JP2816422B2 - 微生物による５−アミノレブリン酸の製造方法 - Google Patents
微生物による５−アミノレブリン酸の製造方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ロドバクター セファ
ロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉ
ｄｅｓ）に属する５−アミノレブリン酸生産菌を、特定
の天然成分の特定量を添加した培地で培養して、５−ア
ミノレブリン酸を高収率で製造する方法、特に、この天
然成分の特定量を特定の方法で添加した培地で培養し
て、５−アミノレブリン酸生産菌を高濃度化し、かつ５
−アミノレブリン酸を高収率で製造する方法に関する。
ロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉ
ｄｅｓ）に属する５−アミノレブリン酸生産菌を、特定
の天然成分の特定量を添加した培地で培養して、５−ア
ミノレブリン酸を高収率で製造する方法、特に、この天
然成分の特定量を特定の方法で添加した培地で培養し
て、５−アミノレブリン酸生産菌を高濃度化し、かつ５
−アミノレブリン酸を高収率で製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】５−
アミノレブリン酸は、ビタミンＢ１２、ヘム、クロロフ
ィルなどのテトラピロール化合物のプレカーサとして、
生体系中で重要な役割を果たしている化合物である。こ
の５−アミノレブリン酸は、人畜に対して毒性を示さ
ず、分解性が高いため環境への残留性もないという優れ
た性質を有する天然化合物であり、近年、除草剤，殺虫
剤，その他への利用が注目されている（特公表６１−５
０２８１４号，特開平２−１３８２０１号公報参照）。
アミノレブリン酸は、ビタミンＢ１２、ヘム、クロロフ
ィルなどのテトラピロール化合物のプレカーサとして、
生体系中で重要な役割を果たしている化合物である。こ
の５−アミノレブリン酸は、人畜に対して毒性を示さ
ず、分解性が高いため環境への残留性もないという優れ
た性質を有する天然化合物であり、近年、除草剤，殺虫
剤，その他への利用が注目されている（特公表６１−５
０２８１４号，特開平２−１３８２０１号公報参照）。
【０００３】しかし、この天然の５−アミノレブリン酸
は、コストが高く、除草剤や殺虫剤等として使用するに
は実用性に欠ける（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｗｅｅｋ／Ｏｃ
ｔｏｂｅｒ，２９，１９８４）。
は、コストが高く、除草剤や殺虫剤等として使用するに
は実用性に欠ける（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｗｅｅｋ／Ｏｃ
ｔｏｂｅｒ，２９，１９８４）。
【０００４】このような現状において、５−アミノレブ
リン酸について、多くの化学合成方法が検討されている
（例えば、特開平２−７６８４１号，同２−１１１７４
７号公報参照）が、未だ充分な方法が開発されていな
い。また、光合成細菌等の微生物を用いた５−アミノレ
ブリン酸の製造方法も検討されている（例えば、特開平
２−９２２９３号，同３−１７２１９１号公報参照）。
リン酸について、多くの化学合成方法が検討されている
（例えば、特開平２−７６８４１号，同２−１１１７４
７号公報参照）が、未だ充分な方法が開発されていな
い。また、光合成細菌等の微生物を用いた５−アミノレ
ブリン酸の製造方法も検討されている（例えば、特開平
２−９２２９３号，同３−１７２１９１号公報参照）。
【０００５】生体系中では、５−アミノレブリン酸は、
グリシンとコハク酸、もしくはグルタミン酸から生合成
され、５−アミノレブリン酸デヒドラターゼにより２分
子が縮合してポルフォビリノーゲンとなり、遂次反応し
て各種テトラピロール化合物へと代謝される。ただし、
このデヒドラターゼは、一般に、活性が高いため、通
常、生体系中に５−アミノレブリン酸が蓄積されること
は稀である。そこで、微生物を用いた５−アミノレブリ
ン酸の製造法では、レブリン酸に代表されるような５−
アミノレブリン酸デヒドラターゼの活性阻害物質を添加
し、５−アミノレブリン酸を蓄積させる方法がよく知ら
れている。
グリシンとコハク酸、もしくはグルタミン酸から生合成
され、５−アミノレブリン酸デヒドラターゼにより２分
子が縮合してポルフォビリノーゲンとなり、遂次反応し
て各種テトラピロール化合物へと代謝される。ただし、
このデヒドラターゼは、一般に、活性が高いため、通
常、生体系中に５−アミノレブリン酸が蓄積されること
は稀である。そこで、微生物を用いた５−アミノレブリ
ン酸の製造法では、レブリン酸に代表されるような５−
アミノレブリン酸デヒドラターゼの活性阻害物質を添加
し、５−アミノレブリン酸を蓄積させる方法がよく知ら
れている。
【０００６】ところで、一般に、微生物は、酵母エキス
等の天然成分を含んだ培地で培養を行うと、最小培地で
培養した場合に比べ、非常に高い増殖性を示す。したが
って、光合成細菌等の微生物を用いた５−アミノレブリ
ン酸の製造方法においても、その培養に天然成分を添加
することで、菌体濃度を数倍に上昇させることが可能で
ある。
等の天然成分を含んだ培地で培養を行うと、最小培地で
培養した場合に比べ、非常に高い増殖性を示す。したが
って、光合成細菌等の微生物を用いた５−アミノレブリ
ン酸の製造方法においても、その培養に天然成分を添加
することで、菌体濃度を数倍に上昇させることが可能で
ある。
【０００７】ただし、この場合、光合成細菌は、高い増
殖性を示しながらも、５−アミノレブリン酸デヒドラタ
ーゼの活性阻害物質の添加、無添加にかかわらず、５−
アミノレブリン酸を殆ど生成しない場合が多い。つま
り、天然成分により何らかの蓄積阻害が起きていること
になる。
殖性を示しながらも、５−アミノレブリン酸デヒドラタ
ーゼの活性阻害物質の添加、無添加にかかわらず、５−
アミノレブリン酸を殆ど生成しない場合が多い。つま
り、天然成分により何らかの蓄積阻害が起きていること
になる。
【０００８】一方、例えば、本発明者等により先に提案
された工業技術院微生物工業技術研究所微工研菌寄第１
２５４２号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５４２）や第１２５４
３号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５４３）のように、自然変異
もしくは人為的な変異処理により、５−アミノレブリン
酸蓄積に関する酵素の天然成分に対する感受性が無くな
り（すなわち「脱感作」して）、５−アミノレブリン酸
を蓄積するようになった光合成細菌も存在する（特願平
３−２８９３０３号明細書参照−以下、「先提案」と言
う）。ただし、これらの菌の場合も、菌体濃度は向上す
るが、最小培地で培養した場合に比べ、５−アミノレブ
リン酸の蓄積量は低く、生産収率は低いものとなってい
る。
された工業技術院微生物工業技術研究所微工研菌寄第１
２５４２号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５４２）や第１２５４
３号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５４３）のように、自然変異
