JPH028720B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、発酵法によるＬ−トリプトフアン
（以下、トリプトフアンと記す）の製造法に関す
る。 従来トリプトフアンの製造法としては、トリプ
トフアンの前駆物質であるアントラニル酸、イン
ドール或は３−インドールピルビン酸よりトリプ
トフアンを製造する方法が知られている。 これら前駆物質を使用する方法に対し、前駆物
質を使用しないで、糖類等を炭素源とし、バチル
ス属に属しトリプトフアンアナログに耐性を有す
る変異株を使用して直接発酵法によりトリプトフ
アンを生産する方法（特公昭48−18828、特公昭
53−39517）が開発されている。 そこで、本発明者らはバチルス属の微生物を用
いて更に糖類等の炭素源からトリプトフアンを直
接発酵法により安価に製造する方法を開発すべく
研究を行つた結果、バチルス属の上記のようなト
リプトフアンアナログ耐性の他に更にＬ−ヒスチ
ジン感受性を有する微生物の中に、従来知られて
いるものより更に大量のトリプトフアンを生産す
る能力を有する菌株があることを見い出した。こ
の発明はこの知見に基づいて更に研究の結果完成
されたものである。 本発明でいうトリプトフアンアナログとはバチ
ルス属に属する微生物の生育を阻害し、この生育
阻害がＬ−トリプトフアンの存在によつて部分的
又は完全に解除されるような薬剤をいい、例えば
５−メチルトリプトフアン等の５，６又は７−低
級アルキルトリプトフアン、５−フルオロトリプ
トフアン等の５又は６−ハロゲノトリプトフア
ン、トリプトフアンハイドロキサメート、又は７
−アザトリプトフアン等がある。 本発明で使用する微生物は、バチルス属に属
し、上記のトリプトフアンアナログに耐性を有
し、更にＬ−ヒスチジン感受性、即ちＬ−ヒスチ
ジンの存在により生育が抑制される性質を有し、
かつトリプトフアン生産能を有する変異株であ
り、例えば次のような変異株が代表例として挙げ
られる。 バチルス・ズブチリス AJ11959 FERM−
P6701（５−Ｆ−Trp^r、His^s） バチルス・ズブチリス AJ11960 FERM−
P6702（５−Ｆ−Trp^r、Leu^-、His^s） バチルス・ズブチリス AJ11961 FERM−
P6703（５−Ｆ−Trp^r、IM^r、His^s） （註） ５−Ｆ−Trp^r：５−フルオロトリプト
フアン耐性 His^s：Ｌ−ヒスチジン感受性 Leu^-：Ｌ−ロイシン要求性 IM^r：インドールマイシン耐性 これら本発明で使用される変異株は、バチルス
属に属するトリプトフアンアナログ耐性のトリプ
トフアン生産菌を親株とし、これに通常の変異誘
導操作、例えば、紫外線照射或はＮ−メチル−
N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下、
NGと略す。）亜硝酸等の化学薬剤処理を施し、
変異処理した菌株を完全培地（平板培地）で培養
し、生育したコロニーを、最少培地及び0.05〜
2.0ｇ／dlのＬ−ヒスチジンを含む最少培地で培
養し、Ｌ−ヒスチジンを含む培地で生育しないか
又は生育が抑制されるコロニーを分離することに
よつて得られる。 上記の親株としては、トリプトフアンアナログ
耐性の他にトリプトフアン生産に有用な性質を有
するトリプトフアン生産菌、例えば、Ｌ−アルギ
ニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシンもしくはＬ−フ
エニルアラニン要求性のトリプトフアン生産菌
（特公昭53−39517号公報）、更にはトリプトフア
ンアナログ耐性でかつインドールマイシン耐性の
トリプトフアン生産菌（特開昭56−92796号公報）
等が使用される。具体例としては次のようなトリ
プトフアンアナログ耐性のトリプトフアン生産菌
が使用される。 バチルス・ズブチリス FT−145 FERM−
P1783（５−Ｆ−Trp^r） バチルス・ズブチリス FFL−５ FERM−
P1786（５−Ｆ−Trp^r＋Leu^-） バチルス・ズブチリス AJ11483 FERM−
P5286（５−Ｆ−Trp^r＋IM^r） その他、本発明の変異株はバチルス属の野性株
を親株とし、これにＬ−ヒスチジン感受性を付与
した後トリプトフアンアナログ耐性を付与するこ
とによつても誘導することができる。この場合に
も更にトリプトフアン生産に有用な性質、例え
ば、Ｌ−フエニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−
ロイシン、Ｌ−ヒスチジン等のアミノ酸に対する
栄養要求性、或はフエニルアラニンアナログ耐性
等を付与することが望ましい。 以下の実験例にて、本発明のＬ−ヒスチジン感
受性トリプトフアン生産菌のＬ−ヒスチジンに対
する感受性を示す。 実験例 第１表に示す組成の最少培地に第２表に示す濃
度となるようにＬ−ヒスチジンを加え直径16.5mm
の試験管に4.0ml宛分注し、110℃で10分間加熱殺
菌して培地を調整した。 上記培地にＬ−ヒスチジンを含まない最少培地
で24時間培養して得られた第２表に示した菌株の
培養液を、夫々各0.1ml宛接触し、30℃で30時間
振盪培養を行い、培養液の570nｍの吸光度を測
定した。その結果を第２表に示す。 第１表 最少培地の組成（PH7.0） 成 分 濃 度 グルコース 5.0ｇ／ 硫酸アンモニウム 1.0 〃 KH₂PO₄ 8.65 〃 MgSO₄・7H₂O 0.2 〃 FeSO₄・7H₂O 10mg／ MnSO₄・4H₂O 10 〃 クエン酸ナトリウム 0.5ｇ／ ※Ｌ−ロイシン 10mg／dl （※Ｌ−ロイシン要求株の場合のみ添加）

