CN1974762A - 具有对卡那霉素抗性和增强的l－赖氨酸生产力的棒杆菌属微生物及生产l－赖氨酸的方法 - Google Patents

具有对卡那霉素抗性和增强的l－赖氨酸生产力的棒杆菌属微生物及生产l－赖氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

提供了能够生产L－赖氨酸并对卡那霉素有抗性的棒杆菌属微生物，以及使用其生产L－赖氨酸的方法。

Description

具有对卡那霉素抗性和增强的L-赖氨酸生产力的棒杆菌属微生物及生产L-赖氨酸的方法
                相关专利申请的交叉参考
本申请要求2005年11月30日提交于韩国知识产权局的韩国专利申请10-2005-0115905的利益，其全部内容通过参考结合与此。
                        发明背景
1.发明领域
本发明涉及具有对卡那霉素抗性和能生产L-赖氨酸的棒杆菌属的微生物以及使用其生产L-赖氨酸的方法。
2.相关领域的描述
Coryneform细菌是属于棒杆菌属和短杆菌属的微生物。
L-赖氨酸是广泛用于动物饲料、医药供应和食品的必需氨基酸。特别是，报道了L-赖氨酸于2004年的用量大约是80万吨，并且预期将来对L-赖氨酸的需求以每年平均约10％持续增加。
L-赖氨酸由微生物如大肠杆菌，棒杆菌等通过直接发酵而生产，因而通过改善发酵工艺开发具有增加的产率或L-赖氨酸生产力的生产微生物具有极大的经济效益。
L-赖氨酸由利用细菌的已知方法生产，所述细菌例如各种营养缺陷型突变体，各种抗药物的细菌，各种对药物敏感的细菌，各种对抗抗生素的细菌。在这些方法中，已知使用对抗抗生素的细菌的方法包括使用各种细菌的方法，所述细菌抗各种抗生素如利福平和链霉素等(参见，例如美国专利号4,623,623)。
然而，尚未报道对卡那霉素具有抗性并且生产L-赖氨酸的细菌，所述卡那霉素是一种基于氨基糖苷的抗生素。
本发明的发明人针对利用棒杆菌属的微生物通过直接发酵来生产L-赖氨酸的方法进行了广泛的研究以减少L-赖氨酸的生产成本和增加L-赖氨酸的产率，发现可以通过赋予棒杆菌属微生物以对抗卡那霉素的抗性而增加L-赖氨酸的生产力，从而完成了本发明。
                          发明概述
本发明提供了具有对卡那霉素抗性和能生产L-赖氨酸的棒杆菌属微生物。
本发明还提供利用该微生物高产率生产L-赖氨酸的方法。
                          发明详述
依照本发明的一个方面，提供了能够生产L-赖氨酸并对卡那霉素有抗性的棒杆菌属微生物。
该微生物可以是能够生产L-赖氨酸并且抵抗卡那霉素的棒杆菌属的任何微生物。例如，棒杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032，Corynebacteriumthermoaminogenes FERM BP-1539，谷氨酸棒杆菌KFCC 10881和谷氨酸棒杆菌KFCC 11001，它们抵抗卡那霉素，但不限于此。
依照本发明一个实施方案的棒杆菌属的微生物是谷氨酸棒杆菌KFCC10881的变体，其抵抗S-(2-氨基乙基)半胱氨酸，α-氨基-β-羟基戊酸，甲基赖氨酸和叠氮化钠，并且对亮氨酸具有需求，对高丝氨酸具有宽松的需求(leaky requirement)，该变体对卡那霉素有抗性。在本发明的当前实施方案中，该变体是谷氨酸棒杆菌KFCC10881-CJP5103(登记号KCCM-10707P)。
棒杆菌属的微生物可通过利用已知的突变方法在能够生产L-赖氨酸的棒杆菌属微生物中诱导突变，然后在存在卡那霉素的条件下培养得到的产物而获得。可以通过将能够生产L-赖氨酸的棒杆菌属微生物暴露于诱变剂如放射性的辐射或诱变化合物来诱导突变。另外，可以使用位点定向诱变，但诱变并不局限于那些方法。
