JP2013208074A - ５−アミノレブリン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】微生物の活性を向上させる方法を提供し、微生物を用いた生産の効率を向上させること。
【解決手段】（Ａ）酵母エキス、乾燥酵母、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、魚粉、カザミノ酸、ＣＳＬ及びＰＤＢから選ばれる１種以上と、（Ｂ）植物蛋白質加水分解物とを含有した培地において、５−アミノレブリン酸生産菌を培養することを特徴とする、５−アミノレブリン酸の製造方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、５−アミノレブリン酸生産菌を培養し、５−アミノレブリン酸を高収率で製造する方法に関する。

５−アミノレブリン酸は、テトラピロール化合物（ビタミンＢ１２、ヘム、クロロフィルなど）を生合成する色素生合成経路の代謝中間体として広く生物圈に存在し、生体内で重要な役割を果たしている化合物である。すなわち、５−アミノレブリン酸は生体系中で、グリシンとスクシニルＣｏＡから５−アミノレブリン酸合成酵素によって、もしくはグルタミン酸からグルタミルｔＲＮＡを経て生合成され、５−アミノレブリン酸デヒドラターゼにより代謝されていくものである。

また、５−アミノレブリン酸は、除草剤、殺虫剤、植物成長調節剤、植物の光合成増強剤として優れた効果を示す天然化合物である（特許文献１、特許文献２）。

しかし、５−アミノレブリン酸は、生産コストが高いため、多くの化学合成法が検討されている（例えば特許文献３、特許文献４）が、未だ十分満足できる方法が開発されていない。

一方、微生物を用いた５−アミノレブリン酸の製造方法も検討されている。例えばプロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属又はメタノサルチナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）属等を用いる方法（特許文献５等）が提案されているが、生産量が非常に少なく、工業的には満足できるものではなかった。

また、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属を用いる方法（特許文献６）は、上記の微生物を用いる方法に比べ生産量が多いが、ロドバクター属を含む光合成細菌の著量な色素合成には光照射が必要であり、色素の前駆体である５−アミノレブリン酸の生産においても十分な光を照射しなければならず、コストがかかる等実用化にはなお多くの課題を残していた。

この問題を解決するため、ロドバクター属細菌を変異し、変異株を作製し、光照射を必要としない従属栄養条件下で５−アミノレブリン酸を製造する方法も提案されているが（特許文献７）、その生産量は光照射を用いる方法に比べ少ないものであった。

一方、光照射を必要としない従属栄養条件下での微生物培養において、酸素はエネルギー産生のため必要不可欠なものである。

しかしながら、酸素は光合成細菌、特に紅色非硫黄細菌の色素合成を阻害し、更に５−アミノレブリン酸合成酵素も酸素によって不活性化されるといわれている（非特許文献１）。

そこで、好気条件下で、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属の培養を行うことができ、かつ光の照射、非照射にかかわらず、５−アミノレブリン酸を高収率で産生する酸素制限条件が見出されている（特許文献８）。さらに、その酸素制限条件が緩和した条件下で５−アミノレブリン酸を生産する株を用いた生産方法も見出された（特許文献９）。

特開昭６１−５０２８１４号公報 特開平２−１３８２０１号公報 特開平２−７６８４１号公報 特開平２−２６１３８９号公報 特開平５−１８４３７６号公報 特開平６−１４１８７５号公報 特開平６−１５３９１５号公報 特開平８−１６８３９１号公報 特開平１１−４２０８３号公報

蛋白質、核酸、酵素、Ｖｏｌ．１５，Ｎｏ．３、１９５（１９７０）

このように、５−アミノレブリン酸の種々の製造方法が検討されているが、更なる収率の向上が望まれている。本発明は、５−アミノレブリン酸生産微生物を用いて、５−アミノレブリン酸を高収率で製造する方法を提供することを目的とする。

