CN105849249A - 具有增强的l-赖氨酸生产能力的棒杆菌属物种的微生物及使用其生产l-赖氨酸的方法 - Google Patents
具有增强的l-赖氨酸生产能力的棒杆菌属物种的微生物及使用其生产l-赖氨酸的方法 Download PDFInfo
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Abstract
提供了棒杆菌属物种的微生物以及通过使用该微生物生产L‑赖氨酸的方法，所述微生物经修饰而过表达谷氨酸棒杆菌的NCg10862基因，从而具有增强的L‑赖氨酸生产能力。
Description
发明领域
本发明涉及具有增强的L-赖氨酸生产能力的属于棒杆菌属的微生物及通过使用该微生物生产L-赖氨酸的方法。
发明背景
L-赖氨酸是一类必需氨基酸，并且在饲料、医学和食物领域中使用。L-赖氨酸主要通过使用诸如大肠杆菌(Escherichia coli)或棒杆菌属(Corynebacterium)等微生物直接发酵生产，并且在这点上，通过具有改善的产率的生产菌株的开发或者发酵工艺的改善来改善L-赖氨酸生产能力可以导致相当大的经济效果。
就改善赖氨酸的生产效率的方法而言，已经使用扩增参与赖氨酸的生物合成途径的基因或修饰基因的启动子以提高参与赖氨酸生物合成途径的酶的活性的方法。另外，已经不断进行对除了参与赖氨酸的生物合成途径的基因外的基因的研究以提高赖氨酸的生产能力。
本发明的发明人试图制备并探索谷氨酸棒状菌(Corynebacterium glutamicum)的野生型DNA文库以筛选与赖氨酸的生产能力相关的性状。因此，通过增强的NCgl0862基因表达，确认赖氨酸得到有效生产，从而完成本发明。直到现在，尚未报告属于棒杆菌属的微生物通过对其额外导入棒杆菌属衍生的NCgl0862基因而能够生成L-赖氨酸的研究。
发明详述
技术问题
本发明提供了属于棒杆菌属的微生物，其中编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多核苷酸的表达是增强的。
本发明提供了通过使用微生物生产L-赖氨酸的方法。
技术方案
本发明的一个方面提供了属于棒杆菌属的微生物，其中编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多核苷酸的表达是增强的。
所述多核苷酸可以编码与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有约70％或更高、约75％或更高、约80％或更高、约85％或更高、约90％或更高、约92％或更高、约95％或更高、约97％或更高、约98％或更高、或约99％或更高的序列同源性的氨基酸序列。如本文中使用的，术语“同源性”指两种多核苷酸或两种多肽模块之间的百分比同一性。可以通过使用本领域中已知的方法测定一种模块和另一种模块之间的序列同源性。例如，可以通过BLAST算法测定此类序列同源性，如文献[参考Karlin和Altschul,Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(在1993中发表)]中或者由Pearson的FASTA算法[参考Methods Enzymol.,183,63(在1990中发表)]披露的。基于BLAST算法，还开发出称作BLASTN或BLASTX的程序[参考www.ncbi.nlm.nih.gov]。
可以如下增强多核苷酸的表达，即通过取代或突变对表达调节序列的修饰、对多核苷酸序列引入的突变、起始密码子的变化、通过经由染色体插入或载体导入的多核苷酸拷贝数的增加、或其组合。
可以修饰多核苷酸的表达调节序列。表达调节序列控制与其可操作连接的多核苷酸的表达，并且例如可以包括启动子、终止子、增强子、沉默子、和Shine-Dalgarno序列。多核苷酸可以具有起始密码子的变化。可以用ATG替代由TTG或GTG组成的起始密码子，从而可以提高相应基因的酶促活性。可以将多核苷酸掺入染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。在本文，特定的位点可以包括例如转座子位点或基因间位点。另外，可以将多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而增加拷贝数。
