JP6194255B2

JP6194255B2 - ５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法

Info

Publication number: JP6194255B2
Application number: JP2014008197A
Authority: JP
Inventors: 優齊藤; 泰嗣山本; 榛稀河野
Original assignee: コスモＡｌａ株式会社
Priority date: 2013-03-22
Filing date: 2014-01-21
Publication date: 2017-09-06
Anticipated expiration: 2034-01-21
Also published as: MA38535B1; JP2014207882A; MA38535A1

Description

本発明は、微生物を用いる５−アミノレブリン酸又はその塩の効率的な製造方法に関する。

５−アミノレブリン酸は、テトラピロール化合物（ビタミンＢ１２、ヘム、クロロフィルなど）を生合成する色素生合成経路の代謝中間体として広く生物圈に存在し、生体内で重要な役割を果たしている。５−アミノレブリン酸は、生体系中で、グリシンとスクシニルＣｏＡから５−アミノレブリン酸合成酵素によって、又はグルタミン酸からグルタミルｔＲＮＡを経て生合成され、５−アミノレブリン酸デヒドラターゼに続く代謝によりヘムやクロロフィルなどのポルフィリン化合物に変換される。この５−アミノレブリン酸は分解性が高く、環境への残留性もないため多くの産業への応用が期待されている（特許文献１、２）。

微生物を用いる５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法としては、種々の光合成細菌、特にロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）に属する微生物、その変異株を用いる方法（特許文献３、４）が知られている。また、これらの微生物の培養条件として酸素制限条件とする方法（特許文献５）、この酸素制限条件を緩和した条件下で５−アミノレブリン酸を生産する変異株を用いる方法（特許文献６）、酸素条件を設定した方法（特許文献７）等が報告されている。

しかし上記のように培養条件については報告されているが、生産の効率化のための培地や生産向上剤については鉄分量が示されているのみであり（特許文献６）、その他報告はない。

上記のように微生物培養によって生産された５−アミノレブリン酸又はその塩は、通常、イオン交換法、クロマト法、抽出法等の常法によって必要に応じて分離・精製することができるが、高精製を達成する方法として培養液から陽イオン交換樹脂を用いて５−アミノレブリン酸を分離する方法がある（特許文献８）。５−アミノレブリン酸の陽イオン交換樹脂を用いる精製においては、副生成物である式（１）の構造をとる５−アミノ−４−ヒドロキシペンタン酸が影響を及ぼす。すなわち、この５−アミノ−４−ヒドロキシペンタン酸はｐＫａ、ｐＩが５−アミノレブリン酸に非常に近いため、精製におけるイオン交換樹脂の交換基を取り合うこととなり、そのため高精製を達成するためには、通液する５−アミノレブリン酸量に対し、多量の樹脂を使用する必要がある。したがって、培養における５−アミノ−４−ヒドロキシペンタン酸の生成量の抑制は樹脂処理の効率化に有効である。

特開昭６１−５０２８１４号公報特開平２−１３８２０１号公報特開平６−１４１８７５号公報特開平６−１５３９１５号公報特開平８−１６８３９１号公報特開平１１−４２０８３号公報特開２００８−２９２７２号公報特開２００７−８４４６６号公報

このように、５−アミノレブリン酸又はその塩の種々の製造方法が検討されているが、更なる収率の向上が望まれている。
本発明は、５−アミノレブリン酸生産微生物を用いて５−アミノレブリン酸又はその塩を高い収率で製造する方法を提供することを目的とする。
さらに培養工程において５−アミノ−４−ヒドロキシペンタン酸の生成を抑制する方法を提供する。

