KR101695605B1 - 유기산들을 생산하는 대장균의 대사적 진화 - Google Patents

Abstract

본 발명은 최소한의 미네랄 배지 내에서 탄소의 단독 소스로서 헥소스 당를 이용하여 발효적 조건 하에서 상업적으로 상당한 양으로 유기산을 생산하도록 미리 최적화된 미생물에 대한 대사적 진화에 관련된다. 이러한 대사적 진화의 결과로서, 상기 미생물은 고유의 성장 동력학, 유기산 생산의 속도 및 탄소원으로서 헥소스 당들을 사용할 수 있는 능력을 보유하면서, 그것의 성장을 위하여 셀룰로오스성 물질로부터 유도되는 펜토스 당들을 사용할 수 있는 능력을 획득한다. 본 발명은 또한 미생물 내에 상업적으로 상당한 양의 유기산들의 생산에서 헥소스 및 펜토스 당들 양자를 동시적으로 사용할 수 있는 능력을 부여하는 유전적 변화를 개시한다.

Description

유기산들을 생산하는 대장균의 대사적 진화{METABOLIC EVOLUTION OF ESCHERICHIA COLI THAT PRODUCE ORGANIC ACIDS}

본 출원은 2009년 11월 18일 출원된 미국 가출원 특허 번호 61/281,483에 대한 우선권을 주장한다.

본 발명은 승인 번호(Award Number) DE-EF0002878/001 하에 미국 에너지 부(US Department of Energy)로부터 수여된 계약 하에 미합중국 정부 지원으로 이루어졌다. 미 합중국 정부는 본 발명에 대한 일정한 권리를 갖는다.

2004 미국 에너지 부 리포트, "바이오매스(biomass)로부터 최고의 가치가 추가된 화합물(Top value added chemicals from biomass)"로 명명된, 는 재생 가능한 공급 재료들로부터 생산될 수 있는 12개 빌딩 블록 화합물들(building block chemicals)을 확인하였다. 12개 당-베이스의 빌딩 블록들은 1,4-이중산들 (1,4-diacids)(숙신산의(succinic), 푸마르산의(fumaric) 및 말산의(malic)), 2,5-퓨란 디카르복실산(2,5-furan dicarboxylic acid), 3-하이드록시 프로피온산(3-hydroxy propionic acid), 아스파르트산(aspartic acid), 글루칸산(glucaric acid), 글루탐산(glutamic acid), 이타콘산(itaconic acid), 레불린산(levulinic acid), 3-하이드록시부티로락톤(3-hydroxybutyrolactone), 글리세롤(glycerol), 소르비톨 (sorbitol) 및 자일리톨(xylitol)/ 아라비니톨(arabinitol)이다.

빌딩 블록 화합물들(building block chemicals)은 새로운 과(families)의 유용한 분자들로 변환될 가능성을 가지고 있는 다중 기능성 그룹들을 가진 분자들이다. 이들 12개의 빌딩 블록들은 후속적으로 많은 수의 높은 가치의 바이오-베이스의 화합물들 또는 재료들로 전환될 수 있다.

디카르복실산, 아미노산, 및 디올과 같은 생물학적 발효 프로세스로부터 유도되는 많은 자연적 대사물들은 폴리머리제이션(polymerization) 및 폴리머들의 화학적 합성을 위해 적합한 기능성 그룹들을 가지고 있다. 최근에는, 산업적 사용을 위해 적합한 모노머성 화학적 화합물들을 생산하기 위한 미생물들의 효율이 유전자 조작들을 통하여 상당히 증가되었다. 그러나, 생물학적 발효의 프로세스를 통하여 산업적 화합물들을 생산하는 비용은 여전히 매우 높다. 현재 산업적 화합물들의 생산을 위한 생물학적 발효의 프로세스는 탄소원으로서 글루코오스 및 옥수수 전분(corn starch)과 같은 정제된 탄수화물들을 사용하며, 또한 이에 따라 산업적 화합물들을 생산하기 위한 발효적 프로세스에 대해 비용을 더하게 된다.

산업적 화합물들을 생산하기 위한 발효적 프로세스의 비용은 발효 프로세스 내에서의 탄소원으로서 리그노셀룰로오스성 바이오매스(lignocellulosic biomass)를 사용함으로써 현저하게 감소될 수 있다. 리그노셀룰로오스성 바이오매스(lignocellulosic biomass)는 농업적 잔여물들, 식품 프로세싱 폐기물들, 나무, 및 종이 및 펄프 산업으로부터의 폐기물들을 포함하는 많은 수의 소스들로부터 얻어질 수 있다. 바이오매스는 대략적으로 40-50%의 헥소스 당들(hexose sugars)(6개의 탄소 원소를 포함하는 당들) 및 10-30%의 펜토스 당들(5개의 탄소 원소를 포함하는 당들)로 구성된다. 헥소스 당들은 C6 당들로서 본 기술 분야에 알려져 있다. 펜토스 당들은 C5 당들로서 본 기술 분야에 알려져 있다. 가수분해될 때에, 상기 리그노셀룰로오스성 재료들은 글루코오스, 자일로스, 아라비노스, 만노스 및 갈락토오스를 포함하는 당들의 혼합물을 생산한다. 그러나, 산업적 화합물들의 생산을 위한 많은 수의 발효 프로세스가 그들의 성장 및 대사를 위한 탄소의 소스로서 순수한 글루코오스를 가지고 개발되어 왔다. 예로서, 미국 특허 번호 7,223,567에 기재되어 있는 이. 콜리 (E. coli ) 균주는 탄소원으로서 글루코오스로 보충된 풍부 배지(rich medium)을 사용한다. 잔타마 외.(Jantama et al.)(2008a; 2008b)에 의해 및 공개된 PCT 특허 출원 번호들 WO/2008/021141A2 및 WO2010/115067A2에 기재되어 있는 숙신산의 생산을 위해 유용한 이. 콜리 (E. coli ) 균주 KJ122는 최소한의 배지 상에서 성장할 수 있으나, 여젼히 탄소의 소스로서 글루코오스 또는 다른 당를 요구한다. 높은 효율로 산업적 화합물들을 생산할 수 있는 능력을 갖는 이들 미생물들이 리그로셀룰로오스의 가수분해로부터 유도되는 당들의 혼합물 내에서 성장할 수 있다면 이상적일 것이다. 본 발명자들은 이미 미생물들을 리그노셀룰로오스성 공급 재료의 가수분해로부터 유도되는 C5 및 C6 당들의 혼합물을 사용하여 특정 산업적 화합물을 생산하는 것을 가능하도록 최적화되게 하는 방법을 밝혀냈다.

다중 당들을 동시적으로 사용하는 미생물의 능력은 특정한 생화학적 조절 시스템들(certain biochemical regulatory systems)의 존재에 의하여 제한된다. 이들 미생물 세포 내부에서의 생화학적 조절 시스템들은 유전적인 바탕을 갖는다. 노력들은 유전자 조작들을 통하여 이러한 조절 시스템들을 극복하기 위해 이루어져 왔다.

많은 경우들에 있어서 산업적 미생물들은 탄소원으로서 글루코오스 또는 수크로스를 함유하는 배지 내에서 성장된다. 성장 배지 내에서의 글루코오스의 존재는 이. 콜리 (E. coli ) 및 산업적 미생물의 다른 종 내에서의 다른 당들의 사용을 억압한다. 이러한 미생물들에 의한, 자일로스, 펜토스 당과 같은 다른 당들의 소비는 성장 배지 내 글루코오스가 완전히 소모된 후에 단지 개시된다. 산업적 미생물 내에서의 탄소 사용성(carbon utilization)에 관련된 이러한 현상은 분해 대사질 억제(catabolite repression) 또는 2 단계 성장(diauxic growth)으로서 참조된다. 상업적 스케일 내에서 산업적 화합물들의 생산 과정 동안에 분해 대사질 억제의 완화를 통해서 C5 및 C6 당들과 같은 다른 당들을 공동으로 사용하는 미생물을 제조하는 방법은 발효에 의해 생산되는 산업적 화합물들의 비용을 감소시키는 데 있어서 중요하다.

미생물들은 세포질(cytoplasmic) 멤브레인에 위치하고 있는 이송자 단백질들(transporter proteins)의 세트를 통하여 당들을 섭취한다. 미생물의 당 이송자들은 세 개의 주요 카테고리들 내에 속한다. 박테리아 내의 당 이송자들 중 가장 큰 그룹은 ATP 결합 카세트 이송자들(ATP binding cassette (ABC) transporters)로 알려져 있다. 상기 이름이 의미하는 바와 같이, ABC 이송자들은 박테리아 세포 내부로 이송되는 당의 매 분자에 대하여 한 분자의 ATP를 요구한다. XylFGH는 세포 내부로 펜토스 당인 자일로스 이송에 대한 ABC 이송자이다. AraFGH는 또한 다른 펜토스 당인 아라비노스 이송에 대한 ABC 이송자이다.

박테리아의 당 이송자들에 대한 두번 째 타입은 주요 촉진자 상과(Major Facilitator Super family (MFS)) 하에 그룹핑된다. 상기 MFS 당 이송자들 내에는, 두 개의 다른 카테고리들이 알려져 있다. MFS는 H⁺-연결된 심포터들(symporters), Na⁺-연결된 심포터들(symporters)-안티포터들(antiporters) 및 유니포터들 (uniporters)을 포함한다. 상기 유니포터들은 당 이송에 대한 간단한 촉진자들 (facilitators)이며 또한 세포 내부로 이송되는 당의 매 분자에 대하여 한 분자의 ATP를 요구하지 않는다. 짐모노나스 모빌리스( Zymononas mobilis ) 내의 트랜스-멤브레인 단백질 Glf가 촉진자의 한 예이다. 상기 H⁺-심포터들은 세포 내부로 이송되는 당의 매 분자에 대하여 한 분자의 세포외 프로톤(extracellular proton)을 요구한다. 이. 콜리 (E. coli ) 내부의 GalP 단백질은 헥소스 당인, 갈락토오스의 세포 내부로의 이송에 대한 심포터이다. GalP는 12개의 트랜스-멤브레인 루프들을 갖는 매우 잘 특성화된 심포터이다. GalP는 또한 세포 멤브레인을 통과하여 글루코오스를 이송시킬 수 있는 능력을 가지고 있는 것으로 보고되어 있다. AraE는 세포 멤브레인을 통과하는 아라비노스의 이송에 대한 프로톤-연결된 심포터이다. 유사하게 XylE 단백질은 자일로스의 이송에 대한 프로톤-연결된 심포터이다.