例如，多核苷酸可以包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
如本文中使用的，术语“可操作连接”指调节序列和多核苷酸序列之间的功能性连接，由此调节序列控制多核苷酸序列的转录和/或翻译。调节序列可以是能提高多核苷酸的表达水平的强启动子。调节序列可以是源自属于棒杆菌属的微生物的启动子或者可以是源自其它微生物的启动子。例如，启动子可以是trc启动子、gap启动子、tac启动子、T7启动子、lac启动子、trp启动子、araBAD启动子或cj7启动子。可以修饰调节序列，使得例如参与赖氨酸的生物合成途径的主要基因的启动子序列在属于棒杆菌属的微生物中展现出更为增强的启动子活性。例如，调节序列可以是lysCP1启动子。如本文中 使用的，术语“lysCP1启动子”指通过提高编码天冬氨酸激酶基因的基因表达水平，酶促活性经改善而大于野生型的酶促活性的约5倍的强启动子，其中通过取代各自编码天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶的基因的启动子位点处的序列提高表达水平(韩国专利No.10-0930203)。
如本文中使用的，术语“载体”指含有基因的调节序列和基因序列并且配置为在合适的宿主细胞中表达靶基因的多核苷酸构建体。或者，载体又可以指多核苷酸构建体，其含有可用于同源重组的序列，从而由于对宿主细胞导入的载体，可以改变宿主细胞的基因组中的内源基因的调节序列，或者可以将可以表达的靶基因插入宿主的基因组的特定位点中。在这点上，本发明中使用的载体可以进一步包含选择标志物以确定载体对宿主细胞的导入或者载体对宿主细胞的染色体的插入。选择标志物可以包含赋予可选择表型，诸如药物抗性、营养缺陷型、针对细胞毒剂的抗性、或表面蛋白的表达的标志物。在用此类选择剂处理的环境中，由于仅表达选择标志物的细胞可以存活或者显示不同表型性状，可以选择经转化的细胞。
例如，本发明中使用的载体可以是能在大肠杆菌和棒状型(Coryne-type)细菌中以两个方向自身复制的载体pECCG122(韩国专利No.10-0057684)，或用于转化宿主细胞以容许将编码靶蛋白的基因插入宿主细胞的染色体中的载体pDZ，其中载体pDZ在谷氨酸棒杆菌中不能复制(韩国专利No.10-0924065)。另外，本文中使用的载体可以是例如源自载体pDZ并且可用于将基因插入谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株的染色体上的转座子位点中的载体pDZTn(韩国专利No.10-1126041)，但是载体不限于此。
如本文中使用的，术语“转化”指将多核苷酸导入宿主细胞中，从而多核苷酸可以作为基因组外元件或者以插入宿主细胞的基因组中能复制。转化本发明中使用的载体的方法可以包括将核酸导入细胞的方法。另外，如相关技术中公开的，可以根据宿主细胞实施电脉冲方法。
例如，属于棒杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒杆菌、有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、或产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)。
属于棒杆菌属的微生物可以具有L-赖氨酸生产能力。微生物可以通过将上文描述的多核苷酸导入属于棒杆菌属并且具有L-赖氨酸生产能力的微生物中而具有改善的L-赖氨酸生产能力。
如本文中使用的，术语“具有L-赖氨酸生产能力”指当在培养基中培养微生物时具有在其中生成并分泌L-赖氨酸的能力。与野生型或亲本菌株相比，微生物可以能够以更大的量在培养基中生成并积累L-赖氨酸。