かかる実状において、５−アミノレブリン酸生産微生物の培養条件、特に培地成分について種々研究を重ねた結果、酵母エキス等の通常の栄養成分に加えて、Ｌ−アルギニン又はその塩を含有する培地で５−アミノレブリン酸生産微生物を培養することにより、５−アミノレブリン酸又はその塩をこれまでの製造法よりも高収率で製造できることを見出した。
さらに、酵母エキス等の通常の栄養成分に加えて、Ｌ−アルギニン又はその塩を含有する培地で５−アミノレブリン酸生産微生物を培養することにより、５−アミノ−４−ヒドロキシペンタン酸の生成を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔６〕を提供するものである。
〔１〕Ｌ−アルギニン又はその塩を含有する培地中で５−アミノレブリン酸生産微生物を培養することを特徴とする５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法。
〔２〕Ｌ−アルギニン又はその塩の含有量が、培地中Ｌ−アルギニン換算で０．０１ｍＭ〜３０ｍＭである〔１〕記載の５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法。
〔３〕５−アミノレブリン酸生産微生物が、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属に属するものである〔１〕又は〔２〕に記載の５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法。
〔４〕５−アミノレブリン酸生産微生物が、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）又はその変異株である〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法。
〔５〕５−アミノレブリン酸生産微生物が、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ＣＲ−００７２００９と命名され、ＦＥＲＭＰ−１６２１７として寄託されたものである〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法。
〔６〕Ｌ−アルギニン又はその塩の含有量が、培地中Ｌ−アルギニン換算で０．５ｍＭ〜１５ｍＭである〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法。

本発明の製造方法によれば、５−アミノレブリン酸生産微生物を、Ｌ−アルギニン又はその塩を含有する培地において培養することにより、５−アミノレブリン酸又はその塩を高収率で製造することができる。

さらに、５−アミノレブリン酸生産微生物を、Ｌ−アルギニン又はその塩を含有する培地において培養することにより、５−アミノレブリン酸又はその塩の精製に影響を及ぼす、副生成物である５−アミノ−４−ヒドロキシペンタン酸の生成量を抑制することが可能となる。

本発明の５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法は、培地としてＬ−アルギニン又はその塩を含有する培地を用いることを特徴とする。培地中のＬ−アルギニン又はその塩の含有量は、５−アミノレブリン酸の生産性の点及び５−アミノ−４−ヒドロキシペンタン酸の生成抑制の点から、Ｌ−アルギニン換算で０．０１ｍＭ〜３０ｍＭが好ましく、０．１ｍＭ〜２０ｍＭがより好ましく、０．３ｍＭ〜１５ｍＭがさらに好ましく、０．５ｍＭ〜１５ｍＭがさらに好ましい。ここで、Ｌ−アルギニン換算とはＬ−アルギニン塩やそれらの水和物を用いた場合であっても、Ｌ−アルギニン換算の濃度であることを示す。アルギニンの塩としては、塩酸塩等の鉱酸塩が挙げられる。

本発明方法におけるＬ−アルギニン又はその塩の培地への添加は、培養培地調製時に添加しても良いが、特には培地と別に滅菌処理し、微生物が５−アミノレブリン酸の生産を開始する直前に添加することが好ましい。ここで、微生物が５−アミノレブリン酸の生産を開始する直前としては、培養開始後１０〜４５時間が好ましく、培養開始後１５〜４０時間がより好ましく、培養開始後２０〜３５時間がさらに好ましい。

本発明の方法に使用される５−アミノレブリン酸生産微生物は、原核微生物の光合成従属栄養細菌であり、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ属が挙げられ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属が好ましく、さらに、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）又はその変異株が好ましく、特には、ロドバクター・スフェロイデスＣＲ−００７２００９と命名され、ＦＥＲＭＢＰ−６３２０として寄託された微生物が好ましい。

本発明に用いられる培地は、酵母エキス、乾燥酵母、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、魚粉、カザミノ酸、ＣＳＬ（コーンスチープリカー）及びＰＤＢ（ＰｏｔａｔｏＤｅｘｔｒｏｓｅＢｒｏｔｈ）から選ばれる１種以上を含有するのが好ましい。これらの成分のうち、酵母エキス及び乾燥酵母から選ばれる１種以上、特に酵母エキスが好ましい。その含有量は合計で１ｇ／Ｌ以上であるが、より好ましい含有量は１ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌ、特に好ましくは５ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌである。

さらに、本発明の方法で培養が行われる培地は、資化し得る炭素源及び窒素源を適当量含有するのが好ましい。炭素源としては、グルコース等の糖類、酢酸、リンゴ酸、乳酸、コハク酸等の酸類などを用いることができる。また、窒素源としては、アンモニア、硫安、塩安、リン安等のアンモニア態窒素化合物、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の硝酸態窒素化合物等の無機窒素源、尿素、ポリペプトン、酵母エキス等の有機態窒素化合物などを用いることができる。