주로 글루코오스와 같은 헥소스 당들의 섭취를 위한 원인이 되는 세번 째 당 이송자는 포스포에놀피루베이트(phosphoenolpyruvate): 카보하이드레이트 포스포트랜스퍼라제 시스템(carbohydrate phosphotransferase system (PTS))으로서 알려져 있다. 다른 두 개의 당 이송자 시스템과 PTS를 구분하는 방법으로서, 상기 다른 두 개의 당 이송자 시스템들(ABC 이송자들 및 MFS 이송자들의 멤버들)은 비-PTS 당 이송자들로서 참조된다. PTS에 의해 촉매화되는 포스포에놀피루베이트(phosphoenolpyruvate)(PEP)로 부터의 포스포릴(phosphoryl) 그룹의 이동은 글루코오스 및 다른 당들의 이송 및 인산화(phosphorylation)를 유도하고 또한 세포 내부에 인산화된 당들 및 피루브산의 형성의 결과를 가져온다. PTS 형성된 피루브산은 분명하게도, 글루코오스가 단지 탄소원인 혐기성 컬쳐 조건들 하에서 PEP로 재활용되지 않는다. 오히려, 피루브산염은 트리카르복실산 회로(tricarboxylic acid cycle)에 의해 이산화탄소로 산화된다. 따라서, 글루코오스의 매 단일 분자의 이송에 대하여, 한 분자의 PEP가 소비된다. 세포성 생물 에너지학의 관점에서, PTS를 통한 당들의 이송은 에너지 집약적인 프로세스(energy intensive process)이다. 따라서 산업적으로 유용한 화합물들의 생산을 위한 세포들 내부에서의 포스포에놀피루베이트 함유량을 보존할 필요성이 존재하는, 혐기적으로 성장하는 세포들 내에서, PTS를 세포 내부로 이송되는 당의 매 분자에 대하여 한 분자의 PEP를 요구하지 않는 다른 비-PTS 당 이송자들로 대체하는 것이 바람직하다.

상기 PTS는 E1 및 HPr로 명명되는 두 개의 세포질 성분들(cytoplasmic components) 및 멤브레인-결합된 성분(membrane-bound component) EII로 이루어진다. 이. 콜리(E.coli)는 적어도 15 개의 다른 EII 복합체들을 포함한다. 각 EII 성분은 당 타입에 대하여 특이적이며 또한 두 개의 소수성 막관통(integral membrane) 도메인들(C 및 D) 및 두 개의 친수성 도메인들(A 및 B)을 포함한다. 이들 네 개의 도메인들은 함께 당 분자들의 이송 및 인산화에 대하여 원인이 된다. EI 단백질은 PEP 로부터 HPr 단백질로 인산염 그룹을 이동시킨다. EII 단백질은 인산화된 HPr 단백질로부터 당 분자로 인산염 그룹을 이동시킨다.

EI은 ptsI 유전자에 의해 인코딩된다. HPr은 ptsH 유전자에 의해 인코딩된다. 장(enteric) 박테리아의 글루코오스-특이성 EII 복합체는 두 개의 이격된 단백질들, 즉 유전자 crr에 의해 인코딩되는 EIIA^Glc 및 유전자 ptsG에 의해 인코딩되는 멤브레인-관련된 단백질 EIICB^Glc를 포함한다. 상기 PTS 매개된 당 이송은 PTS와 관련된 단백질들에 대하여 코딩하는 이들 유전자의 하나를 돌연변이시키는 방법에 의해 저해될 수 있다. 대체적인 포스포에놀피루베이트-독립성 섭취 및 인산화 활성(비-PTS)에 의한 PTS의 기능적 대체는 글루코오스로부터의 생산 수율 및 몇 개의 대사질 클래스(classes of metabolites)에 대한 생산성의 상당한 향상의 결과를 가져왔다.

PTS-매개되는 글루코오스 섭취에서의 감소와 함께, 글루코오스 섭취에 대한 다른 시스템들이 활성화될 수 있어 산업적으로 유용한 화합물들의 생산에 대한 세포 내부에서의 글루코오스의 지속적인 입수 가능성을 보장한다. 예로서, 글루코오스 퍼미아제(glucose permease)에 대하여 코딩하는 glf 유전자는, PTS 매개된 글루코오스 섭취의 손실에 대하여 보충하는 것으로 여겨져 왔다. 유사하게 galP 및 glk 유전자들의 과 발현은 이. 콜리(E. coli)의 pts ^- 균주 내에서의 글루코오스 섭취 및 인산화를 증진시키는 것으로 보고되어져 있다. GalP는 헥소스 당, 갈락토오스의 섭취에 대한 심포터이다. GalP는 pts ^- 균주 내에서 글루코오스를 이송시키는 것으로 보고되어져 있다. GalP 매개된 글루코오스 섭취의 중요성은 pts ^- 돌연변이체 내에서의 galP 유전자의 비활성화가 글루코오스 상에서의 성장을 방해하는 것으로 밝혀진 사실에 의해 입증된다(위 외.(Yi et al.), 2003). PTS의 결여에서, Glk는 그것이 당분해(glycoysis) 내로 들어갈 수 있기 전에 글루코오스 분자의 인산화를 달성하기 위하여 필수적이다. pts ^- 균주 내에서의 GalP 단백질의 발현은 구조적 (constitutive) 프로모터 하에서 galP 유전자를 발현시키는 것에 의해 또는 galS 및 galR과 같은 galP 유전자의 억제자에 대하여 코딩하는 유전자들 내에서의 돌연변이를 통하여 galP 유전자 발현의 억제를 완화하는 방법에 의하여 중 어느 것에 의해 달성될 수 있다.

세포들 내부로의 당들의 이송에서 일어나는 에너지 소모를 감소시키는 것 이외에, PTS와 관련된 단백질에 대하여 코딩하는 유전자 내로 돌연변이들을 도입하는 것은, 펜토스 및 헥소스 당들을 포함하는 배양 배지(culture medium) 내에 존재하는 모든 당들의 동시적인 이송 및 사용을 차례로 허용할 수 있는 분해 대사질 억제를 완화할 것으로 기대된다. 헤르난데즈-몬탈보 외(Hernandez-Montalvo et al.), (2001)는 글루코오스의 이송에 대하여 PTS가 결여된 이. 콜리 (E. coli ) 균주에 의한 글루코오스, 아라비노스 및 자일로스를 포함하는 당 혼합물의 사용을 연구하였다. 상기 pts ^- 돌연변이체는 그것의 와일드-타입 부모 균주와 마찬가지로 빠르게 비-PTS 메카니즘에 의하여 당들을 섭취할 수 있었다. 글루코오스-자일로스 또는 글루코오스-아라비노스 혼합물들로 보충된 최소한의 배지 내에서 성장된 컬쳐들 내에서, 글루코오스는 야생형 균주 내에서 아라비노스 또는 자일로스-사용을 억제하였다. 동일한 컬쳐 조건들 하에서, 상기 pts ^- 돌연변이체는 글루코오스 및 아라비노스를 함께 대사하였다. 그러나, 글루코오스는 여젼히 자일로스 소비에 대하여 부분적으로 억제의 효과를 발휘하였다. 글루코오스-아라비노스-자일로스의 세 개의 혼합물로 성장하는 컬쳐들에서, 야생형 균주는 순서적으로 글루코오스, 아라비노스 및 마지막으로 자일로스를 사용하였다. 반대로, 상기 pts ^- 균주는 글루코오스 및 아라비노스를 함께 대사하였고, 한편 자일로스는 글루코오스-아라비노스 결여 이후에 사용되었다. 글루코오스-아라비노스 공동-대사의 결과로서, pts ^- 균주는 야생형 균주 보다 16% 빠르게 배양 배지 내에 포함된 당들의 총 양을 소비하였다.

글루코오스와 자일로스를 함께 대사하는 능력을 갖는 pts ^- 돌연변이체 균주는 배지 내에서의 당의 소비 속도에서 더 많은 증가를 유발하고 이는 생산성에서의 증가를 가져온다. 따라서, 이들 두 개의 당들이 비가공 셀룰로오스성 가수분해물 내에 존재하는 압도적인 당들을 대표하기 때문에 글루코오스와 자일로스를 함께 대사할 수 있는 미생물에 대하여 본 기술 분야에서의 요구가 존재한다. 나아가, ptsG 유전자 기능의 제거는 유기산들을 생산하도록 대사적으로 엔지니어링된 미생물 성장의 속도를 감소시킬 수 있었다는 것이 보고되어져 왔다(산체스 외.(Sanchez et al.), 2005). 따라서 상업적으로 중요한 화합물들 및 화학적 중간체들의 성장 속도 및 생산 속도를 떨어뜨리지 않으면서 다중 당들을 동시적으로 사용할 수 있는 능력을 달성하기 위한 추가적인 필요성이 존재한다.

모든 참조 문헌들이 독자의 편의를 위하여 하기에서 목록화되었다. 각 문헌은 그것의 전체로서 참조에 의하여 포함되었다.

