KR100733928B1

KR100733928B1 - 카나마이신 내성을 갖고 ｌ-라이신 생산능이 향상된코리네형 미생물 및 그를 이용하여 ｌ-라이신을 생산하는방법

Info

Publication number: KR100733928B1
Application number: KR1020050115905A
Authority: KR
Inventors: 박영훈; 임상조; 문준옥; 성진석
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 2005-11-30
Filing date: 2005-11-30
Publication date: 2007-07-02
Also published as: PL1792984T3; ES2322193T3; US20070122889A1; CN1974762A; EP1792984B1; JP4568713B2; EP1792984A1; CN100482782C; ATE423197T1; US7736880B2; DE602006005207D1; US8361758B2; BRPI0604811B1; US20100216216A1; DK1792984T3; JP2007151550A; BRPI0604811A; KR20070056806A

Abstract

본 발명은 L-라이신 생산능을 가지고 있고, 카나마이신에 대한 내성을 갖는 코리네형 미생물 및 그를 이용하여 L-라이신을 생산하는 방법을 제공한다.

카나마이신, 코리네박테리움, 라이신

Description

카나마이신 내성을 갖고 Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네형 미생물 및 그를 이용하여 Ｌ-라이신을 생산하는 방법{A microorganism of corynebacterium genus having enhanced L-lysine productivity resistant to kanamycin and a method of producing L-lysine using the same}

본 발명은 카나마이신 내성을 갖고 L-라이신 생산능이 향상된 코리네형 미생물 및 그를 이용하여 L-라이신을 생산하는 방법에 관한 것이다.

코리네형 세균은 코리네박테리움 (Corynebacterium) 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물이다.

L-라이신은 필수 아미노산의 일종으로 사료, 의약품 및 식품 등의 분야에 사용되고 있으며, 특히 사료용으로 사용되는 L-라이신은 2004년 약 80만톤 정도로 추정되며 향후에도 연평균 약 10 %의 지속적인 수요증대가 예상되고 있다. L-라이신은 주로 대장균이나 코리네형 세균 등 미생물을 이용한 직접발효법에 의해 생산되고 있기 때문에, 수율 등이 향상된 생산 균주의 개발 또는 발효공정의 개선에 의한 L-라이신의 생산성 향상은 큰 경제적 효과를 가져온다.

L-라이신의 제조방법에는 코리네형 세균에 있어서 각종 영양 요구성 균주, 각종 약제 내성 균주, 각종 약제 민감성 균주 및 각종 항생물질 내성 균주를 이용하는 방법이 알려져 있다. 이들 방법들 중에서 항생제 내성 관련 균주로는, 리팜피신 및 스트렙토마이신 외 다수의 항생제 관련 내성 (미국특허 4,623,623) 균주 등을 이용하는 방법이 알려져 있다.

그러나, 아미노글리코사이드계 항생제의 일종인 카나마이신에 대한 내성을 갖는 L-라이신 생산 균주는 보고된 바 없다.

본 발명자들은 코리네형 세균을 이용하여 직접발효법으로 L-라이신을 생산하는 데 있어 생산원가를 낮추고 수율을 높이기 위하여 L-라이신의 제조방법에 대해 광범위한 연구를 수행하여 왔으며 그 결과, 코리네형 세균에 카나마이신에 대한 내성을 부여함으로써 L-라이신 생산성을 향상시킬 수 있다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 L-라이신 생산능을 가지고 있고, 카나마이신에 대한 내성을 갖는 코리네형 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 미생물을 이용하여 L-라이신을 높은 생산성으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 L-라이신 생산능을 가지고 있고, 카나마이신에 대한 내성을 갖는 코리네형 미생물을 제공한다.

