JP2013511277A - 化学物質の効率的な生産のための微生物の改変 - Google Patents

Abstract

本発明は、遺伝学的に改変された、および代謝的に進化した微生物からの化学物質の生産に関する。化学物質生産における改良は、確立し、そして、それらの改良をもたらす特定の変異は同定されてきた。具体的な例は、コハク酸を生産するように遺伝学的に改変された細菌の株の代謝的進化の間で生じた変異の同定において与えられる。本発明は、増大したコハク酸生産について、代謝的進化の間に選択された変異の産業上の適用性を評価するための方法も提供する。本発明は、さらに代謝的進化の間で選択された変異を有し、コハク酸、他の有機酸、および商業的関心のある他の化学物質の改良された生産に貢献するように改変された微生物を提供する。

Description

関連出願への相互参照
この出願は、２００９年１１月１８日に出願された米国仮出願第６１／２８１，４８１号の優先権を主張する。

政府支援
この発明は、米国エネルギー省から承認された協定の下での米国政府支援で承認番号ＤＥ−ＥＥ０００２８７８／００１で行われた。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。

本発明の背景
過去１０年間、微生物ゲノム、細胞内における生化学的経路、代謝的フラックス分析、マイクロアレイ分析、およびコンピューターによる（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）分析についての知識が激増し、産業上の微生物学は、生体触媒を用いて再生可能な原料から化学物質を製造することに踏み込んだ。

「Ｔｏｐ ｖａｌｕｅ ａｄｄｅｄ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｆｒｏｍ ｂｉｏｍａｓｓ」と題する２００４年の米国エネルギー省の報告は、生体触媒を用いて再生可能な原料から生産することができる１５の構成要素を同定した。その１５の構成要素は、１，４−二酸（コハク酸、フマル酸、およびリンゴ酸）、２，５−フランジカルボン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、アスパラギン酸、グルカル酸、グルタミン酸、イタコン酸、レブリン酸、３−ヒドロキシブチロラクトン、グリセロール、ソルビトール、キシリトール、およびアラビニトールである。米国エネルギー省によって同定されたこれらの１５の化学物質のうち、生体触媒を用いる産業上のスケールでのコハク酸生産は、顕著に発展してきた（Ｋｕｒｚｒｏｃｋ ａｎｄ Ｗｅｕｓｔｅｒ−Ｂｏｔｚ，２００９；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２００９；米国特許出願公開第２００６／００７３５７７号）。

ウシの第一胃に存在するバクテリアは、嫌気性増殖条件下で、コハク酸を生産することが知られている。アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）サクシノゲニス（ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｓ）、アネロビオスピリルム（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｒｉｌｌｕｍ）サクシニシプロデュセンス（ｓｕｃｃｉｎｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、およびマンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）サクシニシプロデュセンス（ｓｕｃｃｉｎｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）などの多数の第一胃バクテリアが、単離され、そして、コハク酸生産のための生体触媒として開発されてきた。商業的実現可能性に近づく力価、比率、および産出量においてコハク酸を生産することができる大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株も、微生物炭素代謝および微生物遺伝学の組み合わせた知識を用いて構築されてきた。米国特許第７，２２３，５６７号は、富栄養増殖培地においてコハク酸を生産する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＳＢＳ５５０ＭＧの構築を説明する。米国特許第６，４５５，２８４号は、コハク酸生産のための生体触媒として、外因性ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の構築を説明する。ピルビン酸カルボキシラーゼは、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株には存在しない。リゾビウム・エトリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｌｔｉ）などの他の微生物から得られるピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子は、構成的プロモーターの下で発現させて、コハク酸生産を増進することができる。ＰＣＴ特許出願第ＷＯ／２００８／１１５９５８およびＷＯ／２０１０／１１５０６７は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＫＪ１２２の構築を説明し、これは、最小増殖培地においてコハク酸を生産するための生体触媒である。

コハク酸および他の化学物質の商業的に魅力的な生合成の生産を達成するために、さらなる遺伝学的操作が必要である。新規の遺伝学的取り組みを用いて細胞内部の生化学的経路を操作することによって微生物によるコハク酸塩および他の化学物質の生産の全般的な「効率」（力価、比率、および産出量含むが、それらに限定されないと定義される）を改良する必要がいまだにある。化学物質生産が、細胞増殖に連動する範囲内において、コハク酸または他の化学物質生産の効率における増大は、所望の化学物質を生産する微生物細胞の増殖の比率を改良することによって達成することもできる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるコハク酸生産についての最大の理論上の産出量は、１ｍｏｌのグルコースごとに１．７１４ｍｏｌのコハク酸であると計算され、全体の産出量で、摂取された１グラムのグルコースについて１．１２グラムのコハク酸を提供する（Ｖｅｍｕｒｉ，ｅｔ ａｌ．，２００２）。

米国特許出願公開第２００８／０００９０４１号は、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株のものよりも少なくとも４７０ｋｂ短い染色体のＤＮＡを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を説明する。この変異体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、より多くの細胞集団（ｍａｓｓ）を蓄積し、そして、蓄積したスレオニンの量における有意な増大を示す。

米国特許出願公開２００９／００７５３３３も、親株と比較して、１または複数の同等または改良された増殖比率、変換効率、タンパク質発現、ＤＮＡ生産、ＤＮＡ産出量、および／またはＤＮＡ質を有する低下したゲノムサイズを持つ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を説明する。

米国特許出願公開２００９／０２２１０５５は、遺伝子破壊に由来する、様々な酵素の良好な生産力を有する新規な枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）変異体株を説明する。

増大した増殖比率達成するためにゲノムサイズを低下させるこれらの取り組みは、発酵槽において増殖するバクテリアが欠失させることができる多くの非必須遺伝子を含むという事実に基づいている。自然環境において生きているバクテリアは、温度、ストレス、または食物供給源の欠如の困難な環境的条件を生存するためのメカニズムを提供する多くの条件応答性遺伝子を有している。これらの遺伝子を複製することは、発酵槽においては必要ではないが、細胞のエネルギーの支出を必要とし、これは、そうではなくこれら不必要遺伝子の不存在であるならば節約することができた。

ゲノムサイズを低下させることの取り組みは、組換えタンパク質、核酸、およびアミノ酸を生産する株の増殖性能を改良するためには有用であるかもしれないが、Ｋｒｅｂｓサイクル（トリカルボン酸サイクルまたはＴＣＡサイクルとしても知られる）における中間体であるコハク酸、フマル酸、およびリンゴ酸などの他の化学物質生産する株の性能を改良するための有用な取り組みであることは示されていない。これらおよび他の化学物質の生産の効率は、中心代謝経路における異なる経路を通じた炭素のフローの比率にも依存し、そして、一定の場合には、嫌気性または微好気性増殖の間において好ましい酸化還元バランスを達成することに依存する。

米国特許出願公開２００９／００７５３５２、およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ（２００５）は、コンピューターによる（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）分析に基づいて細菌の株を改良するための方法を説明する。この取り組みにおいて、有意な量でコハク酸を生産するマンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）サクシニシプロデュセンス（ｓｕｃｃｉｎｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）のゲノムの配列は、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株をコハク酸生産する株に変質させる目的で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において欠失させるべき最適な遺伝子を同定するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のゲノムの配列と比較される。この取り組みは、一見すると魅力的であるのだけれども、Ｍ．サクシニシプロデュセンス（ｓｕｃｃｉｎｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）に由来する遺伝学的情報が、商業的に実行可能なコハク酸塩生産株を達成するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に推定することができるかどうかは、いまだにわからない。上記で引用された米国特許出願からの推奨される欠失は、ｐｔｓＧ、ｐｙｋＡ、およびｐｙｋＦの組み合わせであった。しかしながら、このような株から実際に達成されるコハク酸塩力価は、８．１６ｍＭ（０．９６ｇ／ｌ）のみであったが、これは、商業的に魅力的な生産にとって必要なレベルほど遠く、そして、株の増殖は、非常に貧弱なものであった。さらに、上で参照される出願において推奨されるものに類似する欠失変異の組み合わせ（ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、およびｐｔｓＨＩ）は、早くから報告され、そして、もたらされた株は、グルコース上で非常に貧弱にしか増殖しなかった（Ｐｏｎｃｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９５）。このように、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ（２００５）によって説明された変異の組み合わせは、商業的に実行可能な株を構築するには十分ではなく、そして、変異は、それらが商業的に実行可能株に必要またはふさわしいことを証明することができる株事情において試験されなかった。したがって、当業者にとって、上記の開示から商業的に実行可能なコハク酸塩生産株への明確な経路はなく、このことは、グルコースまたは他の安価な炭素源上において十分に増殖させて、少なくとも２０ｇ／ｌのコハク酸塩（１７０ｍＭ）を生産することを必要とするであろう。

化学物質合成のための石油化学的プロセスと競合させるためには、本技術分野において、化学物質生産のための、より効率的な生体触媒開発する必要性がある。第一の工程は、増進した化学物質生産に貢献しうる宿主染色体における遺伝学的変更を同定することである。この状況を見ると、本発明の目的は、産業上の用途のために選択された微生物株による化学物質生産を改良するために使用することができる新規の変異を同定することである。具体的な実施態様において、本発明の目的は、有機酸の微生物生産の効率を改良することである。より具体的な実施態様において、該目的は、コハク酸生産の効率を改良することである。本発明の別の側面において、該目的は、いかにして、一般的に、代謝的進化などの労働集約型の方法に訴えなければならないことなく、微生物からのコハク酸などの化学物質の生産を理性的に改良するかを知ることである。

突然変異を起こさせ、そして、高リジン生産についてスクリーニングされたコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）グルタミクム（ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）株について、ある種のリバースエンジニアリングが行われてきた。高度に変化したリジン生産株のゲノムが、野生型株のものと比較され、そして、相違が、最小に変異した株を設計しなおすために使用された（Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，２００６）。しかしながら、数百の変異が見出され、そして、これらのわずかしかリジン過剰生産において主要な役割を担わないようであるが、数百の変異の全てを関連性について試験するのは非常に非現実的であろう。一見すると、本明細書において開示された本発明は、この先行技術において開示されたものに類似するようにみえるかもしれないが、主要な相違は、本発明の開始株は、突然変異を起こさせておらず、むしろ自然発生的に変異させることを可能にさせたものであり、そして、それは、スクリーニングされておらず、むしろ代謝的進化のプロセスにおいて選択されたことである。このことは、本発明を識別する少なくとも２つの主要な相違をもたらす：
（１） 変異の密度が、ほとんど２桁の大きさではるかに低いこと、および
（２） 本発明において試験された変異の８つの全てが、改良された増殖、または改良された化学物質生産の効率のいずれかに関連性があることが証明されたこと。このように、本発明の方法および材料は、先行技術のものよりも非常に改良されている。

本発明の概要
本発明は、コハク酸などの化学物質を生産するための改良された能力を有する微生物を提供する。

本発明は、コハク酸などの化学物質を生産するための改良された能力を有する微生物を構築する方法も提供する。

本発明は、コハク酸などの化学物質を生産するための改良された能力を有する微生物を用いてコハク酸を生産するための方法も提供する。

本発明の１つの実施態様において、コハク酸などの化学物質を生産するための改良された能力を有する、および変異したｐｙｋＡ遺伝子を有する微生物が提供される。

本発明の別の実施態様において、コハク酸などの化学物質を生産するための改良された能力を有する、および変異したｐｙｋＦ遺伝子を有する微生物が提供される。

本発明のいまだ別の実施態様において、コハク酸などの化学物質を生産するための改良された能力を有する、ならびに変異したｐｙｋＡおよびｐｙｋＦ遺伝子を有する微生物が提供される。

本発明の１つの実施態様において、コハク酸などの化学物質を生産するための改良された能力を有する、および不活性化した、または変異したｇａｌＳ遺伝子を有する微生物が提供される。

本発明の１つの実施態様において、コハク酸などの化学物質を生産するための改良された能力を有する、および不活性化した、または変異したｇａｌＲ遺伝子を有する微生物が提供される。

本発明の別の実施態様において、コハク酸を生産するための改良された能力を有する、および多重コピーのｇａｌＰ遺伝子を有する微生物が提供される。

本発明のいまだ別の実施態様において、コハク酸を生産するための改良された能力、多重コピーのｇａｌＰ遺伝子、および細胞へのグルコース輸送のための変異したホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）を有する微生物が提供される。

本発明のいまだ別の実施態様において、コハク酸などの化学物質を生産するための改良された能力、および染色体のＤＮＡの４８ｋｂ領域における遺伝子ｙｄｃＣからｙｄｃＦを含む多重遺伝子を含むゲノムの広範な領域の欠失を有する微生物が提供される。

本発明の１つの実施態様において、コハク酸などの化学物質を生産するための改良された能力、およびｒｐｏＡ遺伝子におけるミスセンス変異を有する微生物が提供される。

本発明のいまだ別の実施態様において、コハク酸などの化学物質を生産するための改良された能力、およびｒｐｏＡ遺伝子のアミノ酸位置３２２における変異を有する微生物が提供される。

本発明のいまだ別の実施態様において、コハク酸などの化学物質を生産するための改良された能力、およびｒｐｏＡ遺伝子のアミノ酸位置３２２におけるプロリンからロイシンへの変異を有する微生物が提供される。

本発明のいまだ別の実施態様において、コハク酸などの化学物質を生産するための改良された能力、およびｒｐｏＣ遺伝子における変異を有する微生物が提供される。

本発明のいまだ別の実施態様において、コハク酸などの化学物質を生産するための改良された能力、およびｒｐｏＣ遺伝子のＦ領域における変異を有する微生物が提供される。

本発明のいまだ別の実施態様において、コハク酸などの化学物質を生産するための改良された能力、およびｒｐｏＣ遺伝子のＦ領域における位置７４７におけるアミノ酸におけるミスセンス変異を有する微生物が提供される。

本発明のいまだ別の実施態様において、コハク酸などの化学物質を生産するための改良された能力、およびｒｐｏＣ遺伝子のＦ領域における位置７４７におけるメチオニンからイソロイシンへの変異を有する微生物が提供される。

本発明の１つの実施態様において、コハク酸などの化学物質を生産するための改良された能力を有する、およびｇｌｄＡ遺伝子における変異を有する微生物が提供される。

本発明の１つの実施態様において、コハク酸などの化学物質を生産するための改良された能力を有する、およびｆｔｓＩ遺伝子における変異を有する微生物が提供される。

本発明のいまだ別の実施態様において、コハク酸などの化学物質を生産するための改良された能力を有する、およびｄｈａＭ遺伝子における変異を有する微生物が提供される。

この出願には、図面は含まれていない。

本発明の詳細な説明
発酵性プロセスを通じたコハク酸の生産に適した微生物が、本発明において開示される。本発明は、遺伝学的に修飾された細菌の株によって、炭素化合物から商業的に意味のある量でコハク酸を生産するためのプロセスを提供するが、本発明の教示は、等しく多数の他の化学物質の産業上の生産に応用できる。

本発明の説明の目的で、次の定義が使用されるものとする。

多数の産業上有用な化学物質が、本発明を用いて製造することができる。このような化学物質の例は、エタノール、ブタノール、乳酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩、スレオニン、メチオニン、およびリジンを含むが、これらに限定されない。有機酸は、遊離酸、および塩（例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウムの塩、塩化物、硫酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、等が挙げられるが、これらに限定されない）の両方として、存在することができるので、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、アスパラギン酸、スレオニン、メチオニン、およびリジンなどの化学物質名は、遊離酸およびそれの任意の塩の両方を含むことが意図されているものとする。同様に、コハク酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩、アスパラギン酸塩等などの任意の塩は、その上遊離酸を含むことが意図されているものとする。

本発明は、特定の遺伝学的修飾の技術を、代謝的進化のプロセスに組み合わせて、炭水化物基質を有する無機塩培地中で嫌気性または微好気性増殖条件下でコハク酸生産についての高い産出量、力価、および容量生産力を示す株を得る。

本発明において使用する場合、用語「力価」は、発酵ブロスにおける特定の化合物のモルの濃度を意味する。このように、本発明によってコハク酸を生産するための発酵プロセスにおいて、１００ｍＭのコハク酸力価は、測定の時点での発酵ブロスが、発酵ブロスのリットルごとに１００ｍモルのコハク酸を含有したことを意味するであろう。

本発明において使用する場合、用語「産出量」は、発酵プロセスの間に摂取された原料のモルごとに生産された特定の化合物のモルを参照する。このように、原料としてグルコースを用いるコハク酸の生産のための発酵性プロセスにおいて、用語産出量は、摂取されたグルコースのモルごとに生産されたコハク酸のモルの数を参照する。

本発明において使用する場合、用語「容量生産力」は、ユニット時間ごとにユニット体積ごとに生産されたグラムにおける特定の化合物の量を参照する。このように、コハク酸についての０．９ｇＬ^−１ｈ^−１の容量生産力値は、増殖の時間の間で発酵ブロスの１リットルにおいて、０．９グラムのコハク酸が蓄積することを意味するであろう。

本明細書において使用される用語「遺伝学的に改変された」または「遺伝学的に修飾された」は、微生物のゲノムのＤＮＡの操作を通じて微生物における１または複数の酵素の発現を変化させることの実行を参照する。

本発明において使用する場合、用語「遺伝子」は、遺伝子のオープンリーディングフレーム、ならびに上流および下流調節配列を含む。上流調節領域は、遺伝子のプロモーター領域ともいわれる。下流調節領域は、ターミネーター領域ともいわれる。

