JPH02186994A - 発酵法によるｌ‐アミノ酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は発酵法によるＬ−アミノ酸の製造に関する。Ｌ
−アミノ酸は調味料、医薬、飼料添加物化成品及び試薬
等に広く利用されている。

〔従来の技術〕

発酵法により工業的に生産されるＬ−アミノ酸類として
は、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン、
Ｌ−アルギニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アラニン
、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ヒスチジン
、Ｌ−プロリン、Ｌ−バリン、Ｌ−セリン、Ｌ−オルニ
チン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−チロシン、Ｌ−１−リプト
ファンおよびし−ロイシン等が有り、利用される微生物
としては、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム
属、バチルス属、エセリヒア属、セラチア属。

プロビデンシア属、アースロバクター属等に属する微生
物がある。

これらの各種微生物を利用して、工業的にＬ−アミノ酸
を安価に生産する方法として、微生物の育種改良法が多
用されてきた。即ち、野性株そのもののＬ−アミノ酸生
産能は極めて少ない場合が多いので、人工突然変異によ
り、栄養要求性を付与したり、アナログ耐性を付与した
り栄養要求性とアナログ耐性を組み合せる方法、更には
アミノ酸生合成等の遺伝子を遺伝子組換え法により増強
する方法等が知られている。

〔解決しようとする問題点〕

Ｌ−アミノ酸の発酵収率及び蓄積を向上させることによ
り工業的に安価に生産することは、重要な問題である。

〔問題点を解決するための手段〕 本発明者らはＬ−アミノ酸の発酵収率をさらに向上させ
、工業的に有利な発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法を
開発すべく鋭意研究した結果、グルタミン酸又はアスパ
ラギン酸を含有するペプチド　　（ｘ　　　　ｇｌｕ、
　　　ｇｌｕ−ｘ、　　　ｘ　　−ａｓｐ＋　　　ａｓ
ｐ−ｘ　　；　　ｘ　　はアミノ酸）に耐性を有する菌
株を育種することにより目的とするしニアミノ酸の収率
が向上することを世界に先がけて見出した。本発明はこ
の知見に基づいて更に研究を行った結果なされたもので
ある。

本発明でいうＬ−アミノ酸とは、Ｌ−グルタミン９．Ｌ
−グルタミン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−フェ
ニルアラニン、Ｌ−スレオニン。

Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ
−バリン、Ｌ−セリン、Ｌ−オルニチン。

Ｌ−シトルリン、Ｌ−チロシン、Ｌｌ−リプトファンお
よびＬ−ロイシンなどのＬ−アミノ酸であり、ここに例
示したＬ−アミノ酸以外でも発酵法により生産されるＬ
−アミノ酸であれば本発明の適用の範囲に入る。

即ち、本発明のポイントは、ブレビバクテリウム属又は
コリネバクテリウム属に属し、ｘ　−ｇｌｕ。

ｇｌｕ　−ｘ、　　ｘ−ａｓｐ又はａｓｐ−ｘの構造を
有するペプチドに耐性を有し、且つＬ−アミノ酸生産能
を有する微生物を液体培地中で培養し、培地中に生成蓄
積したＬ−アミノ酸を採取することを特徴とするＬ−ア
ミノ酸の製造法に関する。

本発明のペプチドとしては、ｔｙｒ−ｇｌｕ、　ａｌａ
　−ｇｌｕ、　ｖａｌ　−ｇｌｕ、　ｔｒｐ−ｇｌｕ、
　ｍｅｔ−ｇｌｕ、　ｇｌｙ−ｇｌｕ。

ｇｌｕ−ｇｌｙ、　ｇｌｕ−１ｅｕ＋　ｇｌｕ−ｈｉｓ
＋　ｇｌｙ−ａ３ｐ＋　ａｌａ−ａｓρ＋　ａｓｐ−ｇ
ｌＹ等であり、これらの少くとも一種に耐性を有する菌
株を本発明に於てペプチド耐性菌と言う。