属于棒杆菌属并且具有L-赖氨酸生产能力的微生物可以具有与NADPH生成相关的基因和/或与L-赖氨酸生物合成或分泌相关的基因的增强或降低的表达，或者可以使基因被外来基因取代。与NADPH生成相关的基因可以包括例如编码葡萄糖脱氢酶的基因、编码葡糖酸激酶的基因、编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因、编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因、或编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的基因。与L-赖氨酸生物合成相关的基因可以包括例如编码天冬氨酸氨基转移酶的基因、编码天冬氨酸激酶的基因、编码天冬氨酸半醛脱氢酶的基因、编码二氢吡啶二羧酸合酶(dehydrodipicolinate synthase)的基因、编码二氢吡啶二羧酸还原酶(dehydrodipicolinate reductase)的基因、编码间-二氨基庚二酸脱氢酶(meso-diaminopimelate dehydrogenase)的基因、或编码二氨基庚二酸脱羧酶的基因。与L-赖氨酸分泌相关的基因可以包括lysE，其是赖氨酸输出载体基因。属于棒杆菌属并且具有L-赖氨酸生产能力的微生物也可以通过使用木糖作为碳源而获得此类L-赖氨酸生产能力。
在一个实施方案中，属于棒杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒杆菌KCCM11016P(KFCC10881)(韩国专利No.10-0159812)。
在另一个实施方案中，可以对属于棒杆菌属的微生物导入编码天冬氨酸氨基转移酶的多核苷酸、编码天冬氨酸激酶的多核苷酸、编码天冬氨酸半醛脱氢酶的多核苷酸、编码二氢吡啶二羧酸合酶的多核苷酸、编码二氢吡啶二羧酸还原酶的多核苷酸、和编码二氨基庚二酸脱羧酶的多核苷酸。例如，属于棒杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒杆菌KCCM10770P(韩国专利No.10-0924065)。
在另一个实施方案中，属于棒杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒杆菌KCCM11347P(KFCC10750)。
在另一个实施方案中，属于棒杆菌属的微生物可以通过导入编码丙酮酸羧化酶(pyc)的多核苷酸的突变体、编码高丝氨酸脱氢酶(hom)的多核苷酸的突变体、和编码天冬氨酸激酶(lysC)的多核苷酸的突变体而获得赖氨酸生产能力(Binder et al,GenomeBiology,2012,13:R40)。微生物可以是例如谷氨酸棒杆菌CJ3P。
本发明的另一个方面提供了生产L-赖氨酸的方法，该方法包括培养微生物；并且从培养物中获得L-赖氨酸。
微生物与上文的描述相同。
可以在本领域中已知的培养条件下在合适的培养基中进行微生物的培养。可以根据要选择的微生物容易地调节此类培养方法。培养方法可以包括选自下组的一个或多个：分批培养、连续培养和补料-分批培养。
培养中使用的培养基可以满足特定微生物的要求。培养基可以选自下组：碳源、氮源、微量元素、及其组合。
碳源可以选自下组：碳水化合物、脂质、脂肪酸、醇、有机酸及其组合。碳水化合物可以是葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素或其组合。脂质可以是大豆油、向日葵油、蓖麻油、椰子油或其组合。脂肪酸可以是棕榈酸、硬脂酸、亚油酸或其组合。醇可以是甘油或乙醇。有机酸可以是乙酸。
氮源可以包括有机氮源、无机氮源、或其组合。有机氮源可以选自下组：胨、酵母提取物、肉膏、麦芽抽提物、玉米浸渍液(corn steep liquid,CSL)、大豆粉(soybean meal)及其组合。无机氮源可以选自下组：尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵及其组合。
培养基可以包含选自下组的一种：磷、金属盐、氨基酸、维生素、前体及其组合。磷源可以包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾(dipotassium phosphate)、其相应的含钠盐。金属盐可以是硫酸镁和硫酸亚铁(iron sulfate)。