依照本发明实施方案的谷氨酸棒杆菌KFCC10881-CJP5103(登记号KCCM-10707P)可以通过利用化学诱变剂N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍赋予亲本菌株-谷氨酸棒杆菌KFCC10881以针对卡那霉素的抗性而产生。
特别地，用诱变剂N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍于30℃处理107-108/ml的亲本菌株30分钟以达到最终浓度500μg/ml，分离在含有5mg/l卡那霉素的基本琼脂平板培养基中生长的细菌以获得具有对卡那霉素抗性的突变体。另外，可以通过培养具有对卡那霉素抗性的突变体，彼此比较细菌的L-赖氨酸生产力，并选择具有改善的L-赖氨酸生产力的细菌而获得依照本发明当前实施方案的突变体。
亲本菌株，谷氨酸棒杆菌KFCC10881，和从其获得的具有对卡那霉素抗性的突变体具有如下描述的特性。
亲本菌株，谷氨酸棒杆菌KFCC10881：具有对S-(2-氨基乙基)半胱氧酸的抗性，具有对α-氨基-β-羟基戊酸的抗性，具有对甲基赖氨酸的抗性，和具有对叠氮化钠的抗性，对高丝氨酸具有宽松的需求，并对亮氨酸具有需求。
突变体，谷氨酸棒杆菌KFCC10881-CJP5103：具有对S-(2-氨基乙基)半胱氨酸的抗性，具有对α-氨基-β-羟基戊酸的抗性，具有对甲基赖氨酸的抗性，和具有对叠氮化钠的抗性，对高丝氨酸具有宽松的需求，对亮氨酸具有需求，并具有对卡那霉素的抗性。
在本发明的当前实施方案中，卡那霉素是一种氨基糖苷基抗生素，通过结合参与蛋白质合成的核糖体而干扰蛋白质的合成，从而具有抗生素能力。
如上所述，本发明的微生物具有对卡那霉素的抗性和改善的L-赖氨酸生产力。在赋予亲本菌株以卡那霉素抗性的过程中，考虑参与甲基萘醌类生物合成的基因被灭活，结果获得电子转运活性降低的突变菌株。由于降低的电子转运活性，认为细菌的氧需求也降低，因此L-氨基酸的产率增加。然而，依照本发明当前实施方案的微生物机制并不限于这些具体的机制。
本发明还提供一种生产L-赖氨酸的方法，包括培养依照本发明实施方案的微生物；从培养物中收集L-赖氨酸。
在依照本发明当前实施方案的方法中，可以利用任何培养条件和本领域已知的方法来培养棒杆菌属的微生物。用于培养棒杆菌菌株的培养基的实例是美国细菌学会的普通细菌学方法手册(Manual of Methods forGeneral Bacteriology by the American Society for Bacteriology)(WashingtonD.C.，USA，1981)中公开的培养基。可以用于培养基中的碳源包括下述碳源：糖和碳水化合物如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，淀粉和纤维素；油和脂肪如大豆油，葵花油，蓖麻油和椰子油；脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚麻酸；醇如甘油，乙醇；和有机酸如乙酸。上述提及的糖源的实例可以单独使用或组合使用。氮源实例包括下述物质：蛋白胨，酵母提取物，肉提取物，麦芽提取物，玉米浆，大豆粉和尿素或无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。磷源的实例包括下述物质：磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，或其相应的钠盐。另外，培养基可以包括金属盐如硫酸镁或硫酸铁，它们对于生长是必需的。另外，除了上述成分外，可以使用生长的必需物质如氨基酸和维生素。而且，可以在培养基中使用适当的前体。在分批或连续方式培养过程中可以向培养基中添加上述成分。
利用碱性化合物如氢氧化钠，氢氧化钾或氨，或利用酸性化合物如磷酸或硫酸可以控制培养基的pH。另外，使用抗泡沫剂如脂肪酸聚乙二醇酯来抑制泡沫的产生。为了维持有氧条件，可以将氧或含氧的气体如空气注入到培养基中。培养基的温度可以是20-45℃，优选25-40℃。可以进行培养直至产生所需量的L-赖氨酸，但进行培养10-160小时是理想的。