미국 특허 번호 5,168,056 미국 특허 번호 5,169,768 미국 특허 번호 5,602,030 미국 특허 번호 6,962,794 미국 특허 번호 7,223,567 미국 특허 번호 7,371,558 미국 특허 번호 7,524,660 미국 특허 번호 7,629,162 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0214294 미국 특허 출원 공개 번호 2007/0037265 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0176302 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0148914 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2008/1 15958 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2010/115067

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본 발명의 목적은 생산성을 감소시키지 않으면서 다중 당들을 동시적으로 사용하여 높은 수준의 산업적 화합물들을 생산할 수 있는 미생물들을 대사적으로 진화시키는 것이었다. 본 발명자들은 놀랍게도 대사적 진화를 통하여 다중 당들을 동시적으로 소비하는 미생물들을 제조하기 위한 프로세스를 찾아내었다. 대사적 진화의 이러한 프로세스는 세포들이 빠른 성장과 같은 그것의 고유의 특성들 중의 어느 것 및 상업적으로 상당한 양으로 특정 산업적 화합물들을 생산하는 능력에 영향을 미치는 일 없이, 다중 당들을 사용할 수 있는 능력을 획득하는 것을 허용한다.

본 발명자들은 또한 글루코오스 및 자일로스를 동시적으로 사용하는 미생물의 능력에 대한 새로운 유전적 바탕을 확인하였다. 전체적인-게놈 서열화가 유기산의 생산에서 다중 당들을 동시적으로 사용할 수 있는 능력을 미생물에 대하여 부여하는 유전적 변형을 확인 하는데에 사용되었다.

본 발명 이전에, 헥소스 당들 및 펜토스 당들 양자를 동시적으로 사용할 수 있는 능력이 간단한 유전자 조작을 통하여 달성될 수 있는가에 대해서는 의문이어 왔다. 분자 유전학에 관련된 본 발명은 바이오매스-유도된 당의 전체적인 범위를 효과적으로 대사할 수 있는 능력에 도달하는 잠재성을 부여한다. 일차적으로, 본 발명은 포스포에놀 피루베이트(phosphoenol pyruvate)의 소비와 반드시 결합되어 있지 않는 동시적인 글루코오스 및 자일로스 섭취에 도달하기 위한 유전적 접근을 제공한다.

우리는 상업적으로 탄소원으로서 글루코오스를 포함하는 최소한의 성장 배지 내에서의 발효적 프로세스를 통하여 상당한 양의 유기산들을 생산하기 위하여 유전적으로 변형된 및 최적화된 미생물이, 고유의 최적화된 유기산 생산 속도를 유지하면서, 추가적으로 탄소원으로서 다중 당들을 동시적으로 사용하도록 대사적으로 진화될 수 있음을 뜻밖에 발견하였다.

발효적 프로세스를 통하여 유기산을 생산하는 미생물에 대하여 그들의 성장 및 유기산 생산을 위한 소스로서 다중 타입의 당 분자들을 동시적으로 사용할 수 있는 능력을 부여하기 위한 방법을 제공하는 것이 본 발명의 하나의 목적이다. 비가공 셀룰로오스성 가수분해물을 사용하여 높은 수율의 유기산들을 생산하는 발효적 프로세스를 제공하는 것이 본 발명의 또 다른 목적이다.

본 발명의 구성은 글루코오스로부터 유기산들을 생산하기 위하여 유전적으로 변형되거나 또는 최적화된 미생물들이 헥소스 및 펜토스 당들을 동시적으로 사용할 수 있는 능력을 획득하도록 하는 대사적 진화의 프로세스의 사용이다.

본 발명의 일 실시예에서, 탄소원으로서 글루코오스를 포함하는 배지 내에서 유기산을 생산할 수 있는 이. 콜리 (E. coli ) 박테리움이 유기산 생산에 대한 동일한 속도를 유지하고 또한 탄소원으로서 글루코오스를 사용하는 능력을 보유하는 한편 탄소원으로서 부가적인 타입들의 당를 사용하도록 대사적으로 진화된다.

바람직한 실시예에서, 본 발명은 하나 초과의 타입의 당를 동시적으로 사용하여 최소한의 성장 배지 내에서 유기산을 생산할 수 있는 이. 콜리 (E. coli ) 박테리움을 제공한다.

또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명은 탄소원으로서 리그노셀룰로오스성 가수분해물을 포함하는 식물 가수분해물을 사용하여 최소한의 성장 배지 내에서 유기산을 생산할 수 있는 이. 콜리 (E. coli ) 박테리움을 제공한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에서는, 글루코오스 및 자일로스를 동시적으로 사용하여 숙신산을 생산하는 이. 콜리 (E. coli ) 박테리움이 제공된다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에서는, 리그노셀룰로오스성 가수분해물을 포함하는 식물 가수분해물을 사용하여 최소한의 성장 배지 내에서 숙신산을 생산하는 이. 콜리(E. coli) 박테리움이 제공된다.

본 발명은 특히 매우 비용 효과적인 방법으로 리그노셀룰로오스성 재료들을 사용하는 생물학적 발효 프로세스를 통해 매우 정제된 유기산들을 생산하는데 있어서 유용하다.

또 다른 실시예에서, 본 발명은 PTS 당 이송자와 관련된 단백질에 대하여 코딩하는 유전자의 활성을 감소시키는 것에 더하여, 비-PTS 이송자 단백질들에 대하여 코딩하는 유전자들을 돌연변이화하는 방법을 통하여 다중 당들을 동시적으로 사용하는 미생물을 제조하기 위한 방법을 제공한다.

더욱 바람직한 실시예에서, 갈락토오스 심포터의 감소된 활성 및 돌연변이화된 형태를 갖는 PTS 당 이송자를 포함하는 미생물이 제공된다.

본 발명에 대한 부가적인 장점들은 다음의 기술로부터 더욱 분명할 것이다.

도 1. 8% 자일로스로 보충된 미네랄 염 배지 내에서 이. 콜리(E. coli)의 KJ122 균주에 대한 발효 프로파일. 발효는 총 168 시간의 주기 동안 수행되었다. 솔리드 써클들 내에서 보여지는 자일로스 사용은 오픈 써클들에서 보여지는 550 nm 에서의 광학적 밀도에서의 증가의 관점에서 측정되는 박테리아 세포 밀도에서의 증가에 의해 수반되어 약 96 시간에서 시작되었다. 솔리드 스퀘어들에서 보여지는 숙신산염 농도에서의 증가는 약 96 시간에서 발생하였다. 상기 도면에서 또한 보여지는 것은 발효의 168 시간의 경과 동안 배지 내에서의 아세트산염, 피루브산염 및 말산염의 농도에서의 변화들이다.
도 2. 8% 자일로스로 보충된 미네랄 염 배지 내에서 자일로스를 대사하도록 적합화된 이. 콜리(E. coli)의 KJ122 균주에 대한 발효 프로파일. 발효는 총 168 시간의 주기 동안 수행되었다. 솔리드 써클들 내에서 보여지는 자일로스 사용은 오픈 써클들에서 보여지는 550 nm 에서의 광학적 밀도에서의 증가의 관점에서 측정되는 박테리아 세포 밀도에서의 증가에 의해 수반되어 약 72 시간에서 시작되었다. 솔리드 스퀘어들에서 보여지는 숙신산염 농도에서의 증가는 약 72 시간에서 발생하였다. 상기 도면에서 또한 보여지는 것은 발효의 168 시간의 경과 동안 배지 내에서의 아세트산염, 피루브산염 및 말산염의 농도에서의 변화들이다.
도 3. 8% 자일로스로 보충된 미네랄 염 배지 내에서 이. 콜리(E. coli)의 TG400 균주에 대한 발효 프로파일. 발효 프로파일은 120 시간의 주기 동안 모니터되었다. 솔리드 써클들 내에서 보여지는 자일로스 사용은 오픈 써클들에서 보여지는 550 nm 에서의 광학적 밀도에서의 증가의 관점에서 측정되는 박테리아 세포 밀도에서의 증가에 의해 수반되어 약 30 시간에서 시작되었다. 솔리드 스퀘어들에서 보여지는 숙신산염 농도에서의 증가는 약 30 시간에서 발생하였다. 상기 도면에서 또한 보여지는 것은 발효의 120 시간의 경과 동안 배지 내에서의 아세트산염, 피루브산염 및 말산염의 농도에서의 변화들이다.
도 4. 이. 콜리(E. coli)의 KJ122 및 TG400 균주들에 의한 혼합 당 발효의 프로파일. 발효는 총 144 시간의 주기 동안 수행되었다. 발효 배지는 글루코오스 및 자일로스 양자를 포함하였다. 글루코오스 농도에서의 감소에 의하여 보여지는 바와 같은 글루코오스 사용은 오픈 스퀘어들에 의해 보여진다. 자일로스 농도에서의 감소에 의하여 보여지는 바와 같은 자일로스 사용은 솔리드 써클들에 의해 보여진다. 발효 배지 내에서의 숙신산염 농도에서의 증가는 솔리드 스퀘어들에 의하여 보여진다. 144 시간의 발효의 과정 동안 550 nm 에서의 광학적 밀도에 의해 측정되는 바와 같은 세포 밀도 내에서의 변화가 오픈 써클들에 의하여 보여진다. 도면들에서 또한 보여지는 것은 발효의 144 시간의 경과 동안 아세트산염, 피루브산염 및 말산염의 농도에서의 변화들이다.
도 5. 이. 콜리(E. coil)의 TG400 균주에 의한 2.5%(w/v) 콘 스팁 리쿼(corn steep liquor)로 보충된 해독된 농축된 버개스(detoxified concentrated bagasse) C5 가수분해물의 발효의 프로파일. 자일로스의 농도에서의 감소에 의해 측정되는 바와 같은 자일로스 사용은 솔리드 써클들 내에 보여진다. 발효 배지 내에서의 숙신산염 농도에서의 증가는 솔리드 스퀘어들에 의하여 보여진다. 도면에서 또한 보여지는 것은 발효의 168 시간의 경과 동안 피루브산염, 아세트산염, 말산염 및 락트산염의 농도에서의 변화들이다.
도 6. 글루코오스 및 자일로스 양자를 포함하는 배지 내에서의 이. 콜리(E. coil)의 WG37 균주의 발효 프로파일. 발효는 120 시간의 주기 동안 수행되었다. 글루코오스 농도에서의 감소에 의하여 측정되는 바와 같은 글루코오스 사용은 오픈 스퀘어들에서 보여진다. 자일로스 농도에서의 감소에 의하여 측정되는 바와 같은 자일로스 사용은 솔리드 써클들에서 보여진다. 120 시간의 발효의 과정 동안 550 nm 에서의 광학적 밀도에 의해 측정되는 바와 같은 박테리아 세포 밀도에서의 변화는 오픈 써클들에 의해 보여진다. 숙신산염 농도에서의 증가는 솔리드 스퀘어들 내에 보여진다. 도면에서 또한 보여지는 것은 발효의 120 시간의 경과 동안 아세트산염, 피루브산염 및 말산염의 농도에서의 변화들이다.
도 7. 4% 자일로스 및 7% 글루코오스를 포함하는 성장 배지 내에서의 박테리아의 TG400, WG37 및 KJ122 균주들에 의한 숙신산 생산의 사이드-바이 사이드 비교. 발효는 120 시간 주기 동안 수행되었다. 이. 콜리(E. coil)의 TG400(솔리드 써클들), KJ122(솔리드 트라이앵글), 및 WG37(인버트 트라이앵글) 균주들을 포함하는 발효 배지 내에서의 숙신산의 농도에서의 증가가 120 시간의 주기 동안 모니터되었다.
도 8. 단지 10% 자일로스만을 포함하는 성장 배지 내에서의 박테리아의 TG400, WG37 및 KJ122 균주들에 의한 숙신산 생산의 사이드-바이 사이드 비교. 발효는 120 시간 주기 동안 수행되었다. 이. 콜리(E. coil)의 TG400(솔리드 써클들), KJ122(인버트 트라이앵글), 및 WG37(트라이앵글) 균주들을 포함하는 발효 배지 내에서의 숙신산의 농도에서의 증가가 120 시간의 주기 동안 모니터되었다.
도 9. 단지 10% 글루코오스만을 포함하는 성장 배지 내에서의 박테리아의 TG400, WG37 및 KJ122 균주들에 의한 숙신산 생산의 사이드-바이 사이드 비교. 발효는 120 시간 주기 동안 수행되었다. 이. 콜리(E. coil)의 TG400(솔리드 써클들), KJ122(트라이앵글), 및 WG37(인버트 트라이앵글) 균주들을 포함하는 발효 배지 내에서의 숙신산의 농도에서의 증가가 120 시간의 주기 동안 모니터되었다.
도 10. 탄소의 단독 소스로서 자일로스를 포함하는 성장 배지 내에서의 이. 콜리(E. coil)의 KJ122 및 SI014 균주들 성장 프로파일. 박테리아 성장은 총 97 시간 주기 동안 600 nm에서의 광학적 밀도의 관점에서 모니터되었다. (솔리드 써클들)의 KJ122 균주는 단지 매우 느린 성장을 보였다. 다른 한편으로, SI014 균주 (솔리드 스퀘어들)은 세포 밀도에서의 느린 감소에 의해 후속되는 27 시간 이내의 빠른 성장을 보였다.
도 11. 탄소의 단독 소스로서 자일로스를 포함하는 배지 내에서의 이. 콜리(E. coil)의 KJ122 및 SI014 균주들에 의한 자일로스 사용 및 숙신산 생산에 대한 프로파일. 자일로스 사용은 97 시간의 주기 동안 배지 내에서의 자일로스 농도에서의 감소의 관점으로 측정되었다. SI014 균주(솔리드 스퀘어들)으로의 자일로스 사용은 KJ122 균주(솔리드 써클)에 의한 자일로스 사용과 비교하여 훨씬 빨랐다. 유사하게, SI014 균주(오픈 스퀘어들)으로의 숙신산염 생산은 KJ122 균주(오픈 써클들)에 의한 숙신산염 생산과 비교하여 훨씬 빨랐다.

