CN105658793B - 具有增强的l-赖氨酸生产力的微生物和用于通过使用该微生物产生l-赖氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

提供RNA聚合酶的beta’亚基突变体，包含编码该突变体的多核苷酸的棒状杆菌属微生物，和用于通过培养该微生物产生L‑赖氨酸的方法。

Description

具有增强的L-赖氨酸生产力的微生物和用于通过使用该微生 物产生L-赖氨酸的方法
发明领域
本申请涉及具有增强的L-赖氨酸生产力的微生物和用于通过使用该微生物产生L-赖氨酸的方法。
发明背景
全世界已将多种使用微生物的发酵方法用于大规模产生有用的产物，如氨基酸等。具体地，已开发了许多技术，包括研发细菌菌株和确立发酵条件，来用于使用微生物成功发酵。为了开发用于大规模产生有用产物的细菌菌株，适当地使用了直接或间接牵涉糖酵解途径上游的遗传因子以开发具有更高效率的菌株。一个代表性的技术是总体转录体系工程化(global Transcription Machinery Engineering，gTME)，其在RNA聚合酶的招募蛋白中诱导随机突变以调控细胞中的所有遗传表达。
用于微生物的转录步骤的RNA聚合酶是一种由5个亚基组成的大分子；两个alpha、beta、beta’(beta prime)和sigma亚基。它的全酶表示为α2ββ’σ。其中，核心酶(α2ββ’)在除转录启动步骤外的所有转录步骤中使用。在微生物中，转录开始于RNA聚合酶对启动子的特异性结合，且全酶结合从RNA聚合起始点上游约45个碱基对和下游约10个碱基对的区域中的DNA。
大肠杆菌(E.coli)的RNA聚合酶的Beta’亚基具有进化上高度保守的A～H区域。许多研究已报道了在该区域诱导突变引起不同的变化，如弱化RNA聚合酶与其他因子的结合，增加菌株的生长温度敏感性等。然而，还没有关于将gTME应用到属于棒状杆菌(Corynebacterium)属的细菌菌株和通过突变的特征变化的研究。
编码构成属于棒状杆菌属的细菌菌株的RNA聚合酶的亚基的beta和beta’亚基的基因，即rpoB和rpoC，形成操纵子，且其组成分别为3.5kb和4.0kb的核苷酸。
本发明人将随机突变引入源自属于棒状杆菌属的细菌菌株的rpoC中，并筛选有助于改进L-赖氨酸生产力(productivity)的突变体。他们发现将突变引入对应于大肠杆菌来源的rpoC的G和H的区域中极大地改进了赖氨酸生产力，由此完成了本申请。
发明详述
技术问题
一个方面提供RNA聚合酶的beta’亚基突变体，其能提高L-赖氨酸生产。
另一个方面提供具有编码RNA聚合酶的beta’亚基突变体的核苷酸序列的多核苷酸，该突变体能提高L-赖氨酸生产。
再一个方面提供包含多核苷酸的载体，该多核苷酸具有编码RNA聚合酶的beta’亚基突变体的核苷酸序列，该突变体能提高L-赖氨酸生产。
又一个方面提供包含beta’亚基突变体的微生物。
再一个方面提供通过培养微生物产生L-赖氨酸的方法。
技术方案
一个方面提供RNA聚合酶的beta’亚基(β’-亚基)，其中在SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列中位置975至1284处的1至5个氨基酸被其他氨基酸取代。
该beta’亚基可以是RpoC蛋白。RpoC蛋白可以包含保守区。所述保守区可以是进化上高度保守的区域。RpoC蛋白可以包含多个域。所述多个域可以是A至H域。beta’亚基可以源自属于棒状杆菌属的微生物。源自属于棒状杆菌属的微生物的beta’亚基的氨基酸序列可以由SEQ ID NO:1代表或可以具有与SEQ ID NO:1的约70％或更高,约75％或更高,约80％或更高,约85％或更高,约90％或更高,约92％或更高,约95％或更高,约97％或更高,约98％或更高,或约99％或更高的序列同源性。具有与源自属于棒状杆菌属微生物的beta’亚基的氨基酸序列中位置975至1284处氨基酸的同源性的序列，即RpoC氨基酸序列，可以是大肠杆菌来源的RpoC氨基酸序列。包含G和H域的大肠杆菌的RpoC氨基酸序列可以由SEQ IDNO:4代表。
