KR20030066950A - 코리네박테리움 속의 미생물을 이용한 생산성이 향상된프롤린의 제조방법 - Google Patents

코리네박테리움 속의 미생물을 이용한 생산성이 향상된프롤린의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 코리네박테리움(Corynebacterium) 속의 미생물을 이용한 생산성이 향상된 프롤린의 대량 생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 감마-글루타밀키네이즈(γ-glutamyl kinase) 효소활성이 우수한 돌연변이주를 고농도의 암모늄이온이 존재하는 종균배지에서 성장시켜 주 발효조에 접종한 후, 프롤린 생산의 최적시기에 배지 중의 히스티딘과 글루타메이트 농도를 적절히 조절하면서 유가식으로 배양함으로써 생산성이 향상된 프롤린을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

코리네박테리움 속의 미생물을 이용한 생산성이 향상된 프롤린의 제조방법{Production of proline by Corynebacterium sp.}
본 발명은 코리네박테리움(Corynebacterium) 속의 미생물을 이용한 생산성이 향상된 프롤린의 대량 생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 감마-글루타밀키네이즈(γ-glutamyl kinase) 효소활성이 우수한 돌연변이주를 고농도의 암모늄이온이 존재하는 종균배지에서 성장시켜 주 발효조에 접종한 후, 프롤린 생산의 최적시기에 배지 중의 히스티딘과 글루타메이트 농도를 적절히 조절하면서 유가식으로 배양함으로써 생산성이 향상된 프롤린을 생산하는 방법에 관한 것이다.
프롤린은 생체내 필수아미노산으로 주로 식품첨가제와 수액용 아미노산 제제의 원료로 사용되고 있으며, 고혈압 치료제인 켑토프릴(captopril)의 중간원료 물질로도 사용되고 있다.
프롤린 생산에 이용되는 미생물로는 영양요구성 돌연변이주 혹은 퓨린(purine)/피리미딘(pyrimidine)아날로그에 저항성을 갖는 돌연변이주인 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum)[미국특허 제 3,329,577호], 세라티아 말세센스(Serratia marcescens)[미국특허 제 4,455,372호, 유럽특허 0076516] 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 아세토피룸(Corynebacterium acetophilum), 코리네박테리움 아세토에시도피룸(Corynebacterium acetoacidophilum), 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Corynebacterium)[유럽특허 0098122 A2] 등이 알려져 있다. 또한, 유전자 재조합 균주인 대장균(Escherichia coil)[영국특허 제 2075056호]과 조류(algal)인 클로렐라(Chlorellasp.)[미국특허 제 4,483,038호]를 프롤린 생산에 사용하기도 한다.
상기 특허 중 유럽 특허 0098122 A2호에서는 아날로그 저항성 돌연변이주인 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 아세토피룸(Corynebacterium acetophilum), 코리네박테리움 아세토에시드피룸(Corynebacterium acetoacidphilum), 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum)을 포도당과 슈크로오즈를 주요 탄소원으로 하는 배지에서 배양하여, 배양 3 ∼ 4일 후 35 ∼ 45 g/ℓ의 프롤린을 제조하는 방법을 개시하였다.
한편, 코리네박테리움에서의 프롤린 생합성은 글루타메이트(glutamate)를 전구체로 하여 3단계의 효소반응과 1단계의 자발적인 반응을 거쳐 합성되며, 상기의 효소반응 중 글루타메이트를 감마-글루타밀포스페이트(Υ-glutamyl phosphate)로 전환시키는 효소인 감마-글루타밀키네이즈(Υ-glutatamyl kinase)가 프롤린 생합성에 중요한 효소로 작용한다고 알려져 있다. 이러한 연구결과들에 의하여 코리네박테리움(Corynebacterium) 속의 미생물을 이용하여 프롤린을 과생산할 경우 과량의 글루타메이트를 첨가하여 프롤린의 생산성을 증가시켰다.