可以以连续的方式利用分批、补料分批、重复补料分批或分批发酵法进行培养。这些方法在本领域是众所周知的，并且本发明并不局限于此。
可以通过用硫酸或盐酸处理培养基然后结合使用如阴离子交换层析、浓缩、盐析、等电点沉淀等的方法从培养物中收集L-氨基酸。
通过参考下述实施例将更详细地描述本发明。这些实施例仅是用于举例说明的目的，其不是意图限制本发明的范围。
实施例
实施例1：生产对卡那霉素具有抗性的谷氨酸棒杆菌KFCC10881的突变体
从通过用化学诱变剂N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍诱变作为亲本菌株的谷氨酸棒杆菌KFCC10881而获得的产物中筛选对卡那霉素具有抗性并且具有改善的L-赖氨酸生产力的谷氨酸棒杆菌KFCC10881突变体。
首先，于30℃用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍处理107-108/ml的亲本菌株30分钟，以达到最终浓度500μg/ml。接着，将诱变的微生物培养在包含浓度为5mg/l的卡那霉素的基本琼脂平板培养基中，以分离生长的细菌。另外，培养分离的突变体，并测定它的L-赖氨酸生产力，以从分离的突变体中选择具有最大L-赖氨酸生产力的细菌。
将获得的对卡那霉素具有抗性的突变体命名为谷氨酸棒杆菌KFCC10881-CJP5103，将其于2005年11月16日保藏在韩国微生物保藏中心(KCCM)，保藏号为KCCM-10707P。
在实施例1中获得的突变体和亲本细菌具有下述特性。
亲本细菌，谷氨酸棒杆菌KFCC10881：抗S-(2-氨基乙基)半胱氨酸，抗α-氨基-β-羟基戊酸，抗甲基赖氨酸，抗叠氮化钠，和对高丝氨酸具有宽松的需求，并需要亮氨酸。
突变体，谷氨酸棒杆菌KFCC10881-CJP5103：抗S-(2-氨基乙基)半胱氨酸，抗α-氨基-β-羟基戊酸，抗甲基赖氨酸，抗叠氮化钠，和对高丝氨酸具有宽松的需求，需要亮氨酸，并且抗卡那霉素。
接着，针对抗卡那霉素的所选择的突变体谷氨酸棒杆菌KFCC10881-CJP5103和亲本细菌进行对卡那霉素的抗性实验。首先，将两种微生物培养在LB液体培养基中16小时，然后利用无菌生理盐水洗涤细胞两次。然后，适当稀释洗涤的细胞，并将得到的产物培养在含5mg/l卡那霉素的基本琼脂平板培养基中4天，以测量每种微生物的生产力。基本琼脂平板培养基的组成如下：每1L的蒸馏水(pH7.0)中10g葡萄糖，2g(NH4)2SO4，2g尿素，1.0g KH2PO4，3.0g K2HPO4，0.5g MgSO4·7H2O，10mg FeSO4·7H2O，10mg MnSO4·7H2O，100μg生物素，100μg硫胺·HCl，100μg CaCl2·2H2O，80μg Na2B4O7·10H2O，40μg(NH4)6MoO27·4H2O，10μgZnSO4·7H2O，300μg CuSO4·7H2O，10μg MnCl2·4H2O，1mg FeCl3·6H2O，20g琼脂，0.1g L-亮氨酸(如果需要)，0.1g L-苏氨酸(如果需要)，0.1g L-甲硫氨酸(如果需要)。
测量突变体和亲本细菌在含卡那霉素的培养基的生产力的结果示于表1中。
表1.谷氨基棒杆菌KFCC10881和谷氨酸棒杆菌KFCC10881-CJP5103针对卡那霉素的抗性
  卡那霉素(mg/l)   KFCC-10881   KFCC-10881-CJP5103
  +++   +++
  -   +++
+++：充分生长-：无生长
实施例2：确定谷氨酸棒杆菌KFCC10881-CJP5103的L-赖氨酸生产力
将谷氨酸棒杆菌KFCC10881-CJP5103和谷氨酸棒杆菌KFCC10881接种在含下述25ml接种培养基(seed culture medium)的250ml弯头-挡板烧瓶(corner-baffled flask)中，将得到的产物于30℃培养20小时，同时于220rpm搅拌。接着，将1ml获得的培养基接种到含25ml下述生产培养基的250ml弯头-挡板烧瓶中，并将得到的产物于32℃培养96小时，同时于220rpm搅拌。