もしくは人為的な変異処理により、５−アミノレブリン
酸蓄積に関する酵素の天然成分に対する感受性が無くな
り（すなわち「脱感作」して）、５−アミノレブリン酸
を蓄積するようになった光合成細菌も存在する（特願平
３−２８９３０３号明細書参照−以下、「先提案」と言
う）。ただし、これらの菌の場合も、菌体濃度は向上す
るが、最小培地で培養した場合に比べ、５−アミノレブ
リン酸の蓄積量は低く、生産収率は低いものとなってい
る。
【０００９】本発明は、以上の諸点を考慮し、天然成分
を添加した培地中でも５−アミノレブリン酸を生産する
ことができるロドバクター セファロイデス（Ｒｈｏｄ
ｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）に属する５
−アミノレブリン酸生産菌を、天然成分を添加した培
地、特に天然成分をより多量に含む培地で高濃度化し、
かつ５−アミノレブリン酸を高収率で製造する方法を提
案することを目的とする。
を添加した培地中でも５−アミノレブリン酸を生産する
ことができるロドバクター セファロイデス（Ｒｈｏｄ
ｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）に属する５
−アミノレブリン酸生産菌を、天然成分を添加した培
地、特に天然成分をより多量に含む培地で高濃度化し、
かつ５−アミノレブリン酸を高収率で製造する方法を提
案することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記の目
的を達成するために、研究を重ねる途上で、上記した先
提案の基礎となった知見、すなわち、（ａ）光合成細菌
を変異させたもののなかに、天然成分を添加した培地で
５−アミノレブリン酸を生成する菌株（光合成細菌の５
−アミノレブリン酸蓄積に対する天然成分の阻害に脱感
作した菌株）が存在すること、（ｂ）この菌株を使用す
れば、天然成分を添加した培地での菌体の高濃度化を計
ることができるとともに、５−アミノレブリン酸を高収
率で製造することができること、を踏まえて、さらに研
究を進めた結果、（ｃ）培地に添加する天然成分の種
類、量、そして添加方法を工夫することにより、５−ア
ミノレブリン酸蓄積を阻害しないばかりか、蓄積が著し
く促進されることを見出し、よって５−アミノレブリン
酸をこれまでの製造法よりも高収率で製造できること、
を確認し、本発明を開発するに至った。
的を達成するために、研究を重ねる途上で、上記した先
提案の基礎となった知見、すなわち、（ａ）光合成細菌
を変異させたもののなかに、天然成分を添加した培地で
５−アミノレブリン酸を生成する菌株（光合成細菌の５
−アミノレブリン酸蓄積に対する天然成分の阻害に脱感
作した菌株）が存在すること、（ｂ）この菌株を使用す
れば、天然成分を添加した培地での菌体の高濃度化を計
ることができるとともに、５−アミノレブリン酸を高収
率で製造することができること、を踏まえて、さらに研
究を進めた結果、（ｃ）培地に添加する天然成分の種
類、量、そして添加方法を工夫することにより、５−ア
ミノレブリン酸蓄積を阻害しないばかりか、蓄積が著し
く促進されることを見出し、よって５−アミノレブリン
酸をこれまでの製造法よりも高収率で製造できること、
を確認し、本発明を開発するに至った。
【００１１】すなわち、本発明の５−アミノレブリン酸
の製造方法は、 〔１〕酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカ
ー、カザミノ酸、麦芽エキスからなる群の天然成分から
選ばれる少なくとも１種を、培地に２〜５０ｇ／リット
ル（以下、リットルを「Ｌ」と記し、ミリリットルを
「ｍＬ」と記す）添加するに際し、 （１）菌体増殖が対数増殖期中期以降に達した後に、一
度に、または連続的もしくは断続的に添加するか、 （２）培養開始時に１〜１０ｇ／Ｌを添加し、菌体増殖
が対数増殖期中期以降に達した後に、１〜４９ｇ／Ｌ
を、一度に、または連続的もしくは断続的に添加して、ロドバクター セファロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅ
ｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）に属する ５−アミノレブ
リン酸生産菌を培養することを特徴とし、 〔２〕５−アミノレブリン酸生産菌が工業技術院微生物
工業技術研究所微工研菌寄第１２５４２号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１２５４２）、第１２５４３号（ＦＥＲＭＰ−１２
５４３）の一方または双方であることをも特徴とする。
の製造方法は、 〔１〕酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカ
ー、カザミノ酸、麦芽エキスからなる群の天然成分から
選ばれる少なくとも１種を、培地に２〜５０ｇ／リット
ル（以下、リットルを「Ｌ」と記し、ミリリットルを
「ｍＬ」と記す）添加するに際し、 （１）菌体増殖が対数増殖期中期以降に達した後に、一
度に、または連続的もしくは断続的に添加するか、 （２）培養開始時に１〜１０ｇ／Ｌを添加し、菌体増殖
が対数増殖期中期以降に達した後に、１〜４９ｇ／Ｌ
を、一度に、または連続的もしくは断続的に添加して、ロドバクター セファロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅ
ｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）に属する ５−アミノレブ
リン酸生産菌を培養することを特徴とし、 〔２〕５−アミノレブリン酸生産菌が工業技術院微生物
工業技術研究所微工研菌寄第１２５４２号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１２５４２）、第１２５４３号（ＦＥＲＭＰ−１２
５４３）の一方または双方であることをも特徴とする。
【００１２】本発明の製造方法に使用する５−アミノレ
ブリン酸生産菌は、光合成細菌であるロドバクター セ
ファロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒ
ｏｉｄｅｓ）を親株とし、これを変異して得られるもの
であって、上記した特定の天然成分の特定量を添加した
培地で５−アミノレブリン酸を生産することのできる菌
株（天然成分による５−アミノレブリン酸蓄積阻害に脱
感作した菌株）である。具体例として、工業技術院微生
物工業技術研究所微工研菌寄第１２５４２号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１２５４２），第１２５４３号（ＦＥＲＭ Ｐ−
１２５４３）として寄託されたものが挙げられる。これ
ら微工研菌寄第１２５４２号および第１２５４３号の分
離方法を、以下に例示する。
ブリン酸生産菌は、光合成細菌であるロドバクター セ
ファロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒ
ｏｉｄｅｓ）を親株とし、これを変異して得られるもの
であって、上記した特定の天然成分の特定量を添加した
培地で５−アミノレブリン酸を生産することのできる菌