「対立遺伝子」は、特定の遺伝子のＤＮＡ配列の２またはそれを超える形態の１つである。変異を有する対応する遺伝子と比較した場合、任意の変異のないそれぞれの遺伝子は野生型対立遺伝子と呼ばれる。

「ホモログ」は、共通の祖先ＤＮＡ配列からの系統による第二の遺伝子に関する遺伝子である。用語ホモログは、種形成の事象によって分類される遺伝子の間の関係に、または遺伝学的重複の事象によって分類される遺伝子の間の関係に適用されてもよい。「オーソログ」は、種形成によって共通の祖先遺伝子から進化した異なる種における遺伝子である。普通は、オーソログは、進化の過程において同一の機能を保持する。オーソログの同定は、新たに配列決定されたゲノムにおける遺伝子機能の信頼に値する予測にとって不可欠である。種形成は、由来する種からは新しい様式で生活することができる新種の起源である。このプロセスの部分として、それは、親種との遺伝学的交換に対するいくつかの障壁も獲得してきた。「パラログ」は、ゲノム内における重複によって関連付けられる遺伝子である。オーソログは、進化の過程において同一機能を保持するが、パラログは、新たな機能を進化させる、これは、たとえ、これらが、原初のものに関するものであってもである。

語句「機能的に類似する」は、本明細書において開示される方法によって同一または異なる生物において見出される任意の野生型または変異したＤＮＡ配列、遺伝子、酵素、タンパク質と同等または類似する生物学の機能を有する、任意の生物からの任意の野生型または変異したＤＮＡ配列、遺伝子、酵素、タンパク質を広く意味する。機能的な類似は、配列ホモログを必要としないかもしれない。例えば、この発明において、我々は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における総ピルビン酸キナーゼ活性を低下させるが除去しないｐｙｋＡにおける変異が、より効率的なコハク酸塩生産を導くことを見出す。敷衍して考えてみると、ピルビン酸キナーゼを低下させる例えば酵母サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などの生物の別のタイプにおける変異は、機能的に類似し、そして、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）における関連性がある遺伝子、例えば、ＰＹＫ１またはＰＹＫ２遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｐｙｋＡ遺伝子に機能的に類似するであろう。

「変化した活性」を持つ遺伝子またはタンパク質は、関連性がある野生型遺伝子またはタンパク質と比較した場合に、測定可能な特性における測定可能な相違を生み出す遺伝子またはタンパク質として広く定義される。該変化した活性は、変化した遺伝子またはタンパク質を含有する株のコハク酸塩生産の増殖比率または効率を増大させるまたは減少させることによって、一般的な様式で、それ自体明白に示すことができた。他の測定可能な特性は、酵素活性、酵素の基質特異性、基質に対する親和性または速度などの酵素の動力学的パラメーター、酵素の安定性、酵素の調節特性、遺伝子発現レベル、様々な条件下での遺伝子発現の調整、等を含むが、それらに限定されない。

本発明において使用する場合、用語変異は、オープンリーディングフレーム、上流調節領域、および下流調節領域を含む遺伝子に対して行われた遺伝学的修飾を参照する。遺伝子変異は、遺伝子のオープンリーディングフレームの転写の上方調整または下方調整もしくは完全阻害のいずれかをもたらす。遺伝子変異は、遺伝子全体のコード領域もしくはコードするヌクレオチド配列の部分を欠失させること、フレームシフト変異、ミスセンス変異、もしくは挿入を導入すること、または終止コドンもしくはそれの組み合わせを導入することのいずれかによって達成される。変異は、酵素反応または細胞膜を通した有機分子の輸送などの生物学の機能に直接にかかわるタンパク質をコードする構造的遺伝子において生じるかもしれない。また、変異は、生物学の機能に直接にかかわるタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するタンパク質をコードする調節遺伝子において生じるかもしれない。他の遺伝子の発現を制御するタンパク質は、調節タンパク質といわれ、そして、これらの調節タンパク質をコードする遺伝子は、調節遺伝子といわれる。

「変異」は、関連性がある野生型生物のものと比較したＤＮＡ配列における任意の変更をも含むものとする。例えば、株ＫＪ１２２に見出される変異は、変異した領域のＤＮＡ配列が、親野生型株、ＡＴＣＣ８７３９としても知られる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃのものと比較され場合に見出すことができるＤＮＡ配列における任意の変更である。変異は、任意の数の塩基対の付加的ＤＮＡの挿入、または任意の数の塩基対のＤＮＡの欠失であることができる。挿入変異の特定のタイプは、遺伝子重複である。遺伝子は、遺伝子の第二のコピーが最初のコピーに隣接して位置することができる自然発生的変異事象によって重複していることができ、または遺伝子は、遺伝子の第二のコピーが最初のコピーから遠いゲノムにおける部位に位置することができる遺伝学的改変によって重複していることができる。変異は、１の塩基タイプから別の塩基タイプへの変更、例えば、アデニンからグアニン塩基への変更であることができる。遺伝学の専門語において、変異は、（コドンによってコードされるアミノ酸を変更する）ミスセンス、（コドンを終止コドンに変更する）ナンセンス、（３の倍数ではない多数の塩基の挿入または欠失であり、そして、リーディングフレームを変更し、変異から下流であるコードされるアミノ酸配列を変化させ、しばしば変異から下流に終止コドンを導入する）フレームシフト、または（極性において切り替えられたが欠失させられないＤＮＡ配列からもたらされる）反転であることができる。

「ヌル変異」は、関連性がある遺伝子の全体のオープンリーディングフレームの欠失のものと実質的に同一である、または関連性がある遺伝子の全ての測定可能な活性を除去する表現型を与える変異である。

「変異体」は、１または複数の変異を含有するゲノムを有する微生物である。

この発明において使用する場合、用語「外因性」は、細胞の外側に由来する分子または活性が、宿主微生物に導入されることを意味することが意図されている。微生物細胞に導入された外因性核酸分子の場合、導入された核酸は、独立のプラスミドとして存在してもよく、または宿主染色体のＤＮＡに組み入れられてもよい。タンパク質をコードする外因性核酸は、プロモーターおよびターミネーター配列などのそれ自身の調節配列とともに、発現可能な形態で、微生物細胞に導入されてもよい。また、外因性核酸分子は、宿主染色体のＤＮＡに組み入れられてもよく、そして、宿主調節配列の制御の下にあってもよい。

用語「内因性の」は、宿主細胞内に存在する分子および活性を参照する。生合成の活性に関して使用される場合、用語「外因性」は、宿主参照生物に導入される活性を参照する。供給源は、例えば、宿主微生物への導入に続いて参照活性を発現する同種または異種のコードする核酸であることができる。もし、タンパク質をコードする核酸が、微生物の同一種から得られるならば、それは、同種ＤＮＡと呼ばれる。もし、核酸が異なる微生物種に由来するならば、それは、異種ＤＮＡと呼ばれる。ＤＮＡの特質、それが同種または異種であるかどうかに関係なく、宿主細胞に導入された場合、ＤＮＡならびにＤＮＡを導入した活性由来形態は、外因性と呼ばれる。したがって、本発明のコードする核酸の外因性発現は、異種および同種のコードする核酸のいずれかまたは両方を利用することができる。

「微生物」は、任意のバクテリア、古細菌、酵母、糸状菌、単細胞藻類、たは渦鞭毛藻を含むものとする。

本発明に適した組換え微生物は、多くの細菌のファミリーに、好ましくは、エンテロバクテリアセエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）ファミリーに由来する。適切な微生物は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、およびセラシア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属から選択される。エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属が、特に好ましい。エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属内では、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）種が、特に好ましい。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ、または同様のものなどの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の任意の１つの株は、本発明に有用である。

有機酸を有意な量で生産することができる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、本技術分野においてよく知られている。例えば、米国特許出願公開第２００９／０１４８９１４号は、化学的に純粋な酢酸塩および／またはピルビン酸塩の生産のための生体触媒として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の株を提供する。米国特許７，６２９，１６２は、乳酸の生産のために構築された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ０１１株の派生物を提供する。特許協力条約の下で公開された国際特許出願ＷＯ２００８／１１５９５８およびＷＯ２０１０／１１５０６７は、ｐＨ−制御されたバッチ発酵において、炭素の供給源としてグルコースを含有する最小無機塩培地においてコハク酸塩およびリンゴ酸塩を生産するように改変された微生物を提供する。

本発明のいくつかの他の実施態様において、本発明によって修飾されることができるバクテリアは、アクロモバクター・デルマーベ（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｄｅｌｍａｒｖａｅ）、アクロモバクター・ビスコーサス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）、アクロモバクター・ラクティカム（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｌａｃｔｉｃｕｍ）、アクチノマヅラ・マヅレ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｍａｄｕｒａｅ）、アクチノマイセス・ビオラセオクロモゲネス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｃｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、アエロモナス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アルカリゲネス フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓ）、アルスロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ）、アルスロバクター・トゥメセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｕｍｅｓｃｅｎｓ）、アリスロバクター・パラフィニス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ）、アルスロバクター・ヒドロカーボグルタミカス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ）、アルスロバクター・オキシダンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）、オウレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）サペルダエ（ｓａｐｅｒｄａｅ）、アゾトバクター インディカス（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｉｎｄｉｃｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｙｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・チアミノリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｉａｍｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ブレビバクテリウムアンモニアジェネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、ディバリカツム（ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）、ブレビバクテリウムラクトファーメンツム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ブレビバクテリウムフラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウムグロボサム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｏｂｏｓｕｍ）、ブレビバクテリウムフスカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｕｓｃｕｍ）、ブレビバクテリウムケトグルタミクム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｋｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウムヘルコルム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｈｅｌｃｏｌｕｍ）、ブレビバクテリウム・プシルム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｕｓｉｌｌｕｍ）、ブレビバクテリウムテスタセウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｅｓｔａｃｅｕｍ）、ブレビバクテリウム・ロゼウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｏｓｅｕｍ）、ブレビバクテリウム・イマリオフィリカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｉｕｍ）、ブレビバクテリウム・リネンス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｉｎｅｎｓ）、ブレビバクテリウム・プロトファルミエ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｒｏｔｏｐｈａｒｍｉａｅ）、シトロバクター・フロインディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｏｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、コリネバクテリウム・アセトフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｐｈｉｌｕｍ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エルウィニア・アミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、エルウィニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、エルウィニア・ヘルビコーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）、エルウィニア クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）、エシェリキア フロインディ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、フラボバクテリウム・ペレグリナム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍ）、フラボバクテリウム・フカタム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｕｃａｔｕｍ）、フラボバクテリウム・アウランティナム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｕｒａｎｔｉｎｕｍ）、フラボバクテリウム・レナヌム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｅｎａｎｕｍ）、フラボバクテリウム・ セワネンセ （Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｅｗａｎｅｎｓｅ）、フラボバクテリウム・ブレベ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｒｅｖｅ）、フラボバクテリウムメニンゴセブチクム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）、グルコノバクター・アサイイ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ａｓａｉｉ）、キタサトスポリア・パルロサ（Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒｉａ ｐａｒｕｌｏｓａ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉｅａｅ）、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．ＣＣＭ８２５、モーガネラ・モーガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）、ノカルジア・オパカ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｏｐａｃａ）、ノカルジア・ルゴサ（ｎｏｃａｒｄｉａ ｒｕｇｏｓａ）、プラノコッカスユーシナタス（Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｅｕｃｉｎａｔｕｓ）、プロテウスレッゲリ（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｒｅｔｔｇｅｒｉ）、プロピオニバクテリウム・セルマニ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｈｅｒｍａｎｉｉ）、シュードモナス・シンキサンサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｎｘａｎｔｈａ）、シュードモナス・アゾトフォルマンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・オバリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｖａｌｉｓ）、シュードモナス スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、シュードモナス・アシドボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｌａｎｓ）、シュードモナス ムシドレンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｕｃｉｄｏｌｅｎｓ）、シュードモナス・テストステロニ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）、シュードモナス アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ロドコッカス エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス・ロドクロラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．ＡＴＣＣ １５５９２、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．ＡＴＣＣ １９０７０、セラシア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、スポロサルシナ・ウレア（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ ｕｒｅａｅ）、スタフィローコッカス・オーリーアス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・フラベラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖｅｌｕｓ）、ストレプトマイセス・グリセオラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・オリバセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・バージニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｅ）、ストレプトマイセス・アンチバイオチクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・カカオイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｃａｏｉ）、ストレプトマイセス・ラベンジュレ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラチフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・ショットムレリ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｃｈｏｔｔｍｕｌｌｅｒｉ）、ビブリオ・メッシュニコビ（Ｖｉｂｒｉｏ ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｖｉｉ）、ビブリオ・チロゲネス（Ｖｉｂｒｉｏ ｔｙｒｏｇｅｎｅｓ）、およびキサントモナス・シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｉ）などを含むが、それらに限定されない。

本発明は、発酵プロセスのための基質として炭素源供給源を含有する最小塩培地において発酵性条件下で増殖した場合に、コハク酸についての、目覚しい力価、高産出量、および意味のある容量生産力を示す遺伝学的に修飾された細菌の株を提供する。主題（ｓｕｂｊｅｃｔ）発明の微生物は、ヘキソース、ペントース、二糖、およびグリセロールなどの他の炭素化合物などの様々な糖を用いる単一の工程生産プロセスにおいて採用することができる。

ある文脈における用語「発酵（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）」および「発酵（ｆｅｒｍｅｎｔ）」は、生物による嫌気性増殖、または代謝を示唆する。しかしながら、この開示において、我々は、好気性、嫌気性、もしくは微好気性、またはそれらの組み合わせを含む任意の条件下での微生物の商業的または実験的増殖を広く参照するために、用語「発酵（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）」、および「発酵（ｆｅｒｍｅｎｔ）」を使用するものとする。

多くの化学物質の生合成の生産は、酸素または空気が存在しないまたは限定されている条件下で生産生物の増殖が実行される場合には、より効率的に（例えば、より高い産出量で）進めることができる。これは、主に、酸素の存在が一般的に比較的低価値の副産物である炭素二酸化物への炭素源供給源の代謝をもたらすためである。酸素または空気の意図的な供給の不存在における発酵は、通常、「嫌気性」と呼ばれる。しかしながら、厳密な嫌気性条件を達成することは、コストがかかるものであり、そして、時に、実現しがたい。さらに、いくつかの発酵にとって、厳密な嫌気性条件は、必要ない、または時に最適でない。酸素または空気が厳密には存在しないようにされていない発酵、または酸素または空気が低い制御された比率で意図的に供給される発酵については、我々は、用語「微好気性」を使用するものとする。

本発明の実行に適した微生物は、好気性的に（酸素の存在において）、または嫌気性的に（酸素の完全な不存在において）、または微好気性的に（最小量の酸素供給とともに）増殖することができる。本発明の好ましい実施態様において、コハク酸の生産のために選択される微生物は、嫌気性条件において増殖する。また、本発明に適した微生物は、二相増殖レジームにおいて増殖することができ、ここに、該微生物は、商業的に意味のある量のコハク酸の生産を達成するために嫌気性増殖条件に移動する前に、あるレベルの細胞増殖に到達するために、最初に嫌気性増殖条件において増殖する。本発明の微生物によるコハク酸の生産のための二相増殖の間、コハク酸の生産および蓄積は、嫌気性発酵性増殖フェーズの間に生じる。

本発明において、遺伝子変異の固有および有利な組み合わせが、炭素流動をコハク酸生産に向けるために採用されてきた。加えて、コハク酸生産が微生物増殖に結び付けられ、これは、同じく細胞ＡＴＰレベルおよび酸化還元バランスに結び付けられる。

用語「酸化還元バランス」は、ＮＡＤ^＋に対するＮＡＤＨの適切な割合を維持する細胞の能力を参照する。すなわち、細胞は、嫌気性発酵性増殖の間、炭水化物基質を酸化する十分なＮＡＤ^＋があるように、ＮＡＤＨを酸化することができる。好気性増殖の間、ＮＡＤ^＋プールは、ＮＡＤＨが関与する酸化的ホスホリル化を通じて再生される。しかしながら、嫌気性増殖条件下、ＮＡＤ^＋プールの再生は、ＮＡＤＨを酸化することができる細胞内部の様々な代謝的経路を通じて炭素の流動を操作することのみによって達成される。

「炭素異化生成物抑止」は、１または複数の遺伝子の発現が一部分において炭素の供給源によって調整され、そのうえで生物が増殖する任意の生物学的系を広く参照する。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、野生型生物においてグルコネオゲネシスにおいて機能する遺伝子は、培地におけるグルコースの存在によって抑制される。特に、ｐｃｋ遺伝子は、大半の野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株においてグルコースによって下方調整される。別の例として、酵母サッカロミセスセレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の野生型株において、ガラクトースなどのグルコース以外の炭素源供給源の利用は、培地におけるグルコースの存在によって阻害される。