また、本発明の方法で培養が行われる培地には、さらに、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、グルタミン、アスパラギン、チロシン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸等のアミノ酸等を適宜添加することができる。

本発明においては、さらに、無機塩類等の微量成分、特には、リン化合物、マンガン化合物及び鉄化合物を含有する混合物を１００℃以上で加熱又は０．１ＭＰａ以上で加圧して得られたものを培地に添加するのが、５−アミノレブリン酸の生産性を向上させる点で好ましい。リン化合物としては、リン元素を含むものであればよく、好ましくは、リン酸、リン酸塩、ピロリン酸等が挙げられる。より具体的には、リン酸カルシウム（例えば、Ｃａ₁₀（ＰＯ₄）₆（ＯＨ）₂、Ｃａ₃（ＰＯ₄）₂）、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、ピロリン酸、リン酸一アンモニウム、リン酸二アンモニウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸鉄、リン酸マンガンが挙げられ、特に好ましくは、リン酸カルシウム、ピロリン酸が挙げられる。

マンガン化合物としては、マンガン元素を含むものであればよく、好ましくは、有機栄養源に含まれるマンガン元素、酸のマンガン塩、マンガンハロゲン化物等が挙げられ、より具体的には、Ｍｎ含有酵母エキス、硫酸マンガン無水和物、硫酸マンガン五水和物、塩化マンガン、硝酸マンガン、炭酸マンガン、二酸化マンガンが挙げられ、特に好ましくは、Ｍｎ含有酵母エキス、硫酸マンガン無水和物、硫酸マンガン五水和物が挙げられる。

鉄化合物としては、鉄元素を含むものであればよく、好ましくは、酸の鉄塩、鉄のハロゲン化物、硫化鉄等が挙げられ、より具体的には、ＥＤＴＡ−鉄、塩化鉄（II）又はその水和物、塩化鉄（III）又はその水和物、硫化鉄、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、酢酸鉄、臭化鉄、乳酸鉄、硝酸鉄、硫酸鉄、リン酸鉄、クエン酸鉄アンモニウム、シュウ酸鉄、シュウ酸鉄アンモニウムが挙げられ、特に好ましくは、塩化鉄（II）、塩化鉄（III）が挙げられる。

加熱又は加圧する混合物には、媒体を用いてもよく、その媒体としては、実質的に培地成分を含有しない液体が挙げられ、好ましくは、水である。

上記混合物の加熱は、１００℃以上で行われるが、加熱温度は、１１０〜１３０℃が好ましい。また、上記混合物の加圧は、０．１ＭＰａ以上で行われるが、加圧圧力は、０．１３〜０．２０ＭＰａとすることが好ましい。上記混合物は、加熱し、かつ加圧するのが好ましい。このような加熱及び加圧は、リン化合物、マンガン化合物、及び鉄化合物を混合した後に行う必要があり、混合前に行った場合、優れた５−アミノレブリン酸生産微生物の増殖促進効果や、５−アミノレブリン酸生産能や酸化酵素活性といった微生物の活性を十分に向上させる効果が得られない。加熱又は加圧の時間は、１０〜３０分が好ましい。

また本発明の製造方法では、培地にグリシン又はレブリン酸を添加することが好ましい。グリシンの添加量は培地全量中の１０〜１０００ｍＭ、特に１０〜４００ｍＭとすることが好ましい。またグリシンの１回当りの添加量は培地全量中の１０〜２００ｍＭが好ましく、これを数回添加することが好ましい。レブリン酸の添加量は培地全量中の０．０１〜２０ｍＭ、特に０．１〜１０ｍＭが好ましい。このグリシン、レブリン酸の添加は、５−アミノレブリン酸生産微生物の増殖速度を低下させる場合があるので、そのときはある程度増殖した時点で添加するとよい。

培養にあたっての培養温度、pHは５−アミノレブリン酸生産微生物が生育する条件でよく、例えば、培養温度は１０〜４０℃、特に２０〜３５℃とするのが好ましく、培地のpHは４〜９、特に５〜８とすることが好ましい。なお５−アミノレブリン酸の生産時にpHが変化する場合には、水酸化ナトリウム、アンモニア、水酸化カリウム等のアルカリ溶液や塩酸、硫酸、リン酸等の酸を用いてpHを調整することが好ましい。また、培養にあたっては、特に光照射をする必要はない。