이와 같이 코리네박테리움 속의 미생물을 이용하여 프롤린을 생산할 경우 생산성이 낮고(상업적인 관점), 또한 프롤린의 전구체인 글루타메이트 과량첨가에 의한 프롤린 생산성 증가는 프롤린의 제조단가를 상승시키는 문제점이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 코리네박테리움(Corynebacterium) 속의 미생물을 이용하여 프롤린을 발효적으로 생산하는 데 있어서, 상기의 문제점이 개선된 프롤린 발효공정을 개발하기 위하여 연구를 계속한 결과, 기존의 돌연변이법 및 약제처리에 의한 개발된 균주와 과량의 글루타메이트를 사용하여 프롤린을 생산하는 방법과는 달리, 감마-글루타밀키네이즈(γ-glutamyl kinase) 효소활성이 우수한 돌연변이주를 소량의 프롤린 전구체를 연속적으로 첨가하여 저렴한 비용으로 프롤린을 대량 생산함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 돌연변이된 코리네박테리움(Corynebacterium) 속의 미생물을 이용하여 높은 생산성을 갖고, 저렴하게 프롤린을 대량 생산하는 방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.
본 발명에서는 히스티딘(histidine) 영양요구성인코리네박테리움(Corynebacterium)속의 미생물을 이용한 유가식 발효에 의해 프롤린을 생산하는데 있어서, (1) 감마-글루타밀키네이즈(γ-glutamyl kinase) 효소활성이 증가된 히스티딘 영양요구성 돌연변이주를 선별하고, (2) 상기 돌연변이주를 암모늄이온이 존재하는 종균배지에서 배양하여 생산하고, (3) 상기 종균을 프롤린 생산 주발효조에 접종하여 생산균체를 성장시켜 프롤린 생산을 유도한 후, 배지 중의 히스티딘 및 글루타메이트 농도가 프롤린 생산균주의 프롤린 생산활성을 배양말기까지 유지시킬 수 있도록 조성된 생산용 배지를 공급하여 배양하는 단계를 포함하는 프롤린의 대량 생산방법을 그 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 고농도의 암모늄이온이 존재하는 종균배지에서 감마-글루타밀키네이즈(γ-glutamyl kinase) 효소활성이 우수한 돌연변이주를 성장시켜 주 발효조의 성장배지에 접종한 후, 프롤린 생산의 최적시기에 유가식으로 발효하면서 첨가되는 배지 중의 히스티딘과 글루타메이트 농도를 적절히 조절하여 생산성이 향상된 프롤린의 대량 생산방법에 관한 것이다.
본 발명에서 프롤린의 제조에 사용할 수 있는 미생물은 히스티딘 영양요구성을 나타내는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속의 균주들이며, 바람직하게는 코리네박테리움 아세토에시드피룸 Ryu 3161(Corynebacterium acetophilumRyu 3161)[KCTC 0616BP]을 사용한다.
코리네박테리움 아세토에시드피룸 Ryu 3161(KCTC 0616BP)은 코리네박테리움 아세토에시드피룸(ATCC 13870)을 N-메틸-N′-니트로-N-니트로구아니틴(NTG) 및 자외선으로 처리한 후 히스티딘이 함유한 최소배지에서 배양하고, 이어서 순차적으로 10 mM의 설퍼구아니딘(Sulfaguanidine, SG), 8 mM의 DL-3,4-디하이드로프롤린(DL-3,4-dehydroproline, DHP), 10 mM의 아조티딘-2-카르복실에시드(Azotidine-2-carboxylic acid)를 처리하여 히스티딘이 함유된 최소배지에 배양한 후, 이들 변이주들의 감마-글루타밀키네이즈 효소활성을 측정하여 감마-글루타밀키네이즈 효소활성이 가장 우수한 돌연변이주를 선별함으로써 얻을 수 있는 히스티딘에 대한 영양요구성을 나타내는 신균주이다.