SEQ ID NO:1代表的beta’亚基G域和H域的氨基酸序列中1至5个氨基酸可以被其他氨基酸取代。具体地，SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列中位置975至1284处的1至5个氨基酸可以被其他氨基酸取代。更具体地，SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列中位置1014至1034或位置1230至1255处的1至5个氨基酸可以被其他氨基酸取代。SEQ ID NO:8,9,11,14,15,20,23,24,或25可以是将SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列中位置1014至1034处的1至5个氨基酸用其他氨基酸取代所得的氨基酸序列。SEQ ID NO:10,12,13,16,17,18,19,21,22,或27可以是将SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列中位置1230至1255处的1至5个氨基酸用其他氨基酸取代所得的氨基酸序列。SEQ ID NO:26可以是将SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列中位置1014至1034和位置1230至1255处的1至5个氨基酸用其他氨基酸取代所得的氨基酸序列。
一个具体的实施方案提供了一种多核苷酸，其包含编码RNA聚合酶的beta’亚基突变体的核苷酸序列，其中SEQ ID NO:1的氨基酸序列中位置975至1284处的1至5个氨基酸可以被其他氨基酸取代。
再一个方面提供了包含该多核苷酸的载体。所述多核苷酸可以可操作地连接于调控序列。调控序列可以包含启动子、终止子或增强子。另外，启动子可以可操作地连接于编码基因的序列。如本文中使用的，术语“可操作地连接”可以指核酸表达调控序列与另一个核苷酸序列之间的功能性连接，由此调控序列指导编码基因的核苷酸序列的转录和/或翻译。
又一个方面提供表达RNA聚合酶的beta’亚基突变体的微生物，其中SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列中位置975至1284处的1至5个氨基酸被其他氨基酸取代。
提供包含多核苷酸的微生物，所述多核苷酸具有编码RNA聚合酶的beta’亚基突变体的核苷酸序列，其中SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列中位置975至1284处的1至5个氨基酸被其他氨基酸取代。还提供引入载体的微生物，该载体包含具有编码RNA聚合酶的beta’亚基突变体的核苷酸序列的多核苷酸，其中SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列中位置975至1284处的1至5个氨基酸被其他氨基酸取代。经引入的微生物可以是经转化的微生物。
基因的引入可以是任意形式的引入，例如引入表达盒，引入基因本身或引入多核苷酸构建体。表达盒可以包含基因自身表达所需的所有元件。表达盒可以是多核苷酸构建体。表达盒可以包含启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号，其可操作地连接于基因。表达盒可以是自身可复制的表达载体的形式。可将基因本身或多核苷酸结构引入宿主细胞中以可操作地连接于在宿主细胞中表达所需的序列。
如本文中使用的，术语“转化”意指将基因引入宿主细胞从而使基因在其中表达。转化的基因可以整合到宿主染色体中或/和作为染色体外元件存在。基因可以是编码多肽的多核苷酸。基因包括DNA或RNA。
所述微生物可以是属于棒状杆菌属的微生物。属于棒状杆菌属的微生物可以包括谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、有效棒状杆菌(Corynebacteriumefficiens)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、或产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)，且具体地，它可以为谷氨酸棒状杆菌。具体地，属于棒状杆菌属的微生物可以是登录号为KCCM11016P、KCCM11347P(国际保藏为KFCC10750)、KCCM10770或CJ3P的谷氨酸棒状杆菌。
再一个方面提供产生L-赖氨酸的方法，所述方法包括以下步骤：培养表达RNA聚合酶的beta’亚基突变体的微生物，其中SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列中位置975至1284处的1至5个氨基酸被其他氨基酸取代，从而在培养物中产生L-赖氨酸；和从所述培养物回收L-赖氨酸。所述微生物与上文描述的相同。培养微生物可以在本领域公知的培养条件下在适宜培养基中进行。这类培养过程可以根据要选择的微生物容易地调整。培养方法可以包括选自下组的一种或多种：分批培养、连续培养、和补料分批培养。