「トリカルボン酸サイクル」または「ＴＣＡ」サイクルは、全体において、または一部分において、ほとんどの微生物に存在する一連の生化学的反応である。例えば、真正細菌および酵母などの多くの生物において、ＴＣＡサイクルは、好気性増殖の間の真正サイクルとして動く。この場合、ＴＣＡサイクルは、（酢酸塩などの）２つの炭素ユニットを炭素二酸化物に異化すること、およびグルタミン酸塩、コハク酸塩、およびアスパラギン酸塩などの生合成のための生化学的中間体を生成すること、という２つの主要な機能を有する。嫌気性または微好気性増殖の間、ＴＣＡサイクルは、真正のサイクルとしてではなく、むしろ１または複数の線形経路として動くかもしれない。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における低酸素条件下、ＴＣＡサイクル酵素は、リンゴ酸塩を通じてコハク酸塩をもたらすいわゆる還元的経路、およびクエン酸塩を通じてａ−ケトグルタル酸をもたらすいわゆる酸化的経路を含む２つの分岐した経路として作動する。この場合、ＴＣＡサイクルの機能は、まず生化学的中間体であるグルタミン酸塩、コハク酸塩、およびアスパラギン酸塩を生産することである。いくつかの炭素は、グリオキシル酸短絡回路によって、２つの分岐の間で移動することができる。好気性、嫌気性、および微好気性増殖の間、生合成のために使用される生化学的中間体のそれぞれの分子について、ＴＣＡサイクルにおける分子は、交換されなければならず、さもなければ、該サイクルにおける該化合物は、枯渇するであろう。この交換反応は、アナプレロティック反応と呼ばれる。

共通のアナプレロティック反応は、ピルビン酸塩、またはホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）などの３つの炭素化合物を取り、そして、第二の基質として炭素二酸化物を用いてオキサロ酢酸、またはリンゴ酸塩などの４つの炭素化合物にそれを変質させる。

真正細菌および酵母などの多くの生物において、ＴＣＡサイクルの酵素をコードする遺伝子の発現、およびグリオキシル酸短絡回路は、グルコースによって抑制される、および／または酸素によって誘導される（Ｃｒｏｎａｎ ａｎｄ Ｌａｐｏｒｔｅ，１９９６）。この調整の制御は、複雑である。文献によれば、特に低酸素の条件下でのコハク酸塩および他の化合物の効率的な生産は、還元的ＴＣＡサイクル酵素、およびグリオキシル酸短絡回路のものの繊細なバランスを必要とする（Ｖｅｍｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ ２００５）。

しかしながら、技術の状態は、コハク酸塩などの化合物の生合成のためのＴＣＡサイクル、およびグリオキシル酸短絡回路経路の使用を最適にする、または最適に近くする株を合理的に設計するのに十分には発展していない。本発明の目的の１つは、ＴＣＡサイクルの化学物質の生産のために最適に近い高度に進化した微生物を、ＤＮＡ配列のレベルで見極め、将来的に、より合理的な株の設計および構築が、コハク酸塩、および他の化学物質の生産のための株を改変するために使用することができるようにすることである。本発明において発見された変異は、ＴＣＡサイクル中間体、およびＴＣＡサイクルの派生物中間体、特に、コハク酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、スレオニン、リジン、メチオニン、およびイソロイシンを含むがそれらに限定されないオキサロ酢酸に由来する化学物質を含むＴＣＡサイクルに関する化学物質の生合成を改良するのに有用である。というのは、本明細書において説明される変異は、野生型生物において、このような化合物を生産するために機能する遺伝子および酵素は、複雑な方法において負に調整される条件であるグルコース（または他の糖）ベースの培地における低酸素の条件下、オキサロ酢酸に向かう、およびそれからの代謝的フラックスを増大させることに有用だからである。

しばしばバクテリアにおいて見出される糖の輸送のための１つのメカニズムは、ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）である。これは、２エネルギー−共役タンパク質である酵素ＩおよびＨＰｒ、ならびに典型的には３つのタンパク質ドメインであるＥＩＩＡ、ＥＩＩＢ、およびＥＩＩＣからなるいくつかの糖特異的酵素ＩＩタンパク質、またはタンパク質複合体から構成される。ＥＩＩドメインの組織は、バクテリアの間で異なる。ＥＩＩは、単一の融合タンパク質、または異なる融合および非融合ドメインからなるかもしれない。膜を通じた特定の糖の転位は、内在性膜ドメイン（複数も可）ＥＩＩＣによって、および時にはＥＩＩＤによって促進される。しかしながら、一緒に機能して糖基質の輸送およびホスホリル化を引き起こし、ホスホリル化された炭水化物の細胞内プールをもたらすのは、３つの酵素ドメイン、またはタンパク質の複合体である。エネルギーおよびＰＴＳのためのリン酸の供給源は、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）である。しかしながら、細胞の内部においてＰＴＳおよび生合成の経路の間でＰＥＰについての競合があることができるように、ＰＥＰは、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、アスパラギン酸塩などの多くの４−炭素化合物、およびそれらの４−炭素化合物から作られた他の化合物の生合成のための基質であることもできる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、グルコースのためのＰＴＳ系は、ｐｔｓＨ、Ｉ、Ｇ、およびｃｒｒ遺伝子によってコードされる。糖を微生物に輸送するための他のメカニズムであって、ＰＴＳと関わらないものがある。我々は、直接にはＰＥＰを基質として使用しないこれら他の輸送メカニズムにかかわるタンパク質を「非−ＰＴＳ」糖輸送体と呼ぶものとする。非−ＰＴＳ輸送体の例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＧａｌＰおよびＸｙｌＥなどのプロトン輸送体、サッカロミセスセレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＨＥＸ１、２、６、および７、およびザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）のＧｌｆなどの促進されたディフューザー、ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＸｙｌＦＧＨなどのＡＢＣ−タイプ輸送体である。

バクテリアにおける糖輸送体の最大群は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体として知られている。名が暗示するように、ＡＢＣ輸送体は、バクテリアの細胞に輸送された糖の各分子のためにＡＴＰの分子を必要とする。ＸｙｌＦＧＨは、ペントース糖であるキシロースを細胞に輸送するためのＡＢＣ輸送体である。ＡｒａＦＧＨは、別のペントース糖であるアラビノースを輸送するためのＡＢＣ輸送体である。

他のタイプの非−ＰＴＳバクテリア糖輸送体は、主要ファシリテータースーパーファミリー（ＭＦＳ）下でグループ化される。ＭＦＳ糖輸送体内で、輸送体の２つの異なるカテゴリーが認められている。ＭＦＳは、Ｈ^＋−連動輸送体、Ｎａ^＋−連動輸送体−対向輸送体、および単輸送体を含む。単輸送体は、糖輸送のための単純なファシリテーターである。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における膜貫通タンパク質Ｇｌｆは、単輸送体の例である。Ｈ^＋−輸送体は、細胞に輸送された各糖分子のためにプロトンを必要とする。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＧａｌＰタンパク質は、ヘキソース糖であるガラクトースを細胞に輸送するための輸送体である。ＧａｌＰは、１２の膜貫通ループを有する非常によく特徴付けられた輸送体である。ＧａｌＰは、細胞膜を越えてグルコースを輸送する能力を有するとも報告されている。ＡｒａＥは、細胞膜を越えてアラビノースを輸送するためのプロトン−連動輸送体である。同様に、ＸｙｌＥタンパク質は、キシロースの輸送のためのプロトン−連動輸送体である。

ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）によるグルコース取り込みの除去は、微生物細胞へのグルコース取り込みに費やされるエネルギーを低下させるのに役立つことができた。ＰＴＳを操作することによって保存されるエネルギーは、有機酸生産の効率を改良することに向かわせることができる。ホスホトランスフェラーゼ系遺伝子ｐｔｓＨ、およびｐｔｓＧは、グルコース取り込みにおけるエネルギーを保存するように操作し、そしてそれによって微生物によるコハク酸生産の効率を改良することができる。このように、微生物代謝的経路の分野において入手することができるデータを採ることによって、代謝的経路の大半をブロックするために、および炭素流動を高い効率でのコハク酸の生産に向かわせるために、一連の遺伝子を欠失させることができる。ＰＴＳ−介在グルコース取り込みの阻害を用いて、グルコース取り込みのための他の系は、産業上有用な化学物質の生産のために細胞内でグルコースを確実に継続して入手することができるように活性化することができる。例えば、グルコース単輸送体であるグルコースパーミアーゼをコードするｇｌｆ遺伝子は、ＰＴＳ介在グルコース取り込みの喪失の代わりになることが示されてきた。同様に、ｇａｌＰおよびｇｌｋ遺伝子の過剰発現は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｐｔｓ⁻株におけるグルコース取り込みおよびホスホリル化を増進することが報告されている。ＧａｌＰは、ヘキソース糖であるガラクトースの取り込みのための輸送体である。ＧａｌＰは、ｐｔｓ⁻株においてグルコースを輸送することが報告されてきた。ＧａｌＰ介在グルコース取り込みの意義は、ｐｔｓ⁻変異体におけるｇａｌＰ遺伝子の不活性化が致死的であることが見出されたという事実によって証明されている（Ｙｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）。Ｇｌｋは、解糖に入ることができる前に、グルコース分子のホスホリル化を達成することが必要である。ｐｔｓ⁻株におけるＧａｌＰタンパク質の発現は、構成的プロモーター下の外因性遺伝子を発現すること、またはｇａｌＳおよびｇａｌＲなどのｇａｌＰ遺伝子のリプレッサーをコードする遺伝子における変異を通じてｇａｌＰ発現の抑止を軽減することのいずれかによって達成することができる。

微生物細胞における代謝的経路についての我々の最近の理解を用いて、有意な量のコハク酸を生産するように設計された株を合理的に構築することができる。効率的にコハク酸を生産する微生物の構築のための合理的設計は、細胞の内部の炭素流動のための他の潜在的発酵性経路が遺伝学的操作を通じてブロックされている場合に、コハク酸は、嫌気性または微好気性条件下で蓄積することができたという仮定に基づく。細胞内の炭素流動のために特定の経路をブロックすることが必要である遺伝学的操作は、ブロックされることが求められる経路の作動にかかわる酵素をコードする１または複数の遺伝子の活性を低下させること、または除去することを伴う。酢酸塩、蟻酸塩、エタノール、および乳酸塩への炭素流動は、適切な遺伝学的方法を通じてブロックすることができる。例えば、ａｄｈＥについての遺伝子を欠失させることによって、嫌気性アルコール生産をブロックすることができ、そして、ａｃｋおよび／またはｐｔａＡ遺伝子を欠失させることによって酢酸塩への炭素流動をブロックすることができる。

細胞内の炭素流動のために特定の無用の経路をブロックすること、および炭素流動をコハク酸生産に向けることが原理上は正攻法であるけれども、実際には、合理的に設計された遺伝子欠失は、所望の表現型をもたらさない。Ｊａｎｔａｍａ ｅｔ ａｌ（２００８ａ；２００８ｂ）によって説明されるように、合理的に設計された遺伝子欠失は、最初に、増殖が乏しいバクテリア株をもたらした。増殖が乏しい遺伝子−欠失株は、次に、増殖比率を改良するために代謝的進化にさらされた。このように、コハク酸生産のための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を構築するにあたり、ｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、およびａｃｋ遺伝子を除去した第一段の欠失が行われ、続いて、第一段階の代謝的進化が行われた。

第一段階の代謝的進化の後、第二段の遺伝子欠失が、ｆｏｃＡおよびｐｆｌＢ遺伝子を除去した。そして、第二段の代謝的進化が、行われた。第三段の欠失において、ｍｇｓＡ遺伝子が、除去された。そして、第三段階の代謝的進化が、行われた。第四段の欠失において、ｐｏｘＢ遺伝子が、欠失させられ、除去された。そして、第四段階の代謝的進化が行われた。

「代謝的進化」は、生物（しばしば遺伝学的に改変された生物）の培養（必ずしもそうとは限らないが通常は、液体培養）が、希釈および（「移動」とよばれる）再−増殖の反復したサイクルにさらされ、それによって、多数の移動の後、改良された増殖特性および／またはコハク酸、乳酸、エタノール、またはブタノールなどの増殖に連結している化学物質の改良された生産を保有する株を得ることができるようにするプロセスである。微生物の増殖が発酵によって所望の化学物質を生産することに依存的にされる場合には、代謝的進化は、株改良のための方法として特に効果的である。例えば、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのヘテロ発酵性微生物は、グルコースなどの糖上で嫌気的にまたは微好気的に増殖させられる場合、化学物質であるＤ−乳酸塩、Ｌ−乳酸塩、蟻酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、炭素二酸化物、水素、およびエタノールの混合物を生産する。これらの化合物への経路は、「発酵性経路」と呼ばれる。他の生物において、発酵性経路は、ブタノール、他のアルコール、他の有機酸、エステル、３−ヒドロキシアルカン酸、脂肪酸、アルカン、アルケン、カロテノイド、アミノ酸、およびビタミンなどの非常に多様な化学物質をもたらすことができる。野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によって作られる化合物のうち、少なくともＤ−乳酸塩、コハク酸塩、およびエタノールは、商業的関心があるものであり、そのため、「所望の化合物」であると考えることができる。無用の化合物への経路を制御する遺伝子を欠失させることによって、生物は、所望の化合物への１または複数の経路のみが残され、そのため、増殖が、前記所望の化合物に依存的になる、またはそれに連動する。また、宿主生物からの全ての発酵性経路は、欠失させることができ、そして、宿主生物において天然に生産されない所望の化合物をもたらす異なる生物からの新たな外因性経路が、遺伝学的改変によって導入されることができる。代謝的進化は、そして、増殖をしたがって所望の化合物の生産を改良するために、変異したまたは改変された株に適用される。代謝的進化は、意図的な突然変異生成を必要としないので、進化した株に対する変異的負担は、最小であり、そして、大抵、全てでないかもしれないが、蓄積する変異は、所望の化合物の増殖および／または生産に有益であろう。代謝的進化の良好な例は、株ＫＪ１２２であり、これは、所望の化合物としてコハク酸塩を生産するように改変されており、そして、代謝的進化にさらされている（Ｊａｎｔａｍａ ｅｔ ａｌ．，２００８ｂ）。

この明細書おいて、用語「化学物質」および「化合物」は、区別しないで使用されるものとし、そして、両方ともが、従来の意味において使用されるものとする。

自然発生的変異が生じ、そして、集団において固定されるクローンの間での付随する競合を有する多くの世代の増殖を達成するために、代謝的進化の間、選択された培養物は、反復して移動され、そして、連続して多くの回数、新鮮最小培地に希釈させられ、いくつかの変異が、供給されている炭素源供給源のより効率的な使用、培養における毒性化学物質に耐えるためのより良い能力、およびこの例においてコハク酸であった望ましい化学物質の生産のより高い効率を与える。代謝的進化の間、望ましい表現型を有するが望ましくない副産物の生産も低いまたは存在しないクローンを選択することに注意が払われる。

このように、一般化すると、特定の化学物質を過剰生産するように設計され、そして遺伝学的に改変された微生物生物は適切な増殖比率を有しなくてもよく、そして、結果的に、特定の化学物質を生産するための期待されたまたは所望の効率を示さなくてもよい。代謝的進化は、その特定の化学物質の生産のための増大した比率を伴う生産耐性、および改良した増殖を有する株を選択するために使用されることができる。しかしながら、代謝的進化は、自然発生的変異からもたらされるので、改良された増殖、生産耐性、および化学物質生産の効率をもたらす正確な遺伝学的変更は、代謝的進化方法によって、明白、予測可能、または再現可能でないかもしれない。進化した生物のゲノムのＤＮＡ配列の測定は、蓄積した変異の詳細を提供することができる。そして、同種野生型対立遺伝子を有する進化した株におけるそれぞれの個別の変異を交換することによって、またはその代わりに、ナイーブで進化していない株に変異した対立遺伝子を導入し、続いて、株性能の比較分析をすることによって、どの変異が所望の表現型に貢献するかを実証することができる。進化した株に残るいくつかの変異が所望のプロセスに有害であることはありうる。これらは、進化における初期の段階では有益な変異である、または離れて進化する時間がなかった変異であることができた。任意の場合において、どの変異が有益であるかを、そして、それらの変異の正確な特質を知ることは、（１）将来の遺伝学的改変のためのより合理的な設計、例えば、長期にわたる進化プロセスが必要ないコハク酸生産のための新株または生物の改変、および（２）同じくさらにより合理的な株改良をもたらすことができる、株性能を改良する僅かなまたは予想外の変異に対する洞察、を可能にする。例えば、リプレッサー遺伝子において見出されるフレームシフト変異が進化した株において発見されるならば、遺伝学的改変は、同一の表現型を与える非−復帰可能であり、そしてそのためより安定な対立遺伝子を作出するために、そのリプレッサー遺伝子の完全な欠失を作出するように使用することができる。

生物がある望ましい表現型を獲得するように強いるある選択的な圧力を用いる代謝的進化のプロセスの間、２つの可能な変更が生じえた。該生物は、単純にそれ自体を選択的圧力に適応させることができ、そして、変更した遺伝子型を示さないことができた。また、生物は、選択的圧力下である遺伝学的変更を経験し、そして、より永続的な変更した表現型を示すかもしれない。適応しかない、および遺伝学的変更がない場合、いったん選択圧力が軽減すると、生物は、その最初の表現型に復帰するであろう。これらの生物は、「適応した」生物といわれる。該「適応した」微生物は、変更した表現型を示すためには別の新鮮な段の選択圧力を経験しなければならない。他方、付随する遺伝学的変更がある場合には、変更した表現型は、選択圧力がない場合であっても、存在し続けるであろう。ある遺伝学的変更を伴う代謝的進化は、望ましい。代謝的進化の間で安定な遺伝学的変更を獲得している微生物は、選択圧力のある新鮮培地に移動する前に、微生物を最初の増殖培地においていかなる選択圧力もなしに、しばらく増殖させることによって容易に同定することができる。これらの生物が、いかなる遅延期なしに良好な増殖、および期待される表現型を示すことができるならば、該生物は、代謝的進化の間で、表現型を伴う変更した遺伝子型を獲得したと考えられる。