상기와 같이 히스티딘 영양요구성을 나타내는 코리네박테리움속의 돌연변이 균주를 이용하여 프롤린을 생산할 때에는 우선 고농도의 암모늄이온이 존재하는 종균배지에서 균주를 배양하여 삼투압에 적응시킨다. 이때 종균배지는 2 내지 5% 농도의 황산암모늄, 효모엑기스의 유기질소원이 필수적으로 포함되어야 하며, 배양온도는 28 내지 31 ℃가 바람직하고 배양시간은 10 내지 12시간으로 한다. 이때, 암모늄이온의 온도가 2% 미만일 경우에는 프롤린의 생산성이 감소하는 문제점이 있고, 5%를 초과하면 균체성장이 저해되는 문제점이 있다. 또한, 배양온도가 28 ℃ 미만이면 균체성장이 지연되는 문제점이 있고, 31 ℃ 초과하면 프롤린생산이 감소되는 문제점이 있으며, 배양시간이 10 시간 미만이면 발효초기 균체성장의 지연기가 발생하는 문제가 있고, 12시간이 초과되면 프롤린 생성되는 시간이 감소되는 문제점이 있다.
다음으로, 상기에서 성장한 종균을 주 발효조에 접종하여 프롤린 생산을 유도한 후, 유가식으로 배양하면서 배지 중의 히스티딘과 글루타메이트 농도를 조절하여 균주의 프롤린 생산능력 및 대사활성을 발효말기까지 유지시킴으로써 프롤린의 생산성을 증가시킬 수 있다. 이때 생산용 배지의 공급은 균체농도 8 내지 13 g/ℓ일 때 공급되는 것이 바람직하며, 생산용 배지의 공급속도는 배양액의 히스티딘 농도가 0.5 내지 3 ㎎/ℓ로, 글루타메이트의 농도는 160 내지 400 ㎎/ℓ로 유지하기에 적당한 속도로 공급되는 것이 바람직하고, 28 내지 31 ℃에서 60 내지 70시간 동안 계속 배양한다. 이때, 균체농도가 8 g/ℓ미만일 경우에는 균체농도가 감소되는 문제점이 있고, 13 g/ℓ를 초과하면 프롤린의 생산성이 감소되는 문제점이 있다. 또한, 히스티딘 농도가 0.5 ㎎/ℓ 미만이면 균체 성장속도가 감소되는 문제점이 있고, 3 ㎎/ℓ를 초과하면 균체의 과성장으로 인한 탄소원에 대한 프롤린 생산수율이 감소되는 문제점이 있으며, 글루타메이트의 농도 160 ㎎/ℓ 미만과 400 ㎎/ℓ이상에서는 글루타메이트에서 프롤린으로 전환되는 수율이 감소되는 문제가 있다. 그리고, 배양온도가 28 ℃ 미만이면 균체성장속도가 둔화되는 문제점이 있고, 31 ℃ 초과하면 균체의 과성장으로 인한 탄소원에 대한 프롤린 생산 수율이 감소되는 문제점이 있으며, 배양시간이 60 시간 미만이면 프롤린의 최대 생산성에 도달하지 못하는 문제가 있고, 70시간 초과하면 오히려 발효기간 경과에 따라 프롤린의 생산량이 감소되는 문제점이 있다.
상기 방법에 의하면 3일 이내에 약 100 g/ℓ이상의 프롤린을 얻을 수 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명을 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
참조예 1: 코리네박테리움 아세토에시드피룸 Ryu 3161(KCTC 0616BP)의 제조
코리네박테리움 아세토에시드피룸(ATCC 13870) 1 ∼ 5 ×108세포/㎖을 2 ㎎/㎖의 니트로구아니딘으로 30 내지 50분으로 처리하거나 자외선을 4분간 조사한 후 200 ㎎/ℓ의 히스티딘이 함유한 최소배지(포도당 2%, 인산수소칼륨 0.05%, 인산이나트륨 0.05%, 황산마그네슘 0.05%, 황산암모늄 2%, 우레아 0.1%, 황산망간 0.002%, 황산철 0.002%, 황산아연 0.001%, 바이오틴 0.03%, 사이아민 0.1% 및 한천 2%, pH 7.0)에서 배양하였다. 여기에 10 mM의 설퍼구아니딘(SG)을 처리하여 200 ㎎/ℓ의 히스티딘이 함유된 최소배지에서 배양하여 얻은 돌연변이주를 8 mM의 DL-3,4-디하이드로프롤린(DHP)과 10 mM의 아조티딘-2-카르복실에시드(Azotidine-2-carboxylic acid)를 상기방법과 동일하게 순차적으로 처리하였다.