본 발명은 재조합 미생물들에 의한 탄소 화합물들의 발효로부터 상업적으로 상당한 양으로서 유기산들의 생산을 위한 프로세스를 제공한다. 더욱 상세하게, 본 발명은 발효적 프로세스를 통하여 유기산의 생산에 대하여 적합한 미생물들을 제공한다. 본 발명의 미생물들은 상업적으로 상당한 양의 유기산의 생산을 위한 발효적 프로세스에서 다중 당들을 사용할 수 있는 능력을 갖는다.

본 발명에서 개시되는 것은 발효적 프로세스를 통한 숙신산의 생산에 적합한 미생물들이다. 본 발명이 유전적으로 변형된 박테리아 균주들에 의하여 탄소 화합물들로부터 상업적으로 상당한 양으로 숙신산의 생산에 대한 프로세스를 제공한다고 하더라고, 본 발명의 기술들은 많은 수의 다른 화합물들의 산업적 생산에 대하여 동일하게 적용 가능하다.

본 발명의 기술의 목적을 위하여, 하기 정의들이 사용될 것이다.

많은 수의 산업적으로 유용한 화합물들이 본 발명을 사용하여 제조될 수 있다. 그러한 화합물들의 예들은, 이에 제한되는 것은 아니나, 에탄올, 부탄올, 락트산염, 숙신산염, 푸마르산염, 말산염 트레오닌, 메티오닌 및 라이신을 포함한다. 유기산들이 자유 산으로서 및 염들(예로서, 그러나 이에 제한되는 것은 아닌, 소듐 (sodium), 포타슘(potassium), 마그네슘(magnesium),칼슘( calcium), 암모늄 (ammonium), 클로라이드(chloride), 설페이트(sulfate), 카보네이트(carbonate), 바이카보네이트(bicarbonte) 등의 염)로서 양자로 존재할 수 있기 때문에, 숙신산, 푸마르산, 말산, 아르파르트산, 트레오닌, 메티오닌 및 라이신과 같은 화학적 이름들은 자유 산 및 그들의 어떤 염 양자를 포함하는 것으로 의미될 것이다. 이와 마찬가지로, 숙신산염, 푸마르산염, 말산염, 아스파르트산염 등의 어떤 염은 또한 자유 산을 포함하는 것으로 의미될 것이다.

본 발명은 탄수화물 기질을 갖는 미네랄 염 배지 내에서의 혐기성 성장 조건들 하에서 숙신산 생산에 대한 높은 수율, 타이터(titer) 및 부피 생산성 (volumetric productivity)을 나타내는 균주들을 획득하기 위하여 특이적 유전적 변형들의 기술(technique of specific genetic modifications)과 대사적 진화(metabolic evolution)의 프로세스를 결합한다.

본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "타이터(titer)"는 발효 배지 (fermentation broth) 내에서의 특정 화합물의 몰 농도를 의미한다. 따라서 본 발명에 따르는 숙신산의 생산을 위한 발효 프로세스에서, 100 mM의 숙신산 타이터는 측정의 시간에서의 발효 배지가 발효 배지의 리터(liter) 당 100 mMoles의 숙신산을 함유하였다는 것을 의미할 것이다.

본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "수율(yield)"은 발효 프로세스 동안에 소모되는 공급 재료(feedstock)의 몰 당 생산되는 특정 화합물의 몰을 의미한다. 따라서 공급 재료로서 글루코오스를 사용하는 숙신산의 생산을 위한 발효적 프로세스에서, 상기 용어 수율은 소모되는 글루코오스 몰 당 생산되는 숙신산의 몰 수(the number of moles)를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "부피 생산성(volumetric productivity)"은 단위 시간 당 단위 부피 당 생산되는 그램으로서의 특정 화합물의 양을 의미한다. 따라서 0.9 g L^-1h^-1의 숙신산의 부피 생산성 값은 0.9 그램의 숙신산이 1 시간의 성장 과정 동안 발효 배지의 1 리터 내에 축적된다는 것을 의미할 것이다.

본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자(gene)"는 그 유전자의 개방 리딩 프레임(open reading frame) 및 상부 및 하부 조절 서열들(upstream and downstream regulatory sequences)을 포함한다. 상기 상부 조절 영역은 또한 그 유전자의 프로모터 영역을 의미한다. 상기 하부 조절 영역은 또한 그 터미네이터 영역을 의미한다.

구절 "기능적으로 유사한(functionally similar)"은 여기 기재된 방법들에 의하여 동일한 또는 다른 생물 내에서 발견되는 어떤 야생형 또는 돌연변이화된 DNA 서열, 유전자, 효소, 단백질과 동일하거나 또는 유사한 생물학적 기능을 갖는, 어떤 생물(organism)로부터의 어떤 야생형 또는 돌연변이화된 DNA 서열, 유전자, 효소, 단백질을 광범위하게 의미한다. 기능적으로 유사성은 서열 상동(homology)을 요구할 필요가 없다. 대립 유전자(Allele)는 특정 유전자의 DNA 서열의 둘 또는 초과 형태들 중 하나이다. 각 유전자는 다른 대립 형질들을 갖는다. 어떠한 돌연변이도 없는 유전자는 돌연변이를 포함하는 상응하는 유전자와 비교될 때 야생형 대립 형질(wild type allele)로서 참조된다.

상동체(Homolog)는 공통의 조상의(ancestral) DNA 서열로부터 전해져 온 이차적 유전자에 관련된 유전자이다. 이 용어, 상동체는 종분화(speciation)의 사건에 의하여 구분되는 유전자들 사이에서의 관계에 대하여 또는 유전적 듀플리케이션의 사건에 의하여 구분되는 유전자들 사이에서의 관계에 대하여 적용될 수 있다. 오쏘로그들(Orthologs)은 종분화에 의해 공통의 조상 유전자로부터 진화된 다른 종(species) 내의 유전자들이다. 보통, 오쏘로그들은 진화의 과정에서 동일한 기능을 유지한다. 오쏘로그들에 대한 식별(identification)은 새롭게 서열화된 게놈들 내에서의 유전자 기능의 신뢰할 만한 예측을 위하여 중요하다. 종분화는 그것이 발생하는 종으로부터 새로운 방법으로 살아가는 것을 가능하게 하는 새로운 종의 기원이다. 이러한 프로세스의 일부로서 그것은 그 부모 종과 유전적 교환에 대한 어떤 장벽을 또한 획득하였다. 파라로그들(Paralogs)은 게놈 내부에서의 듀플리케이션에 의해 관련되는 유전자들이다. 오쏘로그들은 진화의 과정에서 동일한 기능을 유지하는 반면, 파라로그들은 그들이 그 고유의 것에 관련되어 있기는 함에도 불구하고, 새로운 기능들을 진화시킨다.