有意な量のコハク酸を生産するための微生物を作るために、糖分解経路、トリカルボン酸サイクル（ＫｒｅｂｓサイクルまたはＴＣＡサイクルとしても知られる）、およびグリオキシル酸短絡回路を含む多くの微生物代謝的経路にかかわる様々な酵素が、引用され、そして、参照によって上記の段落に組み込まれる科学的および特許文献において説明される多様な遺伝学的改変技術を用いて操作することができる。様々な微生物代謝的経路についての詳細は、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒによる生化学の原理、およびＬｕｂｅｒｔ Ｓｔｒｙｅｒによる生化学などの標準的な生化学テキストブックにおいて見出すことができる。Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡにおけるＳｉｇｍａ ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから入手することができるＧ．Ｍｉｃｈａｅｌによるｐａｔｈｗａｙｓ ｐｏｓｔｅｒも、バクテリア細胞内の様々な生化学的経路についての詳細を提供する。

好気性増殖の間、微生物炭素代謝は、解糖、トリカルボン酸サイクル、および酸化的ホスホリル化に関わる。ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨなどの低下した酵素共因子は、細胞増殖に必要なＡＴＰ生産を伴う酸化的ホスホリル化の作動によって再生される。本発明の好ましい実施態様におけるコハク酸の生産のための嫌気性増殖条件下、低下した共因子ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＨの再生は、トリカルボン酸サイクルへの炭素流動をコハク酸生産に向かわせて、そして、ＮＡＤＰ^＋およびＮＡＤ^＋の再生のために他の発酵性経路の全てを除去することによって達成される。

好ましい有機酸のタイプに依存して、微生物が我々の選択の特定の有機酸を生産するように、代謝的経路は、特に改変される。微生物は、乳酸、酢酸、リンゴ酸、ピルビン酸、蟻酸、およびコハク酸を含む多数の有機酸を合成することができる。このように、コハク酸の生産のために生体触媒を開発するにあたり、酢酸、乳酸、ピルビン酸、および蟻酸の生産のための経路は、ブロックされ、そして、コハク酸生産物への炭素流動が、細胞内の炭素代謝にかかわる１または複数の酵素を操作することを通じて促進される。既知の遺伝学的改変技術を用いて操作することができる微生物発酵性経路において活性である該酵素の一覧は、イソクエン酸シンテターゼ（ａｃｅＡ）、リンゴ酸シンターゼ（ａｃｅＢ）、グリオキシル酸短絡回路オペロン（ａｃｅＢＡＫ）、酢酸キナーゼ−ホスホトランスアセチラーゼ（ａｃｋＡ−ｐｔａ）；アコニターゼヒドラターゼ１および２（ａｃｎＡおよびａｃｎＢ）；アセチル−ＣｏＡシンテターゼ（ａｃｓ）；クエン酸リアーゼ（ｃｉｔＤＥＦ）；アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ）；クエン酸シンターゼ（ｃｉｔＺ）；フマル酸レダクターゼ（ｆｒｄ）；乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）；リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）；ａｃｅＢＡＫオペロンリプレッサー（ｉｃｌＲ）；ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｅｐＣ）；ピルビン酸蟻酸リアーゼ（ｐｆｌ）；ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｘＢ）；ピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｐｃｋ）；およびピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）を含むがそれらに限定されない。

炭素源供給源の解糖は、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）の生産をもたらす。ＰＥＰは、さらに、混合した酸経路によって代謝される。本発明において使用する場合、用語「混合した酸経路」は、トリカルボン酸サイクルおよび嫌気性条件下で作動可能である様々な発酵性経路の両方を通じたＰＥＰからの炭素の流動を参照する。嫌気性条件下、ピルビン酸塩の代謝のための少なくとも４つの異なる発酵性経路が認められる。ピルビン酸塩は、ＮＡＤＨを用いて、それによって、ＮＡＤ^＋を生産して炭素源供給源の持続的な代謝に必要な細胞の酸化還元バランスを維持して、乳酸塩に還元してもよい。ピルビン酸塩に由来するアセチル−ＣｏＡも、ＮＡＤ^＋を生産するためのＮＡＤＨの酸化に伴いエタノールを生産するために還元されもよい。ピルビン酸塩も、蟻酸塩または酢酸塩に変質されてよい。

ＴＣＡサイクル内において、２つの異なる腕（ａｒｍｓ）が認められる。イソクエン酸を通じたオキサロ酢酸からコハク酸への炭素流動を包含する酸化的腕（ａｒｍ）と呼ばれるＴＣＡサイクルの１つの腕（ａｒｍ）において、ＮＡＤＰ^＋が、結果として生じるＮＡＤＰＨの形成とともに、イソクエン酸を酸化するために利用される。リンゴ酸塩およびフマル酸塩を通じたオキサロ酢酸からコハク酸への炭素の流動を包含するＴＣＡサイクルの還元的腕（ａｒｍ）と呼ばれるＴＣＡサイクルの他の腕（ａｒｍ）において、ＮＡＤ^＋を生産し、それによって細胞が酸化還元バランスを維持するのに役立つようにするために、ＮＡＤＨは、酸化される。

本発明の１つの実施態様において、発酵性経路を通じたＰＥＰからの炭素流動は、発酵性経路にかかわる酵素をコードする遺伝子を不活性化することによって阻害される。これらの発酵性経路を通じた炭素流動をブロックするのに適した遺伝子は、ｌｄｈＡ、ｐｆｌＢ、ａｄｈＥ、ｐｔａ、ａｃｋＡ、およびｐｏｘＢを含む。これらの遺伝子の１または複数の除去は、発酵性経路を通じたＰＥＰからの炭素流動を低下させることが期待される。本発明の別の側面において、メチルグリオキサルの乳酸への変質に関与するメチルグリオキサルシンターゼ（ｍｇｓＡ）をコードするｍｇｓＡ遺伝子は、発酵性経路にかかわる６つの他の遺伝子の不活性化と並んで不活性化される。

本発明のいまだ別の実施態様において、発酵性経路にかかわる遺伝子の機能的ホモログも、１または他の発酵性経路にかかわることがよく知られている遺伝子を不活性化することのほかにも不活性化される。酢酸キナーゼ活性を有するプロピオン酸キナーゼは、スレオニンの分解ためのみに生産されるｔｄｃＤ遺伝子によってコードされる。しかしながら、１０％（ｗ／ｖ）グルコースを有する嫌気性増殖の間、ｔｄｃＤの発現は、機能的にａｃｋＡを交換することができた。加えて、同一オペロンにおける隣接ｔｄｃＥ遺伝子は、ｐｆｌＢに類似し、そして、ピルビン酸蟻酸−リアーゼ活性を有するα−ケト酪酸蟻酸リアーゼをコードする。本発明の１つの側面において、ｔｄｃＤＥ遺伝子は、炭素の発酵性経路への進入を阻害して、そして、ＴＣＡサイクルへの炭素の流動を確実にするために不活性化される。

本発明の別の実施態様において、発酵性経路を通じた炭素流動をブロックすることに加えて、ＴＣＡサイクル内の炭素流動が、コハク酸の生産に向かう炭素流動があるように変化させられる。本発明の１つの側面において、ＴＣＡサイクル内の炭素流動の操作は、１または複数の遺伝子の発現を上方−調整することによって達成される。本発明のいまだ別の側面において、ＴＣＡサイクル内で機能する１または複数の遺伝子は、コハク酸への増大した炭素流動を促進するように不活性化されてもよい。

本発明の好ましい側面において、リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ｍｄｈが、フマル酸塩およびコハク酸塩へのリンゴ酸塩の変質を改良するために上方調整される。リンゴ酸塩およびフマル酸塩を通じたオキサロ酢酸からのコハク酸への炭素の流動は、ＴＣＡサイクルの還元的腕（ａｒｍ）と呼ばれる。オキサロ酢酸からコハク酸へのこのＴＣＡサイクルの還元的腕（ａｒｍ）を通じた炭素の流動は、生産されるコハク酸の各モルについて２モルのＮＡＤＨを消費し、そして、それによって、嫌気性条件下、細胞の酸化還元バランスを維持することに役立つであろう。換言すると、ｍｄｈの上方−調整は、細胞の酸化還元バランスを維持するために必要なＮＡＤ^＋を再生することに役立つであろう。ｍｄｈ遺伝子発現の該上方−調整は、ｍｄｈ遺伝子のためのネイティブのプロモーターをいくつかの他の強力なプロモーター配列に交換することによって、またはそれに代えてｍｄｈ遺伝子の増大した転写があるようにｍｄｈ遺伝子のプロモーター領域を変異させることによって達成することができる。また、ｍｄｈ遺伝子の付加的コピーを、株に付加することができ、またはｍｄｈ遺伝子の発現を調整する遺伝子をｍｄｈ遺伝子の発現を増大させるために操作することができる。本発明の好ましい実施態様において、ｍｄｈ遺伝子発現の上方調整は、そのプロモーター領域を遺伝学的に操作することによって達成される。

ＴＣＡサイクルの正常な作動において、コハク酸は、ＴＣＡサイクルの腕（ａｒｍ）の酸化の作動を通じて生産される。クエン酸塩、シス−アコニット酸塩、イソクエン酸塩、α−ケトグルタル酸塩、およびスクシニル−ＣｏＡを通じたオキサロ酢酸からコハク酸への炭素の流動は、ＴＣＡサイクルの酸化的腕（ａｒｍ）と呼ばれる。コハク酸は、グリオキシル酸副経路の作動を通じて生産することもできる。グリオキシル酸副経路の作動の間、イソクエン酸リアーゼの作用によって、コハク酸塩およびグリオキシル酸塩がイソクエン酸塩から生産される。このようにＴＣＡサイクルの酸化的腕（ａｒｍ）の作動から、またはグリオキシル酸副経路の作動から生産されるコハク酸塩は、コハク酸デヒドロゲナーゼ（ｓｄｈ）によって、フマル酸を、そして、リンゴ酸を産出するように作用されることができる。したがって、本発明の別の実施態様において、遺伝子不活性化は、細胞内のコハク酸生産を増大させるために、コハク酸塩の脱水素化の阻害に使用することができる。

本発明の別の側面において、グリオキシル酸副経路を通じた炭素流動は、コハク酸生産における増大を達成するように操作することができる。イソクエン酸リアーゼ酵素は、グリオキシル酸塩およびコハク酸塩へのイソクエン酸塩の切断を触媒する。イソクエン酸リアーゼは、ａｃｅＢＡＫオペロンによってコードされる。イソクエン酸リアーゼ活性は、ｉｃｌＲ遺伝子によって抑制される。換言すれば、ｉｃｌＲ遺伝子の発現は、グリオキシル酸短絡回路の作動を阻害する。本発明の１つの側面において、ｉｃｌＲ遺伝子は、発酵性代謝にかかわる遺伝子の不活性化と並んで不活性化される。

本発明のいまだ別の実施態様において、発酵性経路の作動を阻害すること、および遺伝学的操作を通じてコハク酸生産に向かうＴＣＡサイクル内の炭素の流動を増大させることに加えて、ＴＣＡサイクルから他の代謝的経路への外部からの炭素流動は、コハク酸生産を増大させるための遺伝学的手段を通じてブロックされることもできる。例えば、ＴＣＡサイクルからアミノ酸代謝への炭素の流動は、コハク酸に向かう炭素流動を改良するためにブロックすることができる。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子（ａｓｐＣ）は、アスパラギン酸合成においてグルタミン酸からオキサロ酢酸にアミノ基を転位し、それによってＴＣＡサイクルからの炭素の外部からの流動を促進する。本発明の１つの側面において、ＴＣＡサイクルからの炭素の外部からの流動をブロックするために、ＴＣＡサイクルの酸化的または還元的腕（ａｒｍ）のいずれかを通じたオキサロ酢酸からコハク酸生産に向かう炭素流動を改良するために、ａｓｐＣ遺伝子の不活性化が続いて行われる。

他のＴＣＡサイクルからの炭素の外部からの流動は、リンゴ酸塩から生じる。リンゴ酸酵素（ｓｆｃＡ）によるリンゴ酸塩の脱カルボキシル化は、ピルビン酸塩の生産をもたらす。本発明の１つの側面において、ｓｆｃＡ 遺伝子をコードする遺伝子は、ＴＣＡサイクルからの炭素の外部からの流動を縮小するために不活性化される。本発明のいまだ別の側面において、ａｓｐＣおよびｓｆｃＡ遺伝子の両方が、ＴＣＡサイクルからの炭素の外部からの流動を阻害して、コハク酸蓄積を増進するために不活性化される。

本発明のいまだ別の側面において、ＴＣＡサイクルからの炭素の外部からの流動は、オキサロ酢酸塩および酢酸塩へのクエン酸の切断に関与するクエン酸リアーゼ遺伝子（ｃｉｔＤＥＦ）を不活性化することによって阻害される。

発酵性経路にかかわる遺伝子およびそれらの機能的アナログを不活性化することに加えて、増殖に連動するコハク酸産出量は、微生物細胞内のカルボキシル化酵素の遺伝学的操作によってさらに改良することができる。遺伝学的および酵素分析を実施することを通じて代謝的進化の間に生じる変更を特徴付ける間、細胞内のカルボキシル化酵素が、改良されたコハク酸産出量を達成するための遺伝学的操作についてのいまだ別の標的であることができることが示されてきた。

糖分解中間体ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）およびピルビン酸は、ＴＣＡサイクルへの炭素流動を改良するためにカルボキシル化することができる。普通の条件下、ＴＣＡサイクルへの炭素進入は、クエン酸を生産するために、ピルビン酸塩に由来するアセチル−ＣｏＡと、ＴＣＡサイクルにおける中間体であるオキサロ酢酸とを組み合わせるクエン酸シンターゼの作用によって達成される。細胞内に存在する１または複数のカルボキシル化酵素の効率を改良することによって、ホスホエノールピルビン酸ピルビン酸塩およびピルビン酸塩をＴＣＡサイクル中間体であるオキサロ酢酸にカルボキシル化することが可能である。カルボキシル化反応からこのようにして生産されるオキサロ酢酸は、コハク酸を生産するため、ＴＣＡサイクルの還元的腕（ａｒｍ）を通じてさらに還元することができる。

細胞内に存在するカルボキシル化酵素を操作することは、嫌気性発酵性増殖の間のコハク酸産出量を増大させる方法である。外因性供給源からピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）を導入することによって、ピルビン酸塩をオキサロ酢酸にカルボキシル化することが可能であることは、本技術分野においてよく知られている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの遺伝学的操作によく適している微生物株は、ｐｙｃ遺伝子を有さない。リゾビウム・エトリ（Ｒｈｉｚｏｐｉｕｍ ｅｌｔｉ）およびラクトバチルス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉ）などの他のバクテリア種に由来するｐｙｃ遺伝子が、コハク酸生産を改良するために遺伝学的に修飾された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に導入されてきた。

４つの異なる内因性のカルボキシル化酵素が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において知られている。これらの酵素の２つは、ホスホエノールピルビン酸をカルボキシル化することに関与し、そして、２つの他の酵素は、ピルビン酸キナーゼ酵素の作用に由来するホスホエノールピルビン酸に由来するピルビン酸塩のカルボキシル化に関与する。酵素ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）は、コハク酸塩を生産するために、ＴＣＡサイクルの還元的腕（ａｒｍ）に進入することができたオキサロ酢酸にホスホエノールピルビン酸をカルボキシカルボキシル化する。第二のカルボキシル化酵素ホスホエノールピルビン酸キナーゼ（ｐｃｋ）も、オキサロ酢酸を生産するためにホスホエノールピルビン酸をカルボキシカルボキシル化するが、普通は、グルコースの存在においては発現しないので、逆反応を触媒する。２つの他のカルボキシル化酵素、すなわち、ＮＡＤＨ−連動リンゴ酸酵素（ｍａｅＢ）およびＮＡＤＰＨ−連動リンゴ酸酵素（ｍａｅＡ／ｓｆｃＡ）は、ピルビン酸をリンゴ酸にカルボキシカルボキシル化する。ｍａｅＢおよびｓｆｃＡ酵素は、ピルビン酸キナーゼの作用によってホスホエノールピルビン酸に由来するピルビン酸塩をカルボキシカルボキシル化する。

細胞に存在する４つのカルボキシル化酵素の任意の１つは、糖分解サイクル中間体からＴＣＡサイクルへの炭素流動を改良するため、その酵素的活性を増大するために、遺伝学的に操作することができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において存在する４つのネイティブのカルボキシル化酵素のＰＰＣ−触媒反応が、強く好まれる。ＰＥＰにおいて含まれるエネルギーは、無機リン酸塩の放出を有するこの反応において失われる。他の３つのカルボキシル化酵素、すなわち、ｐｃｋ、ｍａｅＡ、およびｓｆｃＡ（ｍａｅＢ）は、これらの３つのカルボキシル化酵素は、グルコースによって抑制されるので、基質としてグルコースを用いた発酵性増殖の間、機能することが期待されない。これら３つのカルボキシル化酵素は、細胞が、有機酸を酸化的に代謝している場合、グルコネオゲネシスの間、逆方向において機能すると考えられる。