본 발명에 있어서, L-라이신 생산능을 가지고 있고, 카나마이신에 대한 내성 을 가지고 있는 것이면 임의의 코리네형 미생물이 포함된다. 상기 코리네박테리움 속 미생물은 예를 들면, 각각 카나마이신 내성이 부여된, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032, 코리네박테리움 써모아미노게네스 FERM BP-1539, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881 및 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC11001이 될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예는, S-(2-아미노에틸)시스테인-내성, α-아미노-β-하이드록실 발레릭산-내성, 메틸라이신-내성, 소듐 아자이드-내성, 호모세린 유출성 및 루이신 요구성을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881의 변이주로서, 카나마이신에 대한 내성을 갖는 변이주이다. 본 구체예에서 있어서, 바람직하기로는, 상기 변이주는 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-CJP5103 (수탁번호 KCCM-10707P) 균주이다.

본 발명의 미생물은 종래 알려진 임의의 돌연변이 유발법에 의하여 L-라이신 생산능을 가진 코리네형 미생물에 돌연변이를 유발하고, 카나마이신의 존재하에서 배양함으로써 얻어질 수 있다. 상기 돌연변이 유발에는 상기 미생물을 변이 유발제, 예를 들면, 방사선 또는 변이 유발 화합물에 노출시켜 이루어질 수 있다. 또한, 위치지향성 돌연변이 유발법 (site directed mutagenesis)이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-CJP5103 (수탁번호 KCCM-10707P) 균주는, 화학적 변이 유발제인 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (N-methyl-N'-nitro-N-itrosoguanidine)을 사용하고 L-라이신 생산능이 있 는 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881을 모균주로 하여, 상기 모균주에 카나마이신 내성을 부여하여 제조될 수 있다.

구체적으로, 카나마이신 내성을 갖는 변이주는 상기 모균주를 돌연변이 유발원인 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘을 10⁷-10⁸/ml의 모균주에 대하여 30 ℃에서 최종 농도 500 ㎍/ml로 30 분간 처리하고, 카나마이신을 5 mg/l의 농도로 함유한 최소 한천평판 배지에서 성장하는 균주를 분리하여 얻을 수 있다. 더욱이, 본 발명의 변이주는, 얻어진 카나마이신 내성을 갖는 변이주를 배양하고, 균주 간의 L-라이신 생산능력을 비교하고, 향상된 L-라이신 생산능력을 갖는 균주를 선별함으로써 얻을 수 있다.

상기한 모균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881 및 그로부터 유도된 카나마이신 내성 변이주는 하기의 특성을 갖는다.

모균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881 : S-(2-아미노에틸)시스테인-내성, α-아미노-β-하이드록실 발레릭산-내성, 메틸라이신-내성, 소듐 아자이드-내성, 호모세린 유출성 및 루이신 요구성.

변이주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881 - CJP5103 : S-(2-아미노에틸)시스테인-내성, α-아미노-β-하이드록실 발레릭산-내성, 메틸라이신-내성, 소듐 아자이드-내성, 호모세린 유출성 및 루이신 요구성 및 카나마이신에 대한 내성.

본 발명에 있어서, 카나마이신은 아미노글리코사이드계 항생제의 일종으로서 단백질 생합성에 관여하는 리보좀과 결합하여 단백질 합성을 방해하여, 항생능력을 갖는다.

이상과 같은 본 발명의 균주는 카나마이신에 대한 내성을 부여함으로써, L-라이신 생산능이 향상된 균주이다. 모균주에 카나마이신 내성을 부여하는 과정에서, 메나퀴논 생합성에 관련되는 유전자가 불활성화되고, 그 결과 전자전달계의 활성이 저하된 균주가 얻어지는 것으로 여겨진다. 전자전달계 활성이 저하된 결과, 산소요구성도 함께 저하되고, 그에 따라 L-아미노산의 생산 수율이 증가한 것으로 여겨진다. 그러나, 본 발명이 이러한 특정한 기작에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 미생물을 배양하는 단계; 및

배양물 중의 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 있어서, 코리네박테리움 속 미생물의 배양은 당업계에 알려진 임의의 배양 조건 및 배양 방법이 사용될 수 있다. 코리네박테리아 균주 배양을 위하여 사용될 수 있는 배지로는 예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)에 개시된 배지가 사용될 수 있다. 배지 중에서 사용될 수 있는 당원으로는 포도당, 사카로즈, 유당, 과당, 맥아당, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨을 함유하는 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유해야 한다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20 ℃ 내지 45 ℃, 바람직하게는 25 ℃ 내지 40 ℃이다. 배양 시간은 원하는 L-아미노산의 생성량이 얻어질 때까지 계속할 수 있으나, 바람직하게는, 10 내지 160 시간이다.

