CN104824364A - 富含五种必需氨基酸的功能蛋白饲料生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种富含五种必需氨基酸的功能蛋白饲料生产方法，首先对谷氨酸棒杆菌、近平滑假丝酵母、植物乳杆菌和纳豆芽孢杆菌进行液体发酵，将发酵醪液混合配制成发酵醪液；再将其按照一定比例与豆粕、棉粕、菜籽粕和花生粕中的一种或两种以上的混合物混合，进行固态发酵，最后对产品干燥、包装，终产品中粗蛋白含量高于50%，且富含五种必需氨酸。本发明将发酵醪液直接与固态物料混合发酵，降低了染杂菌的几率；能耗低，无废弃物排放；通过发酵，降低了物粕类原料中抗营养因子含量，提高了原料中必需氨基酸和蛋白质含量，提升了农副产品的经济附加值；成品饲料中必需氨基酸含量高，可替代外源必需氨基酸的添加量，降低了饲料成本。

Description

富含五种必需氨基酸的功能蛋白饲料生产方法

技术领域

本发明涉及动物饲料生产技术领域，尤其是涉及一种富含五种必需氨基酸的功能蛋白饲料生产方法。

背景技术

    我国养殖业发达，每年消耗的大量饲料蛋白质原料的主要来源为豆粕和鱼粉。虽然这两种产品的粗蛋白含量较高，但鱼粉存在质量不均一，资源日益短缺等问题，而饼粕类饲料成本虽较低，但属于植物蛋白，其中含有大量的抗营养因子，影响动物对饲料的消化和吸收。为解决这一问题，近年出现了利用乳酸菌，芽孢杆菌，酵母菌和光合细菌等混菌发酵生产饲料蛋白原料的技术。此类技术利用发酵饼粕等农副产品，达到消除抗营养因子，增加蛋白含量目的，如国家专利（公布号：CN102488084A）就公开了一种好氧混合菌发酵秸秆饼粕制备蛋白饲料方法；国家专利（公布号：CN101449739）也公布了一种微生态发酵蛋白饲料及其制备方法。但是，常见的发酵饲料生产技术通常难以解决蛋白饲料中氨基酸的平衡问题，特别是必需氨基酸（如精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、缬氨酸和色氨酸等）的含量和组成平衡问题，不同用途的蛋白饲料原料对必需氨基酸含量的要求不同。最新研究表明，补充含必需氨基酸的低蛋白日粮，可以降低饲养成本，减少养殖场环境污染，降低幼畜腹泻率。然而，目前饲料中使用的氨基酸几乎都是先通过生物发酵法生产纯品，再混合添加到浓缩料或全价料中，大幅度提高了饲养成本。

使用芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌等微生物可直接发酵豆粕等农副产品，虽然可以消除豆粕中的抗营养因子、提高消化率，如国家专利（公布号：CN102406134A）就提供了一种高消化率发酵豆粕的固态发酵方法，但这些方法生产的发酵蛋白饲料很难提高其中必需氨基酸的含量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用豆粕、棉粕、菜籽粕和花生粕中的一种或两种以上混合发酵制得富含五种必需氨基酸的功能蛋白饲料生产方法。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的富含五种必需氨基酸的功能蛋白饲料生产方法，包括下述步骤：

第一步，液体发酵

将编号为CICC 20906、CICC 20191、 CICC 20903、CICC 20887和CICC 20192的五种谷氨酸棒杆菌按1:1:1:1:1比例混合后先进行种子培养和液体发酵；将编号为CICC1257的近平滑假丝酵母进行种子培养，然后接入到谷氨酸棒杆菌发酵液中混菌发酵，得到混菌发酵液备用；

将编号为CICC20022或CICC20038的植物乳杆菌单独发酵，发酵液备用；

将编号为CICC23413或CICC20443的纳豆芽孢杆菌单独发酵，发酵液备用；

第二步，制备发酵醪液

将第一步制得的发酵液按谷氨酸棒杆菌和近平滑假丝酵母混菌发酵液10~60份，植物乳杆菌发酵液0~30份或/和纳豆芽孢杆菌发酵液0~30份混合，用Ca(OH)₂调节pH值至中性，得到发酵醪液备用；