"개조된 활성(altered activity)"을 갖는 유전자 또는 단백질은 관련성 있는 야생형의 유전자 또는 단백질과 비교되었을 때에 측정 가능한 특성에서 측정 가능한 차이점을 생산하는 유전자 또는 단백질로서 광범위하게 정의된다. 상기 개조된 활성은 개조된 유전자 또는 단백질을 포함하는 균주의 숙신산염 생산에 대한 성장 속도 또는 효율을 증가시키거나 또는 감소시키는 일반적인 방법에서 그 자체로 명확할 수 있다. 다른 측정 가능한 특성들은, 그러나 이에 제한되는 것은 아닌, 효소 활성, 효소의 기질 특이성, 기질에 대한 친화도 또는 속도와 같은 효소의 동력학적 파라미터들, 효소의 안정도, 효소의 조절 특성들, 유전자 발현 수준, 다양한 조건들 하에서의 유전자 발현의 조절 등을 포함한다.

본 발명에서 사용되는 바와 같이, 상기 용어 돌연변이는 개방 리딩 프레임, 상부 조절 영역 및 하부 조절 영역을 포함하는 유전자에 대하여 이루어지는 유전적 변형들을 의미한다. 상기 유전자 돌연변이들은 상방 조절(up regulation) 또는 하방 조절(down regulation) 또는 그 유전자의 개방 리딩 프레임의 전사의 완전한 저해 중 어느 것을 유도한다. 상기 유전자 돌연변이들은, 그 유전자의 전체적인 코딩하는 영역 또는 그 코딩하는 뉴클레오티드 서열 부분을 삭제함으로써, 또는 프레임 이동 돌연변이(frame shift mutation), 미스센스 돌연변이(missense), 또는 삽입(insertion)을 도입함으로써, 또는 중지 코돈(stop codon) 또는 그들의 조합들을 도입함으로써의 어느 것에 의하여 달성된다. 돌연변이들은 효소 반응 또는 세포 멤브레인을 관통하는 유기 분자들의 이송과 같은 생물학적 기능들에 직접적으로 관련되는 단백질들에 대하여 코딩하는 구조적 유전자들(structual genes)에서 발생할 수 있다. 대체적으로, 돌연변이들은 그 생물학적 기능들에 직접적으로 관련된 단백질에 대하여 코딩하는 유전자들의 발현을 조절하는 단백질들에 대하여 코딩하는 조절 유전자들(regulatory genes)에서 발생할 수 있다. 다른 유전자들의 발현을 조절하는 단백질들은 조절 단백질들(regulatory proteins)로서 참조되며, 또한 이러한 조절 단백질들에 대하여 코딩하는 유전자들은 조절 유전자들(regulatory genes)로서 참조된다.

"돌연변이(Mutation)"는 또한 관련성 있는 야생형 생물의 그것에 관련된 DNA 서열 내에서의 어떤 변화를 포함한다. 예로서, 균주 KJ122 내에서 발견되는 돌연변이는, 그 돌연변이된 영역의 DNA 서열이 부모의 야생형 균주, 이. 콜리 (E. coli .) C, 또한 ATCC 8739로도 알려져 있는, 의 그것과 비교될 때 발견될 수 있는 DNA 서열 내에서의 어떤 변화이다. 돌연변이는 어떤 수의 염기 짝들(base pairs)에 대한 부가적인 DNA의 삽입 또는 어떤 수의 염기 짝들(base pairs)에 대한 DNA의 삭제일 수 있다. 삽입 돌연변이(insertion mutation)의 특정한 타입은 유전자 듀플리케이트(gene duplicate)이다. 유전자는 자발적인 돌연변이적 사건에 의해 듀플리케이트될 수 있고, 이때 상기 유전자의 이차적 카피(secondary copy)는 고유 카피(original copy)에 인접하여 위치될 수 있거나, 또는 유전자는 유전자 조작에 의해 듀플리케이트 될 수 있고, 여기서 상기 유전자의 이차적 카피(secondary copy)는 상기 고유 카피(original copy)로부터 이격되어 있는 게놈 내의 사이트에 위치될 수 있다. 돌연변이는 예로서 아데닌으로부터 구아닌 염기로의 변화와 같이, 하나의 염기 타입으로부터 또 다른 염기 타입으로의 변화일 수 있다. 유전학의 표현(vernacular)에서, 돌연변이는 미스센스(missense)(코돈에 의하여 그를 위해 코딩된 아미노산을 변화시키는), 비인식의(nonsense)(코돈을 중지 코돈으로 변화시키는), 프레임 이동(frameshift)(세 개의 다중적인 것이 아닌 염기들의 수의 삽입 또는 삭제인, 또한 상기 리딩 프레임을 변화시키고 및 돌연변이로부터 하부로 인코딩된 아미노산 서열을 개조하는, 또한 종종 상기 돌연변이로부터 하부로 중지 코돈을 도입하는), 또한 변환(inversion)(극성(polarity)에서 스위치된 그러나 삭제되지는 않은 DNA 서열로부터 도출되는) 일 수 있다.

"제로 돌연변이(null mutation)"는 그 관련성 있는 유전자의 전체적인 개방 리딩 프레임의 삭제의 그것과 실질적으로 동일한, 또는 그 관련성 있는 유전자의 모든 측정 가능한 활성을 제거하는, 표현형(phenotype)을 부여하는 돌연변이이다.

"돌연변이체(mutant)"는 그것의 게놈이 하나 이상의 돌연변이들을 포함하는 미생물이다.

본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "외인성(exogenous)"은 세포의 외부로부터 유도되는 분자 또는 활성이 그 숙주 미생물체 내부로 도입되는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 상기 미생물 세포 내부로 도입되는 외인성 핵산 분자의 경우에 있어서, 상기 도입된 핵산은 독립적인 플라스미드로서 존재할 수 있거나 숙주 염색체 DNA 내부로 집적될 수 있다(integrated). 단백질에 대하여 코딩하는 외인성 핵산은 프로모터 또는 터미네이터 서열들과 같은 그 고유의 조절 서열들과 함께 발현 가능한 형태로 미생물 세포 내부로 도입될 수 있다. 대체적으로, 상기 외인성 핵산 분자는 숙주 염색체 DNA 내부로 집적될 수 있고 또한 상기 숙주 조절 서열들의 조절 하에 있을 수 있다.

용어 "내인성(endogenous)"은 그 숙주 세포 내부에 존재하는 분자들 또는 활성을 의미한다. 생합성적 활성에 대한 참조로서 사용될 때, 상기 용어 "외인성 (exogenous)"은 그 숙주 기준 생물 내부로 도입되는 활성을 의미한다. 상기 소스 (source)는 예로서 상기 숙주 미생물체 내부로의 도입에 따르는 기준이 되는 활성을 발현하는 상동의(homologous) 또는 이종의(heterologous) 인코딩하는 핵산일 수 있다. 만약 단백질에 대하여 코딩하는 핵산이 미생물체의 동일한 종으로부터 얻어지는 것이라면, 그것은 상동성 DNA로서 참조된다. 만약 상기 핵산이 다른 미생물 종으로부터 유도되는 것이라면, 그것은 이종의 DNA로서 참조된다. 상기 DNA의 성질과 관계없이, 그것이 상동이거나 또는 이종의 것이거나, 숙주 세포 내부로 도입될 때에, 상기 DNA 및 도입된 DNA로부터 유도되는 활성은 외인성인 것으로 참조된다. 그러나, 본 발명의 인코딩하는 핵산의 외인성 발현은 이종의 및 상동의 양자의 인코딩하는 핵산 중 어느 것 또는 양자를 이용할 수 있다.

"C5 및 C6 당들을 동시적으로 사용하는" 세포는, 그 세포가 C5 및 C6 당 양자의 실질적인 농도를 포함하는 배지 내에서 성장될 때에, 측정 가능한 속도로, 상기 세포의 배지으로의 접종(inoculation)의 시작에서 어떤 실질적인 지연 없이, 자일로스, 아라비노스, 리보스 등과 같은 C5 당, 및 글루코오스, 프락토스, 갈락토오스 등과 같은 C6 당들 양자를 소모하는 세포를 의미한다. C5 및 C6 당 양자를 함유하는 배지는 정제된 당들로부터 제조될 수 있거나, 또는 그것은 바이오매스 가수분해물로부터 유도될 수 있다.