以上のようにして得られる培養液中の５−アミノレブリン酸又はその塩は、常法により精製することができる。例えば、イオン交換クロマト法、抽出法等の常法によって必要に応じて分離・精製することができるが、陽イオン交換樹脂処理により５−アミノレブリン酸を略精製後、結晶化工程で不純物を取り除くとともに、高純度の５−アミノレブリン酸又はその塩を回収することが好ましい。本発明により得られる培養液中の５−アミノレブリン酸濃度は高く、一方、５−アミノ−４−ヒドロキシペンタン酸の生成は抑制されているので、精製が容易である。５−アミノレブリン酸の塩としては、塩酸塩、リン酸塩、硝酸塩等が挙げられる。

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、これらは単に例示の目的で掲げられものであって、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

（製造例１）
培地１（組成は表１に示す）２００ｍＬを２Ｌ容三角フラスコに分注し、１２１℃で２０分間滅菌した後、放冷した。これにロドバクター・スフェロイデスＣＲ００７２００９（ＦＥＲＭＢＰ−６３２０）を植菌後、３２℃、暗所にて２４時間振盪培養した。

得られた培養物を再び、２Ｌ容三角フラスコに２００ｍＬの培地１を調製したところへ、初期菌体濃度（ＯＤ６６０ｎｍ）が０．２となるように植菌し、３２℃、暗所にて２４時間撹拌培養した。

（比較例１）
３００ｍＬ容三角フラスコに３０ｍＬの培地２（組成は表２に示す）を調製したところへ、製造例で得られた培養物を初期菌体濃度（ＯＤ６６０ｎｍ）が０．５となるように植菌し、２８℃、暗所にて２４〜２６時間撹拌培養した。その後、グリシンを６０ｍＭ、レブリン酸を５ｍＭになるように添加し、硫酸にてpHを６．４〜６．５に調整した後、５本の２０ｍｍφ試験管に５ｍＬずつ分注した。その後、グリシンとレブリン酸の添加から１８時間後で培養を止めた。培養１８時間後の５−アミノレブリン酸蓄積量、及び５−アミノ−４−ヒドロキシペンタン酸蓄積量を表３に示す。

（実施例１）
２８℃で２４〜２６時間培養後、Ｌ−アルギニンを０．５ｍＭになるように添加した以外は比較例１と同様な操作を行った。グリシンとレブリン酸の添加から１８時間後に培養を止めた際の５−アミノレブリン酸蓄積量、及び５−アミノ−４−ヒドロキシペンタン酸蓄積量を表３に示す。

（実施例２）
２８℃で２４〜２６時間培養後、Ｌ−アルギニンを１ｍＭになるように添加した以外は比較例１と同様な操作を行った。グリシンとレブリン酸の添加から１８時間後に培養を止めた際の５−アミノレブリン酸蓄積量、及び５−アミノ−４−ヒドロキシペンタン酸蓄積量を表３に示す。

（実施例３）
２８℃で２４〜２６時間培養後、Ｌ−アルギニンを２ｍＭになるように添加した以外は比較例１と同様な操作を行った。グリシンとレブリン酸の添加から１８時間後に培養を止めた際の５−アミノレブリン酸蓄積量、及び５−アミノ−４−ヒドロキシペンタン酸蓄積量を表３に示す。

（実施例４）
２８℃で２４〜２６時間培養後、Ｌ−アルギニンを５ｍＭになるように添加した以外は比較例１と同様な操作を行った。グリシンとレブリン酸の添加から１８時間後に培養を止めた際の５−アミノレブリン酸蓄積量、及び５−アミノ−４−ヒドロキシペンタン酸蓄積量を表３に示す。

（実施例５）
２８℃で２４〜２６時間培養後、Ｌ−アルギニンを１０ｍＭになるように添加した以外は比較例１と同様な操作を行った。グリシンとレブリン酸の添加から１８時間後に培養を止めた際の５−アミノレブリン酸蓄積量、及び５−アミノ−４−ヒドロキシペンタン酸蓄積量を表３に示す。