糖新生ＰＥＰカルボキシキナーゼ（ｐｃｋ）は、ＴＣＡサイクルへの炭素の流動を改良するために遺伝学的に操作することができる。ｐｃｋの活性を改良することにおける利点は、ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸にカルボキシル化する間のこの酵素が、生産されたオキサロ酢酸の各分子についてＡＴＰの分子の生産をもたらすという事実にある。ＡＴＰ産出量における増大は、細胞の増殖比率を増大するであろう。

発酵性コハク酸塩生産のためのネイティブの糖新生ｐｃｋの動員は、ｐｃｋ遺伝子の転写に肯定的に影響する任意の変異によって達成することができる。ＰＣＫ活性のレベルにおける増大は、ネイティブのプロモーター、または遺伝子の発現を増大させることが知られている任意の他のプロモーター配列を有する多コピープラスミドにおいてｐｃｋ遺伝子を発現させることによって達成することができる。細胞内ｐｃｋ遺伝子の発現を増大させるための別の方法は、付加的コピーのｐｃｋ遺伝子を組み入れることである。本発明の別の実施態様において、ｐｃｋ遺伝子のネイティブのプロモーターは、活性のレベルを増進させることが知られているいくつかの他のプロモーター要素と交換することができる。ｐｃｋ遺伝子の増大した発現は、該遺伝子のプロモーター領域における変異によって、またはｐｃｋ遺伝子のプロモーター領域と相互作用することが知られている調節要素の遺伝学的操作のいずれかによって達成することもできる。ｐｃｋ遺伝子の調節遺伝子タンパク質をコードする遺伝子は、ｐｃｋ遺伝子の発現を増大させるために、変異させる、もしくは欠失させる、またはいくつかの方法において過剰発現させることができる。単一点変異（ｐｃｋ遺伝子のＡＴＧ開始コドンと比較して、位置−６４におけるＧからＡへの転位）は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ酵素活性における対応する増大を伴い、ｐｃｋ遺伝子の転写を増大させることができた。ｐｃｋ遺伝子発現における同様の増大は、ｐｃｋ遺伝子の発現を調整することが知られているタンパク質をコードする遺伝子を遺伝学的に操作することによって達成することもできる。例えば、Ｃｒａタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてｐｃｋ遺伝子の発現を活性化することが示されてきた（Ｓａｉｅｒ ａｎｄ Ｒａｍｓｅｉｅｒ，１９６）。同様に、ｃｓｒＡ系（ｃｓｒＡ、ｃｓｒＢ、ｃｓｒＣ、ｃｓｒＤ、ｕｖｒＹ、またはｂａｒＡを含む）は、ｍＲＮＡ安定性を変化させることによって、ｐｃｋおよびグルコース代謝にかかわる他の遺伝子レベルを調整することも報告されてきた（Ｂａｂｉｔｚｋｅ ａｎｄ Ｒｏｍｅｏ，２００７；Ｐｅｒｎｅｓｔｉｇ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ ｅｔ ａｌ．，２００２）。

本発明において、望ましい表現型、例えば、改良された効率コハク酸生産を示す遺伝学的に改変された、そして、代謝的に進化した株、および遺伝学的に改変されたおよび代謝的に進化した株の構築にあたり使用される野生型株は、ゲノムのＤＮＡ配列分析にさらされる。

野生型親株および遺伝学的に改変された、および代謝的に進化した株の全体ゲノムシーケンシングは、ハイスループットＤＮＡシーケンシングの分野における当業者によく知られているシーケンシング技術によって達成することができる。多数のシーケンシング技術は、市場において入手可能であり、そこでは、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，および４５４，Ｉｎｃ．によって提供されるハードウェア、ソフトウェア、および方法など、コスト−効果的態様で、ゲノムの配列情報を提供することができた。

野生型および進化したバクテリア株から得られる配列データは、適切なソフトウェアを用いて比較することができ、そして、２つの株の間の遺伝学的変更を得ることができる。２つの株の間の遺伝学的変更の全ての一覧から、遺伝学的改変の段階で意図的に導入された遺伝学的変更は、検証することができ、そして、代謝的進化のプロセスの間で生じて固定された付加的遺伝学的変更は、同定することができる。

一度、代謝的進化の間で生じた変異が同定されると、所望の化学物質の生産を改良することにおけるこれらの変異の重要性が、逆遺伝学的分析を用いることによって測定される。例えば、測定することができる力価でコハク酸を生産し、そして、その染色体のＤＮＡにおける最小数の遺伝子変更を含むナイーブなバクテリア株が、利用することができる。ともに変異した形態のｐｃｋおよびｐｓｔＩ、ならびにｐｆｌＢにおける欠失を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＸＺ７２２、および同一公表株ＸＺ７２１は、他の株のうち、この目的に適している（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９）。株ＫＪ１２２（または関心のある任意の他の株）の代謝的進化の間で生じた遺伝学的変異は、本技術分野においてよく知られている技術を用いて株ＸＺ７２１またはＸＺ７２２に導入することができる。２工程遺伝子交換方法は、本技術分野においてよく知られている（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９ａ；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９ｂ；Ｊａｎｔａｍａ ｅｔ ａｌ．，２００８ａ；Ｊａｎｔａｍａ ｅｔ ａｌ．，２００８ｂ）。本発明の株を構築するために使用される「２工程遺伝子交換方法」については、第一の工程は、ｃａｔ（３０ｍｇ／ｌでのクロラムフェニコールに対する耐性）またはｋａｎ（５０ｍｇ／ｌでのカナマイシン耐性）などの薬剤耐性遺伝子を含有する選択可能であり、そして反対−選択可能であるカセットを、６０ｇ／ｌスクロースに対する感受性を与える枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのｓａｃＢ遺伝子とともに導入することである。ｃａｔ−ｓａｃＢまたはｋａｎ−ｓａｃＢカセットは、ｐＬＯＩ４１５１（配列番号３３）またはｐＧＷ１６２（配列番号３４）をそれぞれテンプレートとして用いるＰＣＲによって得られる。ＰＣＲプライマーは、同種組換えを助長するために、プライミング配列の約１８〜２５の塩基に加えて、染色体の標的配列の５’および３’末端に対して相同の約５０の塩基を含有する。線状ＰＣＲ生産物は、プラスミドｐＫＤ４６で以前に形質転換された受容株へのエレクトロポレーションによって形質転換され、ここで、ｐＫＤ４６は、受容株の染色体への所望のＰＣＲ断片の組み入れの頻度を増大させるためにファージラムダＲｅｄリコンビナーゼを発現させるものである。ｐＫＤ４６は、３０℃で１００ｍｇ／ｌでのアンピシリン耐性について選択される。それは、温度感受性複製起点を有し、そして、４２℃での増殖によって宿主株から取り除くことができる。ｐＫＤ４６は、Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｎｎｅｒ（２０００）に説明されており、そして、Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡから入手可能である。２工程遺伝子交換方法の第二の工程については、第二のＰＣＲ生産物は、導入に望ましい対立遺伝子の５’および３’末端にプライムする（ｐｒｉｍｅ）第二の対のＰＣＲプライマーを用いて、例えば、ＫＪ１２２染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いて作られる。この第二の対のプライマーは、第一の対のＰＣＲプライマーと同様に、相同組換えを助長するために、染色体の標的配列の５’および３’末端に相同である約５０の塩基対を含有することもできる。しかしながら、挿入した対立遺伝子にとっての染色体の標的が、挿入されるべき対立遺伝子のネイティブの遺伝子座である場合、第二の工程のための相同配列は、単に増幅したＤＮＡ配列の一部であることもできる。換言すると、染色体における第二の部位において遺伝子の第二のコピーを導入することにおいて染色体の標的が対立遺伝子のネイティブの遺伝子座と異なる部位である場合、染色体の標的に相同である５０塩基対配列は、ＰＣＲプライマーの５’末端に付加されることのみが必要である。第二の工程での変更した対立遺伝子の導入は、相同組換えを刺激するためにいまだｐＫＤ４６を含有する線状の第二のＰＣＲ生産物を受容株（これは第一の工程において作出された株である）にエレクトロポレーションすること、および６０ｇ／ｌスクロースを含有するプレート上で選択することによって達成される。この２工程方法において、相同組換えが臨まれる全ての操作について、ヘルパープラスミドｐＫＤ４６からラムダＲｅｄリコンビナーゼ遺伝子の発現を引き起こすために、細胞は、５ｇ／ｌアラビノースを含有する富栄養培地において増殖させられる。スクロース選択の間に、自然発生的ｓａｃＢ変異体が生じることができるので、結果として生じるコロニーは、クロラムフェニコールまたはカナマイシン感受性について、および所望の対立遺伝子変更を拾い上げたコロニーを同定するための診断的ＰＣＲによって、スクリーニングされる。点変異などの僅かな変異については、所望の対立遺伝子が導入されたことを確認するために、導入される対立遺伝子のＤＮＡ配列を得ることが必要である。これは、導入される対立遺伝子のＰＣＲ増幅されたコピーを得ること、およびＰＣＲ生産物をシーケンシングすることによって達成することができる。例えば、タフツ（Ｔｕｆｔｓ）大学コア施設（Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）、タフツ（Ｔｕｆｔｓ）大学医大、ボストン、マサチューセッツ州、ＵＳＡなどの商業的サービスとしてＤＮＡシーケンシングを行う多くの組織がある。

２工程遺伝子交換のために使用されるＰＣＲプライマーの例は、表２において与えられる。

それぞれの変異の効果を測定する別の取り組みは、上記の同一の２工程遺伝子交換方法を用いて、進化した株（例えば、ＫＪ１２２）における単一変異体対立遺伝子を親株である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ（ＡＴＣＣ ８７３９）からの同種野生型対立遺伝子に交換することである。株構築は、例えば、ファージＰ１ ｖｉｒ（Ｓｉｌｈａｖｙ ｅｔ ａｌ．，１９８４）を用いて普及したバクテリオファージ形質導入によっても達成することができる。

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体にける特定の小さなまたは大きな欠失を作出するための技術も、よく知られており、そして、これらの技術は、他のバクテリア、古細菌酵母、および糸状菌（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ）に応用できるべきである。例えば、Ｋｏｌｉｓｎｙｃｈｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ（２００２）は、染色体のＤＮＡから特定の遺伝子配列を除去するために従うことができる技術を説明しており、そして、これは、参照によって本明細書に組み込まれる。

野生型または変異体を含有する株の同質対後、対立遺伝子が、構築され、対のメンバーは、適切な小スケール発酵槽における増殖および化学物質生産について試験されることができる。例えば、嫌気性または微−好気性条件下でのｐＨ制御での増殖およびコハク酸生産は、以前に説明されたようにして（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９ａ；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８ｂ；Ｊａｎａｔａｍａ ｅｔ ａｌ．，２００８ａ； Ｊａｎｔａｍａ ｅｔ ａｌ．，２００８ｂ）試験することができる。小スケール発酵槽における株性能を試験するためには、それが生産される場合にコハク酸を中和するために使用されるアルカリ性の溶液は、２．４Ｍカリウム炭酸塩を加えた１．２Ｍカリウム水酸化物であることができ、またはそれに代えて、株性能を試験するためには、それは、６Ｍアンモニウム水酸化物を加えた３Ｍアンモニウム重炭酸塩であることができる。

一度に１つの変異をＸＺ７２２などのコハク酸塩−生産大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に導入することによって、またはＫＪ１２２などのコハク酸塩−生産株から１つの変異を一度に除去する（すなわち、１または複数の変異した遺伝子の野生型対立遺伝子を再−導入すること）ことによって、増殖または化学物質生産を改良することに貢献する遺伝学的変更を決定することができる。加えて、変異の組み合わせによる任意の付加的なまたは相乗的な効果があるかどうかを決定するために、１を超えるタイプの変異が、化学物質−生産株に導入する、または除去することができる。変異のこのスクリーニングを通じて、効率的な増殖および化学物質生産を達成するために重要である変異を同定することが可能である。いったん化学物質生産を改良することに関与するそれらの新規の変異が同定されれば、それらの変異は、コハク酸または他の化学物質生産のためのバクテリア株を合理的に設計するために有用である遺伝子修飾の一覧に付加することができ、そして、それにより、望ましい表現型を有する株を選択することにおける代謝的進化のプロセスについての必要性を除去することができる。

本明細書の開示において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の株によってコハク酸塩を生産することに関係する特定の例が与えられる。しかしながら、本発明において発見される原理は、広い適用性を有しており、そのため、特定の例の言及は、広い含意をいかなる方法においても限定するために使用されるべきではない。例えば、特定の遺伝子における特定のタイプの変異が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるコハク酸塩生合成に有用であるという発見は、過度の実験なしに、他のバクテリアおよび他の生物に適用することができる。いったん関心のある遺伝子における変異が同定されると、類似の変異、または同一の機能または目的を達成する変異が、幅広い種類の生物に導入することができる。

例えば、本発明は、高度に発達した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の生産株の文脈において、ピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子の発現における減少が、コハク酸塩生産に有用であることを開示する。他の生物におけるピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子を同定すること、およびコハク酸塩生産を改良するために、欠失または他の変異によって新生物における遺伝子のそのものの発現を減少させることは現在容易である。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、セラシア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ属のバクテリアなどの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の近親については、関連性がある遺伝子が、ＧｅｎＢａｎｋまたはＤＮＡまたはタンパク質配列の他の公的なデータベースを通じた相同性検索によって容易に見出すことができる。何がホモログであり、またはそうでないかを定義するために使用することができるはっきりとした境界はないけれども、クエリー配列の「ホモログ」は、進化的にクエリー配列に関するＤＮＡ配列であり、そして、通常は、１）長さが５０またはそれを超える塩基である配列、または該配列の部分がクエリー配列と５０％またはそれを超える同一性の一致を有する遺伝子またはＤＮＡ配列として見出されることができ、ＧｅｎＢａｎｋを通じて入手可能であるＢＬＡＳＴＮプログラムを用いた欠失および挿入、および初期設定パラメーターを選ぶこと（「説明」、「グラフィカル概説」、および「アラインメント」を設定すること、フォーマット要求形態において１０００またはそれを超えるものに設定することは、１０の初期設定からより大きい数に「期待された」数を増大するように、より大きな数のホモログを生み出すであろう）が可能となり、または２）長さが２５またはそれより多いアミノ酸であり、そしてクエリー配列に対して２５％もしくはそれより高い同一性、または５０％またはそれを超える類似性を有するタンパク質配列、またはタンパク質配列の部分として見出されることができ、ＧｅｎＢａｎｋを通じて入手可能なＢＬＡＳＴＰプログラムの初期設定パラメーターを用いた欠失および挿入が可能となる。相同性検索を行うためにＧｅｎＢａｎｋデータベースおよび様々なＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合、クエリーの最近縁のゲノムを選択しない（または除外する）ことが時に必要である。例えば、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属のメンバーの多数のゲノムは、相同性ヒット一覧においてＫｌｅｂｓｉｅｌｌａなどのより遠縁において存在する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クエリーのホモログを締め出すことができるが、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）のメンバーのゲノムを除外することは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ「ヒット」が見出されることを可能にする。より少ない関連性の生物については、関連性がある遺伝子は、ホモログではないかもしれず、またはＤＮＡまたはタンパク質配列相同性によっては同定することができないかもしれないが、遺伝子は、いまだキーワード検索によって見出すことができる。例えば、検索においてキーワードとして「サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）」および「ピルビン酸キナーゼ」を用いてＧｅｎＢａｎｋを検索することによって、ピルビン酸キナーゼをコードするサッカロミセスセレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）遺伝子を見出すことは容易である。このような検索が行われ、そして、ともにピルビン酸キナーゼをコードするＣＤＣ１９（ＰＹＫ１としても知られる）およびＰＹＫ２の２つの遺伝子が見出された。

つまり、この発明は、代謝的進化の労働集約型のプロセスを通ずることなく望ましい表現型を産業上有用な微生物に与える新規遺伝子変異を同定するための減法的なまたは付加的なゲノム分析を提供する。このようにして、産業上の微生物生物は、完全に合理的な設計を用いて構築することができる。この開示は、微生物を用いた有機酸の生産、より具体的には、生体触媒を用いたコハク酸の生産を詳細に説明するけれども、産業的微生物学の技術分野における当業者は、本明細書に開示された方法を幅広い種類の微生物生体触媒を用いた他の産業上の化学物質の生産力を改良するために適用することができるであろう。

実験的セクション
一般的注釈
株、培地、および増殖条件
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ（ＡＴＣＣ ８７３９）の新たな派生物が、増殖ベースの選択とともに遺伝子欠失の固有の組み合わせを用いたコハク酸塩生産のために開発された。

本発明の微生物は、微生物学の技術分野においてよく知られた多数の異なる培養培地において増殖させることができる。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の野生型および変異体株は、１％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母抽出物、および０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地において増殖する。遺伝学的に修飾された微生物を生体触媒にする発酵性プロセスを用いた有機酸の商業的生産のためには、炭素源供給源を補った最小無機塩培地が、好ましい。ＬＢ培地のような富栄養培地とは対照的に最小無機塩培地の使用は、商業的スケールにおける有機酸の生産のためのコストを下げる。