株（天然成分による５−アミノレブリン酸蓄積阻害に脱
感作した菌株）である。具体例として、工業技術院微生
物工業技術研究所微工研菌寄第１２５４２号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１２５４２），第１２５４３号（ＦＥＲＭ Ｐ−
１２５４３）として寄託されたものが挙げられる。これ
ら微工研菌寄第１２５４２号および第１２５４３号の分
離方法を、以下に例示する。
【００１３】上記の親株の増殖に必要な成分を試験管に
分注し、滅菌した後、親株を接種し、光照射下において
静置培養する。この培養液を緩衝液で洗浄した後、変異
操作を行う。この変異操作としては、通常の変異手法を
採用することができる。例えば、紫外線，電離放射線等
の物理的変異原を寒天培地上の親株に照射したり、エチ
ルメタンスルフォネート（ＥＭＳ），Ｎ−メチル−Ｎ′
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ），エチル
ニトロソ尿素（ＥＮＵ）等のアルキル化剤やブロモデオ
キシウリジン（ＢｒｄＵｒｄ）等の塩基アナログ等の化
学的変異原を添加した緩衝液中で親株を培養したり、あ
るいはトランスポゾン変異法等の生物的変異原を用いる
方法がある。
分注し、滅菌した後、親株を接種し、光照射下において
静置培養する。この培養液を緩衝液で洗浄した後、変異
操作を行う。この変異操作としては、通常の変異手法を
採用することができる。例えば、紫外線，電離放射線等
の物理的変異原を寒天培地上の親株に照射したり、エチ
ルメタンスルフォネート（ＥＭＳ），Ｎ−メチル−Ｎ′
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ），エチル
ニトロソ尿素（ＥＮＵ）等のアルキル化剤やブロモデオ
キシウリジン（ＢｒｄＵｒｄ）等の塩基アナログ等の化
学的変異原を添加した緩衝液中で親株を培養したり、あ
るいはトランスポゾン変異法等の生物的変異原を用いる
方法がある。
【００１４】上記のような変異手法によって上記の親株
を変異した後、さらに緩衝液で洗浄し、寒天培地等に撒
き、培養する。なお、この培養により生育した変異株の
中から、上記した特定の天然成分の特定量を添加した培
地においても５−アミノレブリン酸を生産することので
きる菌株を選択するには、これらの変異株を後述するよ
うな培地で培養し、培養液中の５−アミノレブリン酸を
測定し、５−アミノレブリン酸が生成されているか否か
を確認することによって行われる。
を変異した後、さらに緩衝液で洗浄し、寒天培地等に撒
き、培養する。なお、この培養により生育した変異株の
中から、上記した特定の天然成分の特定量を添加した培
地においても５−アミノレブリン酸を生産することので
きる菌株を選択するには、これらの変異株を後述するよ
うな培地で培養し、培養液中の５−アミノレブリン酸を
測定し、５−アミノレブリン酸が生成されているか否か
を確認することによって行われる。
【００１５】以上のような分離・変異操作に用いる培地
には、変異前の親株の場合，変異後の変異菌の場合とも
同様のものでよく、グルタミン酸，リンゴ酸，酢酸，ピ
ルビン酸，乳酸，コハク酸，フマル酸，酒石酸，グルコ
ン酸，エタノール，グリセロール，グルコース，フルク
トース，マンニトール，ソルビトール，酵母エキス等の
炭素源の他に、一般的な培地成分、あるいは通常光合成
細菌の培養に用いられる成分が添加される。一般的な培
地成分としては、窒素源として、例えばアンモニア，塩
化アンモニウム，燐酸アンモニウム，硫酸アンモニウ
ム，炭酸アンモニウム，酢酸アンモニウム，硝酸アンモ
ニウム，硝酸ナトリウム，尿素等の無機窒素化合物や、
酵母エキス，乾燥酵母，ペプトン，肉エキス，コーンス
ティープリカー，カザミノ酸等の有機窒素源を用いるこ
とができる。また無機塩類として、例えばカリウム，ナ
トリウム，鉄，マグネシウム，マンガン，銅，カルシウ
ム，コバルト等の各塩類等を用いることができる。
には、変異前の親株の場合，変異後の変異菌の場合とも
同様のものでよく、グルタミン酸，リンゴ酸，酢酸，ピ
ルビン酸，乳酸，コハク酸，フマル酸，酒石酸，グルコ
ン酸，エタノール，グリセロール，グルコース，フルク
トース，マンニトール，ソルビトール，酵母エキス等の
炭素源の他に、一般的な培地成分、あるいは通常光合成
細菌の培養に用いられる成分が添加される。一般的な培
地成分としては、窒素源として、例えばアンモニア，塩
化アンモニウム，燐酸アンモニウム，硫酸アンモニウ
ム，炭酸アンモニウム，酢酸アンモニウム，硝酸アンモ
ニウム，硝酸ナトリウム，尿素等の無機窒素化合物や、
酵母エキス，乾燥酵母，ペプトン，肉エキス，コーンス
ティープリカー，カザミノ酸等の有機窒素源を用いるこ
とができる。また無機塩類として、例えばカリウム，ナ
トリウム，鉄，マグネシウム，マンガン，銅，カルシウ
ム，コバルト等の各塩類等を用いることができる。
【００１６】培養条件としては、親株，変異株ともｐＨ
約５〜１０，温度約１５〜４５℃，培養時間約１〜２０
日間で、菌体を生育させるには、親株、変異株とも約
０．５〜５０ｋｌｕｘの光照射嫌気条件下が好ましく、
また好気暗条件下であっても良い。
約５〜１０，温度約１５〜４５℃，培養時間約１〜２０
日間で、菌体を生育させるには、親株、変異株とも約
０．５〜５０ｋｌｕｘの光照射嫌気条件下が好ましく、
また好気暗条件下であっても良い。
【００１７】以上の分離・変異操作によって得られる菌
株の例であるＣＲ−２８６およびＣＲ−２Ｓ５は、親株
とほぼ同様の菌学的性質を有し、かつ上記した特定の天
然成分を添加した培地で５−アミノレブリン酸を生産す
る。このＣＲ−２８６およびＣＲ−２Ｓ５株が、工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１２５４２号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５４２）および第１２５４３号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５４３）として寄託されている。
株の例であるＣＲ−２８６およびＣＲ−２Ｓ５は、親株
とほぼ同様の菌学的性質を有し、かつ上記した特定の天
然成分を添加した培地で５−アミノレブリン酸を生産す
る。このＣＲ−２８６およびＣＲ−２Ｓ５株が、工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１２５４２号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５４２）および第１２５４３号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５４３）として寄託されている。
【００１８】本発明の製造方法では、上記したＣＲ−２
８６やＣＲ−２Ｓ５株に代表される５−アミノレブリン
酸生産菌に限らず、他の作出方法によって得られるも
の，他の菌を親株として得られるものを使用することが
できる。これらの５−アミノレブリン酸生産菌を、特定
の天然成分の特定量を特定の方法で添加した培地で培養
することにより、これらの５−アミノレブリン酸生産菌
を高濃度化し、かつ５−アミノレブリン酸を高収率で製
造することができる。
８６やＣＲ−２Ｓ５株に代表される５−アミノレブリン
酸生産菌に限らず、他の作出方法によって得られるも