第三步，固态发酵

按重量比将100~150份豆粕、棉粕、菜籽粕和花生粕中的一种或两种以上物料与5~10份糖蜜混合，得到固态发酵原料，将第二步得到的发酵醪液按固态发酵原料重量的50~100%的比例与发酵原料混合，进行有氧固态发酵，发酵条件为：起始温度20~30℃，过程控制温度30℃~45℃，发酵时间为48~72h；

  第四步，烘干包装

  发酵结束，将发酵物料在60~70℃条件下烘干到含水量≤12%，粉碎后计量包装，即可得到富含五种必需氨基酸的高蛋白饲料。

所述第一步中谷氨酸棒杆菌与近平滑假丝酵母混菌发酵液的制备方法为：

将使用牛肉膏蛋白胨培养基活化后的五种谷氨酸棒杆菌种用无菌生理盐水制成悬浮菌液，接种到液体发酵种子培养基中培养，培养基组成：葡萄糖100~120g/L、(NH₄)₂SO₄ 20~30g/L、玉米浆10~20g/L、KH₂PO₄ 1~1.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.3~0.5 g/L、生物素5~8×10^-5 g/L、CaCO₃ 10~30 g/L；pH7.0，0.12 MPa下灭菌20 min；培养条件：罐压0.03~0.1 Mpa，搅拌转速 170~230 r/min，通风量1:0.25~0.5，培养温度30~32℃，发酵时间24~48h；将近平滑假丝酵母用无菌生理盐水制成悬浮菌液，当谷氨酸棒杆菌发酵液的产酸率达到5.0%以上时，接入近平滑假丝酵母悬浮菌液，继续培养发酵10h即可。

所述第一步中植物乳杆菌发酵液的制备方法为：

使用固体MRS培养植物乳杆菌，将植物乳杆菌一级固体种子用无菌生理盐水制成悬浮菌液，接种到液体发酵培养基中，培养基组成：葡萄糖或糖蜜20-50g/L、玉米浆20~35 g/L，七水合硫酸镁0.25~0.35 g/L，四水合硫酸锰0.01~0.015 g/L，七水合硫酸铁0.01~0.015 g/L，乙酸钠16~21 g/L，Tween-80 l mL/L；培养条件：罐压0.03~0.1 Mpa静置培养，培养温度30~32℃，发酵时间18~22 h。

所述第一步中纳豆芽孢杆菌发酵液的制备方法为：

将使用牛肉膏蛋白胨培养基活化后的纳豆芽孢杆菌种用无菌生理盐水制成悬浮菌液，接种到液体发酵培养基中，培养基组成：豆粕粉1.0~3.0%，玉米粉1.0~3.0%，硫酸镁0.2~0.6%，硫酸锰0.02~0.06%，氯化钠0.5~1.0%；培养条件：罐压0.05~0.1 Mpa，搅拌转速170~230 r/min，通风量1:0. 5~1.2，培养温度32~35℃，发酵时间18~24 h。

本发明的优点在于工艺简单，将发酵醪液直接与固态物料混合发酵，既利用了微生物的代谢产物，又大大缩短了固态发酵时间，降低了生料固态发酵过程中染杂菌的几率；能耗低，发酵过程中无废弃物排放；通过发酵，降低了植物粕类原料中抗营养因子含量，又提高了原料中必需氨基酸和蛋白质含量；成品饲料中必需氨基酸含量高，可减少或替代外源必需氨基酸的添加量，降低了饲料成本。

本发明中使用了五种谷氨酸棒杆菌，其中编号CICC 20906的可产赖氨酸，编号CICC 20191的可产精氨酸，编号CICC 20903的可产苏氨酸，编号CICC 20887可产缬氨酸，编号CICC 20192可产色氨酸，将其与近平滑假丝酵母、植物乳杆菌和纳豆芽孢杆菌进行种子培养和液体发酵，得到的发酵醪液与豆粕、棉粕、菜籽粕和花生粕中的一种或两种以上物料拌匀进行固态发酵，得到富含赖氨酸、精氨酸、苏氨酸、缬氨酸和色氨酸五种必需的氨基酸的高蛋白饲料原料，解决了蛋白饲料中氨基酸的平衡问题，特别是必需氨基酸（精氨酸，赖氨酸，苏氨酸，缬氨酸和色氨酸）的含量和组成平衡问题。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明。