本発明において用いられる微生物はブレビバクテリウム
属又はコリネバクテリウム属に属し、上記のペプチド耐
性を有し、且つＬ−アミノ酸生産能を有する変異株であ
る。

本発明の変異株を得るには、下記に示す親株より上記ペ
プチド耐性を誘導してもよいし、Ｌ−アミノ酸の生産能
を有する変異株からペプチド耐性株を誘導してもよい。

本変異株の親株となる野性株は、ブレビバクテリウム属
又はコリネバクテリウム属等のコリネホルム型のし一グ
ルタミン酸生産菌として知られているものであり、例え
ば以下のものがある。

ブレビバクテリウム・フラバム　ＡＴＣＣ１４０６７こ
れらの親株又は変異株から、本発明のペプチド耐性株Ｎ
−メチル−Ｎ゛　−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン処
理する等の通常の変異誘導方法が適用できる。変異処理
した菌液から本発明の変異株を分離する方法はペプチド
を含む培地で成育するような菌株を採取することによっ
て行われる。

本発明の変異株の具体的な変異誘導方法とペプチド４度
と菌株の生育度の関係を以下に示す。

〔変異誘導方法〕

ブイヨン寒天スラント上に３０℃で２４時間生育させた
ブレビバクテリウム・フラバム＾ＴＣＣ１４０６７の菌
体をＭ／３０リン酸緩衝液に懸濁し菌体濃度１０’／＋
ｎβの菌体懸濁液に２００μｇ／ｍｌｌのＮ−メチル−
Ｎ゛　−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを加え０℃に
２０分間保持した。次いで遠心分離した後、第１表に示
した組成の培地に種菌し、３１．５℃で２〜１０日間培
養した。

第１表、培地組成 グルコース　　　　　　　　１．０　　　　ｇ／ｄ１尿
　　　素　　　　　　　　　　　　０．２　　　　　　
ｇ／ｄ　ＩＫ）ＩｚＰＯ４０，ｌ　　　　　ｇ／ｄ　ｌ
Ｍｇ５Ｏａ・７１１□０　　　　　　　　０．１　　　
　　ｇ／ｄｉＦｅＳＯａ　・７Ｈ２００，００２ｇ／ｄ
　ｊ！ＭｎＳＯ４・７８２０　　　　　　　　　０．０
０２　　　　ｇ／ｄ　ｊ２ビオチン　　　　　　　　１
００　　　　　　μｇ／ｌサイアミン　　　　　　１０
０　　　　　μｇ／βｔｙｒ　−ｇｌｕ　　　　　　　
　　Ｏ，５ｇ／ｄ　１寒　　　天　　　　　　　　　　
　２．０　　　　　　ｇ／ｄ　＆（ｐ）Ｉ　７．０） 寒天培地に育成してきたｔｙｒ　−ｇｌｕ耐性株２０株
の中から、Ｌ−グルタミン生産能の高い菌株として、ブ
レビバクテリウム・フラバムＡＪ　１２４１８（ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ　　　　）を得た。

同様の変異処理方法を用いることにより、各種のアミノ
酸生産菌株を兄妹として、よりアミノ酸生産能の向上し
た菌株を得る事が出来た。第２表に代表例を示す。

第２表に例示したグルタミン、リジン、アルギニン、グ
ルタミン酸、ヒスチジン、プロリンイソロイシン等の生
産菌の改良の他にも、フェニルアラニン、スレオニン、
バリン、オルニチン、トリプトファン、シトルリン、ロ
イシン、チロシン。

セリンに於ても有効であった。

このようにして得られた変異株のペプチド度を親株と比
較した。

グルコース０．５　ｇ／ｄ　１　、尿素０．２ｇ／ｄｆ
、硫０、１５　ｇ／ｄ　（１、ＫＨｚＰＯａ　０．３　
ｇ／ｄβ、　ＫｚＨＰＯｓ　０．１Ｍｇ５Ｏ，−７８２
００，０１ｇ／ｄＬ　ＣａＣ１ｚ　’２Ｈｚ００゜／ｄ
β、ビオチン１００μｇ／　１　、サイアミン・１００
　／Ｊｇ／ｌ、　Ｆｅ５Ｏａ　・７Ｈｚ００．００２ｇ
／ｄｊ！。