本発明に適している最小無機物培地は、ＮＢＳ培地（Ｃａｕｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００７）およびＡＭ１培地（Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００７）を含む。ＮＢＳ培地は、１ｍＭベタイン、２５．７２ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、２８．７１ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４、２６．５０ｍＭ （ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、１ｍＭ ＭｇＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、０．１ｍＭ ＣａＣｌ_２．２Ｈ_２０、０．１５ｍＭ チアミンＨＣｌ、５．９２ μＭ ＦｅＣｌ_３６Ｈ_２０、０．８４μＭ ＣＯＣｌ_２．６Ｈ_２Ｏ、０．５９μＭ ＣｕＣｌ_２、２Ｈ_２Ｏ、１．４７μＭ ＺｎＣｌ_２、０．８３μＭ Ｎａ_２ＭｏＯ_４ ２Ｈ_２Ｏ、および０．８１μＭ Ｈ_３ＢＯ_３を含有する。ＡＭ１培地は、１ｍＭ ベタイン、１９．９２ｍＭ （ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、７．５６ｍＭ ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４、１．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、１．０ｍＭ ベタイン−ＫＣｌ、８．８８μＭ ＦｅＣｌ_３６Ｈ_２０、１，２６μＭ ＣＯＣｌ_２．６Ｈ_２Ｏ、０．８８μＭ ＣｕＣｌ_２．２Ｈ_２Ｏ、２．２０μＭ ＺｎＣｌ_２、１．２４μＭ Ｎａ_２ＭｏＯ_４２Ｈ_２Ｏ、１．２１μＭ Ｈ_３ＢＯ_３、および２，５０μＭ ＭｎＣｌ_２４Ｈ_２Ｏを含有する。微量元素は、１０００Ｘストックとして調製され、そして、次の成分が含められる：１．６ｇ／Ｌ ＦｅＣｌ_３、０．２ｇ／Ｌ ＣｏＣｌ_２６Ｈ_２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ ＣｕＣｌ_２、０．２ｇ／Ｌ ＺｎＣｌ_２４Ｈ_２Ｏ、０．２ｇ／Ｌ ＮａＭｏＯ_４、０．０５ｇ／Ｌ Ｈ_３ＢＯ_３、および０．３３ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ_２４Ｈ_２Ｏ。

有機酸の微生物生産のための無機物培地は、炭素源供給源が補われる。本発明に有用である炭素源供給源は、キシロースのようなペントース糖、グルコース、フルクトース、およびガラクトースのようなヘキソース糖、またはスクロースおよびマルトースのような二糖を含むが、それらに限定されない。炭素源供給源は、グルコースおよびキシロースの組み合わせなどの異なる糖の組み合わせを提供することによっても満足させることができる。炭素源供給源は、でんぷんまたはリグノセルロースの加水分解に由来することもできる。でんぷんおよびリグノセルロースなどの複合体炭水化物の加水分解は、熱−化学物質変質プロセスを用いること、または本技術分野においてよく知られている酵素的方法を用いることのいずれかによって、達成することができる。微生物発酵を用いた有機酸の産業上の生産のための好ましい炭素源供給源は、農業または林業廃棄物の加水分解に由来するリグノセルロース加水分解物である。リグノセルロース加水分解物は、ヘキソース−濃縮およびペントース−濃縮分画を産出するためにさらに分画化してよく、そして、それらの分画は、微生物発酵プロセスを用いた有機酸の商業的生産のための炭素の供給源として役立つことができる。上記のある濃度で多数の微生物に毒性であると見出されるフルフラールなどの特定の化学物質を除去するために、リグノセルロース加水分解物はさらに解毒することができる。

株構築の間、培養物は、２％（ｗ／ｖ）グルコースまたは５％（ｗ／ｖ）アラビノースを含有するルリア（Ｌｕｒｉａ）ブロス（ｂｒｏｔｈ）（１０ｇｌ^−１ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）トリプトン、５ｇｌ^−１ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）酵母抽出物および５ｇｌ^−１ＮａＣｌ）において３０、３７、または３９℃で好気的に増殖させられた。抗生物質耐性をコードする遺伝子、プラスミド、または外来性遺伝子はコハク酸塩生産のために開発された最終株には存在しない。しかしながら、異なる株の構築の初期段階の間、様々な抗生物質耐性マーカーが使用された。抗生物質選択プロセスに必要とされるアンピシリン（５０ｍｇｌ^−１）、カナマイシン（５０ｍｇｌ^−１）、またはクロラムフェニコール（４０ｍｇｌ^−１）などの抗生物質が、添加された。

種培養物および発酵物を、グルコース、１００ｍＭ ＫＨＣＯ_３、および１ｍＭ ベタインＨＣｌを含有するＮＢＳまたはＡＭ１無機塩培地において３７℃、１００ｒｐｍで増殖させた。いくつかの実験においてコーンスティープリカーを使用した。それは、コーン湿潤製粉工業からの副産物である。酵母抽出物およびペプトンと比較すると、それは、ビタミンおよび微量元素の安価な供給源である。

特に言及がない場合、発酵性コハク酸塩生産のためには、株は、３７℃で抗生物質を用いずに１０％（ｗ／ｖ）グルコースおよび１００ｍＭカリウム重炭酸塩を補ったＮＢＳ無機塩培地（Ｃａｕｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００４）において増殖させた。発酵のための前−接種材料は、新鮮コロニーを２５０ｍｌフラスコ（１００ｍｌ ＮＢＳ培地、２％グルコース）に移動することによって増殖させた。１６時間（３７℃、１２０ｒｐｍ）後、この培養物は、０．０３３ｇ細胞乾燥重量（ＣＤＷ）ｌ^−１の接種材料を提供するために、３００ｍｌ ＮＢＳ培地（１０％グルコース、１００ｍＭカリウム重炭酸塩）を含有する小発酵器に希釈した。

増殖培地における有機酸の蓄積は、培地のｐＨを低下させる傾向があるので、培養培地に必要とされるような適切な中和剤を添加することが必要である。培養器のｐＨは、ｐＨプローブを用いて連続的に観測することができ、そして、増殖培地のｐＨをおおよそ中性ｐＨに維持するために適切な塩基は、添加することができる。微生物培養物のｐＨを維持することに適した塩基は、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＮＨ_４ＳＯ_４、Ｎａ_２ＣＯ_３、ＮａＨＣＯ_３、およびＮＨ_４ＣＯ_３を含むが、それらに限定されない。この目的に適した塩基は、単独でまたは組み合わせて使用することができる。

ある実験において、発酵物は、付加的なＣＯ_２（１．２Ｍカリウム水酸化物中の２．４Ｍカリウム炭酸塩）を含有する塩基を添加することによって、ｐＨ７．０に自動的に維持された。次に、ｐＨは、３Ｍ Ｋ_２ＣＯ_３および６Ｎ ＫＯＨの１：１混合物を添加することによって維持された。発酵器は、サンプル除去のための排出口として役立つ１６ゲージ針を除き密封した。嫌気は、ＣＯ_２の大気を確実にするために役立つ添加された重炭酸塩で増殖の間に迅速に達成された。

細胞増殖： 細胞集団は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ ２０ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて５５０ｎｍ（ＯＤ_５５０）での光学密度を測定することによって推定された。

有機酸および糖分析： 様々な有機酸および糖の濃度が、ＨＰＬＣによって測定された。発酵ブロスに存在するコハク酸および他の有機酸が、ＢｉｏＲａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈ カラムを有するＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣ装置上で分析された。ＢｉｏＲａｄ Ｍｉｃｒｏｇｕａｒｄ Ｃａｔｉｏｎ Ｈ^＋が、保護カラムとして使用された。ＨＰＬＣ分析のための標準は、０．００８Ｎ硫酸において調製された。ＨＰＬＣカラム温度は、５０℃に維持された。０．００８Ｎ濃度での硫酸が０．６ｍｌ／分の流動比率での移動相として使用された。様々な成分の定量化は、２１０ｎｍでのその吸光を測定することによって行われた。

実施例
実施例１ ＫＪ１２２および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ野生型（ＡＴＣＣ ８７３９）のゲノム配列の比較
ＫＪ１２２株は、一連の遺伝学的操作、および多くの数または段の代謝的進化を通じて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ株に由来した。ＫＪ１２２株の構築の詳細は、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ／２００８／１５９５８号、およびＷＯ／２０１０／１１５０６７号において提供され、それれは、参照によって本明細書に組み込まれる。Ｊａｎｔａｍａ ｅｔ ａｌによる２つの科学的出版物（２００８ａおよび２００８ｂ）、ならびにＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌによる２つの科学的出版物（２００９ａ；２００９ｂ）も、ＫＪ１２２株の構築を説明する。これら科学的出版物の両方が、参照によって本明細書に組み込まれる。株ＫＪ１２２は、株指定番号数Ｂ−５０１１５として、２００８年２月２０日にＵＳＤＡ-ＡＲＳ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託された。

ＫＪ１２２のゲノムの配列およびは、タフツ（Ｔｕｆｔｓ）大学コア施設（Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）でのイルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）シーケンシングシステムを用いて得られ、そして、該配列は、ＧｅｎＢａｎｋから入手可能である（アクセス番号ＣＰ０００９４６）注釈付きの野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ配列と比較された。この比較ゲノム分析から、これら２つの株の間の多数の遺伝学的相違が検出された。この開示において、オープンリーディングフレームにおいて生じる変異の位置は、オープンリーディングフレームの開始コドンの第一の塩基（上で参照したＧｅｎＢａｎｋ配列において注釈される）を、塩基数１として数えるヌクレオチド塩基の数に基づく座標を用いて与えられるであろう。ＫＪ１２２および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃの間の遺伝学的相違の一覧から、ＫＪ１２２を構築するにあたっての様々な段階で意図的に導入された欠失が検証され、そして、代謝的進化のプロセスの間で生じる遺伝学的変更の付加的一覧が同定された。代謝的進化のプロセスの間でＫＪ１２２のゲノムにおいて固定された変異の一覧に含まれたものは、
１） ２つのピルビン酸キナーゼの１つをコードするｐｙｋＡ（配列番号１）におけるフレームシフト変異、
２） 糖輸送体遺伝子ｇａｌＰなどのガラクトース誘導性遺伝子のリプレッサーをコードするｇａｌＳ遺伝子（配列番号２）におけるフレームシフト変異、
３） 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣゲノムのｙｄｃＣからｙｄｃＦまでを含む多くの遺伝子を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムの領域の４８キロ塩基欠失（配列番号３）、
４） ＲＮＡポリメラーゼのサブユニットをコードするｒｐｏＡ遺伝子のＣ−末端ドメインにおける点ミスセンス変異（配列番号４）、
５） ＲＮＡポリメラーゼの異なるサブユニットをコードするｒｐｏＣ遺伝子のＦ領域における点ミスセンス変異（配列番号５）、
６） グリセロールデヒドロゲナーゼをコードするｇｌｄＡ遺伝子におけるフレームシフト変異（配列番号６）、
７） ＰＥＰ−依存性ジヒドロキシアセトンキナーゼのサブユニットをコードするｄｈａＭ遺伝子におけるフレームシフト変異（配列番号７）、および
８） 細胞壁合成および細胞形状にかかわる遺伝子をコードするｆｔｓＩ遺伝子におけるミスセンス点変異（配列番号８）、
であった。

実施例２
ＫＪ１２２における変異ｐｙｋＡ遺伝子の回復
野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および多くの他のバクテリアがグルコース含有培地において増殖する場合、細胞の内部でのピルビン酸塩生産は、結果的に生じるピルビン酸塩の分子の形成とともにグルコースを輸送およびホスホリル化するためにホスホエノールピルビン酸塩（ＰＥＰ）の分子を使用するホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）の作用を通じて生じる。ピルビン酸塩形成は、ｐｙｋＡおよび／またはｐｙｋＦ遺伝子によってコードされるピルビン酸キナーゼ酵素の作用から生じることもできる。ＰｙｋＡおよびＰｙｋＦタンパク質は、アイソザイムである。グルコースが炭素の供給源である場合、両方のピルビン酸キナーゼアイソザイムは、ピルビン酸塩生合成における積極的役割を有する。しかしながら、３つの変異体ｐｔｓ、ｐｙｋＡおよびｐｙｋＦは、唯一の炭素源供給源としてのグルコース上で増殖することができない。というのは、ピルビン酸塩を形成する細胞の能力が存在しない、または非常に減少しているからである（Ｐｏｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。

ＫＪ１２２は、ＰＴＳの成分であるタンパク質ＰｔｓＩをコードするｐｔｓＩにおいて変異を含有するので（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９ａ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９ｂ）、代謝的進化の間でＫＪ１２２においてｐｙｋＡ遺伝子も変異したという観察は、期待されなかった。この変異がコハク酸生産に貢献するかどうかを決定するために、野生型ｐｙｋＡ対立遺伝子がＫＪ１２２に導入され、新株ＷＧ８５ａが与えられ、そして、コハク酸生産に対するこの変異の効果の観点から、表現型の変更が評価された。ＷＧ８５ａは、上記の２工程遺伝子交換方法を用いる２工程において構築された。第一の工程において、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットが、株ＫＪ１２２のｐｙｋＡ遺伝子座に導入され、株ＷＧ８４が得られた。使用されたＰＣＲプライマーは、配列番号２１および２２であった（表１参照）。第二の工程において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃからの野生型ｐｙｋＡ遺伝子がＷＧ８４に導入され、株ＷＧ８５ａが得られた。使用したＰＣＲプライマーは、配列番号２３および２４であった（表１参照）。ＫＪ１２２についての約５５０ｍＭと比較して、ＷＧ８５ａは、約１６０ｍＭのコハク酸塩を生産した。明らかに、ＫＪ１２２におけるｐｙｋＡ変異は、コハク酸塩生産に重要である。ＫＪ１２２におけるｐｙｋＡ変異は、フレームシフトであるので、ｐｙｋＡの欠失を含有する株が同様に機能するものと推論することができる。中間体株ＷＧ８４は、ｐｙｋＡオープンリーディングフレームの完全な欠失を含有し、そして、予測されたように、ＷＧ８４は、５４０ｍＭのコハク酸塩力価でＫＪ１２２と同様に機能し、ＫＪ１２２におけるフレームシフト変異がヌル変異に類似することが示された。この発見が得られたので、次に、発明者は、低下したレベルのピルビン酸キナーゼ活性がＫＪ１２２にとって重要であり、そして、この状態は、関連する取り組みのいずれか１つによって達成することができたと推論することができた。例えば、ＫＪ１２２におけるｐｔｓＩ＊活性は、さらに低下し、または除去することができた、ＰｙｋＦ活性は、縮小または除去することができた、またはＰｙｋＡ、ＰｙｋＦ、および／またはＰｔｓＩの減少した活性の組み合わせが、コハク酸塩生産にとって重要であることが現在知られている総ピルビン酸キナーゼ活性における低下を確立するために使用することができた。

第二のピルビン酸キナーゼ遺伝子であるｐｙｋＦにおける欠失がｐｙｋＡにおける欠失と置換することができたかどうかを決定するために、ｐｙｋＦにおける欠失が株ＷＧ８５ａに導入され、株ＷＧ８９が得られた。これは、２工程遺伝子交換方法を用いて達成された。第一の工程については、ｋａｎ−ｓａｃＢカセットが、ＷＧ８５ａのｐｙｋＦ伝子座に導入され、株ＷＧ８７が得られた。使用されたプライマーは、配列番号３６および３７であった（表１参照）。第二の工程については、ｐｙｋＦオープンリーディングフレームの欠失がＷＧ８７に導入され、新株ＷＧ８９が得られた。使用されたＰＣＲプライマーは、配列番号３８および３９であり（表１参照）、そして、テンプレートはｐＧＷ１９１（配列番号３５）であった。小スケール発酵槽において、ＷＧ８９は、より不十分に増殖して、そして、ＫＪ１２２についての５１０ｍＭと比較して、１１５ｍＭコハク酸塩のみを生産した。このように、ｐｙｋＦの欠失は、コハク酸塩生産を改良するためには、ｐｙｋＡの欠失またはフレームシフトの代わりになることができない。ＷＧ８９およびＷＧ８５ａは、異なる実験において試験されたけれども、ＷＧ８９は、ＷＧ８５ａよりも不十分に行うようであり、このことは、ＫＪ１２２における増殖およびコハク酸塩生産にとってのピルビン酸キナーゼの最適レベルがあるが、ｐｙｋＦの欠失が良好なコハク酸塩生産にとって最適ではない総ピルビン酸キナーゼ活性のレベルをもたらすことを示す。このように、代謝的進化は、最適レベルに近いピルビン酸キナーゼのレベルを有する株を生産した。さらに、米国特許出願公開２００９／００７５３５２およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ（２００５）に示唆されるように、ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、および１または複数のｐｔｓ遺伝子）をコードする全ての遺伝子の欠失は、コハク酸塩生産を改良しないであろう。というのは、総ピルビン酸キナーゼ活性は、このような株において低すぎるであろうからである。本発明によって、新株における、例えば、サッカロミセスセレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における、新しいコハク酸塩生産株を構築する場合、無用の経路をブロックした後、総ピルビン酸キナーゼのレベルは、コハク酸塩生産の良好な効率を与えるように調節されるであろう。このことは、例えば、非必須ピルビン酸キナーゼ遺伝子であるＰＹＫ２を欠失させること、そして、残っているＰＹＫ１の発現または活性のレベルを変化させることによって、ＰＹＫ１の前に様々な長さのプロモーターを導入することによって、またはＰＹＫ１オープンリーディングフレームの５’末端または３’末端から進行性欠失を作ること、および改良されたコハク酸塩生産について試験することによって、達成することができる。

