JPH027637B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、発酵法によるＬ−トリプトフアン
（以下、トリプトフアンと記す）の製造法に関す
る。 従来トリプトフアンの製造法としては、トリプ
トフアンの前駆物質であるアントラニル酸、イン
ドール或いは３−インドールピルビン酸よりトリ
プトフアンを製造する方法等が知られている。 これら前駆物質を使用する方法に対し、５−フ
ロロトリプトフアン等のトリプトフアンアナログ
耐性を有するバチルス属の微生物を用いて、糖類
等の炭素源から直接発酵法によりトリプトフアン
を製造する方法が開示されている（特公昭53−
39517）。 本発明者らは更に糖類等の炭素源からトリプト
フアンを直接発酵法により安価に製造する方法を
開発すべく研究を行つた結果、バチルス属の上記
のようなトリプトフアンアナログ耐性の他に更に
１，２，４−トリアゾール−３−アラニン（単に
トリアゾールアラニンと略す）に耐性を有する微
生物の中に従来知られているものより更に大量の
トリプトフアンを生産する能力を有する菌株があ
ることを見い出した。この発明はこの知見に基づ
いて更に研究の結果完成されたものである。 本発明の方法で使用される変異株は、バチルス
属に属し、５−フルオロトリプトフアン、７−ア
ザトリプトフアン、メチルトリプトフアン、ナフ
チルアラニン、トリブタゾン等のトリプトフアン
アナログ及びトリアゾールアラニンに耐性を有
し、かつトリプトフアンを生産する能力を有する
微生物であり、例えば次のような変異株が使用さ
れる。 バチルス・ズブチリスAJ11737 FERM
−P6264（５−Ｆ−TrP^r、TA^r） バチルス・ズブチリスAJ11738 FERM
−P6265（５−Ｆ−TrP^r、Leu^-、TA^r） バチルス・ズブチリスAJ11739 FERM
−P6266（５−Ｆ−TrP^r、IM^r、TA^r） ５−Ｆ−TrP^r：５−フルオロトリプトフアン耐
性 TA^r：トリアゾールアラニン耐性 Leu^-：Ｌ−ロイシン要求性 IM^r：インドールマイシン耐性 これら本発明で使用される変異株は従来知られ
ているバチルス属に属しトリプトフアンアナログ
に耐性を有するＬ−トリプトフアン生産菌を親株
とし、これに通常の変異誘導操作、例えば、紫外
線照射あるいはＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−
ニトロソグアニジン（以下、NGと略す。）亜硝
酸等の化学薬剤処理を施し、変異処理した菌株を
親株が生育できないような量のトリアゾールアラ
ニンを含有する平板寒天培地で培養し、該平板培
地上に生育するコロニーを分離することによつて
得られる。 親株としては、トリプトフアンアナログ耐性の
トリプトフアン生産菌、トリプトフアンアナログ
耐性でかつＬ−アルギニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ロ
イシンもしくはＬ−フエニルアラニン要求性のト
リプトフアン生産菌（特公昭53−39517号公報）、
又はトリプトフアンアナログ耐性がかつインドー
ルマイシン耐性のトリプトフアン生産菌（特開昭
56−92796号公報）等が使用され、例えば次のよ
うなトリプトフアン生産性変異株が使用される。 バチルス・ズブチリス FT−145
FERM−P1783（５−Ｆ−TrP^r） バチルス・ズブチリス FFL−５
FERM−P1786（５−Ｆ−TrP^r、Leu^-） バチルス・ズブチリス AJ11483
FERM−P5286（５−Ｆ−TrP^r、IM^r） その他に本発明の変異株はバチルス属の野生株
を親株とし、これにトリアゾールアラニン耐性を
付与した後トリプトフアンアナログ耐性を付与す
ることによつても誘導できる。この場合にも更に
トリプトフアン生産に有用な性質、例えばＬ−フ
エニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−ロイシン、
Ｌ−ヒスチジン等のアミノ酸に耐する栄養要求性
等を付与することが望ましい。 以下の実験例にて本発明のトリアゾールアラニ
ン耐性トリプトフアン生産菌のトリアゾールアラ
ニンに対する耐性度を示す。 実験例 第１表に示す組成の最少培地及び最少培地に
1000μｇ／mlのトリアゾールアラニンを添加した
寒天培地を調製し、加熱滅菌した後、直径8.5cm
のプレートに移してプレート寒天培地を作つた。 上記トリアゾールアラニン含有のプレートに最
少寒天プレート 上に生育したバチルス・ズブチリスAJ11737
AJ11738及びAJ11739を夫々各プレート当り10⁶
個宛接種し、30℃で48時間プレート培養を行い、
プレート上に生育したコロニー数を測定した。そ
の結果を第２表に示す。

【表】

【表】 尚、本発明でいうトリアゾールアラニン耐性と
は10⁶個の変異株を1000μｇ／mlのトリアゾールア
ラニンを含有する最少培地で培養（30℃、48時
間）した場合に500個以上のコロニーを生成する
ものをいう。 本発明で使用する培養培地は特に制限するとこ
ろはなく、炭素源、窒素源、無機塩及び必要なら
ば有機微量栄養素を含有する通常の培地である。
炭素源としてはグルコース、フラクトース、シユ
ークロース、マルトース、澱粉の水解物、糖蜜等
の炭水化物が使用され、その他酢酸、クエン酸等
の有機酸、あるいはエタノール、グリセリン等の
アルコール類も単独あるいは上記他の炭素源と併
用して使用できる。窒素源としては硫酸アンモニ
ウム、尿素、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、アンモニアガス、その他を、無機塩としては
リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、塩
塩、マンガン塩が使用され、その他微量金属塩等
を必要に応じて使用する。有機微量栄養素として
は、栄養要求性のある場合には該当するアミノ
酸、ビタミン、脂肪酸類、有機塩基物質等を適量
添加し必要に応じてさらに生育促進物質としてア
ミノ酸、ビタミン、味液（登録商標、大豆加水分
解物）、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸等を
使用する。 培養条件は、通常の培養条件で良く、PH５ない
し９、温度は20℃ないし40℃で好気的条件下に24
ないし96時間培養すればよい。培養中にPHが下が
る場合には、炭酸カルシウムを別殺菌して加える
か又はアンモニア水、アンモニアガス等のアルカ
リで中和する。又、有機酸を炭素源とする場合は
PHの上昇を鉱酸又は有機酸で中和する。 トリプトフアンの単離採取は常法によつて行い
うる。得られたものはペーパークロマトグラム上
のRf値、Ehrlich試薬によるトリプトフアン特異
反応或いは微生物定量法による生物活性値によ
り、トリプトフアン標品のそれらと一致すること
を確かめ、トリプトフアンと同定した。 トリプトフアンの定量はロイコノストツク、メ
センテロイデス（ATCC8042）を用いる微生物定
量法に従つて行つた。 以下、実施例にて説明する。 実施例 １ 下記第３表に示した組成のトリプトフアン生産
用培地20mlを500ml容のフラスコに分注し、加熱
滅菌した後、これに第４表に示す微生物をそれぞ
れ1/3スラント量植えつけ30℃で96時間振盪培養
した。それぞれの培養液中のトリプトフアン生成
量は第４表の如くであつた。

【表】

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ バチルス属に属し、トリプトフアンアナログ
   およびトリアゾールアラニンに耐性を有し、かつ
   Ｌ−トリプトフアン生産能を有する微生物を液体
   培地中に好気的に培養し、培養液中にＬ−トリプ
   トフアンを生成蓄積せしめ、これを採取すること
   を特徴とするＬ−トリプトフアンの製造法。