ＭｎＳＯ４・７１１ｚ００．００２ｇ／ｄ　１および第
３表に示しのペプチドを含み、ｐＨ７，０に調節した液
体培天然培地（ペプトン１　ｇ／ｄ　１２．酵母エキス
１ｇＮａＣｊ！　０．５ｇ／ｄｊ！、ｐＨ７，０）スラ
ント上で２４培養した菌体を殺菌水に）詭濁して接種し
、２間培養して菌の生育による濁度を測定し、相育度（
％）で示した。（第３表〜第９表）第 表 本液体培地にグアニン５■／ｄβ添加。

第　　８ 表 第　　９ 表 Ｐｒｏ車 １ｅ 本液体培地にイソロイシン１５■／ｄＩｌ添加。

〔作　用〕

このような変異株を培養する際に用いろ培地は、炭素源
、窒素源、無機イオン、栄養要求性を満足させるべき物
質及び必要に応じビタミン等その他の有機微量栄養素を
含有する通常の培地である。

炭素源としては、グルコース、シュークロース等の炭水
化物、酢酸等の有機酸等が、窒素源としては、アンモニ
ア水、アンモニアガス、アンモニウム塩等が好適である
。無機イオンとしてはカリウムイオン、ナトリウムイオ
ン、マグネシウムイオン、リン酸イオンその他が必要に
応じ適宜培地に添加される。培養は好気的条件が望まし
く、培養の間、培地のｐＨを４ないし８に温度を２５℃
ないし３７℃に調節しつつ行えばより好ましい結果が得
られる。か（して工ないし７日間も培養すれば培地中に
著量のＬ−アミノ酸が生成蓄積するので、次にイオン交
換樹脂による方法等によりＬ−アミノ酸の結晶を取得す
ることができる。

゛・以下実施例にて説明する。

実施例１ グルコースｌＯ％、硫酸アンモニウム、１％、リン酸第
−カリ０．２５％、硫酸マグネシウム０．０４％、硫酸
第一鉄０．００１％、サイアミン塩酸塩３５０μｓ／　
ｊ！　、ビオチン５μｇ／ｊ２．味液（登録商標）　０
．５　ｍｉ！７ｄｌ、　　ｐＨ７゜０の組成からなる水
溶液培地を小型ガラス製ジャーファーメンタ−に３００
　ｍββ背分し、常法により殺菌した後、あらかじめ３
０℃で２４時間ブイヨンスラント上で生育させたところ
の第１０表に示した各種のしグルタミン生産菌株を接種
した。次いでそのｐｌ＋をアンモニアガスで６．５に維
持しながら３１６５℃に１２０Ｏｒｐｍ、ｉｌｌｌ俗気
毎分１容にて３０時間培養した。発酵終了液中に生成蓄
積されたＬ−グルタミンの対重量グルコース収率を第１
０表に示した。

されたし−リジンの対重量グルコース収率を第１１表に
示した。

ブレビバクテリウム・フラバム　Ａ　Ｊ　１２４１８を
使用した発酵終了液１βから遠心分離によって菌対を除
去して上清液を得、これからイオン交換樹脂をもちいる
常法にしたがってＬ−グルタミンを分離し、Ｌ−グルタ
ミンの結晶１９．０　ｇを得た。

実施例２ グルコース１０％、硫酸アンモニウム２％、リン酸第−
カリＯ，１％、硫酸マグネシウム０．０４％硫酸第一鉄
０．００１％、硫酸マンガン０．００１％サイアミン・
塩酸塩２００μｇ／ｌ、ヒオチン５００μｇ／ｌ、味液
（登録商標）　５　ＩＩ＋ｊ！／ｄｌ、ニコチン酸アミ
ド１　ｍｇ／ｄ　ｌ　、　ＤＬ−アラニン０．１％、ｐ
Ｈ７，０の組成からなる水溶液培地を小型ガラス製ジャ
ーファーメンタ−に３００ｍＪ宛分注し、常法により殺
菌した後、あらかじめ３０℃で４８時間ブイヨンスラン
ト上で生育させたところの第１１表に示した各種のし一
リジン生産菌株を接種した。次いでそのｐＨをアンモニ
アガスで７，０に維持しつつ３１．５℃にて１２００ｒ
ｐｍ、通気毎分１／２容にて４８時間培養した。発酵終
了液中に生成蓄積ブレビバクテリウム・ラクトフェルメ
ンタムＡ　Ｊ　１２４２０を使用した発酵終了液ＩＩｌ
から遠心分離によって菌体を除去して上滑液を得、これ
からイオン交換樹脂をもちいる常法によって、Ｌ−リジ
ンを分離し、Ｌ−リジンの結晶１９．２　ｇを得た。