の，他の菌を親株として得られるものを使用することが
できる。これらの５−アミノレブリン酸生産菌を、特定
の天然成分の特定量を特定の方法で添加した培地で培養
することにより、これらの５−アミノレブリン酸生産菌
を高濃度化し、かつ５−アミノレブリン酸を高収率で製
造することができる。
【００１９】以下、ＣＲ−２８６やＣＲ−２Ｓ５株を用
いて、本発明の製造方法により、５−アミノレブリン酸
を製造する場合につき、詳細に説明する。先ず、培地と
しては、上記の分離・変異操作に用いる培地に、酵母エ
キス、ペプトン、コーンスティープリカー、カザミノ
酸、麦芽エキスからなる群の天然成分から選ばれる少な
くとも１種２〜５０ｇ／Ｌを下記の方法で添加した培地
（以下、「特定培地」と言う）を使用する。培養条件
は、前述の分離・変異操作の条件と同様である。ただ
し、この場合、約０．５〜５０ｋｌｕｘの光照射嫌気条
件が望ましい。
いて、本発明の製造方法により、５−アミノレブリン酸
を製造する場合につき、詳細に説明する。先ず、培地と
しては、上記の分離・変異操作に用いる培地に、酵母エ
キス、ペプトン、コーンスティープリカー、カザミノ
酸、麦芽エキスからなる群の天然成分から選ばれる少な
くとも１種２〜５０ｇ／Ｌを下記の方法で添加した培地
（以下、「特定培地」と言う）を使用する。培養条件
は、前述の分離・変異操作の条件と同様である。ただ
し、この場合、約０．５〜５０ｋｌｕｘの光照射嫌気条
件が望ましい。
【００２０】上記の天然成分の添加量は少なすぎると、
５−アミノレブリン酸蓄積の促進効果が出ず、逆に多す
ぎても、菌体の生育が阻害されるため、培地全体に対
し、添加総量で約２〜５０ｇ／Ｌ、好ましくは約３〜５
０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは約５〜３０ｇ／Ｌの範囲内
とする。
５−アミノレブリン酸蓄積の促進効果が出ず、逆に多す
ぎても、菌体の生育が阻害されるため、培地全体に対
し、添加総量で約２〜５０ｇ／Ｌ、好ましくは約３〜５
０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは約５〜３０ｇ／Ｌの範囲内
とする。
【００２１】なお、天然成分の添加量を約２ｇ／Ｌとす
る場合は、前述した先提案の実施例や後述の表６にも示
すように、培養開始時に全量を一度に添加しても、５−
アミノレブリン酸生産菌の生育が阻害されることはな
く、菌体濃度を高濃度化することができる。これに対
し、天然成分の添加量を約３ｇ／Ｌ以上もの大量にする
場合は、５−アミノレブリン酸の蓄積は促進されて、５
−アミノレブリン酸の製造量は増加するが、５−アミノ
レブリン酸生産菌の生育が阻害され、菌体の高濃度化を
図ることができず、したがって５−アミノレブリン酸の
製造量にも限界が生じてくる。
る場合は、前述した先提案の実施例や後述の表６にも示
すように、培養開始時に全量を一度に添加しても、５−
アミノレブリン酸生産菌の生育が阻害されることはな
く、菌体濃度を高濃度化することができる。これに対
し、天然成分の添加量を約３ｇ／Ｌ以上もの大量にする
場合は、５−アミノレブリン酸の蓄積は促進されて、５
−アミノレブリン酸の製造量は増加するが、５−アミノ
レブリン酸生産菌の生育が阻害され、菌体の高濃度化を
図ることができず、したがって５−アミノレブリン酸の
製造量にも限界が生じてくる。
【００２２】そこで、５−アミノレブリン酸生産菌の高
濃度化をも図るべく、延いては５−アミノレブリン酸の
製造量の増大をも図るべく、添加方法を次のようにする
ことが重要である。 （１）菌体増殖が対数増殖期中期以降に達した後に、一
度に、または連続的もしくは断続的に添加するか、 （２）培養開始時に１〜１０ｇ／Ｌを添加し、菌体増殖
が対数増殖期中期以降に達した後に、１〜４９ｇ／Ｌ
を、一度に、または連続的もしくは断続的に添加する。 なお、上記の対数増殖期とは、細菌の数が対数的に増加
していく時期であり、微工研菌寄第１２５４２号、第１
２５４３号を使用する場合には、植菌後、約２４〜４８
時間で終了する。
濃度化をも図るべく、延いては５−アミノレブリン酸の
製造量の増大をも図るべく、添加方法を次のようにする
ことが重要である。 （１）菌体増殖が対数増殖期中期以降に達した後に、一
度に、または連続的もしくは断続的に添加するか、 （２）培養開始時に１〜１０ｇ／Ｌを添加し、菌体増殖
が対数増殖期中期以降に達した後に、１〜４９ｇ／Ｌ
を、一度に、または連続的もしくは断続的に添加する。 なお、上記の対数増殖期とは、細菌の数が対数的に増加
していく時期であり、微工研菌寄第１２５４２号、第１
２５４３号を使用する場合には、植菌後、約２４〜４８
時間で終了する。
【００２３】上記の（１）では、所定の菌体増殖時期に
達した時点で、一度に、または連続的もしくは断続的に
添加し、上記の（２）では、培養開始時に必要量の一部
を添加しておき、所定の菌体増殖時期に達した時点で、
残部を、一度に、または連続的もしくは断続的に添加し
てもよい。なお、（１），（２）の連続的もしくは断続
的に添加する際には、同量づつであってもよいし、徐々
に多量となるようにしてもよい。天然成分による５−ア
ミノレブリン酸生産菌の生育阻害が多く見られる場合
は、後者の徐々に多量となるようにすることが好まし
い。
達した時点で、一度に、または連続的もしくは断続的に
添加し、上記の（２）では、培養開始時に必要量の一部
を添加しておき、所定の菌体増殖時期に達した時点で、
残部を、一度に、または連続的もしくは断続的に添加し
てもよい。なお、（１），（２）の連続的もしくは断続
的に添加する際には、同量づつであってもよいし、徐々
に多量となるようにしてもよい。天然成分による５−ア
ミノレブリン酸生産菌の生育阻害が多く見られる場合
は、後者の徐々に多量となるようにすることが好まし
い。
【００２４】また、上記の天然成分を添加した特定培地
には、５−アミノレブリン酸のプレカーサであるグリシ
ンとコハク酸もしくはグルタミン酸を添加すると、より
高濃度の５−アミノレブリン酸を生成することができる
が、培養開始時にグリシンとコハク酸もしくはグルタミ
ン酸を添加すると、菌株の増殖速度が遅くなるため、あ
る程度増殖した時点で添加することが好ましい。添加量
は、グリシンとコハク酸もしくはグルタミン酸のいずれ
の場合も、余り少なすぎると添加効果がなく、逆に余り
多すぎても菌体の生育が阻害されるため、培地全体に対
し、約１０〜８０ｍｍｏｌ／Ｌ、特に約１５〜４５ｍｍ
ｏｌ／Ｌの範囲内とすることが好ましい。添加方法は、
一度に全量を添加してもよいが、連続的にまたは断続的
に添加してもよい。後者の場合は、同量づつであっても
よいし、徐々に多量となるようにしてもよい。５−アミ
ノレブリン酸生産菌の生育阻害が多く見られる場合は、
後者の徐々に多量となるようにすることが好ましい。
には、５−アミノレブリン酸のプレカーサであるグリシ
ンとコハク酸もしくはグルタミン酸を添加すると、より
高濃度の５−アミノレブリン酸を生成することができる
が、培養開始時にグリシンとコハク酸もしくはグルタミ
ン酸を添加すると、菌株の増殖速度が遅くなるため、あ
る程度増殖した時点で添加することが好ましい。添加量
は、グリシンとコハク酸もしくはグルタミン酸のいずれ
の場合も、余り少なすぎると添加効果がなく、逆に余り
多すぎても菌体の生育が阻害されるため、培地全体に対