상기의 방법으로 히스티딘에 대한 영양요구성을 나타내고 감마-글루타밀키네이즈 효소활성이 증가된 신균주를 얻었으며, 이를 코리네박테리움 아세토에시드피룸 Ryu 3161(Corynebacterium acetophilumRyu 3161)로 명명하였고, 1999년 5월 20일자로 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 수탁번호 KCTC 0616BP를 부여받았다.
참조예 2: 측정방법
다음 실시예에서 각종 측정방법은 다음과 같이 수행하였다.
(1) 세포건조량 측정
배양액을 원심분리하여 세포를 얻은 후 등장액으로 세척하고, 80 ℃에서 건조하여 항량에 도달하였을 때의 무게를 측정하였다.
(2) 프롤린의 정량법
프롤린의 생산량은 닌하이드린 방법[Chinard, J.Biol.Chem., 199, 91(1952)]을 사용하여 측정하였다.
(3) 히스티딘의 정량법
히스티딘의 양은 맥펄슨 방법[Bioche.J., 401, 470,(1942)]을 사용하여 측정하였다.
(4) 감마-글루타밀키네이즈 효소활성 측정법
돌연변이주의 감마-글루타밀키네이즈 효소활성은 데이비드 제이 헤이저와 비비안 모세스가 설명한 방법[Biochem.J.,173,219(1973)]을 사용하여 측정하였다.
실시예 1 및 비교예 1
코리네박테리움 아세토에시드피룸(ATCC 13870)과 코리네박테리움 아세토에시드피룸 Ryu 3161(KCTC 0616BP)을 각각 플라스크배지(포도당 10%, 효모엑기스 0.7%, 황산암모늄 3%, 황산마그네슘 0.1%, 인산수소칼륨 0.3%, 황산망간 0.002%, 황산철 0.002%, 황산아연 0.001%, 바이오틴 0.03%, 사이아민 0.1%, 탄산칼슘 0.2%, pH 7.0)에서 30 ℃로 72시간 배양한 후 상기 참조예 2에서와 같이 세포 건조량, 감마-글루타밀키네이즈 효소활성 및 프롤린 농도를 측정하여 다음 표 1에 나타내었다.
구 분 균주 세포건조량(g/ℓ) 프롤린농도(g/ℓ) 감마-글루타밀키네이즈 효소활성(mmol/g-protein)
비교예 1 코리네박테리움 아세토에시드피룸(ATCC 13870) 7.4 0.9 1.2
실시예 1 코리네박테리움 아세토에시드피룸 Ryu 3161(KCTC 0616BP) 6.6 2.6 1.8
상기 표 1에서 나타낸 바와 같이, 돌연변이주인 코리네박테리움 아세토에시드피룸 Ryu 3161(KCTC 0616BP)는 모균인 코리네박테리움 아세토에시드피룸(ATCC 13870)에 비하여 감마-글루타밀키네이즈 효소활성이 1.5배 증가되었고, 프롤린의 생산량 약 3배 증가됨을 알 수 있었다.
실시예 2
2 ℓ회분식 접종용 배지(포도당 12%, 효모엑기스 0.7%, 황산마그네슘 0.1%, 인산수소칼륨 0.3%, 황산망간 0.002%, 황산철 0.002%, 황산아연 0.001%, 바이오틴 0.03%, 사이아민 0.1%)에 황산암모늄 농도를 각각 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 및 6.0%로 첨가하고, 상기 실시예 1과 동일한 플라스크 배지에서 30 ℃로 24시간 배양한 코리네박테리움 아세토에시드피룸 Ryu 3161(KCTC 0616BP)를 10% 농도가 되도록 접종하였다. 이를 30 ℃에서 pH 7.0을 유지하면서 48시간 동안 배양한 후 상기 참조예 2에서와 같이 세포건조량과 프롤린 생성량을 측정하여 다음 표 2에 나타내었다.