かかる実状において、本発明者らは、５−アミノレブリン酸生産菌の培養条件、特に培地成分について種々研究を重ねた結果、酵母エキス等の通常の栄養成分に加えて植物蛋白質加水分解物を含有する培地で５−アミノレブリン酸生産菌を培養することにより、５−アミノレブリン酸をこれまでの製造法よりも高収率で製造できることを確認し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、酵母エキス、乾燥酵母、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、魚粉、カザミノ酸、ＣＳＬ及びＰＤＢから選ばれる１種以上と、植物蛋白質加水分解物とを含有した培地において、５−アミノレブリン酸生産菌を培養することを特徴とする、５−アミノレブリン酸の製造方法を提供するものである。

本発明の製造方法によれば、５−アミノレブリン酸生産菌を、特定の培地において培養することにより、５−アミノレブリン酸を高収率で製造することができるため、製造効率が大幅に向上し、５−アミノレブリン酸の製造コストを低減することができる。

植物蛋白質加水分解物種による、５−アミノレブリン酸力価との関係を示す図である。 植物蛋白質加水分解調味液の添加量別による、５−アミノレブリン酸力価を示す図である。 植物蛋白質加水分解調味粉体の添加量別による、５−アミノレブリン酸力価を示す図である。

本発明の方法において５−アミノレブリン酸生産菌の培養が行われる培地は、（Ａ）酵母エキス、乾燥酵母、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、魚粉、カザミノ酸、ＣＳＬ及びＰＤＢから選ばれる１種以上と、（Ｂ）植物蛋白質加水分解物とを含有する。

本発明に使用される（Ｂ）植物蛋白質加水分解物は、植物蛋白質を加水分解して得られるアミノ酸混合物を主成分とする組成物であり、通常コクやうまみをもたらす目的で加工食品に使用されるものであるが、培地の成分としては利用されていない。植物蛋白質加水分解物としては、植物蛋白質の塩酸加水分解物、酵素加水分解物、熱水分解物等が挙げられるが、塩酸加水分解物が入手の容易性、５−アミノレブリン酸の生産性の点でより好ましい。

原料である植物蛋白質としては、大豆、脱脂大豆、大豆グルテン、小麦グルテン、コーングルテン等が挙げられる。塩酸加水分解法としては、植物蛋白質に塩酸を加えて加水分解した後、水酸化ナトリウムにより中和することにより行うのが好ましい（特開平６−３０７２２２号公報、特開平７−１８４５５７号公報等）。より好ましい植物蛋白質加水分解物は、大豆、脱脂大豆、大豆グルテン、小麦グルテン、コーングルテン等の可食性植物蛋白質の塩酸加水分解物である。

用いる植物蛋白質加水分解物は、その加水分解率が５０％以上のものが好ましい。ここで加水分解率は、アミノ態窒素量をホルモール滴定法によって測定し、ケルダール法によって測定した全窒素量で除して求めることができる。

本発明に使用される植物蛋白質加水分解物は、植物蛋白質加水分解液であっても、それを乾燥した植物蛋白質加水分解粉体又はペーストでもよいが、培地に均一に混合させた方が製造管理しやすいために植物蛋白質加水分解液であることが好ましい。

なお、目的物である５−アミノレブリン酸を食品として使用する場合には、植物蛋白質加水分解物は、調味料としての使用目的で製造管理された植物蛋白質加水分解調味物であることが好ましく、特に、植物蛋白質加水分解調味液が好ましく、更に混合醸造醤油の原料に用いられる植物蛋白質加水分解調味液であることが好ましい。