し、約１０〜８０ｍｍｏｌ／Ｌ、特に約１５〜４５ｍｍ
ｏｌ／Ｌの範囲内とすることが好ましい。添加方法は、
一度に全量を添加してもよいが、連続的にまたは断続的
に添加してもよい。後者の場合は、同量づつであっても
よいし、徐々に多量となるようにしてもよい。５−アミ
ノレブリン酸生産菌の生育阻害が多く見られる場合は、
後者の徐々に多量となるようにすることが好ましい。
【００２５】また、５−アミノレブリン酸デヒドラター
ゼの活性阻害物質を添加することもできる。例えば、こ
の阻害物質としてレブリン酸を使用する場合、レブリン
酸の添加方法は、培養開始時（あるいはグリシンとコハ
ク酸の添加時）から一定の間隔で少量（同量）づつ添加
してもよいし、培養開始時（あるいはグリシンとコハク
酸の添加時）に全量添加しておいてもよい。菌の生育が
対数増殖期中期を過ぎた後に、全量を一度に、あるいは
少量（同量）づつ添加するとなおよい。
ゼの活性阻害物質を添加することもできる。例えば、こ
の阻害物質としてレブリン酸を使用する場合、レブリン
酸の添加方法は、培養開始時（あるいはグリシンとコハ
ク酸の添加時）から一定の間隔で少量（同量）づつ添加
してもよいし、培養開始時（あるいはグリシンとコハク
酸の添加時）に全量添加しておいてもよい。菌の生育が
対数増殖期中期を過ぎた後に、全量を一度に、あるいは
少量（同量）づつ添加するとなおよい。
【００２６】培養液のｐＨは５〜１０の範囲内で、例え
ばＨＣｌ水溶液等の酸またはＮａＯＨ水溶液等のアルカ
リを用いて一定に保つことにより、より高濃度の５−ア
ミノレブリン酸を製造することができる。
ばＨＣｌ水溶液等の酸またはＮａＯＨ水溶液等のアルカ
リを用いて一定に保つことにより、より高濃度の５−ア
ミノレブリン酸を製造することができる。
【００２７】５−アミノレブリン酸の蓄積量は、培養後
一定時間が通過すると、減少してしまう。これは、培養
液中に添加されている上記のレブリン酸が代謝等により
減少してしまうため、レブリン酸による５−アミノレブ
リン酸デヒドラターゼの活性阻害効果が弱まり、５−ア
ミノレブリン酸が代謝されるためと考えられる。したが
って、５−アミノレブリン酸を高効率で製造するには、
所定の時間経過後（すなわち、５−アミノレブリン酸の
蓄積量がピークとなった時点で）、培養を停止すればよ
い。
一定時間が通過すると、減少してしまう。これは、培養
液中に添加されている上記のレブリン酸が代謝等により
減少してしまうため、レブリン酸による５−アミノレブ
リン酸デヒドラターゼの活性阻害効果が弱まり、５−ア
ミノレブリン酸が代謝されるためと考えられる。したが
って、５−アミノレブリン酸を高効率で製造するには、
所定の時間経過後（すなわち、５−アミノレブリン酸の
蓄積量がピークとなった時点で）、培養を停止すればよ
い。
【００２８】以上のようにして得られる培養液または反
応液中の５−アミノレブリン酸は、常法により精製する
ことができる。例えば、溶剤抽出等の方法によって回収
することができ、このときカラムクロマトグラフィ等の
公知の精製方法を適宜併用することもできる。
応液中の５−アミノレブリン酸は、常法により精製する
ことができる。例えば、溶剤抽出等の方法によって回収
することができ、このときカラムクロマトグラフィ等の
公知の精製方法を適宜併用することもできる。
【００２９】
【作用】本発明の製造方法では、使用するロドバクター
セファロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａ
ｅｒｏｉｄｅｓ）に属する５−アミノレブリン酸生産菌
が、特定の天然成分が特定量で添加された培地におい
て、５−アミノレブリン酸を生成し、培養液中に５−ア
ミノレブリン酸を多量に蓄積する作用をなすため、５−
アミノレブリン酸が高収率で製造される。
セファロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａ
ｅｒｏｉｄｅｓ）に属する５−アミノレブリン酸生産菌
が、特定の天然成分が特定量で添加された培地におい
て、５−アミノレブリン酸を生成し、培養液中に５−ア
ミノレブリン酸を多量に蓄積する作用をなすため、５−
アミノレブリン酸が高収率で製造される。
【００３０】このとき、本発明の製造方法では、特定の
天然成分の特定量を、特定の方法で添加するため、該天
然成分による５−アミノレブリン酸生産菌の生育阻害が
一層効果的に回避されて、菌体が高濃度化され、かつ５
−アミノレブリン酸の生産量も一層向上する。
天然成分の特定量を、特定の方法で添加するため、該天
然成分による５−アミノレブリン酸生産菌の生育阻害が
一層効果的に回避されて、菌体が高濃度化され、かつ５
−アミノレブリン酸の生産量も一層向上する。
【００３１】
〔５−アミノレブリン酸生産菌の分離〕表１に示す光合
成細菌用の最小培地であるグルタメート・マレート培地
（培地１）の培地成分を、水道水１Ｌに溶かして培地１
を調製した。培地１のｐＨは６．８であった。
成細菌用の最小培地であるグルタメート・マレート培地
（培地１）の培地成分を、水道水１Ｌに溶かして培地１
を調製した。培地１のｐＨは６．８であった。
【００３２】
【表１】
【００３３】上記の培地１に酵母エキス２ｇ／Ｌを添加
して調製した培地（培地２）を、外径２１ｍｍの試験管
に１０ｍＬ入れ、１２１℃で１５分間滅菌し、光合成細
菌であるロドバクター・セファロイデス（Ｒｈｏｄｏｂ
ａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ＩＦＯ１２２０
３を１白金耳植え継ぎ、３０℃，５ｋｌｕｘの光照射下
で３日間静置培養した。別の試験管に培地２を１０ｍＬ
分注し、滅菌した。この培地２に上記の培養液１を３白
金耳植え継ぎ、３０℃，２５０ｒｐｍで８時間往復振盪
培養した。この培養液２を、洗浄のため、１５，０００
ｒｐｍにて３０秒間遠心分離し、その上清を捨て、遠心
分離前の培養液２と同量になるようにトリス・マレイン
酸バッファ（ｐＨ６．０）に懸濁させた。この洗浄操作
を、さらに２度繰り返した。
して調製した培地（培地２）を、外径２１ｍｍの試験管
に１０ｍＬ入れ、１２１℃で１５分間滅菌し、光合成細
菌であるロドバクター・セファロイデス（Ｒｈｏｄｏｂ
ａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ＩＦＯ１２２０
３を１白金耳植え継ぎ、３０℃，５ｋｌｕｘの光照射下
で３日間静置培養した。別の試験管に培地２を１０ｍＬ
分注し、滅菌した。この培地２に上記の培養液１を３白
金耳植え継ぎ、３０℃，２５０ｒｐｍで８時間往復振盪
培養した。この培養液２を、洗浄のため、１５，０００
ｒｐｍにて３０秒間遠心分離し、その上清を捨て、遠心
分離前の培養液２と同量になるようにトリス・マレイン
酸バッファ（ｐＨ６．０）に懸濁させた。この洗浄操作
を、さらに２度繰り返した。
【００３４】この後、再び１５，０００ｒｐｍにて３０
秒間遠心分離し、その上清を捨て、化学的変異原である
Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
（ＮＴＧ）を１００μｇ／ｍＬの濃度になるように添加
し、３０℃で８０分間静置インキュベートした。
秒間遠心分離し、その上清を捨て、化学的変異原である
Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