황산암모늄의 농도에 따른 세포건조량 및 프롤린 생성량
황산암모늄농도(%) 세포건조량(g/ℓ) 프롤린 생성량(g/ℓ)
1.0 20.2 6.8
2.0 20.3 6.9
3.0 13.2 29.5
4.0 10.5 25.5
5.0 8.7 20.2
6.0 4.5 7.0
상기 표 2로부터 황산암모늄 농도가 증가함에 따라 세포건조량은 감소하고, 프로린의 생성량은 세포건조량과 무관하게 황산암모늄 농도가 2 내지 5% 일 때 프롤린의 생산성이 좋게 나타났으며, 황산암모늄 농도가 3%일 때 최대량을 생산할 수 있다는 것을 알 수 있었다. 이는 3.0%보다 높은 황산암모늄 농도에서는 황산암모늄이 균체성장에 저해를 주어 프롤린의 생성을 감소시켰기 때문이다.
실시예 3
코리네박테리움 아세토에시드피룸 Ryu 3161(KCTC 0616BP)를 상기 실시예 2의 접종용 배지에서 포도당 3.0%과 황산암모늄을 3.0%로 고정한 배지와 상기 실시예 2에서의 접종용 배지의 포도당 3.0%과 염화나트륨 1.0%로 고정한 배지에서 30 ℃로 12시간 성장시켜, 2 ℓ의 성장배지(포도당 6%, 효모엑기스 0.7%, 황산마그네슘 0.1%, 인산수소칼륨 0.3%, 황산망간 0.002%, 황산철 0.002%, 황산아연 0.001%, pH 7.0)에 10% 농도가 되게끔 접종하였다. 상기 배지에서 균체를 11 g/ℓ까지 성장시킨 후 생산용 배지(포도당 45%, 황산마그네슘 0.14%, 인산수소칼륨 0.3%, 인산이나트륨 0.5%, 히스티딘 0.02%, 황산암모늄 4%)를 시간당 16 ㎖씩 첨가하면서 30 ℃, pH 7.0에서 60시간 동안 더 배양하였다. 배양종료 후 상기 참조예 2에서와 같이 세포건조량과 프롤린 생성량을 측정하여 다음 표 3에 나타내었다.
종균배지에 따른 세포건조량 및 프롤린 생성량
종균배지 성분 세포건조량(g/ℓ) 프롤린 생성량(g/ℓ)
① + 포도당 3.0% + 황산암모늄 3.0% 24.5 69
① + 포도당 3.0% + 염화나트륨 1.0% 24.2 53
① 효모엑기스 0.7%, 황산마그네슘 0.1%, 인산수소칼륨 0.3%, 황산망간 0.002%, 황 산철 0.002%, 황산아연 0.001%, 바이오틴 0.03%, 사이아민 0.1%
상기 표 3에서 보는 바와 같이, 종균배지에 황산암모늄을 첨가하여 종균을 성장시킨 경우가 염화나트륨을 첨가하여 종균을 성장시킨 경우에 비하여 세포건조량은 변화가 없었지만, 프롤린의 생성량은 1.3배 증가하였다. 이는 황산암모늄 첨가에 의하여 고삼투압 배양조건에서 적응된 종균이 다른 경우에 비하여 프롤린 생성능력이 현저히 향상되기 때문이다.
실시예 4
상기 실시예 3의 성장배지와 동일한 2 ℓ부피의 배지에 상기 실시예 2의 접종용 배지에서 포도당을 3.0%로 황산암모늄을 3.0%로 고정하고 30 ℃로 12시간 배양한 코리네박테리움 아세토에시드피룸 Ryu 3161(KCTC 0616BP)를 10% 농도가 되도록 접종하였다. 상기의 성장배지에서 균체농도가 5, 8, 10, 13 및 16 g/ℓ일 때 상기 실시예 3의 생산용 배지와 동일한 배지를 시간당 16 ㎖씩 첨가하면서 30 ℃, pH 7.0에서 60시간 더 배양하였다. 배양종료 후 상기 참조예 2에서와 같이 세포건조량과 프롤린 생성량을 측정하여, 그 결과를 다음 표 4에 나타내었다.