植物蛋白質加水分解物の培地への添加量は、その主成分がアミノ酸混合物であることから、培地１Ｌあたり全窒素量として０．０１〜１０ｇ、さらに０．１〜２ｇ、さらに０．３〜１．５ｇとするのが、５−アミノレブリン酸の生産性の点から好ましい。より具体的には、培地に含有させる植物蛋白質加水分解物が、植物蛋白質加水分解液の場合の添加量は、培地１Ｌあたりに１〜１００ｍＬ、特に１〜５０ｍＬ、更に１５ｍＬ〜２５ｍＬ添加させることが好ましく、植物蛋白質加水分解粉体又はペーストの場合の添加量は、培地１Ｌあたり０．１ｇ〜１００ｇ、特に０．１ｇ〜２０ｇが好ましく、更に５ｇ〜１５ｇであることが好ましい。

本発明方法における植物蛋白質加水分解物の培地への添加は、培養培地と別に滅菌処理し、微生物が５−アミノレブリン酸の生産工程開始直前に添加することが好ましい。

本発明に用いられる培地は、（Ａ）酵母エキス、乾燥酵母、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、魚粉、カザミノ酸、ＣＳＬ（コーンスチープリカー）及びＰＤＢ（Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｂｒｏｔｈ）から選ばれる１種以上を含有する。本発明においては、当該（Ａ）成分に前記（Ｂ）植物蛋白質加水分解物を併用することにより、５−アミノレブリン酸の生産性が顕著に向上する。これらの（Ａ）成分のうち、酵母エキス及び乾燥酵母から選ばれる１種以上、特に酵母エキスが好ましい。その含有量は合計で１ｇ／Ｌ以上であるが、より好ましい含有量は、１ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌ、特に５ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌである。

本発明においては、さらに（Ｃ）リン化合物、マンガン化合物及び鉄化合物を含有する混合物を１００℃以上で加熱又は０．１ＭＰａ以上で加圧して得られたものを培地に添加するのが、５−アミノレブリン酸の生産性を向上させる点で好ましい。リン化合物としては、リン元素を含むものであればよく、好ましくは、リン酸、リン酸塩、ピロリン酸等が挙げられる。より具体的には、リン酸カルシウム（例えば、Ｃａ₁₀（ＰＯ₄）₆（ＯＨ）₂、Ｃａ₃（ＰＯ）₂）、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、ピロリン酸、リン酸一アンモニウム、リン酸二アンモニウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸鉄、リン酸マンガンが挙げられ、特に好ましくは、リン酸カルシウム、ピロリン酸が挙げられる。

マンガン化合物としては、マンガン元素を含むものであればよく、好ましくは、酸のマンガン塩、マンガンハロゲン化物等が挙げられ、より具体的には、硫酸マンガン無水和物、硫酸マンガン五水和物、塩化マンガン、硝酸マンガン、炭酸マンガン、二酸化マンガンが挙げられ、特に好ましくは、硫酸マンガン無水和物、硫酸マンガン五水和物が挙げられる。

鉄化合物としては、鉄元素を含むものであればよく、好ましくは、酸の鉄塩、鉄のハロゲン化物、硫化鉄等が挙げられ、より具体的には、ＥＤＴＡ−鉄、塩化鉄（ＩＩ）又はその水和物、塩化鉄（ＩＩＩ）又はその水和物、硫化鉄、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、酢酸鉄、臭化鉄、乳酸鉄、硝酸鉄、硫酸鉄、リン酸鉄、クエン酸鉄アンモニウム、シュウ酸鉄、シュウ酸鉄アンモニウムが挙げられ、特に好ましくは、塩化鉄（ＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）が挙げられる。

加熱又は加圧する混合物には、媒体を用いてもよく、その媒体としては、実質的に培地成分を含有しない液体が挙げられ、好ましくは、水である。

上記混合物の加熱は、１００℃以上で行われるが、加熱温度は、１１０〜１３０℃が好ましい。また、上記混合物の加圧は、０．１ＭＰａ以上で行われるが、加圧圧力は、０．１３〜０．２０ＭＰａが好ましい。上記混合物は、加熱し、かつ加圧するのが好ましい。このような加熱及び加圧は、リン化合物、マンガン化合物、及び鉄化合物を混合した後に行う必要があり、混合前に行っても、優れた微生物の増殖促進効果や、アミノ酸生産能や酸化酵素活性といった微生物の活性を十分に向上させる効果が得られない。加熱又は加圧の時間は、１０〜３０分が好ましい。