（ＮＴＧ）を１００μｇ／ｍＬの濃度になるように添加
し、３０℃で８０分間静置インキュベートした。
【００３５】このようにして処理した菌１を、上記と同
様の方法で３回洗浄した後、別の試験管に分注し、滅菌
した培地２に植え継ぎ、３０℃，２５０ｒｐｍで２日間
往復振盪培養した。培地２に寒天１７ｇ／Ｌを添加して
調製した培地を１２１℃で１５分間滅菌し、同じく滅菌
したシャーレに撒いて、寒天平板培地を調製した。この
シャーレに、上記の培養液（菌１の培養液）３を滅菌水
で１，０００倍に希釈して塗布し、３０℃で４日間培養
した。上記のようにして得られたコロニー約１４，００
０個を、それぞれ培地２に植菌し、３０℃，５ｋｌｕｘ
で１．５日間静置培養した。
様の方法で３回洗浄した後、別の試験管に分注し、滅菌
した培地２に植え継ぎ、３０℃，２５０ｒｐｍで２日間
往復振盪培養した。培地２に寒天１７ｇ／Ｌを添加して
調製した培地を１２１℃で１５分間滅菌し、同じく滅菌
したシャーレに撒いて、寒天平板培地を調製した。この
シャーレに、上記の培養液（菌１の培養液）３を滅菌水
で１，０００倍に希釈して塗布し、３０℃で４日間培養
した。上記のようにして得られたコロニー約１４，００
０個を、それぞれ培地２に植菌し、３０℃，５ｋｌｕｘ
で１．５日間静置培養した。
【００３６】次いで、グリシンとコハク酸をそれぞれ３
０ｍｍｏｌ／Ｌ、レブリン酸を１５ｍｍｏｌ／Ｌになる
ように添加し、培養を更に２日間続けた。その後、培養
液の上清から５−アミノレブリン酸を定量した。これら
約１４，０００個の変異菌株の中に、培地２中で５−ア
ミノレブリン酸を生成する菌株が数株存在していた。こ
の５−アミノレブリン酸を生成する菌株のうち生成量の
多い２株を、それぞれロドバクター セファロイデス
ＣＲ−２８６およびＣＲ−２Ｓ５と命名した。
０ｍｍｏｌ／Ｌ、レブリン酸を１５ｍｍｏｌ／Ｌになる
ように添加し、培養を更に２日間続けた。その後、培養
液の上清から５−アミノレブリン酸を定量した。これら
約１４，０００個の変異菌株の中に、培地２中で５−ア
ミノレブリン酸を生成する菌株が数株存在していた。こ
の５−アミノレブリン酸を生成する菌株のうち生成量の
多い２株を、それぞれロドバクター セファロイデス
ＣＲ−２８６およびＣＲ−２Ｓ５と命名した。
【００３７】〔５−アミノレブリン酸の製造〕 参考例１ 上述の５−アミノレブリン酸生産菌の分離例で得られた
変異菌株ＣＲ−２８６（微工研菌寄第１２５４２号）お
よびＣＲ−２Ｓ５（微工研菌寄１２５４３号）を、それ
ぞれ各３本づつ試験管に入れた特定培地（実施例１の培
地１に、天然成分として酵母エキス２ｇ／Ｌを添加した
もの）（培地量１０ｍＬ）に接種し、３０℃，５ｋｌｕ
ｘの光照射下で１．５日間静置培養した。次いで、グリ
シンとコハク酸をそれぞれ３０ｍｍｏｌ／Ｌ、レブリン
酸を０，１０，３０ｍｍｏｌ／Ｌになるように添加し、
培養を続けた。その後、培養液中に生成される５−アミ
ノレブリン酸の量の経時変化を測定した。この結果を、
表２に示す。
変異菌株ＣＲ−２８６（微工研菌寄第１２５４２号）お
よびＣＲ−２Ｓ５（微工研菌寄１２５４３号）を、それ
ぞれ各３本づつ試験管に入れた特定培地（実施例１の培
地１に、天然成分として酵母エキス２ｇ／Ｌを添加した
もの）（培地量１０ｍＬ）に接種し、３０℃，５ｋｌｕ
ｘの光照射下で１．５日間静置培養した。次いで、グリ
シンとコハク酸をそれぞれ３０ｍｍｏｌ／Ｌ、レブリン
酸を０，１０，３０ｍｍｏｌ／Ｌになるように添加し、
培養を続けた。その後、培養液中に生成される５−アミ
ノレブリン酸の量の経時変化を測定した。この結果を、
表２に示す。
【００３８】
【表２】
【００３９】表２から明らかなように、ＣＲ−２８６及
びＣＲ−２Ｓ５は、特定培地中で多量の５−アミノレブ
リン酸を生成していることが判る。また、５−アミノレ
ブリン酸の生成量は、一定の時間が経過すると、減少し
てしまう。これは、前述したように、培養液中に添加し
たレブリン酸が代謝等により減少してしまうことによ
り、５−アミノレブリン酸デヒドラターゼへの阻害効果
が弱まり、５−アミノレブリン酸が代謝されることを明
示していると解される。
びＣＲ−２Ｓ５は、特定培地中で多量の５−アミノレブ
リン酸を生成していることが判る。また、５−アミノレ
ブリン酸の生成量は、一定の時間が経過すると、減少し
てしまう。これは、前述したように、培養液中に添加し
たレブリン酸が代謝等により減少してしまうことによ
り、５−アミノレブリン酸デヒドラターゼへの阻害効果
が弱まり、５−アミノレブリン酸が代謝されることを明
示していると解される。
【００４０】実施例１〜２０，比較例１〜５ 表３に示す光合成細菌用の最小培地であるグルタメート
・マレート培地の培地成分を水道水１Ｌに溶かして培地
３を調製した。培地３のｐＨは、６．８であった。
・マレート培地の培地成分を水道水１Ｌに溶かして培地
３を調製した。培地３のｐＨは、６．８であった。
【００４１】
【表３】
【００４２】上記の培地３に、天然成分として酵母エキ
ス（株式会社日本製薬製商品名「Ｅｘｔｒａｃｔ Ｙｅ
ａｓｔ Ｄ−３，Ｄｒｙ」），カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ
製商品名「Ｃａｓａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ，Ｂａｃｔｏ
Ｖｉｔａｍｉｎ ａｓｓａｙ」），ペプトン（株式会社
日本製薬商品名「ポリペプトン」），麦芽エキス（Ｄｉ
ｆｃｏ製商品名「Ｍａｌｔ Ｅｘｔｒａｃｔ，Ｂａｃｔ
ｏ」），コーンスティープリカー（和光純薬株式会社製
薬商品名「Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｌｉｑｕｏｒ，Ｐｏ
ｗｄｅｒ」）の５種類を、それぞれ０ｇ／Ｌ，２ｇ／
Ｌ，５ｇ／Ｌ，１０ｇ／Ｌ，１５ｇ／Ｌになるように添
加し、計２５種類の特定培地を調製し、外径２１ｍｍの
試験官に１０ｍＬ入れ、１２１℃で１５分間滅菌した。
次に、ＣＲ−２８６（微工研菌寄第１２５４２号）を接
種し、３０℃，５ｋｌｕｘの光照射下で、２４時間静置
培養した。次いで、グリシンとコハク酸をそれぞれ３０
ｍｍｏｌ／Ｌ、レブリン酸を１５ｍｍｏｌ／Ｌ添加し、
培養を続けた。培養液中に蓄積する５−アミノレブリン
酸の量の経時変化を測定した。この結果を表４に示す。
ス（株式会社日本製薬製商品名「Ｅｘｔｒａｃｔ Ｙｅ
ａｓｔ Ｄ−３，Ｄｒｙ」），カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ
製商品名「Ｃａｓａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ，Ｂａｃｔｏ
Ｖｉｔａｍｉｎ ａｓｓａｙ」），ペプトン（株式会社
日本製薬商品名「ポリペプトン」），麦芽エキス（Ｄｉ
ｆｃｏ製商品名「Ｍａｌｔ Ｅｘｔｒａｃｔ，Ｂａｃｔ
ｏ」），コーンスティープリカー（和光純薬株式会社製
薬商品名「Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｌｉｑｕｏｒ，Ｐｏ
ｗｄｅｒ」）の５種類を、それぞれ０ｇ／Ｌ，２ｇ／
Ｌ，５ｇ／Ｌ，１０ｇ／Ｌ，１５ｇ／Ｌになるように添
加し、計２５種類の特定培地を調製し、外径２１ｍｍの
試験官に１０ｍＬ入れ、１２１℃で１５分間滅菌した。
次に、ＣＲ−２８６（微工研菌寄第１２５４２号）を接