可以将培养基或其个别组分以分批模式、连续模式、或补料-分批模式添加到培养基。
在培养方法中，可以调节培养物的pH。可以通过对培养物添加氢氧化铵、氢氧化钾、氨水(ammonia)、磷酸或硫酸实施pH调节。此外，培养方法可以包括防止气泡产生。可以通过使用消泡剂进行气泡产生的防止。消泡剂可以包括脂肪酸聚乙二醇酯(fatty acidpolyglycol ester)。此外，培养方法可以包括将气体注射入培养物中。气体可以包括能够维持培养物的需氧条件的任何气体。气体可以是氧气或含氧气体。含氧气体可以包括空气。在培养中，培养物的温度可以是20至45℃，例如22至42℃或25至40℃。可以继续培养，直到L-赖氨酸的生产达到期望的水平。
例如，可以如下从培养物回收生成的L-赖氨酸，即用硫酸或氢氯酸处理 培养物，接着进行诸如阴离子交换层析、浓缩、结晶和等电点沉淀的方法的组合。
本发明的有利效果
可以通过使用根据本发明的一个方面的微生物提高L-赖氨酸的生产能力。
可以通过使用根据本发明的另一个方面的生产L-赖氨酸的方法提高L-赖氨酸的生产能力。
实施例
在下文中，本申请会参考实施例更为详细地描述。然而，这些实施例仅仅用于例示目的，并且本申请的范围并不意图受限于这些实施例。
实施例1：制备野生型谷氨酸棒杆菌基因组DNA文库
制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株的基因组DNA，然后用限制酶Sau3AI处理，从而获得6至8kb的部分片段。连接片段与穿梭载体pECCG122以转化大肠杆菌和棒杆菌，该穿梭载体包含用于限制酶BamHI的末端。然后，用所得的载体转化大肠杆菌DH5α，并且在含有卡那霉素(25mg/L)的LB固体培养基上涂布。通过PCR(使用SEQ ID NO:3和4的引物)选择用插入有片段的载体转化的菌落，并且进行混合培养，并且通过一般已知的质粒提取方法自其获得质粒。
SEQ ID NO:3:TCAGGGTGTAGCGGTTCGGTTTAT。
SEQ ID NO:4:CCGCGCGTAATACGACTCACTATA。
实施例2：导入文库和选择具有改善的赖氨酸生产能力的菌株
使用电脉冲方法用实施例1中制备的重组载体转化谷氨酸棒杆菌KCCM11016P菌株(其生成赖氨酸)，然后在下文描述的复合培养基板上涂布。
<复合培养基板>
20g葡萄糖、50g(NH4)2SO4、10g胨、5g酵母提取物、1.5g尿素、5gKH2PO4、10g K2HPO4、0.5g MgSO4·7H2O、100μg生物素、1,000μg硫胺素(thiamine)HCl、2,000μg泛酸钙、2,000μg烟酰胺、20g琼脂和25mg卡那霉素(基于1L蒸馏水)。
将约2,000个菌落接种入含有200uL下文描述的复合液体培养基的96深孔板(由Bioneer Company制造)的每孔中，然后通过以200rpm和30℃摇动培 养24小时。根据赖氨酸氧化酶法，将50ul每种培养物添加至96孔板，其上分布含有赖氨酸氧化酶的反应混合物(含有200ul磷酸钾(pH 7.5)、0.04ul赖氨酸氧化酶(0.1个单位/ul)、0.04ul过氧化物酶(1个单位/ul)和0.4mg ABTS)。在反应30分钟后，测量OD405nm的吸光度，并且比较颜色形成的程度。在它们之中，选择7类实验组，各组具有高于对照组(KCCM11016P/pECCG122)的吸光度。
<复合液体培养基>
20g葡萄糖、10g胨、5g酵母提取物、1.5g尿素、4g KH2PO4、8g K2HPO4、0.5g MgSO4·7H2O、100μg生物素、1,000μg硫胺素HCl、2,000μg泛酸钙和2,000μg烟酰胺(基于1L蒸馏水)。
将个体菌株接种入含有25ml下文描述的种子培养基的250ml三角振荡烧瓶(corner-baffled flask)中，然后通过以200rpm和30℃摇动培养20小时。然后，将1ml种子培养物接种入含有24ml下文描述的生产培养基的250ml三角振荡烧瓶中，然后通过以200rpm和37℃摇动培养96小时。在完成培养后，通过HPLC分析L-赖氨酸浓度，并且表1中显示了分析结果。