実施例３ グルコースｌＯ％、硫酸アンモニウム４％、リン酸第−
カリ０．１％、硫酸マグネシウム０．０４％硫酸第一鉄
ｏ、ｏｏｉ％、硫酸マンガンｏ、ｏｏｉ％サイアミン・
塩酸塩１００μｇ／　１　、とオチン１００μｇ／、ｉ
！、味′／＆（登録商標）５ｍｌｌ／ｄＣ酵母エキス０
．２％ｐＨ７，０の組成からなる水溶液培地を小型ガラ
ス製ジャーファーメンタ−に３００ｍｌ宛分注し、常法
により殺菌した後、あらかじめ３０’Ｃで２４時間ブイ
ヨンスラント上で生育させたところの第１２表に示した
各種のＬ−アルギニン生産菌株を接種した。次いでその
ｐＨをアンモニアガスで７．０に維持しつつ３１．５℃
にて１２０　Ｏｒｐｍ、通気毎分１／２容にて４８時間
培養した。発酵終了液中に生成蓄積されたし一アルギン
の対重量グルコース収率を第１２表に示した。

コリネバクテリウム・グルタミウムＡ　Ｊ　１２４２２
を使用した発酵終了液１１から遠心分離によって菌体を
除去して上清液を得、これから弱酸性イオン交換樹脂を
用いる常法によって、Ｌ−アルギニンを単離精製し、Ｌ
−アルギニンの結晶１７．３　ｇを得た。

実施例４ グルコース１０％、リン酸第−カリ０．２％、硫酸マグ
ネシウム０．１％、硫酸第一鉄０．００１％。

硫酸マンガン０．００１％、サイアミン・塩酸塩５００
．１７ｇ／Ｃビオチン５μｇ／１１味液（登録商標Ｈｍ
Ｉ２／ｄｆ、　ｐＨ７，２の組成からなる水溶液培地を
小型ガラス製ジャーファーメンタ−に３００ｍｊ２宛分
注し、オートクレーブにて殺菌した後、あらかじめ３０
℃で２４時間ブイヨンスラント上で生育させたところの
第１３表に示した各種のし一グルタミン酸生産菌株を接
種した。次いでそのｐＨをアンモニアガスでｐＨ７，２
に維持しつつ、３１．５℃にて１２００ｒｐｍ、　１／
　２容にて４８時間培養した。発酵終了液中に生成蓄積
されたし一グルタミン酸の対重量グルコース収率を第１
３表に示した。

ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡ　Ｊ　１
２４２３を使用した発酵終了液１１から、遠心分離によ
って菌体を除去して上清液を得、これからイオン交換樹
脂を用いる常法によってＬ−グルタミン酸を単離精製し
、Ｌ−グルタミン酸の結晶３５、５　ｇを得た。

実施例５ グルコース１０％、硫酸アンモニウム０．５％。

リン酸第−カリ０．１５％、硫酸マグネシウム０．１％
、硫酸第一鉄０．００１％、硫酸マンガン（５，００１
％５サイアミン・′塩酸塩３００μｇ／ｌ、ヒオチン３
５０μｇ／Ｌ味液（登録商標）５ｍｊ？／ｄＩ！、酢酸
アンモニウム０．５％、ｐ）！７．０の組成からなる水
溶液培地を小型ガラス製ジャ７フアーメンターに３００
ｍＡ宛分注し、オートクレーブにて殺菌した後、あらか
じめ３０℃で２４時間ブイヨンスラント上で生育させた
第１４表に示した各種のＬ−ヒスチジン生産菌株を接種
した。次いで、そのｐＨをアンモニアガスで７．０に維
持しつつ、３１．５℃に−で１２０　Ｏｒｐｍ、通気毎
分１／２容にて４８時間培養した。発酵終了液中に生成
蓄積されたし一ヒスチジンの対重量グルコース収率は第
１４表の如くであった。