培养中使用的培养基可以满足特定微生物的要求。培养基可以选自下组：碳源、氮源、微量元素及其组合。
碳源可以是选自下组的碳源：碳水化合物、脂质、脂肪酸、醇、有机酸及其组合。碳水化合物可以是葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素或其组合。脂质可以是大豆油、向日葵油、蓖麻油、椰子油或其组合。脂肪酸可以是棕榈酸、硬脂酸、亚油酸或其组合。醇可以是甘油或乙醇。有机酸可以是乙酸。
氮源可以包括有机氮源、无机氮源或其组合。有机氮源可以选自下组：蛋白胨、酵母提取物、肉膏(meat extract)、麦芽提取物、玉米浆(corn steep liquid)(CSL)、大豆粉及其组合。无机氮源可以选自下组：尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵及其组合。
培养基可以包含选自下组的一种：磷，金属盐，氨基酸，维生素，前体及其组合。磷源可以包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、与其对应的含钠盐。金属盐可以是硫酸镁和硫酸铁。
可以以分批模式、连续模式或补料分批模式将培养基或各种组分添加到培养基。
在培养方法中，可以调整培养物的pH。pH调整可以通过添加氢氧化铵、氢氧化钾、氨水、磷酸、或硫酸至培养物来进行。另外，培养方法可以包括预防气泡生成。气泡产生的预防可通过使用防沫剂来进行。防沫剂可以包括脂肪酸聚二醇酯。另外，培养方法可以包括将气体注射到培养物中。气体可以包括维持培养物的需氧条件的任何气体。该气体可以是氧气或含氧气体。含氧气体可以包括空气。在培养时，培养的温度可以是20至45℃，例如22至42℃或25至40℃。培养可以持续至L-赖氨酸的生产达到期望水平。
在产生L-赖氨酸的方法中，L-赖氨酸可以包括L-赖氨酸的盐。
本申请的有利效果
L-赖氨酸的产生可通过使用依照一个方面的RNA聚合酶的beta’亚基、编码其的多核苷酸、包含该多核苷酸的载体和微生物来增加。
L-赖氨酸的产生可通过依照一个方面产生L-赖氨酸的方法来增加。
附图简述
图1显示大肠杆菌的RpoC蛋白的保守序列结构和棒状杆菌的RpoC蛋白的预测的保守序列结构；和
图2是棒状杆菌RpoC和大肠杆菌RpoC的G和H保守区的预测氨基酸序列之间的比较。
实施例
下文中，本申请将参照实施例更详细地描述。然而，这些实施例仅用于例示性目的，且本申请的范围不意图受限于这些实施例。
实施例1：通过人工诱变构建rpoC突变体文库
为了获得rpoC基因突变体，通过以下方法构建载体文库。通过易错PCR扩增包含棒状杆菌来源的rpoC基因(SEQ ID NO:5)的上游碱基序列(300bp)和rpoC(4002bp)基因的碱基序列(4302bp)，其使用KCCM11016P(韩国专利公开No.KR2007-0057093的国际保藏KFCC10881)的染色体作为模板和SEQ ID NOS:6和7的引物。为了将0-4.5个突变每kb引入扩增基因中，使用GenemorphII随机诱变试剂盒(Stratagene)。将含有500ng KCCM11016P菌株的染色体、各125ng的引物1和2、1×Mutazyme II反应缓冲液、40mM dNTP(脱氧核苷酸-三磷酸)混合物、2.5U的Mutazyme II DNA聚合酶的50uL反应溶液进行在94℃变性2分钟，25个循环的94℃变性1分钟、56℃退火1分钟和72℃聚合4分钟，然后在72℃聚合10分钟。
使用pTOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)将扩增的基因片段连接到pTOPO载体。之后，将载体转化到大肠杆菌DH5α中并涂布在含有25mg/l卡那霉素的LB固体培养基上。选择20种经转化的菌落，从其获得质粒，接着进行序列分析。结果发现突变以0.5个突变/kb的频率引入到不同位点。采取约10,000个经转化的大肠杆菌菌落并从其提取质粒，其称为pTOPO-rpoC(M)文库。还制备具有野生型rpoC基因的pTOPO-rpoC(W)质粒作为对照组。通过PCR扩增rpoC基因片段，其使用KCCM11016P的染色体作为模板和SEQ ID NOS:6和7的引物进行，然后以相同的方式制备pTOPO-rpoC(W)质粒。
实施例2：基于赖氨酸生产力筛选rpoC突变体
将作为亲本菌株的KCCM11016P菌株用pTOPO-rpoC(M)文库转化并涂布在含有卡那霉素(25mg/l)的复合培养基板上以获得约21,500个菌落。