種し、３０℃，５ｋｌｕｘの光照射下で、２４時間静置
培養した。次いで、グリシンとコハク酸をそれぞれ３０
ｍｍｏｌ／Ｌ、レブリン酸を１５ｍｍｏｌ／Ｌ添加し、
培養を続けた。培養液中に蓄積する５−アミノレブリン
酸の量の経時変化を測定した。この結果を表４に示す。
【００４３】
【表４】
【００４４】表４から明らかなように、天然成分による
５−アミノレブリン酸の蓄積阻害に脱感作した菌株ＣＲ
−２８６に対して、天然成分の添加は著しい蓄積促進を
示している。しかし、酵母エキスの場合、添加量が１５
ｇ／Ｌになると蓄積量が減少しているが、これは生育阻
害がかかっているためと思われる。
５−アミノレブリン酸の蓄積阻害に脱感作した菌株ＣＲ
−２８６に対して、天然成分の添加は著しい蓄積促進を
示している。しかし、酵母エキスの場合、添加量が１５
ｇ／Ｌになると蓄積量が減少しているが、これは生育阻
害がかかっているためと思われる。
【００４５】実施例２１ ＣＲ−２８６を、実施例１〜２０で調製した培地３に、
実施例１〜４で使用したものと同じ酵母エキスを２ｇ／
Ｌとなるように添加して調製した特定培地に接種し、３
０℃、５ｋｌｕｘの光照射下で培養を開始した。４８時
間経過後（すなわち、菌体増殖が対数増殖期中期以降に
達した後）、グリシンとコハク酸を各３０ｍｍｏｌ／
Ｌ、レブリン酸を３０ｍｍｏｌ／Ｌ、上記と同じ酵母エ
キスを１０ｇ／Ｌとなるように添加し、その後、レブリ
ン酸を２４時間毎に２回、１５ｍｍｏｌ／Ｌとなるよう
に添加した。また、２Ｎ−ＨＣｌ水溶液と、２Ｎ−Ｎａ
ＯＨ水溶液とを用いて、培養中の培養液をｐＨ６．５に
制御した。以上のような生産培養中に蓄積した５−アミ
ノレブリン酸量の最高値は、１．８ｇ／Ｌであった。
実施例１〜４で使用したものと同じ酵母エキスを２ｇ／
Ｌとなるように添加して調製した特定培地に接種し、３
０℃、５ｋｌｕｘの光照射下で培養を開始した。４８時
間経過後（すなわち、菌体増殖が対数増殖期中期以降に
達した後）、グリシンとコハク酸を各３０ｍｍｏｌ／
Ｌ、レブリン酸を３０ｍｍｏｌ／Ｌ、上記と同じ酵母エ
キスを１０ｇ／Ｌとなるように添加し、その後、レブリ
ン酸を２４時間毎に２回、１５ｍｍｏｌ／Ｌとなるよう
に添加した。また、２Ｎ−ＨＣｌ水溶液と、２Ｎ−Ｎａ
ＯＨ水溶液とを用いて、培養中の培養液をｐＨ６．５に
制御した。以上のような生産培養中に蓄積した５−アミ
ノレブリン酸量の最高値は、１．８ｇ／Ｌであった。
【００４６】実施例２２，２３ 実施例１〜４で使用したものと同じ酵母エキスと、実施
例９〜１２で使用したものと同じペプトンとを、各５ｇ
／Ｌづつ、または１０ｇ／Ｌづつ、２種類同時に添加し
た以外は、実施例１〜２０および比較例１〜５と同様に
して培養を行った。この結果を表５に示す。
例９〜１２で使用したものと同じペプトンとを、各５ｇ
／Ｌづつ、または１０ｇ／Ｌづつ、２種類同時に添加し
た以外は、実施例１〜２０および比較例１〜５と同様に
して培養を行った。この結果を表５に示す。
【００４７】
【表５】
【００４８】実施例２４〜２７、比較例６ ＣＲ−２８６を、実施例１〜２０で調製した培地３に、
実施例１〜４で使用したものと同じ酵母エキスを０ｇ／
Ｌ，２ｇ／Ｌ，５ｇ／Ｌ，１０ｇ／Ｌ，１５ｇ／Ｌにな
るように添加して調製した特定培地に接種し、３０℃、
５ｋｌｕｘの光照射下で４８時間培養した後、菌体重量
を測定した。この結果を表６に示す。
実施例１〜４で使用したものと同じ酵母エキスを０ｇ／
Ｌ，２ｇ／Ｌ，５ｇ／Ｌ，１０ｇ／Ｌ，１５ｇ／Ｌにな
るように添加して調製した特定培地に接種し、３０℃、
５ｋｌｕｘの光照射下で４８時間培養した後、菌体重量
を測定した。この結果を表６に示す。
【００４９】
【表６】
【００５０】表６から明らかなように、天然成分（酵母
エキス）を添加することにより、非常に高い増殖性を示
すことが判る。また、実施例２７のように、１５ｇ／Ｌ
もの天然成分を培養開始時に一度に添加すると、生育阻
害がかかることも判るが、これを実施例２１のように数
回に分けて添加すれば、阻害がかかるどころか、むしろ
生育は促進される。
エキス）を添加することにより、非常に高い増殖性を示
すことが判る。また、実施例２７のように、１５ｇ／Ｌ
もの天然成分を培養開始時に一度に添加すると、生育阻
害がかかることも判るが、これを実施例２１のように数
回に分けて添加すれば、阻害がかかるどころか、むしろ
生育は促進される。
【００５１】実施例２８〜３１、比較例７ 使用した菌株をＣＲ−２Ｓ５（微工研菌寄第１２５４３
号）に、また培地に加える天然成分を酵母エキス１種類
としたこと以外は、すべて実施例１〜２０および比較例
１〜５と同様にして培養を行った。結果を表７に示す。
号）に、また培地に加える天然成分を酵母エキス１種類
としたこと以外は、すべて実施例１〜２０および比較例
１〜５と同様にして培養を行った。結果を表７に示す。
【００５２】
【表７】
【００５３】比較例８〜１２ 使用した菌株を親株（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈ
ａｅｒｏｉｄｅｓ ＩＦＯ１２２０３）としたこと以外
は、すべて実施例２８〜３１および比較例７と同様にし
て培養を行った。結果を表８に示す。
ａｅｒｏｉｄｅｓ ＩＦＯ１２２０３）としたこと以外
は、すべて実施例２８〜３１および比較例７と同様にし
て培養を行った。結果を表８に示す。
【００５４】
【表８】
【００５５】表８から明らかなように、親株であるＲｈ
ｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ＩＦＯ
１２２０３株は、酵母エキスを添加しても５−アミノレ
ブリン酸を蓄積しなかった。
ｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ＩＦＯ
１２２０３株は、酵母エキスを添加しても５−アミノレ
ブリン酸を蓄積しなかった。
【００５６】実施例３２ ＣＲ−２８６（微工研菌寄第１２５４２号）を、実施例
１〜２０で調製した培地３に、実施例１〜４で使用した
ものと同じ酵母エキスを１０ｇ／Ｌになるように添加し
て調製した特定培地（培地４）に接種し、３０℃、５ｋ
ｌｕｘの光照射下で４８時間予備培養した。この菌体
を、遠心分離により回収し、再び、培地４に、菌体濃度
を回収する前の２倍まで高濃度化して再懸濁し、生産培
養を行った。培養条件は、３０℃，５ｋｌｕｘ，光照射
条件下とし、グリシンとコハク酸を各６０ｍｍｏｌ／
Ｌ、レブリン酸を３０ｍｍｏｌ／Ｌになるように生産培
養開始時に添加、その後レブリン酸を２４時間毎に２
回、３０ｍｍｏｌ／Ｌになるように添加した。また、２
Ｎ−ＨＣｌ水溶液、２Ｎ−ＮａＯＨ水溶液を用いて、ｐ
Ｈ６．５の一定に制御した。生産培養中に蓄積した５−
アミノレブリン酸量の経時変化を表９に示す。
１〜２０で調製した培地３に、実施例１〜４で使用した
ものと同じ酵母エキスを１０ｇ／Ｌになるように添加し
て調製した特定培地（培地４）に接種し、３０℃、５ｋ
ｌｕｘの光照射下で４８時間予備培養した。この菌体
を、遠心分離により回収し、再び、培地４に、菌体濃度
を回収する前の２倍まで高濃度化して再懸濁し、生産培
養を行った。培養条件は、３０℃，５ｋｌｕｘ，光照射
条件下とし、グリシンとコハク酸を各６０ｍｍｏｌ／
Ｌ、レブリン酸を３０ｍｍｏｌ／Ｌになるように生産培
養開始時に添加、その後レブリン酸を２４時間毎に２