実施例３
ＸＺ７２２におけるｇａｌＳの変異
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ株およびＫＪ１２２株の間の比較ゲノム配列分析は、ｇａｌＳ遺伝子におけるフレームシフト変異を明らかにした。この遺伝子は、ガラクトースパーミアーゼであるＧａｌＰをコードするｇａｌＰ遺伝子の発現を抑制することが知られている。ＧａｌＰタンパク質は、ＰＴＳの成分であるＰｔｓＩタンパク質をコードするｐｔｓＩが変異しているＫＪ１２２株の場合のように、グルコース輸送のための完全に機能的なホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）の不存在に少なくとも部分的に関与することが報告されている（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ ２００９ａ）。このように、ＫＪ１２２におけるｇａｌＳ変異は、グルコース取り込みに関するいくつかの機能的意義、またはコハク酸生産の比率に対するいくつかの他の効果を有する可能性がある。このことは、ｇａｌＳのＫＪ１２２対立遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＸＺ７２２（ΔｐｆｌＢ、ｐｔｓＩ＊、ｐｃｋ＊）に移動して、新株ＷＧ８６ａを与えること、およびこの株におけるコハク酸生産の比率に対する変異の効果を評価することによって試験される。ＷＧ８６ａは、上で説明した２工程遺伝子交換方法を用いる２工程において構築された。第一の工程において、ｋａｎ−ｓａｃＢカセットは、株ＸＺ７２２のｇａｌＳ遺伝子座に導入され、株ＷＧ８３が得られた。使用されたＰＣＲプライマーは、配列番号１７および１８であった（表１参照）。第二の工程において、ＫＪ１２２遺伝子からのｇａｌｓのフレームシフトした対立遺伝子が導入され、株ＷＧ８６ａが得られた。使用されたＰＣＲプライマーは、配列番号１９および２０であった（表１参照）。小スケール発酵槽において、ＸＺ７２２からのコハク酸塩力価は、１７５ｍＭであったが、他方、ＷＧ８６ａのものは、２１０ｍＭであり、ｇａｌＳ変異は、改良されたコハク酸塩生産に貢献することができることを提供する。ｇａｌＳ変異は、フレームシフトであり、そのため、ｇａｌｓにおける欠失が、同様に振舞うであろうが、より遺伝学的に安定であろうと推論することができる。中間体株ＷＧ８３は、ｇａｌＳオープンリーディングフレームの欠失を含有し、そして、それは、ＷＧ８６ａと同様に振る舞い、２２０ｍＭコハク酸塩を生産する。加えて、発明者らは、ｇａｌＰ発現の異なるリプレッサーをコードすることが知られているｇａｌＲ遺伝子を変異させることも、グルコースを移入する細胞の能力を増大させることによって、コハク酸生産を増進するであろうと推論することができる。さらに、発明者らは、ｇａｌＰ遺伝子のコピー数における増大は、類似の効果を有し、そして、コハク酸塩生産の効率を増大させるためのいまだ別の取り組みを提示するであろうと推論することができる。ｇａｌＰ遺伝子、ならびに調節部位とともに、またはそれなしでプロモーターおよびターミネーターを含有する隣接上流および下流ＤＮＡは、ＰＣＲによって増幅し、そして、コハク酸塩生産大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の染色体のネイティブのｇａｌＰ遺伝子座から遠位である１または複数の部位に導入し、ｇａｌＰ遺伝子の１を超えるコピーを含有する株を得ることができる。結果として生じる株は、より高いレベルのＧａｌＰタンパク質を有するおかげで、コハク酸生産について増進するであろう（実施例１１参照）。

実施例４
染色体ＤＮＡからの４８ｋｂｐ領域の欠失
ＫＪ１２２および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ株の間の比較ゲノム配列分析は、代謝的進化のプロセスの間でのＫＪ１２２におけるゲノムの遺伝子ｙｄｃＣからｙｄｃＦを含む４８キロ塩基領域の欠失を明らかにした。この欠失は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ ８７３９のヌクレオチド座標２，４１６，１０８および２，４６４，２８４の間の配列（両方のヌクレオチドを含む）に対応する。この遺伝子欠失の機能的意義、およびコハク酸生産に対するその影響は、ＫＪ１２２に４８キロ塩基配列を再導入し、株ＷＧ１１０を得ることによって評価される。このことは、遺伝子交換方法およびＰ１ ｖｉｒ形質導入の組み合わせを用いる２工程において達成される。第一の工程については、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットは、ＫＪ１２２の欠失末端点の間に導入され、株ＷＧ５１が得られた。使用されるＰＣＲプライマーは、配列番号３１および３２であった（表１参照）。第二の工程において、ＷＧ５１は、宿主としての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣとともにＰ１ ｖｉｒを用いてスクロース耐性およびクロラムフェニコール感受性に形質導入され、ＫＪ１２２株バックグラウンドにおいてそのネイティブの遺伝子座に復帰した現在４８キロ塩基配列を有する新株ＷＧ１１０が得られる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の株の特定の領域の欠失は、米国特許出願公開２００９／００７５３３３および２００８／０００９０４１において説明される方法を用いて達成することができる。ＫＪ１２２の特定の４８キロ塩基欠失は、（１）ＷＧ５１から受容株に形質導入すること、クロラムフェニコール耐性について選択すること、および（２）ＫＪ１２２から工程１において構築された株に形質導入すること、スクロース耐性について選択すること、およびクロラムフェニコール感受性についてスクリーニングすることによる２工程において他の受容大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に導入することができる。

明白に、４８キロ塩基欠失下に含まれる遺伝子は、最小グルコース培地における増殖に、またはコハク酸生産に必須ではない。４８ｋｂ欠失の利点は、結果として生じる染色体がわずかに短いことであり、このことは、増殖の比率においてわずか増大を与えるであろう。さらに、少なくとも欠失下に４つの遺伝子があり、これは、単独で欠失させた場合、最小グルコース培地における増殖で密度がより高くなる。ケイオウ（Ｋｅｉｏ）欠失コレクションの株ＪＷ５２２６、ＪＷ１４２７、ＪＷ５２２９、およびＪＷ１４３８は、それぞれ遺伝子ｙｄｃＩ、ｙｄｃＬ、ｙｄｃＯ、およびｙｄｃＶにおける欠失を含有するが、全て、最小グルコース培地において４８時間で顕著に高いＯＤ６００に増殖する（Ｂａｂａ， Ｔ． ｅｔ． ａｌ（２００６）における補足表３参照）。

実施例５
ＫＪ１２２における変異したｒｐｏＡ遺伝子の回復
バクテリアＲＮＡポリメラーゼのコア酵素は、化学量論α_２ββ’ωでアルファ（α）、ベータ（β）、ベータ’（β’）、およびオメガ（ω）の４つの異なるポリペプチドサブユニットを含有する。ＲＮＡポリメラーゼのアルファサブユニットは、ｒｐｏＡ遺伝子によってコードされる。このサブユニットは、酵素の会合に必要であり、そして、それは、いくつかの調節タンパク質と相互作用する。ＫＪ１２２および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ株の間の比較ゲノム配列分析は、ｒｐｏＡ遺伝子におけるミスセンス点変異を明らかにした。より具体的には、この変異は、ＲＮＡポリメラーゼアルファサブユニットＣ−末端ドメイン（α−ＣＴＤ）におけるアミノ酸位置３２２に位置する。野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ株におけるプロリン残基は、ＫＪ１２２株においてロイシン残基に変質した。

アラニンにプロリン３２２を変更する異なる変異は、ｍｅｔＥ遺伝子の発現に対して負の効果を有するとして、以前に説明されてきた（Ｆｒｉｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０００）。別の報告において、ＲｐｏＡタンパク質におけるこの位置でのアラニンへのプロリンの変異は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてｒｈａＳプロモーターのサイクリックＡＭＰ受容体タンパク質（ＣＲＰ）活性化を低下させることが見出された（Ｈｏｌｃｒｏｆｔ ａｎｄ Ｅｇａｎ，２０００）。ＫＪ１２２のＲｐｏＡタンパク質におけるプロリンのロイシンへの点変異の効果は、ｒｐｏＡ変異の野生型対立遺伝子をＫＪ１２２に移動して、新株ＲＹ８５９Ａ１を得ること、およびコハク酸生産に対するこの変異の効果を測定することによって評価された。ＲＹ８５９Ａ１は、Ｐ１ ｖｉｒ形質導入を用いる２工程において構築された。第一に、連鎖ａｒｏＥ：：ｋａｎ対立遺伝子が、宿主としてのケイオウ（Ｋｅｉｏ）欠失コレクション（Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡから入手可能）からＪＷ３２４２を用いて、そして、カナマイシン耐性について選択して、ＫＪ１２２に形質導入された。第二の工程については、野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃが宿主として使用され、そして、選択は、最小グルコース培地上での増殖について行った。ＲＹ８５９Ａ１のｒｐｏＡ遺伝子の配列が測定され、そして、野生型であることが示された。小スケール発酵槽中４８時間で、ＲＹ８５９Ａ１は、３７０ｍＭでコハク酸塩を生産したが、これは、３８５ｍＭを生産したＫＪ１２２よりわずかに少ない。発酵は、２通り行われ、そして、再現性があった。

実施例６
ＫＪ１２２における変異したｒｐｏＣ遺伝子の回復
ＫＪ１２２および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ株の間の比較ゲノム配列分析は、ｒｐｏＣ遺伝子によってコードされるＲＮＡポリメラーゼのβ’サブユニットのＦ領域におけるミスセンス点変異を明らかにした。ＲｐｏＣタンパク質は、ＲＮＡ合成の間、ＤＮＡテンプレートに結合する。位置７４７におけるメチオニン残基は、ＫＪ１２２においてイソロイシンに交換された。ＫＪ１２２のＲｐｏＣタンパク質におけるこの点変異の効果は、ｒｐｏＣ変異の野生型対立遺伝子をＫＪ１２２に移動して、新株ＲＹ８６２Ａを得ること、およびコハク酸生産に対するこの変異の効果を測定することによって評価された。ＲＹ８６２Ａは、Ｐ１ ｖｉｒ形質導入を用いて構築された。連鎖ｔｈｉＧ：：ｋａｎ対立遺伝子は、宿主としてケイオウ（Ｋｅｉｏ）欠失コレクション（Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡから入手可能）からのＪＷ５５４９を用いて、そしてカナマイシン耐性について選択してＫＪ１２２に形質導入された。ＲＹ８６２ＡのｒｐｏＣ遺伝子の配列は、測定され、そして、野生型であることが示された。５ｍｇ／リットルでのチアミンＨＣｌが、ＲＹ８６２Ａの増殖を確実にするために、ＲＹ８６２Ａおよび対照ＫＪ１２２のための発酵培地に添加された。小スケール発酵槽において４８時間で、ＲＹ８６２Ａのコハク酸塩力価は、３２０ｍＭであり、ＫＪ１２２の力価４２５ｍＭよりも顕著に小さかった。ＲＹ８６２Ａの初期の増殖比率も、０．２３ ＯＤ５５０／時間であるＫＪ１２２の比率と比較して遅く、０．１５ ＯＤ５５０／時間であった。発酵は、２通りについて行われ、再現性があった。

実施例７
ＫＪ１２２における変異したｇｌｄＡ遺伝子の回復
ＮＡＤ^＋−依存性グリセロールデヒドロゲナーゼは、ｇｌｄＡ遺伝子によってコードされる。ＧｌｄＡタンパク質は、グリセロールのジヒドロキシアセトンへの可逆的酸化を触媒し、そして、Ｒ−ラクトアルデヒドへのメチルグリオキサルの還元を触媒することもできる。比較ゲノム配列分析は、ＫＪ１２２におけるｇｌｄＡ遺伝子がフレームシフト変異を含有することを明らかにした。コハク酸生産に対する変異した形態のｇｌｄＡ遺伝子の影響は、上で説明した２工程遺伝子交換方法を用いて野生型ｇｌｄＡ遺伝子をＫＪ１２２に導入して、新株ＡＣ６を得ることによって評価された。第一の工程において、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットが、株ＫＪ１２２のｇｌｄＡ遺伝子座に導入され、株ＡＣ５が得られた。使用したＰＣＲプライマーは、配列番号９および１０であった（表１参照）。第二の工程において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃからの野生型ｇｌｄＡ遺伝子が、ＡＣ５に導入され、株ＡＣ６が得られた。使用したＰＣＲプライマーは、配列番号１３および１４であった（表１参照）。小スケール発酵槽において、９６時間で、ＡＣ６のコハク酸塩力価は、５８０ｍＭであり、５３０ｍＭであるＫＪ１２２の力価よりもわずかに高かった。しかしながら、ＡＣ６の初期増殖比率は、０．１６ ＯＤ５５０／時間であり、０．２０ ＯＤ５５０／時間であるＫＪ１２２の力価よりわずかに遅かった。このように変異したｇｌｄＡは、ＫＪ１２２の代謝的進化の間で選択されるであろうわずかな増殖の利点を与える。

実施例８
ＫＪ１２２における変異したｄｈａＭ遺伝子の回復
ジヒドロキシアセトンキナーゼは、１つのオペロンにおける３つの遺伝子ｄｈａＫＬＭによってコードされるホスホトランスフェラーゼ（ＰＴＳ）系に関するマルチサブユニットタンパク質である。ＤｈａＭサブユニットは、マンノース輸送体のＩＩＡドメイン、ホスホリル担体タンパク質Ｈｐｒ、および酵素１のＮ−末端ドメインに対して配列類似性を有する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、ＤｈａＭは、ジヒドロキシアセトンのホスホリル化におけるリン酸のための供与体として、ＡＴＰの代わりにＰＥＰを使用する。ＤｈａＭは、酵素１およびホスホリル担体タンパク質ＨＰｒを通じたＰＥＰによってホスホリル化される。ＫＪ１２２のｄｈａＭ遺伝子は、フレームシフト変異を含有する。ＫＪ１２２におけるｄｈａＭ変異の効果を評価するために、野生型ｄｈａＭ遺伝子が上記の２工程遺伝子交換方法を用いてＫＪ１２２に導入され、新株ＡＣ２が得られた。第一の工程において、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットが株ＫＪ１２２のｄｈａＭ遺伝子座に導入され、株ＡＣ１が得られた。使用したＰＣＲプライマーは、配列番号１１および１２であった（表１参照）。第二の工程において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃからの野生型ｄｈａＭ遺伝子が、ＡＣ１に導入され、株ＡＣ２が得られた。使用したＰＣＲプライマーは、配列番号１５および１６であった（表１参照）。小スケール発酵槽において、９６時間で、ＡＣ２からのコハク酸塩の力価は、５６０ｍＭであり、５３０ｍＭであるＫＪ１２２の力価よりもわずかに高かった。しかしながら、ＡＣ６の初期増殖比率は、０．１６ ＯＧ５５０／時間であり、０．２０ ＯＤ５５０／時間であるＫＪ１２２の比率よりもわずかに遅かった。このように、ｄｈａＭを変異させることは、ＫＪ１２２の代謝的進化の間で選択されるであろうわずかな増殖利点を与える。ＤｈａＫＬＭは、コハク酸生合成のための基質であるＰＥＰを消費するので、ＰＥＰの保存は、ＫＪ１２２の増殖利点のためのメカニズムである。ｄｈａＫＬＭオペロンにおける遺伝子を変異させることに加えて、またはそれに代えて、任意の他のＰＴＳ−依存性ジヒドロキシアセトンキナーゼのサブユニットをコードする遺伝子も、コハク酸生産におけるその重要性を試験するために変異させることができる。

実施例９
ＫＪ１２２におけるｆｔｓＩ遺伝子におけるミスセンス変異の回復
ｆｔｓＩ遺伝子は、細胞壁合成および／または隔壁形成にかかわる必須タンパク質をコードする。ＫＪ１２２のｆｔｓＩ遺伝子は、コード配列の塩基６１９をＣからＴに変更するミスセンス変異を含有し、これは、アルギニン２０７をシステインに変更する。ＫＪ１２２のＦｔｓＩタンパク質におけるアルギニンのシステインへの点変異の効果は、ｆｔｓＩ変異の野生型対立遺伝子をＫＪ１２２に移動して新株ＲＹ８５８Ｇ１を得ること、およびコハク酸生産に対するこの変異の効果を測定することによって、評価された。ＦｔｓＩは、必須タンパク質であるので、２工程遺伝子交換方法は、働かないでろう。そのため、ＲＹ８５８Ｇ１を構築するかわりに２工程Ｐ１ ｖｉｒ形質導入が使用された。第一に、連鎖ｌｅｕＡ：：ｋａｎ対立遺伝子が、宿主としてケイオウ（Ｋｅｉｏ）欠失コレクション（Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ， ＣＴ， ＵＳＡから入手可能である）からＪＷ００７３を用いて、およびカナマイシン耐性について選択してＫＪ１２２に形質導入され、新株ＲＹ８５３Ｇ１が得られた。第二の工程について、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃが宿主として使用され、ＲＹ８５３Ｇ１が受容者であり、および選択は最小グルコース培地上での増殖について行われた。ＲＹ８５８Ｇ１のｆｔｓＩ遺伝子の配列が、測定され、そして、野生型であることが示された。小スケール発酵槽において、ＲＹ８５８Ｇ１は、ＫＪ１２２と約同一の初期比率で増殖したが、７２時間において、ＲＹ８５８Ｇ１は、４６０ｍＭを生産したＫＪ１２２よりもわずかに少ないコハク酸塩である４４０ｍＭを生産した。このように、ＫＪ１２２のｆｔｓＩ遺伝子におけるミスセンス変異は、コハク酸塩力価における増大にわずかに寄与する。