<复合培养基板(pH 7.0)>
10g葡萄糖，10g蛋白胨，5g牛肉膏，5g酵母提取物，18.5g脑心浸液，2.5g NaCl，2g尿素，91g山梨糖醇，20g琼脂(基于1L蒸馏水)
<种子培养基(pH 7.0)>
20g葡萄糖，10g蛋白胨，5g酵母提取物，1.5g尿素，4g KH2PO4，8g K2HPO4，0.5gMgSO4·7H2O，100μg生物素，1000μg硫胺HCl，2000μg泛酸钙，2000μg烟酰胺(基于1L蒸馏水)
将如此获得的约21,500个菌落分别接种到300uL的选择培养基中，并在96孔板中在32℃，1000rpm培养约24小时。为了分析培养物中L-赖氨酸的产生量，使用茚三酮(ninhydrin)方法。在完成培养后，使10ul培养上清和190ul的茚三酮反应溶液在65℃反应30分钟，然后使用分光光度计测量在570nm波长处的吸光度以选出比对照组，具有野生型rpoC的KCCM11016P-rpoC(W)显示更高吸光度的约2,000个突变体菌落。其他菌落显示与用作对照的KCCM11016P或KCCM11016P-rpoC(W)相似的吸光度。从选择的2000个菌落中，以相同方式通过茚三酮反应选出相比于KCCM11016P-rpoC(W)菌株显示增强的L-赖氨酸生产力的前183个菌株。
<选择培养基(pH 8.0)>
10g葡萄糖，5.5g硫酸铵，1.2g of MgSO4·7H2O，0.8g KH2PO4，16.4g K2HPO4，100μg生物素，1000μg硫胺HCl，2000μg泛酸钙，2000μg烟酰胺(基于1L蒸馏水)
实施例3：鉴定来自rpoC人工突变体文库的选择菌株中的基因突变
为了发现实施例2中选择的菌株的特征，实施了测序分析。为了探索突变，测定了KCCM11016P-rpoC(M)的rpoC染色体区的碱基序列，并基于NIH GenBank(US)鉴定。
图1b显示大肠杆菌RpoC蛋白的保守序列结构和棒状杆菌RpoC蛋白的预测的保守序列结构。依照图1b，对选择的突变体rpoC的碱基序列的同源性分析结果显示突变在166个菌株(对应于183个菌株的91％)中集中在rpoC编码的SEQ ID NO:1氨基酸序列的位置975至1284处。还发现突变在116个菌株(对应于166个菌株的约70％)中集中在氨基酸序列的位置1014至1034和位置1230至1255处的小区域中。
为了表征其中集中了突变的区域，比较棒状杆菌RpoC和积极研究的大肠杆菌RNA聚合酶beta’亚基之间的氨基酸序列。图2是大肠杆菌RpoC和棒状杆菌RpoC的G和H保守区的预测氨基酸序列之间的比较。依照图2，它显示已知为大肠杆菌RNA聚合酶beta’亚基的进化上高度保守序列的8个域中G和H域的68.4％和77.8％同源性。图1显示大肠杆菌RpoC蛋白的保守序列结构，和棒状杆菌RpoC蛋白的预测的保守序列结构。根据图1b，发现突变集中在棒状杆菌RpoC蛋白的位置975至1284处，该区域显示与大肠杆菌的RNA聚合酶beta’亚基rpoC的G和H域的高度同源性。在116个菌株中，在茚三酮反应中显示高吸光度的前20个菌株称为KCCM11016P-rpoC(M1)～KCCM11016P-rpoC(M20)。
实施例4：KCCM11016P-rpoC(M)的赖氨酸生产力和分析
为了发现实施例3中选择的20个菌株KCCM11016P-rpoC(M1)～KCCM11016P-rpoC(M20)的特征，通过以下方法培养它们，比较其赖氨酸生产力和分析培养液中的组分。
将个体菌株接种于含有25ml种子培养基的250ml三角烧瓶(corner-baffledflask)并伴随200rpm摇动在30℃培养20小时。将1ml的种子培养基接种于含有24ml生产培养基的250ml三角烧瓶并伴随200rpm摇动在30℃培养72小时。种子培养基和生产培养基具有以下组成。
<种子培养基(pH 7.0)>
20g葡萄糖，10g蛋白胨，5g酵母提取物，1.5g尿素，4g KH2PO4，8g K2HPO4，0.5gMgSO4·7H2O，100μg生物素，1000μg硫胺HCl，2000μg泛酸钙，2000μg烟酰胺(基于1L蒸馏水)
<生产培养(pH 7.0)>
100g葡萄糖，40g of(NH4)2SO4，2.5g大豆蛋白，5g玉米浆固体(corn steepsolid)，3g尿素，1g KH2PO4，0.5g MgSO4·H2O，100μg生物素，1000μg硫胺HCl，2000μg泛酸钙，3000μg烟酰胺，30g CaCO3(基于1L蒸馏水)
通过HPLC分析的L-赖氨酸浓度在表1给出。
表1
KCCM11016P-rpoC(M)产生的L-赖氨酸浓度