대장균( Escherichia coli ), 시트로박터 프룬디 ( Citrobactor freundii ), 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans), 글루코노박터 아사이(Gluconobacter asaii), 아크로모박터 델마바(Achromobacter delmarvae ), 아크로모박터 비스코서스 (Achromobacter viscosus ), 아크로모박터 락티컴 ( Achromobacter lacticum ), 아그로박테리움 투메파시언스 ( Agrobacterium tumefaciens ), 아그로박테리움 라디오박터 (Agrobacterium radiobacter ), 알칼리진스 페칼리스 ( Alcaligenes faecalis ), 아트로박터 시트레우스 ( Arthrobacter citreus ), 아트로박터 투메슨스 ( Arthrobacter tumescens), 아크로박터 파라피누스 ( Arthrobacter paraffineus ), 아크로박터 하이 드록카보글루타미커스(Arthrobacter hydrocarboglutamicus ), 아크로박터 옥시단스 (Arthrobacter oxydans ), 아우레오박테리움 사퍼다 ( Aureobacterium saperdae ), 아 조박터 인디커스 ( Azotobacter indicus ), 브레비박테리움 암모니아진스 (Brevibacterium ammoniagenes ), 디배리카툼 ( divaricatum ), 브레비박테리움 락토퍼멘툼 (Brevibacterium lactofermentum ), 브레비박테리움 플라붐 ( Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 글로보숨 ( Brevibacterium globosum ), 브레비박테리움 퍼스쿰 (Brevibacterium fuscum ), 브레비박테리움 케토글루타미쿰 ( Brevibacterium ketoglutamicum), 브레비박테리움 헬로콜룸 ( Brevibacterium helcolum ), 브레비박테 리움 퍼실룸 ( Brevibacterium pusillum ), 브레비박테리움 테스타세움 (Brevibacterium testaceum ), 브레비박테리움 로세움 ( Brevibacterium roseum ), 브레비박테리움 이마리오필리움 ( Brevibacterium immariophilium ), 브레비박테리움 리넨스(Brevibacterium linens), 브레비박테리움 프로토파미아 ( Brevibacterium protopharmiae), 코린박테리움 아세토필룸 ( Corynebacterium acetophilum ), 코린박 테리움 글루타미쿰 ( Coryneb acterium glutamicum ), 코린박테리움 칼루나 (Corynebacterium callunae ), 코린박테리움 아세토아시도필룸 ( Corynebacterium acetoacidophilum), 코린박테리움 아세토글루타미쿰 ( Corynebacterium acetoglutamicum), 엔테로박터 에어로진스 ( Enterobacter aerogenes ), 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora ), 에르위니아 카로토보라 ( Erwinia carotovora ), 에르위니아 허비콜라( Erwinia herbicola ), 에르위니아 크리산테미 ( Erwinia chrysanthemi), 프라보박테리움 페레그리눔 ( Flavobacterium peregrinum ), 플라보박테리움 퍼카툼 ( Flavobacterium fucatum ), 플라보박테리움 오란티눔 ( Flavobacterium aurantinum), 플라보박테리움 레나눔 ( Flavobacterium rhenanum ), 플라보박테리움 세와넨스(Flavobacterium sewanense ), 플라보박테리움 브레베 ( Flavobacterium breve), 플라보박테리움 메닌고셉티쿰 ( Flavobacterium meningosepticum ), 마이크로코커스 종 CCM825 ( Micrococcus sp . CCM825 ), 모르가넬라 모르가니 ( Morganella morganii), 노카디아 오파카 ( Nocardia opaca ), 노카디아 루고사 ( Nocardia rugosa ), 플라노코커스 유시나투스 ( Planococcus eucinatus ), 프로테우스 레트게리 ( Proteus rettgeri), 프로피오니박테리움 세르마니 ( Propionibacterium shermanii ), 슈도모나스 신크산타 ( Pseudomonas synxantha ), 슈도모나스 아조토포만스 ( Pseudomonas azotoformans), 슈도모나스 플루오레슨스 ( Pseudomonas fluorescens ), 슈도모나스 오발리스(Pseudomonas ovalis ), 슈도모나스 스투트제리 ( Pseudomonas stutzeri ), 슈도모나스 아시도볼란스 ( Pseudomonas acidovolans ), 슈도모나스 머시도렌스 (Pseudomonas mucidolens ), 슈도모나스 테스토스테로니 ( Pseudomonas testosteroni), 슈도모나스 에어루기노사 ( Pseudomonas aeruginosa ), 로도코커스 에 리트로폴리스 (Rhodococcus erythropolis ), 로도코커스 로도크러스 ( Rhodococcus rhodochrous), 로도코커스 종 ATCC 15592( Rhodococcus sp . ATCC 15592), 로도코커 스 종 ATCC 19070( Rhodococcus sp . ATCC 19070), 스포로사키나 우레아 (Sporosarcina ureae ), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus ), 비브리오 메츠니코비 ( Vibrio metschnikovii ), 비브리오 티로진스 ( Vibrio tyrogenes ), 악티노마두라 마두라 ( Actinomadura madurae ), 악티노마이스 바이오아케오크로모진스 (Actinomyces violaceochromogenes ), 키타사토스포리아 파룰로사 ( Kitasatosporia parulosa), 스트렙토마이스 코엘리컬러 ( Streptomyces coelicolor ), 스트렙토마이스 플라벨루스(Streptomyces flavelus ), 스트렙토마이스 그리세올러스 ( Streptomyces griseolus), 스트렙토마이스 리비단스 ( Streptomyces lividans ), 스트렙토마이스 올리바세우스 (Streptomyces olivaceus ), 스트렙토마이스 타나시엔시스 ( Streptomyces tanashiensis), 스트렙토마이스 버지니아 ( Streptomyces virginiae ), 스트렙토마이스 안티비오티커스 ( Streptomyces antibioticus ), 스트렙토마이스 카카오(Streptomyces cacaoi ), 스트렙토마이스 라벤둘라 ( Streptomyces lavendulae ), 스트렙토마이스 비리도크로모진스 ( Streptomyces viridochromogenes ), 에어로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida ), 바실러스 퍼밀러스 (Bacillus pumilus ), 바실러스 서큘란스 (Bacillus circulans ), 바실러스 티아미노리티커스 (Bacillus thiaminolyticus), 바실러스 리체니포미스 (Bacillus licheniformis ), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis ), 바실러스 아밀로리퀴파시언스 (Bacillus amyloliqyefaciens), 바실러스 코아굴란스 (Bacillus coagulans ), 에셰리키아 프룬디 (Escherichia freundii ), 마이크로박테리움 암모니아필룸 ( Microbacterium ammoniaphilum), 세라티아 마세슨스 ( Serratia marcescens ), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium ), 살모넬라 쇼트뮬레리 (Salmonella schottmulleri ), 클레브시엘라 옥시토카 ( Klebsiella oxytoca ), 클레브시엘라 뉴모니아 ( Klebsiella pneumonieae), 또는 크산토모나스 시트리(Xanthomonas citri)를 포함하는 많은 수의 미생물들이 본 발명에 대하여 적합하다. 본 발명에 대하여 가장 적합한 재조합 미생물들은 바람직하게 엔테로박테리아 과(Enterobacteriaceae family)으로부터 유도된다. 상기 바람직한 미생물들은 에셰리키아 ( Escherichia ), 에르위니아 (Erwinia), 프로비덴시아 ( Providencia ), 클레브시엘라 ( Klebsiella ), 시트로박터 (Citrobactor) 및 세라티아( Serratia ) 속(genera)으로부터 선택된다. 상기 에셰리 키아(Escherichia) 속이 가장 바람직하다. 에셰리키아 ( Escherichia ) 속 내의 대장균(Escherichia coli ) 종이 특히 바람직하다.

상당한 양으로 유기산들을 생산하는 것을 가능하게 하는 이. 콜리 (E. coli ) 균주는 본 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 예로서, 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0148914는 화학적으로 순수한 아세트산염 및/또는 피루브산염의 생산에 대하여 생체 촉매로서의 이. 콜리 (E. coli ) 균주들을 제공한다. 미국 특허 7,629,162는 락트산의 생산을 위하여 제조된 이. 콜리 K011(E. coli K011)의 유도체들을 제공한다. 특허 협정 조약 번호들 WO 2008/115958 및 WO 2010/115067 하에 공개된 국제 특허 출원들은 pH-조절된 배치 발효 내에서 탄소의 소스로서 글루코오스를 포함하는 최소한의 미네랄 염 배지 내에서 숙신산염 및 말산염을 생산하도록 조작된 미생물을 제공한다.

ATCC(아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection))와 같은 컬쳐 콜렉션들로부터 얻어지는 야생형 이 . 콜리 (E. coli ) 균주들이 상업적으로 상당한 양으로 하나 이상의 유기산을 생산할 수 있는 향상된 능력을 가진 균주를 얻기 위하여 유전적으로 엔지니어링될 수 있거나 또한 후속적으로 대사적으로 진화될 수 있다.

여기 기재된 바와 같은 용어들 "유전적으로 엔지니어링된(genetically engineered)" 또는 "유전적으로 엔지니어링하는(genetically engineering)"은 그 미생물들의 게놈 DNA 또는 플라스미드를 조작하는 것을 통해 그 미생물들 내에서의 하나 이상의 효소들의 발현을 개조하는 것의 실행을 의미한다. 게놈 조작들은 게놈 DNA으로부터의 특정 DNA 서열들을 개조하는 것, 부가하는 것 또는 제거하는 것 중 어느 것을 포함한다. 게놈 조작들은 또한 미생물의 게놈 DNA 서열 내로의 외부 DNA 서열의 삽입을 포함한다. 본 발명의 가장 바람직한 실시예들에서, 유전 조작들은 어떤 외부 DNA를 도입하는 일 없이 미생물의 게놈 DNA로부터 특정 DNA 서열들을 제거하는 방법에 의하여 달성된다. 특정한 단백질 생산물에 대하여 코딩하는 유전자의 발현을 비활성화하기 위하여 필요한 특정한 유전자 조작들은 미생물 게놈 내로의 외부 DNA 서열의 삽입을 요구한다. 본 발명의 가장 바람직한 실시예들에서, 도입된 외인성 DNA 서열들은 그 미생물의 게놈 DNA로부터 궁극적으로 제거되며 이에 따라 유전적 엔지니어링 프로세스의 종결 시점에서 그 미생물은 그것의 고유의 게놈 DNA 내에 외인성 DNA의 어떤 것도 가지고 있지 않을 것이다. 본 발명의 바람직한 실시예의 목적들을 달성하기 위하여 필요한 다양한 기술들은 잔타마 외. (Jantama et al.)(바이오테크놀로지 및 바이오엔지니어링(Biotechnology and Bioengineering) 99:1 140-1 153 및 바이오테크놀로지 및 바이오엔지니어링 (Biotechnology and Bioengineering) 101 : 881-893)에 상세하게 기재되어 있다. 공개된 미국 특허 번호 7,629,162 및 미국 특허 출원 2009/0148914 및 국제 공개 번호들 WO 2008/115958 및 WO 2010/115067을 갖는 특허 협정 조약 번호들 하에 국제 특허 출원들은 또한 본 발명의 다양한 실시예들을 실행하는데 있어서 유용한 유전적 엔지니어링 기술들을 기재한다. 이러한 과학적인 공개들 및 특허 문서들은 본 발명에 대하여 유용한 유전적 엔지니어링 기술들에 대한 상세함을 제공하는 목적을 위하여 참조로서 여기에 포함된다.