本发明所用的菌种谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum，CICC 20906、CICC 20191、CICC 20903 、CICC 20887、CICC 20192)，近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis，CICC 1257），植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，CICC20022、CICC20038）、纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto， CICC23413、CICC20443）均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

实施例1

本发明所述的富含五种必需氨基酸的功能蛋白饲料生产方法包括下述步骤：

第一步，液体发酵

将牛肉膏蛋白胨上的五种谷氨酸棒杆菌（编号分别为CICC20191、CICC20906、CICC20903、CICC20887和CICC 20192）用200ml无菌生理盐水制成悬浮菌液,按1:1:1:1:1比例混合后，接种到液体发酵培养基中培养(装液量60%)，培养基组成：葡萄糖120g/L、(NH₄)₂SO₄ 30g/L、玉米浆20g/L、KH₂PO₄ 1.5g/L、MgSO₄·7H₂O0.5 g/L、生物素8×10^-5 g/L、CaCO₃ 30 g/L；pH7.0，0.12 MPa下灭菌20 min；培养条件：罐压0.1 Mpa，搅拌转速 230 r/min，通风量1:0.25，培养温度30℃，发酵时间48h；将YPD培养基上的近平滑假丝酵母（编号为CICC  1257）用200ml无菌生理盐水制成悬浮菌液，当谷氨酸棒杆菌发酵液的产酸率达到5.0%以上时，接入近平滑假丝酵母悬浮菌液，继续培养发酵10h；

将斜面上的植物乳杆菌（编号为CICC20022）在盛有MRS培养基的500mL茄形扁瓶中接种，将植物乳杆菌一级固体种子用200mL无菌生理盐水制成悬浮菌液，到发酵罐中培养（装液量60%），培养基组成：葡萄糖或糖蜜20-50g/L、玉米浆35 g/L，七水合硫酸镁0.35 g/L，四水合硫酸锰0.015 g/L，七水合硫酸铁0.015 g/L，乙酸钠21 g/L，Tween-80 lmL/L；培养条件：罐压0.1 Mpa静置培养，培养温度30℃，发酵时间22 h。

第二步，制备发酵醪液

将第一步制得的发酵液按谷氨酸棒杆菌和近平滑假丝酵母发酵液20份与植物乳杆菌发酵液10份混合均匀，用Ca(OH)₂调节pH值至7.0，得到发酵醪液备用；

第三步，固态发酵

按重量比将100份去皮豆粕（也可以是棉粕、花生粕以及它们的混合物均可）与5份糖蜜混合，得到固态发酵原料；将第二步配制的发酵醪液按固态发酵原料重量的60%的比例与固态发酵原料混合均匀，在发酵塔上进行有氧固态发酵，发酵条件：起始温度25℃，过程控制温度45℃，发酵时间为60h；

  第四步，烘干包装

  发酵结束，将发酵物料传送到干燥器上，使用热风，在65℃条件下烘干到含水量≤12%，粉碎后计量包装，得到富含五种必需氨基酸的高蛋白饲料原料。

按照国家标准（GB/T 19541和GB/T 18296）进行测定，本发明方法制得的发酵豆粕与普通豆粕、常规发酵豆粕的营养指标进行对比，结果如下：

从上表中可看出，本发明方法得到的发酵豆粕中，粗蛋白含量高达51.26%，必需氨基酸中的精氨酸含量可达到4.01%，赖氨酸含量可达到3.81%，苏氨酸含量可达2.2%，缬氨酸含量可达2.86%，色氨酸含量可达0.76%。本发明全面提升了饲料中五种必须氨基酸的含量，本领域目前尚无同类技术的出现，同时饲料的适口性好，易于动物吸收和利用。

实施例2

本发明所述的富含五种必需氨基酸的功能蛋白饲料生产方法包括下述步骤：

第一步，液体发酵

五种谷氨酸棒杆菌（编号为CICC20191、CICC20906、CICC20903、CICC20887和CICC 20192）与近平滑假丝酵母（编号为CICC 1257）混菌液的制备方法同实施例1；