【表】

【表】 本発明で使用する培地は炭素源、窒素源、無機
塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等
の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地が使
用される。炭素源としてはグルコース、シユーク
ロース、マルトース、澱粉水解物、糖蜜等が使用
され、その他エタノール、酢酸、クエン酸等も単
独或は上記他の炭素源と併用して用いられる。窒
素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝
酸塩、尿素、ペプトン等有機或は無機の窒素源が
使用される。有機微量栄養素としてはアミノ酸、
ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含
有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆
蛋白分解物等が使用され、生育にアミノ酸等を要
求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求
される栄養素を補添することが必要である。無機
塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシ
ウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。 培養は通常の培養条件下で行えば良く、PHを５
ないし９、温度を20ないし40℃に制御しつつ１〜
４日間振盪培養又は通気撹拌培養することにより
培養液中に著量のトリプトフアンが蓄積される。
培養中にPHが下がる場合には、炭酸カルシウムを
別殺菌して加えるか又はアンモニア水、アンモニ
アガス等のアルカリで中和する。又、有機酸を炭
素源とする場合はPHの上昇を鉱酸又は有機酸で中
和する。 培養液からトリプトフアンを採取する方法は、
公知のトリプトフアン回収方法に従つて行えば良
く、培養液から菌体を除去した後濃縮晶析する方
法或はイオン交換クロマトグラフイー等によつて
採取される。 以下、実施例にて説明する。 実施例 １ 下記第３表に示した組成のトリプトフアン生産
用培地20mlを500ml容フラスコに分注し、110℃で
10分間加熱した後、第４表に示す微生物をそれぞ
れ1/3スラント量植えつけ30℃で96時間振盪培養
した。それぞれの培養液中のトリプトフアン生成
量は第４表の如くであつた。 第３表 トリプトフアン生産用培地組成（PH7.0） 成 分 濃 度 グルコース 80ｇ／ 塩化アンモニウム 10 〃 KH₂PO₄ １ 〃 KCl ２ 〃 MnSO₄・7H₂O 10ml／ FeSO₄・4H₂O 10 〃 カザミノ酸 ４ｇ／ MgSO₄・7H₂O 0.4 〃 CaCO₂ 40 〃 ※Ｌ−ロイシン 20mg／dl （※Ｌ−ロイシン要求株の場合のみ添加） 第４表 トリプトフアン生成量 菌 株 （mg／ml） FT−145 1.9 AJ11959 4.6 FEL5 4.2 AJ11960 7.8 AJ11483 6.2 AJ11961 9.5

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ バチルス属に属し、Ｌ−ヒスチジン感受性及
   びトリプトフアンアナログ耐性を有しかつＬ−ト
   リプトフアン生産能を有する微生物を培養して培
   養液中にＬ−トリプトフアンを生成、蓄積せし
   め、該Ｌ−トリプトフアンを採取することを特徴
   とする発酵法によるＬ−トリプトフアンの製造
   法。