<种子培养基(pH 7.0)>
20g葡萄糖、10g(NH4)2SO4、10g胨、5g酵母提取物、1.5g尿素、4gKH2PO4、8g K2HPO4、0.5g MgSO4·7H2O、100μg生物素、1,000μg硫胺素HCl、2,000μg泛酸钙和2,000μg烟酰胺(基于1L蒸馏水)。
<生产培养基(pH 7.0)>
100g葡萄糖、40g(NH4)2SO4、2.5g大豆蛋白、5g玉米浸渍固体、3g尿素、1g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、100μg生物素、1,000μg硫胺素HCl、2,000μg泛酸钙、3,000μg烟酰胺、和30g CaCO3(基于1L蒸馏水)。
[表1]
基于上文的结果，选择与对照组相比显示增加的赖氨酸生产能力的KCCM11016P/M2和KCCM11016P/L52，然后自其提取质粒，接着使用SEQ ID NO:3和4的引物进行测序分析。源自KCCM11016P/M2的质粒命名为pEC-L1，并且源自KCCM11016P/L52的质粒命名为pEC-L2。pEC-L1质粒包含NCgl0857基因的可读框(ORF)起始密码子上游的约200个碱基对(bp)至NCgl0862基因的ORF终止密码子下游的约200bp。pEC-L2质粒包含NCgl0861基因的ORF终止密码子下游的约250bp至NCgl0865基因的ORF起始密码子上游的约300bp。因而，确认了两类质粒都共同包含NCgl0862基因。
实施例3：制备载体以替换NCgl0862基因的启动子
基于实施例2中获得的结果，为了确认NCgl0862基因的过表达是否实际上诱导赖氨酸生产能力的改善，制备配置为替换染色体上的NCgl0862基因的启动子的载体。对于启动子的替换，使用野生型启动子(lysCP)和经修饰的启动子lysCP1作为lysC基因的启动子。
如下提供了详细描述。
基于国立卫生研究所National Institutes of Health(NIH GenBank,US)的GenBank，设计引物对(SEQ ID NO:5和6或SEQ ID No:7和8)，其配置为分别扩增NCgl0862基因(SEQ ID NO:2)的ORF起始密码子的上游和下游。另外，设计引物对(SEQ ID NO:9和10的引物)以从lysC基因上游的序列扩增启动子位点。下文显示了引物的SEQ ID No.和序列。有下划线的序列标示由限制酶识别的位点。
SEQ ID NO:5是GTGAATTCCGCCCGTATGGTGATT；
SEQ ID NO:6:TAGGATCCAGAAGGCGCTGGCTT
SEQ ID NO:7:AGGGATCCTAACATATGGAAGCCGAAGCACCT
SEQ ID NO:8:AGGTCGACTCATTCGTTCATAATT
SEQ ID NO:9:TAGGATCCTAGGGAGCCATCTTTTGGGG
SEQ ID NO:10:TAACATATGTGTGCACCTTTCGATCTACG。
通过使用谷氨酸棒杆菌KCCM11016P菌株的基因组DNA作为模板和SEQ ID NO:5和6及SEQ ID NO:7和8，以及SEQ ID NO:9和10的引物对进行PCR，从而获得各自具有NCgl0862基因的ORF起始密码子的左和右侧翼序列的300bp DNA片段和lysC片段的野生型启动子的片段。用于PCR扩增的条件包括于94℃变性5分钟，于94℃变性30秒，于56℃退火30秒，和于72℃聚合30秒的30个循环，然后于72℃聚合7分钟。分别用EcoRI和BamHI，和BamHI和SalI处理具有NCgl0862基因的ORF起始密码子的左或右侧翼序列的通过PCR扩增的每种300bp产物，然后连接到通过用限制酶SalI和EcoRI处理用于对属于棒杆菌属的微生物的染色体插入的载体pDZ获得的DNA片段，从而获得载体。