さらに、本発明の方法で培養が行われる培地は、資化し得る炭素源及び窒素源を適当量含有するのが好ましい。ここで、炭素源としては、グルコース等の糖類、酢酸、リンゴ酸、乳酸、コハク酸等の酸類などを用いることができる。また、窒素源としては、硫安、塩安、リン安等のアンモニア態窒素化合物、硝酸ナトリウム等の硝酸態窒素化合物等の無機窒素源、尿素等の有機窒素化合物などを用いることができる。また、有機性廃水、無機性廃水等を用いることができる。

また、本発明の方法で培養が行われる培地には、更に、無機塩類等の微量成分、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、グルタミン、アスパラギン、チロシン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸等を適宜添加することができる。

本発明の方法を用いて５−アミノレブリン酸を生産する場合、５−アミノレブリン酸生産菌を培養する培地には、グリシンを添加することが好ましい。グリシンの添加量は、終濃度で１０〜１０００ｍＭ、特に１０〜４００ｍＭであるのが好ましい。グリシンの１回当りの添加量は１０〜２００ｍＭが好ましく、これを数回添加することが好ましい。

本発明の方法で培養される５−アミノレブリン酸生産菌は、原核微生物の光合成従属栄養細菌であり、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ属が挙げられ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属が好ましく、更に、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）又はその変異株が好ましく、特には、ロドバクター・スフェロイデス ＣＲ−００７２００９と命名され、ＦＥＲＭ ＢＰ−６３２０として寄託されたものが好ましい。

本発明の方法で行われる微生物の培養にあたっての培養温度、ｐＨは５−アミノレブリン酸生産菌が生育する条件でよく、例えば、培養温度は、１０〜４０℃、特に２０〜３５℃が好ましく、培地のｐＨは３〜９が好ましく、特に６〜８が好ましい。なお、５−アミノレブリン酸の生産時にｐＨが変化する場合には、水酸化ナトリウム、アンモニア、水酸化カリウム等のアルカリ溶液や塩酸、硫酸、燐酸等の酸を用いてｐＨを調整することが好ましい。なお、前記の光合成従属栄養細菌を用いた場合、光照射は特に必要がない。

以上のようにして得られる培養液または反応液中の５−アミノレブリン酸は、常法により精製することができる。例えば、イオン交換法、クロマト法、抽出法等の常法によって必要に応じて分離・精製することができる。

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、これらは単に例示の目的で掲げられるものであって、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
２Ｌフラスコに表１に示す培地を２００ｍＬ分注し、１２１℃、０．１５ＭＰａで２０分間滅菌後、室温に戻るまで静置して培地１を得た。得られた培地１にロドバクター・スフェロイデスＣＲ００７２００９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６３２０）を５００μＬ植菌後、３２℃、１４０ｒｐｍで２６時間培養し、培養液を得た。

２Ｌフラスコに表１に示す培地を２００ｍＬ分注し、１２１℃、０．１５ＭＰａで２０分間滅菌後、室温に戻るまで静置して培地２を得た。培地１で培養した５−アミノレブリン酸生産菌をＯＤ＝０．４となるように植菌し、３２℃、１４０ｒｐｍで２０時間培養し、培養液を得た。

３Ｌ発酵槽に表２に示す培地を１．８Ｌ分注し、１２１℃、０．１５ＭＰａで２０分間滅菌後、室温に戻るまで静置して培地３を得た。培地２で培養した５−アミノレブリン酸生産菌をＯＤ＝０．４となるように植菌し、２８℃、３５０〜４８０ｒｐｍで培養した。