実施例１０
変異の組み合わせの付加的効果
上述の実施例で詳細に説明された株比較の結果は、表３において要約される。１つずつ試験された多くの変異は、コハク酸塩力価または増殖比率においてわずかな増大しか与えなかった。しかしながら、これらの増大は、その原種と比較してＫＪ１２２について見いだされた全般的な改良を与えるためには付加的および／または相乗的でなければならない（Ｊａｎｔａｍａ ｅｔ ａｌ．，２００８ａ；Ｊａｎｔａｍａ ｅｔ ａｌ ２００８ｂ）。例えば、野生型ｒｐｏＡ遺伝子を含有するＲＹ８５９Ａ１に野生型ｒｐｏＣ遺伝子を形質導入することによって構築された、ｒｐｏＡにおけるミスセンス変異、およびｒｐｏＣにおけるミスセンス変異の両方について回復したＫＪ１２２の派生物は、新株ＲＹ８６０Ａをもたらした。ＲＹ８６０Ａの構築は、受容株がＫＪ１２２の代わりにＲＹ８５９Ａ１であるほかは、実施例６において上で説明されたＲＹ８６２Ａと同一の方法において行われた。小スケール発酵槽において、チアミンＨＣｌを５ｍｇ／ｌで補って４８時間で、ＲＹ８６０Ａは、ＫＪ１２２（４２５ｍＭ）よりも顕著に少なく、そして、ｒｐｏＣ変異のみについて回復しているＲＹ８６２Ａ（３２０ｍＭ）よりも少ないコハク酸塩（３００ｍＭ）を生産した。

実施例１１
ナイーブ株からの新コハク酸塩生産体の構築
株ＴＧ１２８は、遺伝子型ΔｆｒｄＡＢＣＤ、ΔａｄｈＥ、ΔｐｆｌＢ、ΔｍｇｓＡ、およびΔａｃｋを有する、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｗ（ＡＴＣＣ ９６３７）に由来したＤ−乳酸塩生産体である。ＴＧ１２８は、２００５年７月２５日にＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１８１５ Ｎ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，６１６０４ Ｕ．Ｓ．Ａ．に寄託され、そして、株寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０９６２を有する。ＴＧ１２８は、そして、第一にスクロース上での増殖について、第二に３９℃での増殖について、および第三に４０℃での増殖について選択することによって代謝的に進化させた。結果として生じた株は、ＴＧ１６０と名付けられた。ＴＧ１６０は、次に、コハク酸生産株であるように再改変された。ＫＪ１２２からの対立遺伝子が、上で説明した２工程遺伝子交換方法を用いる次の時系列で導入された：ｐｃｋ＊、ΔｌｄｈＡ、ｆｒｄＡＢＣＤ^＋、およびｐｔｓＩ＊。ｐｃｋ＊およびｐｔｓＩ＊変異は、両方とも、ＫＪ１２２ゲノムにおいて見出され、そして、コハク酸生産の効率を増大することが示された変異であった（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９ａ）。結果として生じた株であるＷＧ３２ｂを、次に、約１２６世代間（２３移動）、小微好気性発酵槽において増殖させ、株ＷＧ３２ｂ−Ｔ２３が得られた。ＷＧ３２ｂ−Ｔ２３は、小スケール発酵槽において約２６０ｍＭコハク酸を作成する適度に良好なコハク酸生産体である。次に、本発明の発見に基づき、ＫＪ１２２のゲノムに、２つの付加的変異がＷＧ３２ｂ−Ｔ２３に付加された。第一に、ｇａｌＰ遺伝子の第二のコピーは、ネイティブのプロモーター、およびターミネーターを含有するフランキング配列とともに、２工程遺伝子交換方法を用いて、ゲノムにおいてｄｎａＡ遺伝子の近くの遺伝子座に組み入れられた。挿入部位におけるＤＮＡ配列は、
ａｔｔａａａｔｔｔｔｃｃａａｔａｔｇｃｇｇｃｇｔａａａｔｃｇｔｇｃｃｃｇｃｃｔｃｇｃｇｇｃａｇｇａｔｃｇｔｔｔａｃａｃｔｔａｇｃｇａｇｔｔｃｔｇｇａａａｇｔｃｃｔｇｔｇｇａｔａａａｔｃｇｇｇａａａａｔｃｔｇｔｇａｇａａａｃａｇａａｇａｔｃｔ−挿入部位−ｃｔｔｇｃｇｃａｇｔｔｔａｇｇｃｔａｔｇａｔｃｃｇｃｇｇｔｃｃｃｇａｔｃｇｔｔｔｔｇｃａｇｇａｔｃｔｔｇａｃｔｃｇｇｇｃａｔａｔａａｃｃｇｃａｇａｃａｇｃｇｇｔ
である。第一の工程において、ｋａｎ−ｓａｃＢカセットが、ｄｎａＡ遺伝子座に挿入され、株ＷＧ６２が得られた。使用されたＰＣＲプライマーは、配列番号２５および２６であった（表１参照）。第二の工程において、ｇａｌＰの第二のコピーが、ｄｎａＡ遺伝子座に導入された。使用されたＰＣＲプライマーは、配列番号２７および２８であった（表１参照）。ＷＧ７４と名づけられた結果として生じた株は、小スケール発酵において約３２０ｍＭコハク酸を生産した。第二に、ｐｙｋＡ遺伝子のオープンリーディングフレームの全体がＷＧ７４から欠失させられ、そして、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットに交換され、新株ＷＧ９６が得られた。使用されたＰＣＲプライマーは、配列番号２９および３０であった（表１参照）。小スケール発酵において、ＷＧ９６は、４５０ｍＭコハク酸を生産し、これは、前駆株ＷＧ３２ｂ−Ｔ２３およびＷＧ７４のものに対して明確な改良である。このように、発明者らは、ＫＪ１２２における変異の正確な特質を発見することが、異なる、より進化が少ない親株から、新しい、改良されたコハク酸生産株をいかにして構築するかについての固有の情報、および洞察を与えることを明確に確立した。さらに、本発明の発見は、広く適用可能である。例えば、ｇａｌＳ変異を知ることは、新株におけるＫＪ１２２において見出される同一の変異を導入することにのみでなく、ＧａｌＳ抑制の標的であるｇａｌＰ遺伝子を複製することにも適用することができる。別の例として、ｐｙｋＡ変異のことを知ることは、新株におけるＫＪ１２２において見出される同一の変異を導入することにのみでなく、ｐｙｋＡの欠失を導入することにも適用することができる。

本明細書において開示される本発明は、コハク酸以外の化学物質を生産するための株、およびプロセスを改良することに一般化することができる。提供される実施例は、例示的であり、限定的でないことが意図されている。

ＧａｌＰタンパク質は、細胞におおよそＡＴＰの１／３を負担させるプロトン共輸送メカニズムによって、グルコースおよび他の糖を移入する機能がある。移入の後、グルコースなどの糖は、ホスホリル化されることが必要であり、これは、総コストの約１．３３ＡＴＰについて、１つの付加的ＡＴＰを消費する。代謝的エネルギーに関して、これは、１つのＰＥＰが費やされるＰＴＳ系によってグルコースなどの糖を移入するよりもコストが少なく、これは約２ＡＴＰとエネルギー的に同等である。このように、ＧａｌＰによってグルコースなどの糖を移入することは、ＰＴＳを用いることによるよりも、より効率的である。

さらに、多くの発酵性プロセスにおいて、特に、しかし嫌気性および微好気性プロセスに限り、ＰＥＰは、リンゴ酸、フマル酸、アスパラギン酸塩、スレオニン、メチオニン、リジン、およびその他などの、コハク酸以外の化学物質の生合成のための中間体であることができる。このように、ＰＴＳの代わりにＧａｌＰを用いることによってＰＥＰを保存することによって、およびピルビン酸キナーゼ活性を低下させることによって、一般に、生合成の効率を改良することができる。

多くの発酵において、最小培地におけるより効率的な増殖が望ましく、そして、ＫＪ１２２に見出される４８ｋｂ欠失が、最小培地において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を用いる任意の発酵における効率の改良を助力するであろう。

ＫＪ１２２に見出されるｆｔｓＩ変異は、同じく体積に対するより高い表面積割合を導く、より小さい、またはより球状である細胞に導くことよって効率を改良するかもしれない。これは、今度は、グルコース、スクロース、マルトース、グリセロールなどの栄養素のより効率的な移入、およびコハク酸塩、リンゴ酸塩、マル酸塩、アスパラギン酸塩、スレオニン、メチオニン、リジンなどの生産物のより効率的な排出をもたらすであろう。

ｒｐｏＡおよびｒｐｏＣに見出される変異は、グルコースによる異化生成物抑制の一般的な喪失をもたらす。この抑止解除は、多くの場合において生合成の効率を増大させる。例えば、安価な糖の望ましい供給源であるバイオマス加水分解物は、通常、グルコースを含む糖の混合物を含有する。様々な他の糖がグルコースと同時に使用され、そして、異化生成物抑制の除去が非−グルコース糖をグルコースとともに効率的に摂取し、そして、代謝させる細胞の能力を増進させることが望ましい。さらに、異化生成物抑制の除去は、ｐｃｋ、ｇａｌＰ、ｍｄｈ、ｆｕｍＡ、ｘｙｌＥ、ｌａｃＺ、ｌａｃＹ、ｆｕｍＢ、およびｆｒｄＡＢＣＤなどの所望の遺伝子の発現を増大させる。このように、本発明のＲＮＡポリメラーゼ変異は、様々な商業的有用株および発酵プロセスに対する広い適用性を有する。

このように、本発明において発見された変異は、コハク酸生産を増大させることに有用であり、それらは、コハク酸生産または他の有機酸生産について以前に説明されてこなかった点において新規であり、そして、それらは、当業者が本発明の個々の変異、またはそれらの変異の組み合わせがコハク酸または他の有機酸生産を改良するであろうと予測することができなかった点において進歩性がある。

ＫＪ１２２のゲノム配列において発見されたいくつかの変異は、１つずつ変化した場合には増殖またはコハク酸生産に対してごくわずかな効果しか生み出さないけれども、増殖の比率における小ない増大でさえ、多くの世代にカバーされる期間としての代謝的進化の間に選択されるであろうことが強調されるべきである。さらに、それぞれの個々の変異が付加的にまたは相乗的に寄与するいくつかの変異の組み合わせは、増殖および／またはコハク酸生産の効率におけるずっと大きい増大を与えるであろう。

新しい第二の親株から発酵によって所望の化学物質を生産する目的で微生物を構築するための方法は、実施例１１に開示するように、幅広い種類の化学物質および株に一般化することができる。一般的な方法は、
（Ａ）第一の親株から、前記所望の化学物質と異なる発酵生産物への生合成の経路における工程を触媒する酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つを欠失させ、第一の中間株をもたらすこと
（Ｂ）前記第一の中間株に対して代謝的進化を行い、第二の中間株をもたらすこと、
（Ｃ）前記親株、および前記第二の中間株のゲノムのＤＮＡ配列を測定すること、
（Ｄ）前記ゲノムのＤＮＡ配列を比較して、前記代謝的進化の間に選択された変異を同定すること、
（Ｅ）前記変異の少なくとも１つを試験して、前記変異のどれが増殖比率または前記所望の化学物質の生産の効率を増大させることに有益であるかを決定すること、
（Ｆ）前記有益な変異の少なくとも１つを選ぶこと、および
（Ｇ）前記有益な変異の少なくとも１つ、または前記有益な変異の１つと機能的に類似する変異の少なくとも１つを、第二の親株に導入して、前記微生物をもたらすこと
を含むであろう。

この一般的な方法は、フマル酸塩、リンゴ酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、およびこれらの化学物質のいずれかの派生物などの、コハク酸塩以外の化学物質に、ならびに他のバクテリア、古細菌（ａｒｃｈｅｏｎ）、酵母、糸状菌（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ）、藻類（ａｌｇａｅ）、および渦鞭毛藻（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ）を含む、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）以外の微生物に、適用されるであろう。

本出願の発明は、特に好ましい実施態様に関して上で詳細に説明されてきた。上で詳細に行った説明に詳しい技能を持つ実施者は、次の請求項の精神を逸脱することなく任意の修飾を作ることができる。

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全ての参考文献は、読み手の便宜のために掲載される。それぞれの参考文献は、参照によってその全体が組み込まれる。

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Claims (23)

1. 増大したレベルのホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性、およびピルビン酸キナーゼ活性をコードする遺伝子における変異を含む、非天然に生じる微生物。
2. 増大したレベルのホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性が、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を増大させる変化した調節配列に、ｐｃｋ遺伝子のネイティブの調節配列を交換することに起因する、請求項１の非天然に生じる微生物。
3. ピルビン酸キナーゼ活性をコードする遺伝子が、ｐｙｋＡ遺伝子、またはそれのホモログである、請求項１の非天然に生じる微生物。
4. ピルビン酸キナーゼ活性をコードする遺伝子が、ｐｙｋＦ遺伝子、またはそれのホモログである、請求項１の非天然に生じる微生物。
5. さらにＰＥＰ−依存性ホスホトランスフェラーゼ系の機能を減少させる１または複数の遺伝学的修飾を含む、請求項１の非天然に生じる微生物。
6. さらに
   （ａ） ＰＥＰ−依存性ホスホトランスフェラーゼ系の機能を減少させる１または複数の遺伝学的修飾、および
   （ｂ） 少なくとも１つの非−ＰＴＳ糖輸送体の活性を増大させる１または複数の遺伝学的修飾
   を含む、請求項１の非天然に生じる微生物。
7. 前記非−ＰＴＳ糖輸送体が、ガラクトースパーミアーゼである、請求項７の非天然に生じる微生物。
8. ガラクトースパーミアーゼの活性における増大が、ガラクトースパーミアーゼをコードするｇａｌＰ遺伝子のコピー数を増大させることによって達成される、請求項７の非天然に生じる微生物。
9. ガラクトースパーミアーゼの活性における増大が、１または複数の変異を通じてリプレッサーの陰性制御を軽減することによって達成される、請求項７の非天然に生じる微生物。
10. ガラクトースパーミアーゼの前記リプレッサーが、ｇａｌＳまたはｇａｌＲ遺伝子によってコードされる、請求項９の非天然に生じる微生物。
11. さらに発酵性経路にかかわる遺伝子の少なくとも１つにおける変異を含む、請求項１の非天然に生じる微生物。
12. さらにトリカルボン酸サイクルの作動と関連する遺伝子の少なくとも１つにおける変異を含む、請求項１の非天然に生じる微生物。
13. さらにＲＮＡポリメラーゼサブユニットをコードする遺伝子における変異を含む、請求項１の非天然に生じる微生物。
14. ２０ｇ／Ｌを超えるオキサロ酢酸に由来する有機酸または他の化学物質を生産し、かつ、ＲＮＡポリメラーゼのサブユニットをコードする遺伝子における変異を含む、非天然に生じる微生物。
15. ＲＮＡポリメラーゼのサブユニットをコードする遺伝子が、ｒｐｏＡ遺伝子である、請求項１３または請求項１４の非天然に生じる微生物。
16. ＲＮＡポリメラーゼのサブユニットをコードする遺伝子が、ｒｐｏＣ遺伝子である、請求項１３または請求項１４の非天然に生じる微生物。
17. さらに染色体のＤＮＡにおける欠失を含み、ここで、前記欠失が、ｙｄｃＣ、ｙｄｃＤ、ｙｄｃＥ、およびｙｄｃＦ遺伝子を除去する、請求項１の非天然に生じる微生物。
18. さらにｆｔｓＩ遺伝子における変異を含む、請求項１または請求項１４の非天然に生じる微生物。
19. さらにｇｌｄＡ遺伝子における変異を含む、請求項１または請求項１４の非天然に生じる微生物。
20. さらに、ｄｈａＫＬＭオペロンまたはＰＴＳ−依存性ジヒドロキシアセトンキナーゼのサブユニットをコードする遺伝子における変異を含む、請求項１または請求項１４の非天然に生じる微生物。
21. ２０ｇ／Ｌを超えるオキサロ酢酸に由来する有機酸または他の化学物質を生産し、かつ、染色体のＤＮＡにおける欠失を含み、ここで、前記欠失が、ｙｄｃＣ、ｙｄｃＤ、ｙｄｃＥ、およびｙｄｃＦ遺伝子、またはそれのホモログを除去する、非天然に生じる微生物。
22. （ａ） 請求項１〜請求項１４のいずれかの微生物を培養すること、
    （ｂ） 炭素源を提供すること、
    （ｃ） 前記微生物に前記炭素源を代謝させることを可能にすること、および
    （ｄ） 随意的に、コハク酸を単離すること
    を含む、コハク酸を生産する方法。
23. 発酵によって所望の化学物質を生産する目的の微生物を構築するための方法であって、
    （ａ） 第一の親株から、前記所望の化学物質と異なる発酵生産物への生合成の経路における工程を触媒する酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つを欠失させて、第一の中間株をもたらすこと、
    （ｂ） 前記第一の中間株に対する代謝的進化を行い、前記第一の株のものと比較して改良された増殖を有する第二の中間株をもたらすこと、
    （ｃ） 前記第一の親株および第二の中間株のゲノムのＤＮＡ配列を測定すること、
    （ｄ） 前記ゲノムのＤＮＡ配列を比較して、前記代謝的進化の間で選択された変異を同定すること、
    （ｅ） 前記変異の少なくとも１つを試験すること、および前記変異のどれが、前記所望の化学物質の生産の効率の増殖比率における増大にとって有益であるかを同定すること、ならびに
    （ｆ） 前記同定された有益な変異の１もしくは複数、または前記有益な変異に１つに機能的に類似する変異の１もしくは複数を、第二の親株に導入して、所望の化学物質を生産するための微生物をもたらすこと、
    を含む方法。