停止培养后，通过高压液相色谱(HPLC)测量L-赖氨酸的产生。在谷氨酸棒杆菌KFCC10881和谷氨酸棒杆菌KFCC10881-CJP5103的培养物中L-赖氨酸的量以L-赖氨酸的盐酸盐形式表示，分别为44.5g/l和48.1g/l。
接种培养基(pH7.0)：
20g原糖(raw sugar)，10g蛋白胨，5g酵母提取物，1.5g尿素，4gKH2PO4，8g K2HPO4，0.5g MgSO4 7H2O，100μg生物素，1,000μg硫胺HCl，2,000μg泛酸钙，2,000μg烟酰胺(1L蒸馏水为基础)
生产培养基(pH7.0)：
100g原糖，40g(NH4)2SO4，2.5g大豆蛋白，5g corn steep solid，3g尿素，1g KH2PO4，0.5g MgSO4 7H2O，100μg生物素，1,000μg硫胺HCl，2,000μg泛酸钙，3,000μg烟酰胺，30g CaCO3(1L的蒸馏水为基础)
实施例3：从谷氨酸棒杆菌KFCC10881-CJP5103的培养基中分离L-赖氨酸
向1L赖氨酸发酵液中加入盐酸，所述发酵液通过在含糖蜜和原糖的培养基中培养谷氨酸棒杆菌KFCC10881-CJP5103获得，将发酵液的pH调至pH2.0，钙离子转化为CaSO4和CaCl2。然后，通过使培养基向上方流动将培养基吸附到阳离子交换树脂(Diaion SK-L10)，其以铵的形式再生。通过用软化水洗涤去除阳离子交换树脂中的残余细菌后，通过用2N氢氧化铵洗脱树脂收集高度浓缩的赖氨酸。将收集的溶液浓缩并通过冷却至20℃结晶，同时调整pH至5.0。通过离心分离结晶完全的淤浆获得首批湿产物，通过分批浓缩和结晶母液获得第二批湿产物。通过合并首批和第二批湿产物并干燥所述合并的产物获得44g的干燥的赖氨酸产物，其具有98.5％的赖氨酸含量。
实施例4：从谷氨酸棒杆菌KFCC10881-CJP5103的培养基中分离L-赖氨酸
向1L赖氨酸发酵液中加入硫酸，所述发酵液通过在含糖蜜和原糖的培养基中培养谷氨酸棒杆菌KFCC10881-CJP5103获得，将发酵液的pH调至pH2.0。然后，通过使培养基向上方流动将培养基吸附到阳离子交换树脂(Diaion SK-L10)，其以铵的形式再生。通过用软化水洗涤去除阳离子交换树脂中的残余细菌后，通过用2N氢氧化铵洗脱树脂收集高度浓缩的赖氨酸。将收集的溶液浓缩并通过冷却至20℃结晶，同时利用盐酸调整pH至5.0。通过离心分离结晶完全的淤浆获得首批湿产物，通过分批浓缩和结晶母液获得第二批湿产物。通过合并首批和第二批湿产物并干燥所述合并的产物获得45g的干燥的赖氨酸产物，其具有99％的赖氨酸含量。
依照本发明的微生物具有L-赖氨酸生产力。
在利用依照本发明的微生物生产L-赖氨酸的方法中，可以高产率地生产L-赖氨酸。
尽管参考本发明的示例性实施方案已经具体显示和描述了本发明，本领域的普通技术人员可以理解可以对本发明进行各种形式和细节变化而不背离如后附的权利要求所限定的本发明的精神和范围。

Claims (4)

1.棒杆菌属微生物，其能够产生L-赖氨酸，并且对卡那霉素有抗性。
2.权利要求1的棒杆菌属微生物，其中所述微生物是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)KFCC10881的变体，其对S-(2-氨基乙基)半胱氨酸，α-氨基-β-羟基戊酸，甲基赖氨酸和叠氮化钠有抗性，并且对亮氨酸有需求，对高丝氨酸有宽松的需求，所述变体对卡那霉素有抗性。
3.权利要求2的棒杆菌属微生物，其中所述微生物是谷氨酸棒杆菌KFCC10881-CJP5103(登记号是KCCM-10707P)。
4.一种生产L-赖氨酸的方法，其包含培养依照权利要求1-3任一项的棒杆菌属微生物；和从培养物中收集L-赖氨酸。
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