３Ｌ発酵槽での培養液中の５−アミノレブリン酸生産菌のＯＤが１２に達したことを確認した後、グリシンを５ｇ／Ｌとなるように、更に、植物蛋白質加水分解物とを、植物蛋白質加水分解調味液（播州調味料株式会社製、製品名：ＮＫ−１２：全窒素量３．０ｗ／ｖ％）として２０ｍＬ／Ｌとなるように、また植物蛋白質加水分解調味粉体（播州調味料株式会社製、製品名：プロエキスＰ：全窒素量９．５ｗ／ｗ％）として９．４ｇ／Ｌとなるように添加した。その後３９０ｒｐｍで生産を開始し、グリシン濃度が０．５ｇ／Ｌ以下となった場合にはグリシン濃度が５ｇ／Ｌとなるようにグリシンを添加して約６５時間培養し、微生物の５−アミノレブリン酸生産能力を確認した。結果を図１に示す。

比較例１
３Ｌ発酵槽での培養において、植物蛋白質加水分解物を添加しないこと以外は、実施例１と同様の工程を行った。結果を図１及び２に示す。

実施例２
実施例１と同様の工程で前培養を行い、３Ｌ発酵槽での培養において、植物蛋白質加水分解物の添加量を、植物蛋白質加水分解調味液（播州調味料株式会社製、製品名：ＮＫ−１２）として培地１Ｌあたり２．０ｍＬ、４．０ｍＬ、２０ｍＬとなるように、また植物蛋白質加水分解調味粉体（播州調味料株式会社製、製品名：プロエキスＰ）として０．９、１．９、９．４ｇ／Ｌとなるように添加し、植物蛋白質加水分解物の添加量による５−アミノレブリン酸の生産能力の差異を調べた。前者の結果を図２に、後者の結果を図３に示す。

図１に示すように、添加物は液状（ＮＫ−１２）でも粉末（プロエキスＰ）でも植物蛋白質加水分解物であれば、微生物の５−アミノレブリン酸の生産能力が上昇することが確認できた。
しかしながら、製造安定性を鑑みれば、植物蛋白質加水分解調味液であるＮＫ−１２が、製造管理上、使用し易かった。

図２及び図３に示すように、植物蛋白質加水分解物の培地あたりの添加量を検討したところ、いずれも添加量に依存して５−アミノレブリン酸生産力価は向上するものの、大差はなく、少量であっても十分な効果を示すことが確認できた。

Claims (7)

1. （Ａ）酵母エキス、乾燥酵母、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、魚粉、カザミノ酸、ＣＳＬ及びＰＤＢから選ばれる１種以上と、（Ｂ）植物蛋白質加水分解物とを含有した培地において、５−アミノレブリン酸生産菌を培養することを特徴とする、５−アミノレブリン酸の製造方法。
2. 植物蛋白質加水分解物が、植物蛋白質の塩酸加水分解物である請求項１記載の５−アミノレブリン酸の製造方法。
3. 植物蛋白質加水分解物の培地中への添加量が、培地１Ｌあたり全窒素量として０．０１〜１０ｇである請求項１又は２記載の５−アミノレブリン酸の製造方法。
4. 植物蛋白質加水分解物が、植物蛋白質加水分解液である、請求項１〜３のいずれかに記載の５−アミノレブリン酸の製造方法。
5. ５−アミノレブリン酸生産菌が、ロドバクテリウム（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属するものである、請求項１〜４のいずれかに記載の５−アミノレブリン酸の製造方法。
6. ５−アミノレブリン酸生産菌が、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）又はその変異株である、請求項１〜５のいずれかに記載の５−アミノレブリン酸の製造方法。
7. ５−アミノレブリン酸生産菌が、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ＣＲ−００７２００９と命名され、ＦＥＲＭ Ｐ−１６２１７として寄託されたものである請求項１〜６のいずれか１項記載の５−アミノレブリン酸の製造方法。