본 발명의 실행을 위한 적합한 미생물들은 호기성적으로(산소의 존재하에) 또는 혐기성적으로(산소의 완전한 결여에서) 또는 미세 호기성적으로(최소 량의 산소 공급을 가지고) 성장될 수 있다. 대체적으로 본 발명을 위한 적합한 미생물들은, 상기 미생물이, 상업적으로 상당한 양으로 바람직한 유기산들의 생산에 도달하기 위하여 그것을 혐기성 성장 조건으로 이동시키기 전에 세포 성장의 어떤 수준에 도달할 때까지 호기성 성장 조건에서 최초로 성장되는, 이중-상 성장 레짐(double-phase growth regime) 내에서 성장될 수 있다. 특정 유기산을 생산하는 미생물을 만들기 위하여, 당분해(glycolytic) 경로, 트리카르복실산 회로(또한 크레브 (Krebs) 회로 또는 TCA 회로로 알려져 있는) 및 글리옥실산 션트(glyoxylate shunt), 를 포함하는, 많은 수의 미생물의 대사적 경로들에 관련되는 다양한 효소들이, 상기 구절들 내에서 참조에 의해 언급되고 또한 포함된 과학적 및 특허 문헌 내에 기재된 다양한 유전적 엔지니어링 기술들을 사용하여 조작될 수 있다. 모든 그러한 참조들은 참조로서 본 출원 내로 포함된다. 다양한 미생물 대사적 경로들에 대한 상세는 르닝거에 의한 생화학의 이론(Principles of Biochemistry, by Lehninger) 및 루버트 스트라이어에 의한 미생물학(Biochemistry by Lubert Stryer) 과 같은 표준 생화학 교과서들에서 찾아질 수 있다.

바람직한 유기산의 타입에 의존적으로, 대사적 경로들이 유전적으로 엔지니어링되며 이에 따라 미생물은 우리의 선택의 특정 유기산을 생산한다. 상기 미생물들은 많은 수의 유기산들, 락트산, 아세트산, 및 숙신산을 포함하는, 을 합성할 수 있다. 알려진 유전적 엔지니어링 기술들을 사용하여 조작될 수 있는 미생물학적 발효 경로 내에서 활성인 효소들의 목록은, 이에 제한되는 것은 아니나, 이소시트레이트 신터타제(isocitrate synthetase (aceA)), 말레이트 신타제(malate synthase (aceB)), 글리옥실산 션트 오페론(glyoxylate shunt operon (aceBAK)), 아세테이트 키나제-포스포트랜스아세틸라제(acetate kinase- phosphotransacetylase (ackA -pta)); 아코니타제 하이드라타제 1 및 2(aconitase hydratase 1 and 2 (acnA and acnB)); 아세틸-CoA 신터타제(acetyl- CoA synthetase (acs)); 알콜 디하이드로지나제(alcohol dehydrogenase (adhE)); 시트레이트 신타제(citrate synthase (citZ)); 푸마레이트 리듀스타제(fumarate reductase (frd)); 락테이트 디하이드로지나제(lactate dehydrogenases (Idh)); 말레이트 디하이드로지나제(malate dehydrogenase (mdh)); aceBAK 오페론 억제자(aceBAK operon repressor (iclR)); 포스포에놀 피루베이트 카르복실라제(phosphoenol pyruvate carboxylase (pepC)); 피루베이트 포메이트 리아제(pyruvate formate lyase (pfl)); 피루베이트 옥시다제 (pyruvate oxidase (poxB)); 및 피루베이트 카르복실라제(pyruvate carboxylase (pyc))를 포함한다. 당분해(glycolytic) 경로, 트리카르복실산 회로(또한 크레브 (Krebs) 회로 또는 TCA 회로로 알려져 있는) 및 글리옥실산 션트(glyoxylate shunt)에 직접적으로 관여되는 이러한 유전자들 외에, 유기산의 합성을 위한 에너지 소스로서 유용한 탄소 화합물들의 섭취 내에 관여되는 유전자들의 유전자 조작이, 또한 유기산 생산에서의 탄소 섭취를 증진시키거나 또는 에너지 사용의 효울을 증진시키는 어느 것을 위하여 조작될 수 있다. 예로서, 포스포트랜스퍼라제 시스템 (phosphotransferase system (PTS))에 의한 글루코오스 섭취에서의 감소는 미생물 세포 내로의 글루코오스 섭취에 대하여 소모되는 에너지를 감소시키는데에 도움이 될 수 있다. PTS를 조작하는 것에 의하여 보존된 에너지는 유기산 생산의 효율을 향상시키기 위하여 보내어질 수 있다. 포스포트랜스퍼라제 시스템 (phosphotransferase system) 유전자 ptsH 및 ptsG는 글루코오스 섭취에서 에너지를 보존하도록 및 이에 따라 그 미생물에 의한 유기산 생산의 효율을 향상시키도록 조작될 수 있다. 따라서 미생물 대사적 경로들의 영역에서 입수 가능한 데이터를 탐색함으로써, 유전자들의 세트를 삭제할 수 있고, 따라서 대사적 경로들의 대부분을 차단하고 또한 탄소 흐름을 특정 유기산의 생산으로 보낼 수 있다.

중앙의 대사적 경로들 및 당 섭취 메카니즘들 이외에, 박테리아 세포들 내부의 카르복실화 효소들(carboxylating enzymes)은 또한 유기산의 발효적 생산을 향상시키기 위하여 조작될 수 있다. 발효적 생산에서의 카르복실화 효소들의 역할은 현재 잘 확립되어 있다. 카르복실화 효소들의 적어도 네 개의 다른 타입들은 박테리아 세포들 내부에서 기능성인 것으로 알려져 있다. 포스포에놀 피루베이트 카르복실라제(phosphoenol pyruvate carboxylase (PEPcase 또는 PPC))는 포스포에놀 피루베이트를 카르복실화하여 옥살로아세트산의 형성을 유도한다. 말산의 효소들은 (malic enzymes) 피루브산을 카르복실화하여 말산의 형성을 유도하고 또한 NADH 또는 NADPH와 같은 환원된 보조 인자(cofactor)를 요구한다. 피루베이트 카르복실라제(pyruvate carboxylase (PYC))로 알려져 있는 세번 째 카르복실화 효소는 피루브산을 카르복실화하여 옥살로아세트산을 생산한다. 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제(phosphoenolpyruvate carboxykinase (PCK))로 알려져 있는 네번 째 카르복실화 효소는 포스포에놀 피루베이트 분자의 카르복실화로부터 생산되는 옥살로아세트산염의 매 분자에 대하여 한 분자의 ATP의 생산과 함께 포스포에놀 피루베이트를 옥살로아세트산염으로 카르복실화한다. 이러한 카르복실화 효소 중 어느 것은 또한 산업적으로 유용한 화합물들의 발효적 생산을 향상시키기 위하여 헥소스 및 펜토스 당들을 동시적으로 사용할 수 있는 능력을 갖는 박테리아 균주들 내에서 적합하게 조작될 수 있다.

포스포에놀피루베이트 카르복시키나제(phosphoenolpyruvate carboxykinase (pck))는 트리카르복실산 회로 내로의 탄소의 흐름을 향상시키기 위하여 유전적으로 조작될 수 있다. pck의 활성을 향상시키는데 있어서의 유리한 점은 이러한 효소들이 포스포에놀 피루베이트를 옥살로아세트산염으로 카르복실화하는 동안, 생성되는 옥살로아세트산염의 매 분자에 대하여 한 분자의 ATP의 생산의 결과를 가져온다는 사실에 있다. ATP 수율에서의 증가는 세포들의 성장 속도를 증가시킬 것이다.

발효적인 숙신산염 생산을 위한 자연의 pck(native pck)의 채용은 상기 pck 유전자의 전사에 긍정적인 영향을 주는 어떤 돌연변이에 의해 달성될 수 있다. PCK 활성 수준에서의 증가는 그 유전자의 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있는 자연적인 프로모터 또는 어떤 다른 프로모터 서열을 가진 다중 카피 플라스미드 (multicopy plasmid) 내에서 pck 유전자를 발현시키는 방법에 의하여 달성될 수 있다. 세포 내에서 pck 유전자의 발현을 증가시키는 또 다른 방법은 트랜스포존들 (transposons)을 사용하여 pck 유전자의 추가적인 카피들을 집적하는 것이다. 본 발명의 또 다른 실시예에서, pck 유전자의 자연적인 프로모터는 활성 수준을 증가시키는 것으로 알려져 있는 어떤 다른 프로모터 성분들에 의해 대체될 수 있다. 증가된 pck 유전자의 발현은 또한 그 유전자의 프로모터 영역에서의 돌연변이에 의해서 또는 pck 유전자의 프로모터 영역과 상호 작용하는 것으로 알려져 있는 조절 성분들의 유전자 조작에 의해서 중 어느 것에 의해 달성될 수도 있다. pck 유전자의 조절자 단백질에 대하여 코딩하는 유전자는 pck 유전자의 발현을 증가시키기 위하여 어떤 방법으로 돌연변이화되거나 또는 삭제되거나 또는 과발현될 수 있다. 싱글 점돌연변이(pck 유전자의 ATG 개시 코돈에 대하여 관련된 위치 64에서의 G 에서 A 로의 전이) 는 상응하는 포스포에놀 피루베이트 카르복시키나제 효소 활성에서의 증가에 의하여 수반되는 pck 유전자의 전사를 증가시킬 수 있었다. pck 유전자 발현에서의 유사한 증가는 또한 pck 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있는 단백질들에 대하여 코딩하는 유전자들을 유전적으로 조작하는 것에 의하여 달성될 수 있다.

유전적으로 엔지니어링된 미생물에 의한 유기산의 생산은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있는 적당한 기술들에 의해 확인되고 또한 정량화될 수 있다. 예로서, HPLC 기술들인 선택된 클론에 의해 생산된 유기산의 양을 측정하는데에 사용될 수 있다. 상기 HPLC 기술은 또한 선택된 클론들에 의해 생산된 유기산의 순도를 결정하는 데에도 도움을 준다.