表３から分かるように、Ｌ−アルギニンの添加によって５−アミノレブリン酸の生産性が向上し、かつ５−アミノレブリン酸と５−アミノ−４−ヒドロキシペンタン酸の生成比率が最大で約６０％向上した。

（製造例２）
２００ｍＬの培地１を２Ｌ容三角フラスコに分注し、１２１℃で２０分間滅菌した後、放冷した。これにロドバクター・スフェロイデスＣＲ００７２００９（ＦＥＲＭＢＰ−６３２０）を植菌後、３２℃、暗所にて２６時間振盪培養した。

得られた培養物を再び、２Ｌ容三角フラスコに２００ｍＬの培地１を調製したところへ、初期菌体濃度（ＯＤ６６０ｎｍ）が０．４となるように植菌し、３２℃、暗所にて２０時間撹拌培養した。

（比較例２）
３Ｌ容の培養槽に１．８Ｌの培地３（組成は表４に示す）を調製したところへ、製造例２で得られた培養物を、初期菌体濃度（ＯＤ６６０ｎｍ）が０．４となるように植菌し、２８℃、通気量１．８Ｌ／分、溶存酸素濃度の下限値が５％となるよう通気撹拌培養した。培養開始２４〜２６時間後にグリシンを６５ｍＭ、レブリン酸を５ｍＭになるように添加し、撹拌回転数を４２０ｒｐｍにして、硫酸を用いてpHを６．４〜６．５に保ちながら培養を続けた。さらに、培養開始４０時間後から１２時間毎にグリシンを６５ｍＭになるように３回添加し、最初のグリシン添加から５２時間で培養を止めた。５−アミノレブリン酸蓄積量を表５に示す。

（実施例６）
２８℃で２４〜２６時間培養後に、Ｌ−アルギニンを５ｍＭになるように添加した以外は比較例２と同様な操作を行った。５−アミノレブリン酸蓄積量を表５に示す。

（実施例７）
２８℃で２４〜２６時間培養後に、Ｌ−アルギニンを７．５ｍＭになるように添加した以外は比較例２と同様な操作を行った。５−アミノレブリン酸蓄積量を表５に示す。

（実施例８）
２８℃で２４〜２６時間培養後に、Ｌ−アルギニンを１０ｍＭになるように添加した以外は比較例２と同様な操作を行った。５−アミノレブリン酸蓄積量を表５に示す。

表５から分かるように、Ｌ−アルギニンの添加によって５−アミノレブリン酸の生産性が向上した。

（製造例３）
２００ｍＬの培地１を２Ｌ容三角フラスコに分注し、１２１℃で２０分間滅菌した後、放冷した。これにロドバクター・スフェロイデスＣＲ００７２００９（ＦＥＲＭＢＰ−６３２０）を植菌後、３２℃、暗所にて２６時間振盪培養した。

（比較例３）
３Ｌ容の培養槽に１．８Ｌの培地４（組成は表６に示す）を調製したところへ、製造例３で得られた培養物を、初期菌体濃度（ＯＤ６６０ｎｍ）が０．４となるように植菌し、２８℃、通気量１．８Ｌ／分、溶存酸素濃度の下限値が５％となるよう通気撹拌培養した。培養開始２４〜２６時間後に、グリシンを６５ｍＭ、レブリン酸を５ｍＭになるように添加し、撹拌回転数を４２０ｒｐｍにして、硫酸を用いてｐＨを６．４〜６．５に保ちながら培養を続けた。さらに、培養開始４０時間後と５２時間後にそれぞれグリシンを６５ｍＭになるように添加し、最初のグリシン添加から４０時間後に培養を止めた。５−アミノレブリン酸蓄積量を表７に示す。

（実施例９）
２８℃で２４〜２６時間培養後に、Ｌ−アルギニンを４．５ｍＭになるように添加した以外は比較例３と同様な操作を行った。５−アミノレブリン酸蓄積量を表７に示す。

表７から分かるように、Ｌ−アルギニンの添加によって５−アミノレブリン酸の生産性が向上した。

Claims

Ｌ−アルギニン又はその塩をＬ−アルギニン換算で０．５ｍＭ〜１０ｍＭ含有する培地中で、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ＣＲ−００７２００９と命名され、ＦＥＲＭＢＰ−６３２０として寄託された５−アミノレブリン酸生産微生物を培養することを特徴とする５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法。