如表1显示的，KCCM11016P-rpoC(M)中L-赖氨酸的平均浓度比产生L-赖氨酸的菌株KCCM11016P-rpoC(W)增加了13％。20种rpoC突变体的氨基酸序列中变化由SEQ ID NOS:8至27表示。对20种突变体的氨基酸序列分析的结果显示通过将突变引入位置975至1284处的区域极大地增强了赖氨酸生产力，该区域显示与大肠杆菌的RNA聚合酶beta’亚基rpoC的G和H域的高度同源性。
表2
KCCM11016P-rpoC(M1)～(M20)中的rpoC氨基酸突变
实施例5：构建用于将rpoC突变插入产生高浓度L-赖氨酸的菌株的染色体中的载体
为了在实施例2中确认的经序列取代的rpoC突变菌株的突变中，检查在显示与大肠杆菌rpoC的G和H域有高度同源性的区域中突变的效果，构建了用于其染色体插入的载体。
基于报道的碱基序列，合成了在5’末端具有EcoRI限制位点的引物SEQ ID NO:28和29和在3’末端具有SalI限制位点的引物SEQ ID NO:30。其中，使用引物SEQ ID NOS:28和30，以及KCCM11016P-rpoC的M1,M2,M4,M7,M8,M13,M16,M17,M18和M19，即10种染色体作为模板来通过PCR扩增约2000bp的10种rpoC(mt)基因片段。PCR条件包括在94℃变性5分钟，30个循环的94℃变性30秒、56℃退火30秒和72℃聚合2分钟，然后在72℃变性7分钟。进一步地，使用引物SEQ ID NO:29和30，以及KCCM11016P-rpoC的M3,M5,M6,M9,M10,M11,M12,M14,M15和M20，即10种染色体作为模板来通过PCR扩增约600bp的10种rpoC(mt)基因片段。本文中使用的引物由SEQ ID NO:28至30表示。
将由PCR扩增的20种基因片段用限制酶EcoRI和SalI分别处理以获得DNA片段，将其各自连接到具有EcoRI和SalI限制位点的用于染色体插入的pDZ载体(韩国专利NO.2009-0094433)，并转化到大肠杆菌DH5α中，将其涂布到含有卡那霉素(25mg/l)的LB固体培养基上。通过PCR选择用期望的插入基因的载体转化的菌落，并通过一般已知的质粒提取方法从其获得质粒，且这些质粒根据用作模板的菌株的编号分别称为pDZ-rpoC(M1)～(M20)。
实施例6：将rpoC突变引入产生高浓度L-赖氨酸的KCCM11016P菌株的染色体中并比较赖氨酸生产力
通过同源染色体重组将实施例5中制备的pDZ-rpoC(M1)～(M20)载体转化到产生L-赖氨酸的菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P中。之后，通过测序分析选择具有rpoC突变的染色体插入的菌株，并以与实施例3中相同的方式培养。分析其中L-赖氨酸的浓度，且结果在表3给出。引入rpoC突变的菌株分别称为谷氨酸棒状杆菌KCCM11016P::rpoC(M1)～(M20)。
表3
如表3显示的，在各自引入具有1或2个碱基取代的rpoC基因的KCCM11016P::rpoC(M1)～(M20)中，L-赖氨酸的平均浓度相比于对照组具有野生型rpoC基因的KCCM11016P增加了高至约6～15％。其中，作为前20％代表的KCCM11016P::rpoC(M15)，作为前40％代表的KCCM11016P::rpoC(M10)和作为前60％代表的KCCM11016P::rpoC(M19)分别称为CA01-2267,CA01-2268和CA01-2266，并在2013年6月12日保藏于韩国微生物保藏中心(KCCM)，保藏号为KCCM11428P,KCCM11429P和KCCM11427P。
实施例7：将rpoC突变引入产生高浓度L-赖氨酸的KCCM11347P菌株的染色体中并比较赖氨酸生产力
为了检查在属于谷氨酸棒状杆菌属的其他菌株中的效果，通过与实施例6相同的方式将rpoC突变引入L-赖氨酸产生菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM11347P(韩国专利No.1994-0001307，KFCC10750的国际保藏微生物)来制备菌株，并分别称为KCCM11347P::rpoC(M1)～(M20)。以与实施例3相同的方式培养它们，并分析其中的L-赖氨酸浓度，结果在表4给出。
表4
KFCC10750::rpoC(M1)～(M20)产生的L-赖氨酸浓度
如表4显示的，发现在各自引入具有1或2个碱基取代的rpoC基因的实验组1～20即KCCM11347P::rpoC(M1)～(M20)中，L-赖氨酸的平均浓度相比于对照组具有野生型rpoC基因的KCCM11347P增加了8～16％。