为了扩增lysCP启动子或lysCP1启动子，通过使用谷氨酸棒杆菌ATCC 13032菌株或KCCM11016P-lysCP1菌株(韩国专利No.10-0930203)的基因组DNA作为模板和SEQ ID NO:9和10的引物对实施PCR，从而获得lysCP启动子和lysCP1启动子的300bp片段。用BamHI和NdeI处理lysC野生型启动子和lysCP1启动子的DNA片段。然后，连接上文获得的载体与通过用BamHI和NdeI处理获得的DNA片段，从而制备重组质粒pDZ-lysCP_N0862和pDZ-lysCP1_N0862。
实施例4：分析具有替换的NCgl0862衍生赖氨酸生产菌株的启动子的菌株的赖氨
酸生产能力
根据电脉冲方法(Van der Rest et al.,Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545,1999)，将实施例3中制备的重组质粒pDZ-lysCP_N0862和pDZ-lysCP1_N0862转化入谷氨酸棒杆菌KCCM11016P中。根据一般已知的染色体同源重组，通过PCR(SEQ ID NO:5和8的引物)选择lysC启动子插入NCgl0862基因的启动子位点中的菌株。选择的重组菌株命名为谷氨酸棒杆菌KCCM11016P::lysCP_N0862和KCCM11016P::lysCP1_N0862。
为了鉴定此类制备的赖氨酸生产菌株KCCM11016P::lysCP_N0862和KCCM11016P::lysCP1_N0862的赖氨酸生产能力，以与实施例2中相同的方式对菌株进行种子培养和生产培养，然后，如下文显示(参见表2)分析每种培养物的赖氨酸浓度。
[表2]
如表2中显示的，确认了与亲本菌株KCCM11016P相比，用lysC野生型启动子替换启动子的KCCM11016P::lysCP_N0862菌株的赖氨酸生产能力平均增加1％，并且与亲本菌株相比，用lysCP1启动子替换启动子的KCCM11016P::lysCP1_N0862菌株的赖氨酸生产能力平均增加4％。此后，KCCM11016P::lysCP1_N0862菌株命名为CA01-2269，并且在2013年6月12日以登录号KCCM11430P保藏于韩国微生物培养物保藏中心(Korean Culture Center ofMicroorganisms，KCCM)。
实施例5：制备用于对NCgl0862基因的额外染色体插入的载体
为了容许将期望的基因插入转座子基因的位置中，使用自pDZ载体设计的pDZTN载体作为基础载体，从而设计并制备配置为另外将实施例2的NCgl0862基因插入染色体中的载体。
基于报告的序列，合成引物(SEQ ID NO:7和12)以扩增NCgl0862基因的位点。通过使用谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的染色体作为模板进行PCR，从而扩增NCgl0862基因的约370bp ORF位点。
另外，合成引物(SEQ ID NO:10和11)以扩增lysC基因的启动子的位点。通过使用谷氨酸棒杆菌KCCM11016P-lysCP1导入菌株的染色体作为模板实施PCR，从而扩增约300bp启动子位点。在本文，用于PCR扩增的条件包括于94℃变性5分钟，于94℃变性30秒，于56℃退火30秒，和于72℃聚合30秒的30个循环，然后于72℃聚合7分钟。
SEQ ID NO:11:TAACTAGTTAGGGAGCCATCTTTTGGGG
用限制酶SpeI和NdeI处理通过PCR扩增的基因片段，从而获得其DNA片段。连接DNA片段与具有限制酶SpeI末端的用于染色体插入的载体pDZTN。然后，用所得的载体转化大肠杆菌DH5α，并且在含有25mg/L卡那霉素的LB固体培养基上涂布。通过PCR(SEQ ID NO:12和13的引物)选择用包含其中插入的期望基因的载体转化的菌落，并且通过进行一般已知的质粒提取方法获得质粒，然后命名为pDZTN-N0862。
SEQ ID NO:12:TAACTAGTATGCTCGGTCCGGGCA
SEQ ID NO:13:GCAGGCGGTGAGCTTGTCAC。