コリネバクテリウム・グルタミクムＡ　Ｊ　１２４２５
を使用した発酵終了液１βから遠心分離によって菌対を
除去して上清液を得、これからイオン交換樹脂を用いる
常法によってＬ−ヒスチジンを単離・精製し、Ｌ−ヒス
チジンの結晶４．７ｇを得た。

実施例６ グルコース１０％、硫酸アンモニウム４％１　リン酸第
−カリ０．１％、硫酸マグネシウム０．５％硫酸第一鉄
０．００１％９硫酸マンガン０．００１％。

サイアミン・塩酸塩１００μｇ／Ｎ、ビオチン３５０ｐ イシン３　５　ｎｗ／ｄｆｆ　、　ｐＨ７．　０の組成
からなる水溶液培地を小型ガラス製ジャーファーメンタ
−に３００ｍ１ｌ宛分注し、常法により殺菌した後、あ
らかじめ３０℃で２４時間ブイヨンスラント上で生育さ
せた第１５表に示した各種のＬ−プロリン生産菌株を接
種した。次いでそのｐｉをアンモニアガスで７．０に維
持しつつ、３１．５℃にて１　２　０　Ｏｒｐｍ。

通気毎分１／２容にて４８時間培養した。発酵終了液中
に生成蓄積されたＬ−プロリンの対重量グルコース収率
を第１５表に示した。

ブレビバクテリウム・フラバムＡ　Ｊ　１２４２７を使
用した発酵終了液１１から遠心分離によって菌体を除去
して上滑液を得、これからイオン交換樹脂を用いる常法
によってＬ−プロリンを単離精製し、Ｌ−プロリンの結
晶１７．５　ｇを得た。

実施例７ グルコース１０％、硫酸アンモニウム１％、リン酸第−
カリ０．１％、硫酸マグネシウム０．０４％。

硫酸第一鉄ｏ、ｏｏｔ％、硫酸マンガン０．００１％。

サイアミン・塩酸塩１００μｇ／１．ビオチン１１００
ｐ／１．味液（登録商標）２ｍｆ／ｄｌ、ｐＨ７，０の
組成からなる水溶液培地を小型ガラス製ジャーファーメ
ンタ−に３００ｍｊ２宛分注し、常法により殺菌した後
、あらかじめ３０℃で２４時間ブイヨンスラント上で生
育させた第１Ω表に示した各種のし一イソロイシン生産
菌株を接種した。次いでそのｐＨをアンモニアガスで７
．３に維持しつつ、３１．５°Ｃにて、１２０　Ｏｒｐ
ｍ、通気毎分１／２容にて４８時間培養した。発酵終了
液中に生成蓄積されたし一インロイシンの対重量グルコ
ース収率を第１６表に示した。

ブレビバクテリウム・フラバムＡ　Ｊ（１２４２Ｂ）！
　　）を使用した発酵終了液１１２から遠心分離によっ
て菌体を除去して上清液を得、これからイオン交換樹脂
を用いる常法によってＬ−イソロイシンを単離精製し、
Ｌ−イソロイシンの結晶６．５ｇを得た。

〔発明の効果〕

本発明により、各種のＬ−アミノ酸を収率よく得ること
ができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属に
   属しグルタミン酸又はアスパラギン酸を含有するペプタ
   イドに耐性を有し、且つＬ−アミノ酸生産能を有する微
   生物を液体培地で培養し、培地中に生成蓄積したＬ−ア
   ミノ酸を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造
   法。 ２）グルタミン酸又はアスパラギン酸を含有するペプチ
   ドがｘ−ｇｌｕ、ｇｌｕ−ｘ、ｘ−ａｓｐ又はａｓｐ−
   ｘである第１請求項記載のＬ−アミノ酸の製造法。 但し、ｘは【遺伝子配列があります】 又はｔｈｒを示 す。 ３）ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属に
   属し、グルタミン酸又はアスパラギン酸を含有するペプ
   チドに耐性を有する微生物。 ４）グルタミン酸又はアスパラギン酸を含有するペプチ
   ドがｘ−ｇｌｕ、ｇｌｕ−ｘ、ｘ−ａｓｐ又はａｓｐ−
   ｘである第３請求項記載の微生物。 但しｘは【遺伝子配列があります】 又はｔｈｒを示す。