实施例8：将rpoC突变引入产生高浓度L-赖氨酸的KCCM10770P菌株的染色体中并比较赖氨酸生产力
为了检查在属于谷氨酸棒状杆菌属的其他菌株中的效果，通过与实施例6相同的方式将rpoC突变引入L-赖氨酸产生菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM10770P(韩国专利No.0924065)来制备菌株，并分别称为KCCM10770P::rpoC(M1)～(M20)。KCCM10770P菌株是源自KCCM11016P的产生L-赖氨酸的菌株，其在染色体上保留了构成赖氨酸生物合成途径的6个基因类型(即aspB(天冬氨酸氨基转移酶编码基因)、lysC(天冬氨酸激酶编码基因)、asd(天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因)、dapA(二氢吡啶二羧酸合酶编码基因)、dapB(二氢吡啶二羧酸还原酶编码基因)和lysA(二氨基庚二酸脱羧酶编码基因))的一个或多个拷贝。以与实施例3相同的方式培养它们，并分析其中的L-赖氨酸浓度，结果在表5给出。
表5
KCCM10770P::rpoC(M1)～(M20)产生的L-赖氨酸浓度
如表5显示的，发现在各自引入具有1或2个碱基取代的rpoC基因的实验组1～20即KCCM10770P::rpoC(M1)～(M20)中，L-赖氨酸的平均浓度相比于对照组具有野生型rpoC基因的KCCM10770P增加了约3～10％。
实施例9：将rpoC突变引入产生高浓度L-赖氨酸的CJ3P菌株的染色体中并比较赖氨酸生产力
为了检查在属于谷氨酸棒状杆菌属的其他菌株中的效果，通过与实施例6相同的方式将rpoC突变引入L-赖氨酸产生菌株CJ3P(Binder等Genome Biology 2012,13:R40))来制备菌株，并分别称为CJ3P::rpoC(M1)～(M20)。CJ3P菌株是具有L-赖氨酸生产力的谷氨酸棒状杆菌菌株，其通过用已知的技术将3种类型突变(pyc(Pro458Ser),hom(Val59Ala),lysC(Thr311Ile))引入野生型而制备。以与实施例3相同的方式培养它们，并分析其中的L-赖氨酸浓度，结果在表6给出。
表6
CJ3P::rpoC(M1)～(M20)产生的L-赖氨酸浓度
如表6显示的，发现在各自引入具有1或2个碱基取代的rpoC基因的实验组1～20即CJ3P::rpoC(M1)～(M20)中，L-赖氨酸的平均浓度相比于对照组具有野生型rpoC基因的CJ3P增加了高达57％。因此，通过将突变引入位置975至1284中极大地增强了赖氨酸生产力，该区域显示与大肠杆菌RNA聚合酶beta’亚基rpoC的G和H域的高度同源性。
菌株保藏机构：韩国微生物保藏中心
保藏编号：KCCM11427P
保藏日期：20130612
菌株保藏机构：韩国微生物保藏中心
保藏编号：KCCM11428P
保藏日期：20130612
菌株保藏机构：韩国微生物保藏中心
保藏编号：KCCM11429P
保藏日期：20130612
菌株保藏机构：韩国微生物保藏中心
保藏编号：KCCM11016P
保藏日期：19951218
菌株保藏机构：韩国微生物保藏中心
保藏编号：KCCM11347P
保藏日期：19911210
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Claims (6)

1.一种RNA聚合酶的beta prime亚基突变体，其中所述RNA聚合酶的beta prime亚基突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15或25所示。
2.一种多核苷酸，其具有编码权利要求1的RNA聚合酶的beta prime亚基突变体的核苷酸序列。
3.一种载体，其包含与调控序列可操作连接的权利要求2的多核苷酸。
4.一种棒状杆菌属(Corynebacterium)微生物，其表达权利要求1的RNA聚合酶的betaprime亚基突变体。
5.权利要求4的微生物，其中所述棒状杆菌属微生物是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
6.一种产生L-赖氨酸的方法，所述方法包括以下步骤：
培养权利要求4的微生物以在培养基中产生L-赖氨酸；和
从所述培养基回收L-赖氨酸。
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