본 발명의 방법에 있어서, 배양은 배치 공정, 주입 배치 및 반복 주입 배치 공정과 같은 연속식 또는 회분식으로 이루어질 수 있다. 이러한 배양은 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 임의의 방법이 사용될 수 있다.

L-아미노산은 배양액을 황산 또는 염산 처리한 후에 음이온 교환 크로마토그 래피, 농축, 정석, 등전점 침전 등의 공정을 병용하여 배양물로부터 회수될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 카나마이신 내성 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881 의 변이주의 제작

본 실시예에서는 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881를 모균주로 하고, 화학적 변이 유발제인 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘을 사용하여, 카나마이신 내성을 가지고, L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881의 변이주를 선발하였다.

먼저, 10⁷-10⁸/ml의 모균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881에 돌연변이 유발원인 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘을 30 ℃에서 최종 농도 500 ㎍/ml로 30 분 동안 처리하였다. 다음으로, 변이 처리된 미생물을 카나마이신을 5 mg/l의 농도로 함유한 최소 한천 평판 배지에서 배양하여, 성장하는 균주를 분리하였다. 또한, 분리된 변이주를 배양하고, L-라이신 생산량을 측정하여, 분리된 변이주들 중에서 L-라이신 생산능력이 가장 높은 균주를 선별하였다.

이렇게 얻어진 카나마이신 내성 변이주를 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-CJP5103로 명명하고, 2005년 11월 16일자로 한국미생물보존센터 (KCCM)에 기탁하고, 수탁번호 제KCCM-10707P호를 부여받았다.

본 실시예에서 얻어진 변이주와 모균주는 아래와 같은 특성을 갖는다.

다음으로, 선발된 카나마이신 내성 변이균주인 KFCC10881-CJP5103와 모균주의 카나마이신에 대한 내성을 시험하였다. 먼저, 루리아 버타니(LB) 액체 배지에서 상기 미생물을 16 시간 동안 성장시킨 다음, 세포를 멸균 생리 식염수로 2회 세척한 후 적당히 희석하여 5 mg/l 카나마이신을 함유하는 최소 한천 평판 배지에서 4 일 동안 배양한 후, 각 균주의 성장도를 측정하였다. 상기 최소 한천 평판 배지의 조성은 다음과 같다: 포도당 10g, (NH₄)₂SO₄ 2g, 요소 2g, KH₂PO₄ 1.0g, K₂HPO₄ 3.0g, MgSO₄·7H₂O 0.5g, FeSO₄·7H₂O 10mg, MnSO₄·7H₂O 10mg, 바이오틴 100㎍, 티아민·HCl 100㎍, CaCl₂·2H₂O 100㎍, Na₂B₄O₇·10H₂O 80㎍, (NH₄)₆MoO₂₇·4H₂O 40㎍, ZnSO₄·7 H₂O 10㎍, CuSO₄·7 H₂O 300㎍, MnCl₂·4H₂O 10㎍, FeCl₃·6H₂O 1mg, 한천 20g, 필 요시 L-루신 0.1g, 필요시 L-트레오닌 0.1g, 필요시 L-메티오닌 0.1g ,증류수 1리터당 (pH 7.0). 변이주와 모균주의 카나마이신 함유 배지에서의 성장도의 측정 결과는 표 1에 나타내었다.

표 1. 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881와 KFCC10881-CJP5103의 카나마이신에 대한 내성

카나마이신 (mg/l)	KFCC-10881	KFCC-10881-CJP5103
0	+++	+++
5	-	+++

+++: 충분한 성장 -: 성장하지 않음.