取纳豆芽孢杆菌（编号为CICC23413）斜面种子在盛有蛋白胨牛肉膏培养基的500ml茄形瓶中接种，将纳豆芽孢杆菌一级固体种子用200ml无菌生理盐水制成悬浮菌液，接种到2m3发酵罐中（种子罐培养基装液量60%）发酵培养，培养基组成：豆粕粉2.0%，玉米粉1.5%，硫酸镁0.4%，硫酸锰0.05%，氯化钠1.0%；培养条件：罐压0.05 Mpa，搅拌转速190 r/min，通风量1:0.8，培养温度35℃，发酵时间20 h。

第二步，制备发酵醪液

将第一步制得的发酵液按谷氨酸棒杆菌和近平滑假丝酵母混菌发酵液30份与纳豆芽孢杆菌发酵液10份混合均匀，用Ca(OH)₂调节pH值至7.0，得到发酵醪液备用；

第三步，固态发酵

按重量比将120份去皮豆粕与10份糖蜜混合，得到固态发酵原料；将第二步配制的发酵醪液按固态发酵原料重量的80%的比例与固态发酵原料混合均匀，进行有氧固态发酵，发酵条件：起始温度25℃，过程控制温度45℃，发酵时间为60h；

  第四步，烘干包装

  发酵结束，将发酵物料传送到干燥器上，使用热风，在65℃条件下烘干到含水量≤12%，粉碎后计量包装，得到富含五种必需氨基酸的高蛋白饲料原料。

按照国家标准（GB/T 19541和GB/T 18296）进行测定，本发明方法制得的发酵豆粕与普通豆粕、常规发酵豆粕的营养指标进行对比，结果如下：

从上表中可看出，本发明方法得到的发酵豆粕中，粗蛋白含量高达51.8%，必需氨基酸中的精氨酸含量可达到3.71%，苏氨酸含量可达到2.31%，缬氨酸含量可达2.93%，色氨酸含量可达0.81%，赖氨酸含量可达3.98%。本发明全面提升了饲料中五种必须氨基酸的含量，目前尚无同类技术的出现，同时饲料的适口性好，易于动物吸收和利用。

实施例3

本发明所述的富含五种必需氨基酸的功能蛋白饲料生产方法包括下述步骤：

 第一步，液体发酵：

五种谷氨酸棒杆菌和近平滑假丝酵母混菌发酵方法与实施例1相同；植物乳杆菌发酵醪液生产方法与实施例1相同；纳豆芽孢杆菌发酵醪液生产方法与实施例2相同。

第二步，制备发酵醪液：

将第一步制得的发酵液按谷氨酸棒杆菌和粘性丝孢酵母混菌发酵液40份，植物乳杆菌发酵液20份，纳豆芽孢杆菌发酵液20份，混合均匀，得到发酵醪液。

第三步，好氧固态发酵

按重量比，将去皮豆粕150份与10份糖蜜混合得到固态发酵原料；将第二步配制的发酵醪液按固态发酵原料重量的80%的比例与固态发酵原料混合均匀，在发酵塔上进行有氧固态发酵；固态发酵条件与实施例1相同；

第四步，烘干包装：

与实施例1相同。

应用本发明生产方法制得的发酵豆粕蛋白原料经测定与豆粕、常规发酵豆粕蛋白原料营养指标的对比结果见下表所示。

从上表中可看出，本发明方法得到的发酵豆粕中，粗蛋白含量高达51.8%，必需氨基酸中的精氨酸含量可达到3.70%，苏氨酸含量可达到2.32%，缬氨酸含量可达2.91%，色氨酸含量可达0.80%，赖氨酸含量可达3.94%。本发明全面提升了饲料中五种必须氨基酸的含量，目前尚无同类技术的出现，同时饲料的适口性好，易于动物吸收和利用。

上述实施例中，固态发酵原料也可以用豆粕、棉粕、菜籽粕和花生粕中的一种或两种以上混合物替换。

Claims (4)