생산용배지 첨가시점에 따른 세포건조량 및 프롤린 생성량
생산용 배지첨가시점(기준 : 균체농도,g/ℓ) 세포건조량(g/ℓ) 프롤린 생성량(g/ℓ)
5 22.5 60
8 23.4 63
10 24.5 69
13 25.3 65
16 26.2 52
상기 표 4에서 나타낸 바와 같이, 생산용 배지의 첨가시기가 늦을수록 세포건조량은 증가하고, 프롤린의 생성량은 생산용 배지가 성장배지에서 세포건조량이 10 g/ℓ일 때 첨가되는 것이 다른 경우에 비하여 1.1배에서 1.3배까지 증가됨을 알 수 있었다.
실시예 5
상기 실시예 4와 동일한 접종용 배지에서 30 ℃로 12시간 배양한 코리네박테리움 아세토에시드피룸 Ryu 3161(KCTC 0616BP)을 상기 실시예 3의 성장배지와 동일한 2 ℓ부피의 배지에 10%의 양으로 접종하고 30 ℃에서 배양하면서 세포건조량이 8 g/ℓ되는 시점에 상기 실시예 3의 생산용 배지와 동일한 배지에 4%의 글루타메이드가 첨가된 배지를 시간당 16 ㎖씩 첨가하여 유가배양을 실시하였다. 그 결과, 총 70 시간의 발효에서 24 g/ℓ의 세포건조량 및 106 g/ℓ의 프롤린을 얻었다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 기존의 돌연변이법 및 약제처리에 의해 개발된 균주와 과량의 글루타메이트를 사용하여 프롤린을 생산하는 방법과는 달리, 개발균주들의 감마-글루타밀키네이즈(γ-glutamyl kinase) 효소활성을 측정하여 상기 효소활성이 우수한 균주를 이용하고 소량의 프롤린 전구체를 연속적으로 첨가함으로써 프롤린 생산성을 증가시키며 기존방법들보다 프롤린 제조단가를 현저히 감소시킬 수 있다.

Claims (6)

  1. 감마-글루타밀키네이즈(γ-glutamyl kinase) 효소활성이 증가된 코리네박테리움 아세토에시드피룸 Ryu 3161(KCTC 0616BP).
  2. 히스티딘(histidine) 영양요구성인 코리네박테리움(Corynebacterium) 속의 미생물을 이용한 유가식 발효에 의해 프롤린을 생산하는데 있어서,
    (1) 감마-글루타밀키네이즈(γ-glutamyl kinase) 효소활성이 증가된 히스티딘 영양요구성 돌연변이주를 선별하고,
    (2) 상기 돌연변이주를 암모늄이온이 존재하는 종균배지에서 배양하여 종균을 생산하고,
    (3) 상기 종균을 프롤린 생산 주발효조에 접종하여 생산균체를 성장시켜 프롤린 생산을 유도한 후, 배지 중의 히스티딘 농도가 0.5 내지 3 ㎎/ℓ, 글루타메이트의 농도가 160 내지 400 ㎎/ℓ로 유지시킬 수 있는 생산용 배지를 공급하면서 유가배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 프롤린의 대량 생산방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 (2)의 돌연변이주가 코리네박테리움 아세토에시드피룸 Ryu 3161(KCTC 0616BP)인 것을 특징으로 하는 프롤린의 대량 생산방법.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 (2)의 암모늄이온이 존재하는 종균배지는 2 내지 5% 농도의 황산암모늄, 효모엑기스, 포도당이 포함되며, 28 내지 31 ℃에서 배양하는 것을 특징으로 하는 프롤린의 대량 생산방법.
  5. 제 2 항에 있어서, 상기 (3)의 생산용 배지를 균체농도가 8 내지 13 g/ℓ일 때 공급하는 것을 특징으로 하는 프롤린의 대량 생산방법.
  6. 제 2 항에 있어서, 상기 (3)의 유가배양은 28 내지 31 ℃에서 60 내지 70 시간동안 수행하는 것을 특징으로 하는 프롤린의 대량 생산방법.
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