실시예 2: 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881 - CJP5103 의 L-라이신 생산성의 확인

하기의 종 배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881 및 KFCC10881-CJP5103을 접종하고 30 ℃에서 20 시간 동안 220 rmp으로 교반하면서 배양하였다. 다음으로, 얻어진 배양액 1 ml를 하기의 생산 배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 접종하고 32 ℃에서 96시간 동안 220 rpm으로 교반하면서 배양하였다.

배양 종료 후 HPLC에 의해 L-라이신의 생산량을 측정하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881 및 KFCC10881-CJP5103의 배양물 중의 L-라이신의 양은 염산염으로 나타내어 각각 44.5 g/l 및 48.1 g/l이었다.

종 배지 ( pH 7.0):

원당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH₂PO₄ 4 g, K₂HPO₄ 8 g, MgSO₄ 7 H₂O 0.5 g, 바이오틴 100㎍, 티아민 HCl 1000㎍, 칼슘-판토텐산 2000㎍, 니코틴아미드 2000㎍ (공정수 1 리터 기준)

생산 배지 ( pH 7.0):

원당 100 g, (NH₄)₂SO₄ 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고체 (Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH₂PO₄ 1 g, MgSO₄ 7 H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO₃ 30 g, (공정수 1리터 기준)

실시예 3: 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881 - CJP5103 의 배양액으로부터 L-라이신의 분리

당밀 및 원당 함유 배지에 균주 KFCC10881-CJP5103을 이용하여 얻은 라이신 발효액 1L에 염산을 사용하여 pH를 2.0으로 조절하여 Ca² ⁺ 이온을 CaSO₄, CaCl₂ 형태로 하였다. 다음으로, 배양액을 암모늄 형태로 재생된 양이온 교환 수지 (Diaion SK-L10)에 상류 방향으로 흡착시켰다. 이어서 탈염수로 세척하여 수지층 내에 잔존하는 균체 등을 제거한 후 2N 수산화 암모늄으로 용리를 행하여 라이신 고농도 부분을 수거하였다. 수거된 액을 농축한 후, 염산으로 pH 5.0으로 조절하면서 20℃로 냉각 결정화하였다. 결정화가 완료된 슬러리를 원심분리하여 1차 습제품을 얻고 모액은 재차 회분식으로 농축하면서 결정화한 후 2차 습제품을 얻었다. 1차 및 2차 습제품을 모두 합하여 건조한 결과 함량 98.5%의 라이신 건제품 44 g을 얻을 수 있 었다.

실시예 4: 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881 - CJP5103 의 배양액으로부터 L-라이신의 분리

전처리 당밀 및 원당 함유 배지에 균주 KFCC10881-CJP5103을 이용하여 얻은 라이신 발효액 1 L에 황산을 사용하여 pH를 2.0으로 조정한 후 암모늄 형태로 재생된 양이온 교환 수지 (Diaion SK-L10)에 상류 방향으로 흡착시켰다. 이어서 탈염수로 세척하여 수지층 내에 잔존하는 균체 등을 제거한 후 2N 수산화 암모늄으로 용리를 행하여 라이신 고농도 부분을 수거하였다. 수거된 액은 농축하여 염산으로 pH 5.0으로 조절하면서 20℃로 냉각 결정화하였다. 결정화가 완료된 슬러리를 원심분리하여 1차 습제품을 얻고 모액은 재차 회분식으로 농축하면서 결정화한 후 2차 습제품을 얻었다. 1차 및 2차 습제품은 모두 합하여 건조한 결과 함량 99%의 라이신 건제품 45 g을 얻을 수 있었다.

본 발명의 미생물은 향상된 L-라이신 생산능을 갖는다.

본 발명의 방법에 의하면, L-라이신을 높은 생산성으로 생산할 수 있다.

Claims

L-라이신 생산능을 가지고 있고, 카나마이신에 대한 내성을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-CJP5103 (수탁번호 KCCM-10707P).
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제1항에 따른 미생물을 배양하는 단계; 및

배양물 중의 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신의 생산 방법.