1.一种富含五种必需氨基酸的功能蛋白饲料生产方法，其特征在于：包括下述步骤：

第一步，液体发酵

将编号为CICC 20906、CICC 20191、 CICC 20903、CICC 20887和CICC 20192的五种谷氨酸棒杆菌按1:1:1:1:1比例混合后先进行种子培养和液体发酵；将编号为CICC1257的近平滑假丝酵母进行种子培养，然后接入到谷氨酸棒杆菌发酵液中混菌发酵，得到混菌发酵液备用；

将编号为CICC20022或CICC20038的植物乳杆菌单独发酵，发酵液备用；

将编号为CICC23413或CICC20443的纳豆芽孢杆菌单独发酵，发酵液备用；

第二步，制备发酵醪液

将第一步制得的发酵液按谷氨酸棒杆菌和近平滑假丝酵母混菌发酵液10~60份，植物乳杆菌发酵液0~30份或/和纳豆芽孢杆菌发酵液0~30份混合，用Ca(OH)₂调节pH值至中性，得到发酵醪液备用；

第三步，固态发酵

按重量比将100~150份豆粕、棉粕、菜籽粕和花生粕中的一种或两种以上物料与5~10份糖蜜混合，得到固态发酵原料；将第二步得到的发酵醪液按固态发酵原料重量的50~100%的比例与发酵原料混合，进行有氧固态发酵，发酵条件为：起始温度20~30℃，过程控制温度30℃~45℃，发酵时间为48~72h；

  第四步，烘干包装

  发酵结束，将发酵物料在60~70℃条件下烘干到含水量≤12%，粉碎后计量包装，即可得到富含五种必需氨基酸的高蛋白饲料。

2.根据权利要求1所述的富含五种必需氨基酸的功能蛋白饲料生产方法，其特征在于：所述第一步中谷氨酸棒杆菌与近平滑假丝酵母混菌发酵液的制备方法为：

将使用牛肉膏蛋白胨培养基活化后的五种谷氨酸棒杆菌种用无菌生理盐水制成悬浮菌液，接种到液体发酵种子培养基中培养，培养基组成：葡萄糖100~120g/L、(NH₄)₂SO₄ 20~30g/L、玉米浆10~20g/L、KH₂PO₄ 1~1.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.3~0.5 g/L、生物素5~8×10^-5 g/L、CaCO₃ 10~30 g/L；pH7.0，0.12 MPa下灭菌20 min；培养条件：罐压0.03~0.1 Mpa，搅拌转速 170~230 r/min，通风量1:0.25~0.5，培养温度30~32℃，发酵时间24~48h；将近平滑假丝酵母用无菌生理盐水制成悬浮菌液，当谷氨酸棒杆菌发酵液的产酸率达到5.0%以上时，接入近平滑假丝酵母悬浮菌液，继续培养发酵10h即可。

3.根据权利要求1所述的富含五种必需氨基酸的功能蛋白饲料生产方法，其特征在于：所述第一步中植物乳杆菌发酵液的制备方法为：

使用固体MRS培养植物乳杆菌，将植物乳杆菌一级固体种子用无菌生理盐水制成悬浮菌液，接种到液体发酵培养基中，培养基组成：葡萄糖或糖蜜20-50g/L、玉米浆20~35 g/L，七水合硫酸镁0.25~0.35 g/L，四水合硫酸锰0.01~0.015 g/L，七水合硫酸铁0.01~0.015 g/L，乙酸钠16~21 g/L，Tween-80 l mL/L；培养条件：罐压0.03~0.1 Mpa静置培养，培养温度30~32℃，发酵时间18~22 h。

4.根据权利要求1所述的富含五种必需氨基酸的功能蛋白饲料生产方法，其特征在于：所述第一步中纳豆芽孢杆菌发酵液的制备方法为：

将使用牛肉膏蛋白胨培养基活化后的纳豆芽孢杆菌种用无菌生理盐水制成悬浮菌液，接种到液体发酵培养基中，培养基组成：豆粕粉1.0~3.0%，玉米粉1.0~3.0%，硫酸镁0.2~0.6%，硫酸锰0.02~0.06%，氯化钠0.5~1.0%；培养条件：罐压0.05~0.1 Mpa，搅拌转速170~230 r/min，通风量1:0. 5~1.2，培养温度32~35℃，发酵时间18~24 h。