回、３０ｍｍｏｌ／Ｌになるように添加した。また、２
Ｎ−ＨＣｌ水溶液、２Ｎ−ＮａＯＨ水溶液を用いて、ｐ
Ｈ６．５の一定に制御した。生産培養中に蓄積した５−
アミノレブリン酸量の経時変化を表９に示す。
【００５７】
【表９】
【００５８】表９から明らかなように、天然成分を１０
ｇ／Ｌ添加することにより、５−アミノレブリン酸を最
高約２．４ｇ／Ｌまで蓄積することができる。
ｇ／Ｌ添加することにより、５−アミノレブリン酸を最
高約２．４ｇ／Ｌまで蓄積することができる。
【００５９】
【発明の効果】以上詳述したように、本発明の製造方法
によれば、ロドバクター セファロイデス（Ｒｈｏｄｏ
ｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）に属する５−
アミノレブリン酸生産菌が、特定の天然成分の特定量
を、特定の方法で添加した培地において、非常に高い増
殖率を示し、かつ５−アミノレブリン酸を多量に蓄積す
ることができるため、製造中の菌体濃度を数倍に上昇さ
せることができ、製造効率が大幅に向上し、５−アミノ
レブリン酸の製造コストを低減することができる。
によれば、ロドバクター セファロイデス（Ｒｈｏｄｏ
ｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）に属する５−
アミノレブリン酸生産菌が、特定の天然成分の特定量
を、特定の方法で添加した培地において、非常に高い増
殖率を示し、かつ５−アミノレブリン酸を多量に蓄積す
ることができるため、製造中の菌体濃度を数倍に上昇さ
せることができ、製造効率が大幅に向上し、５−アミノ
レブリン酸の製造コストを低減することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 堀田 康司 埼玉県幸手市権現堂1134−２ 株式会社 コスモ総合研究所 研究開発センター内 (56)参考文献 特開 平１−148193（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−261389（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 13/00 - 13/24 ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (2)
- 【請求項１】 酵母エキス、ペプトン、コーンスティー
プリカー、カザミノ酸、麦芽エキスからなる群の天然成
分から選ばれる少なくとも１種を、培地に２〜５０ｇ／
リットル添加するに際し、 （１）菌体増殖が対数増殖期中期以降に達した後に、一
度に、または連続的もしくは断続的に添加するか、 （２）培養開始時に１〜１０ｇ／リットルを添加し、菌
体増殖が対数増殖期中期以降に達した後に、１〜４９ｇ
／リットルを、一度に、または連続的もしくは断続的に
添加して、 ロドバクター セファロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅ
ｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）に属する ５−アミノレブ
リン酸生産菌を培養することを特徴とする５−アミノレ
ブリン酸の製造方法。 - 【請求項２】 ５−アミノレブリン酸生産菌が工業技術
院微生物工業技術研究所微工研菌寄第１２５４２号（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１２５４２）、第１２５４３号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１２５４３）の一方または双方であることを特徴
とする請求項１記載の５−アミノレブリン酸の製造方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4322694A JP2816422B2 (ja) | 1992-11-08 | 1992-11-08 | 微生物による５−アミノレブリン酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4322694A JP2816422B2 (ja) | 1992-11-08 | 1992-11-08 | 微生物による５−アミノレブリン酸の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06141875A JPH06141875A (ja) | 1994-05-24 |
| JP2816422B2 true JP2816422B2 (ja) | 1998-10-27 |
Family
ID=18146574
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4322694A Expired - Fee Related JP2816422B2 (ja) | 1992-11-08 | 1992-11-08 | 微生物による５−アミノレブリン酸の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2816422B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102812119B (zh) * | 2010-03-26 | 2015-05-20 | 朝日集团控股株式会社 | 酵母培养方法 |
| JP6194255B2 (ja) * | 2013-03-22 | 2017-09-06 | コスモＡｌａ株式会社 | ５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法 |
| JP6069057B2 (ja) * | 2013-03-22 | 2017-01-25 | コスモＡｌａ株式会社 | ５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法 |
| EP2977459B1 (en) * | 2013-03-22 | 2019-11-13 | neo ALA Co., Ltd. | Method for producing 5-aminolevulinic acid or salt thereof |
| JP6262047B2 (ja) * | 2014-03-26 | 2018-01-17 | コスモＡｌａ株式会社 | ５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01148193A (ja) * | 1987-12-04 | 1989-06-09 | Daicel Chem Ind Ltd | ５−アミノレブリン酸の製造法 |
| JPH0655147B2 (ja) * | 1989-03-31 | 1994-07-27 | 株式会社クボタ | ５―アミノレブリン酸の製法 |
-
1992
- 1992-11-08 JP JP4322694A patent/JP2816422B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06141875A (ja) | 1994-05-24 |
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