장률을 확인하였다.

MRS 배지와 YG 배지(효모 추출물 및 글루코스 함유) 및 각각의 배지에 MSG를 첨가한 배지에 락토바실러스 플란타룸 EJ2014(KCCM11545P)을 배양한 후 세포 성장률과 pH를 확인하였다.

도 1의 A 및 B에서 볼 수 있는 바와 같이, MSG 첨가와 관련 없이 MRS 배지에서 가장 높은 세포 생장률을 보였으며, MSG가 첨가된 YG 배지(효모 추출물 및 글루코스 함유)가 MSG 무첨가 YG 배지에 비해 증가된 세포 성장률을 보임을 확인할 수 있었다.

그러나, YG 배지가 MRS 배지에 비해 낮은 세포 성장률을 보임에도 불구하고, MSG가 첨가된 YG 배지가 MRS 배지에서와 유사한 pH 감소율을 보임을 확인할 수 있었다(도 1의 C 및 D).

<실시예 2>

효모 추출물의 농도에 따른 락토바실러스 플란타룸 균주의 세포 성장률 및 GABA 생산률을 확인하였다.

배지에서 효모 추출물의 양을 10 g/L로 고정하고 글루코스의 양을 효모 추출물의 양에 대하여 1:1, 2, 5, 10, 20으로 증가시켜 락토바실러스 플란타룸 EJ2014을 배양하였다. 그 결과, 글루코스 농도가 증가할수록 락토바실러스 플란타룸 EJ2014의 생장활성이 감소하였으며, pH 감소율 역시 생장 활성과 비례하였다.

그런 다음, 배지에서 글루코스의 양을 10 g/L로 고정하고 효모 추출물의 양을 글루코스 양에 대하여 1:1, 2, 5, 10, 20으로 증가시켜 락토바실러스 플란타룸 EJ2014을 배양하였다. 그 결과, 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 글루코스와 효모 추출물이 1:10의 비율일 때 가장 높은 활성을 보임을 확인할 수 있었다. 또한, 도 3의 TLC 프로파일에서 확인할 수 있는 바와 같이, 글루코스와 효모 추출물이 1:10의 비율일 때 GABA의 생산량도 증가하였다.

<실시예 3>

MSG의 농도에 따른 락토바실러스 플란타룸 EJ2014 균주의 세포 성장률 pH 및 GABA 생산률을 확인하였다.

글루코스와 효모 추출물이 1:10의 비율(글루코스 10 g/L, 효모 추출물 100 g/L)로 함유된 배지에 MSG의 농도를 0.25, 2.25, 5,25 및 8.25%(w/v)로 증가시켰을 때, 2.25%의 MSG가 첨가된 배지에서 높은 세포 생장률, 감소된 pH를 보였으며(도 4), 가장 높은 GABA 생산률을 보임을 확인할 수 있었다(표 1).

<실시예 4>

최적의 배지 조성물에서 락토바실러스 플란타룸 EJ2014 균주의 GABA 생산률을 확인하였다.

최적 배지 조성물(글루코스 10 g/L, 효모 추출물 100 g/L, MSG 2.25 %) 에 락토바실러스 플란타룸 EJ2014 균주를 배양하여 72 시간 동안 GABA 발효를 실시하였다.

그 결과, 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이 최종적으로 약 19.8 g/L의 GABA 가 생산되었으며, MSG에서 GABA로 88%에 해당하는 전환율을 보였다. 이는 기존의 락토바실러스 플란타룸 균주를 이용한 GABA 합성(표 2)과 비교했을 때 가장 많은 양을 합성량을 보이는 것이다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 구체적인 실시예를 상세하게 설명되었으나, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서 다른 구성요소를 추가, 변경, 삭제 등을 통하여, 퇴보적인 다른 발명이나 본 발명 사상의 범위 내에 포함되는 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구의 범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구의 범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (6)

1% (w/v) 글루코스, 10% (w/v) 효모 추출물 및 2.25% (w/v) MSG를 포함하는 배지 조성물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) EJ2014(KCCM11545P) 균주를 접종한 후 28 내지 32℃에서 72시간 동안 배양하는 단계를 포함하고,
상기 MSG는 70 내지 90%가 GABA로 전환되는 것을 특징으로 하는, GABA(Gamma-amino butyric acid)를 생산하는 방법.

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

Images