实施例6：分析包含染色体上额外插入的NCgl0862的菌株的赖氨酸生产能力
基于染色体同源重组，使用实施例5中制备的载体pDZTN-N0862转化L-赖氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌KCCM11016P。此后，通过PCR(使用SEQ ID NO:12和13的引物)自其选择性筛选菌落，并且所得的菌株命名为KCCM11016P::N0862-Tn。以与实施例2中相同的方式各自培养KCCM11016P::N0862-Tn和对照组，然后如下文所示(参见表3)分析培养物中的L-赖氨酸的浓度。
[表3]
因此，确认与亲本菌株KCCM11016P相比，KCCM11016P::N0862-Tn(其是具有染色体上额外插入的NCgl0862基因的菌株)的赖氨酸生产能力增加8％。
实施例7：使用包含染色体上额外插入的NCgl0862的KCCM10770P衍生微生物生产
L-赖氨酸
使用实施例5中制备的载体pDZTN-N0862来转化谷氨酸棒杆菌KCCM10770P，其是赖氨酸生产菌株，其中对其染色体额外添加7类参与L-赖氨酸生物合成途径的基因。此后，通过PCR选择在染色体上额外插入NCgl0862基因的菌株，并且所得的菌株命名为谷氨酸棒杆菌KCCM10770P::N0862-Tn。以与实施例2中相同的方式培养菌株，然后如下文所示(参见表4)分析培养物中的L-赖氨酸的浓度。
[表4]
因此，确认与亲本菌株相比，赖氨酸生产能力增加5％。
实施例8：使用包含染色体上额外插入的NCgl0862的CJ3P衍生微生物生产L-赖氨
酸
为了鉴定属于谷氨酸棒杆菌的其它菌株中的效果，使用实施例5中制备的载体pDZTN-N0862转化谷氨酸棒杆菌CJ3P，其是具有与L-赖氨酸生产能力的改善有关的3类基因突变的赖氨酸生产菌株。此后，通过PCR选择染色体上额外插入NCgl0862基因的菌株，并且所得的菌株命名为CJ3P::N0862-Tn。以与实施例2中相同的方式培养菌株，然后如下文所示(参见表5)分析培养物中的L-赖氨酸的浓度。
[表5]
因此，确认与亲本菌株相比，赖氨酸生产能力增加12％。
实施例9：使用包含染色体上额外插入的NCgl0862的KCCM11347P衍生微生物生产
L-赖氨酸
为了鉴定属于谷氨酸棒杆菌的其它菌株中的效果，以与实施例5中相同 的方式将载体pDZTN-N0862导入L-赖氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌KCCM11347P(韩国专利No.1994-0001307)，并且所得的菌株命名为KCCM11347P::N0862-Tn。以与实施例2中相同的方式培养菌株，然后如下文所示(参见表6)分析培养物中的L-赖氨酸的浓度。
[表6]
因此，确认与亲本菌株相比，赖氨酸生产能力增加6％。
保藏机构名称：韩国微生物培养物保藏中心(国际)
保藏号：KCCM11347P
保藏日期：19911210
与保藏的微生物或其它生物材料相关的说明
(PCT第13条之二)
表PCT/RO/134(1998年7月，2004年1月重印)
保藏机构名称：韩国微生物培养物保藏中心(国际)
保藏号：KCCM11430P
保藏日期：20130612
与保藏的微生物或其它生物材料相关的说明
(PCT第13条之二)
表PCT/RO/134(1998年7月，2004年1月重印)
PCT/RO/134表
Claims (4)
1.一种生成L-赖氨酸的属于棒杆菌属(Corynebacterium)的微生物，其具有编码SEQID NO:1的氨基酸序列的多核苷酸的改善的表达。
2.权利要求1的微生物，其中所述改善的表达通过基因拷贝数的增加、表达调节序列的操纵、或其组合诱导。
3.权利要求1的微生物，其中所述微生物是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。
4.一种生产L-赖氨酸的方法，所述方法包括：
培养权利要求1的微生物；并
从所述培养物中回收L-赖氨酸。
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