본 발명의 미생물은 미생물학 분야에서 잘 알려져 있는 많은 수의 다른 컬쳐 미디아에서 성장될 수 있다. 예로서, 이. 콜리(E. coli)의 야생형 및 돌연변이체 균주들이 1%(w/v) 트립톤(tryptone), 0.5%(w/v) 이스트 추출물, 및 0.5%(w/v) NaCl을 포함하는 루리아-버타니(Luria-Bertani)(LB) 배지에서 성장된다. 생체 효소로서 유전적으로 변형된 미생물을 포함하는 발효적 프로세스를 사용하는 유기산의 상업적 생산을 위하여, 탄소원로 보충된 최소한의 미네랄 염 배지가 선호된다. LB 배지와 같은 풍부 배지에 반대되는 것으로서 최소 미네랄 염 배지의 사용은 상업적 스케일로 유기산들의 생산을 위한 경비를 감소시킨다. 본 발명을 위해 적합한 최소한의 미네랄 배지들은 NBS 배지(코지 외.(Causey et al.), 2007) 및 AM1 배지(마티네즈(Martinez et al.), 2007)을 포함한다. NBS 배지는 1 mM 베타인(betaine), 25.72 mM KH₂P0₄, 28.71 mM KH₂P0₄, 26.50 mM (NH₄)2HP0₄, 1 mM MgS0₄.7H₂0, 0.1 mM CaCl₂.2H₂0, 0.15 mM 티아민(Thiamine) HCl, 5.92 μM FeCl₃6H₂0, 0.84 μM C0C1₂.6H₂0, 0.59 μM CuCl₂. 2H₂0, 1.47 μM ZnCl₂, 0.83 μM Na₂Mo0₄ 2H₂0, 및 0.81 μM H₃B0₃을 포함한다. AM1 배지는 1 mM 베타인(betaine), 19.92 mM (NH₄)₂HP0₄, 7.56 mM NH₄H₂P0₄, 1.5 mM MgS0₄.7H₂0, 1.0 mM 베타인(Betaine)-KCl, 8.88μM FeCl₃6H₂0, 1.26 μM C0C1₂.6H₂0, 0.88 μM CuCl₂.2H₂0, 2.20 μM ZnCl₂, 1.24 μM Na₂Mo0₄2H₂0, 1.21 μM H₃B0 및 2.50 μM MnCl₂4H₂0을 포함한다.

성장 배지 내에서의 유기산들의 축적이 배지 내에서의 pH를 감소시키는 경향이 있기 때문에, 컬쳐 배지에 대하여 요구되는 바와 같이 적합한 중성화시키는 제재들을 부가하는 것이 필요하다. 컬쳐 용기의 pH는 pH 프로브를 사용하여 연속적으로 모니터될 수 있고, 또한 적합한 염기가 그 성장 배지의 pH를 중성 pH 주위로 유지시키기 위하여 부가될 수 있다. 미생물 컬쳐의 pH를 유지하기 위하여 적합한 염기들은 이에 제한되는 것은 아니나, NaOH, KOH, NH₄HC0₃, Na₂C0₃, NaHC0₃, K2CO₃ 및 (NH₄)₂CO₃를 포함한다. 이러한 목적을 위한 적합한 염기들은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.

미생물학적 생산을 위한 미네랄 배지는 탄소원로 보충된다. 본 발명에서 유용한 탄소원들은 이에 제한되는 것은 아니나 자일로스와 같은 펜토스 당들, 글루코오스, 프럭토스, 및 갈락토오스와 같은 헥소스 당들을 포함한다. 상기 탄소원은 또한 글루코오스 및 자일로스의 조합과 같이 다른 당들의 조합을 제공하는 것에 의해 만족될 수도 있다. 탄소원은 또한 스타치(starch) 또는 리그노셀룰로오스 (lignocellulose)의 가수분해로부터 유도될 수도 있다. 스타치(starch) 또는 리그노셀룰로오스(lignocellulose)와 같은 복합 탄수화물들의 가수분해는 본 기술 분야에서 잘 알려져 있는 열-화학적 전화 프로세스 또는 효소적 방법들 중 어느 것을 사용하여 달성될 수 있다. 미생물학적 발효를 사용하는 유기산의 산업적인 생산을 위한 바람직한 탄소원은 농업적(agricultural) 또는 임업적(forestly) 폐기물로부터 유도되는 리그노셀룰로오스 가수분해물이다. 리그노셀룰로오스 가수분해물은 추가적으로 헥소스-풍부한 및 펜토스-풍부한 분획을 생산하도록 추가적으로 분할될 수 있으며, 또한 그러한 분획들은 미생물학적 발효 프로세스를 사용하는 유기산들의 상업적 생산을 위한 탄소의 소스로서 작용할 수 있다. 상기 리그노셀룰로오스 가수분해물은 추가적으로 어떤 농도들 이상에서 많은 수의 미생물들에 대하여 독성인 것으로 발견된 푸르푸랄(furfural)과 같은 어떤 화합물들을 제거하기 위하여 해독될 수 있다.

유전적 엔지니어링으로부터 획득된 미생물 균주들은 유기산들의 생산을 위해 기대되는 유전자형(genotype)을 갖는다. 그러나, 최소한의 미네랄 염 배지 내에서의 그들의 성장 또는 요구되는 속도로 특정 유기산을 생산할 수 있는 그들의 능력 또는 리그노셀룰로오스 가수분해물로부터 유도된 탄소원 내에서의 어떤 화합물에 대한 그들의 내성의 능력은 큰 스케일의 발효 프로세스를 통한 유기산의 상업적 생산을 위한 생체 촉매로서 이러한 유전적으로 변형된 미생물을 사용하기에 적합하지 않을 수 있다. 유전자 결실(gene deletions)로부터 얻어지는 유전적으로 변형된 미생물 균주들은 후속적으로 대사적 적합화(metabolic adaptation) 또는 진화를 통하는 가장 대표적인 클론을 위하여 선택될 수 있다. 상기 대사적 진화의 과정 동안, 선택된 컬쳐는 선택 과정에서 발생된 하나 이상의 자발적인 돌연변이들이 빠른 세포 성장, 다른 탄소원들의 빠른 소비, 다중 당들을 동시적으로 사용할 수 있는 능력, 탄소원 내에서의 독성 화합물들을 참아낼 수 있는 능력 및 바람직한 유기산의 높은 생산 수율 및 생산성 반면 다른 유기산들의 낮은 생산을 나타내는 표현형 (phenotype)의 결과를 가져오는 클론에 도달하기 위하여 반복적으로 일정 시간 주기 동안 신선한 미네랄 배지 내로 이동된다. 대사적 진화 과정에서, 주목은 바람직한 표현형들을 갖는 클론을 선택하는 것에 대하여 주어진다. 특정 유기산을 생산하기 위하여 유전적으로 엔지니어링된 미생물은 상업적으로 매력적인 성장 속도를 가지지 않을 수 있고 또한 결과적으로 그 특정 유기산에 대해 기대되는 수율을 보이지 않을 수 있다. 대사적 진화가 그 특정 유기산의 생산을 위한 증가된 속도에 의해 수반되는 상당한 성장을 보이는 균주를 진화하도록 후속될 수 있다. 탄소원으로서 보충된 미네랄 배지 내에서 매우 우수한 성장 속도를 보이는 그러나 바람직한 유기산의 수율에서는 향상되지 않았던 대사적 진화로부터의 결과로서의 클론은 바람직한 클론이 아니다.

이. 콜리(E. coli)의 KJ122 균주가 본 발명의 바람직한 실시예에서 사용된다. KJ122는 야생형 이 . 콜리 (E. coli ) C 균주으로부터 유전적 엔지니어링 및 대사적 진화 양자의 조합을 포함하는 다중 단계들을 통하여 유도되었다. 유전적 엔지니어링 기술들을 사용하여 락테이트 디하이드로지나제(lactate dehydrogenases (IdhA)), 알콜 디하이드로지나제(alcohol dehydrogenase (adhE)), 포메이트 트랜스포터(formate transporter (focA)), 아세톤 키나제(acetate kinase (ackA)), 피루베이트 포메이트 리아제(pyruvate formate lyase (pflB)), 메틸글리옥살 신타제 (methylglyoxal synthase (mgsA)), 피루베이트 옥시다제(pyruvate oxidase (poxB)), 아세테이트 키나제 활성을 갖는 프로피오네이트 키나제(propionate kinase)(tdcD), α-케토부티레이트 포메이트 리아제(α-ketobutryate formate lyase(tdcE)), 시트레이트 리아제(citrate lyase (citF)), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(aspartate aminotransferase (aspC)), 및 말릭산 효소(malic enzyme (sfcA)를 포함하는 12 개의 다른 유전자들이 부모 이. 콜리 (E. coli ) C 균주 ATCC 8739의 염색체 DNA로부터 삭제되었다. KJ122 균주를 유도하는 이. 콜리 (E. coli ) C 균주 ATCC 8739에 대하여 행해진 상기 유전자 조작들은 잔타마 외.(Jantama et al.)(2008a 2008b)에 의해 상세하게 기재되었다.

미생물이 특정한 바람직한 표현형을 획득하도록 강제하는 선택적인 압력을 사용하는 대사적 진화의 과정 동안에, 두 개의 가능한 변화들이 일어날 수 있다. 그 미생물은 간단히 선택적인 압력에 대하여 그 자신을 순응시킬 수 있고(adapt) 또한 변화된 유전자형(genotype)을 보일 수 있다. 대체적으로, 그 미생물은 선택적인 압력 하에서 특정 유전적 변화들을 경험하고 영원히 변화된 표현형을 나타낼 수도 있다. 단지 순응(adaptation)이 존재하고 또한 어떠한 유전적 변화도 존재하지 않을 때에 그 미생물은 상기 선택 압력이 일단 완화되면 그것의 본래의 표현형으로 복귀할 것이다. 이러한 미생물들은 "순응된(adapted)" 미생물들로 참조된다. 상기 "순응된" 미생물들은 변화된 표현형을 나타내기 위하여 선택 압력하에 또 다른 새로운 라운드(fresh round)의 대사적 진화를 경험해야 한다. 다른 한편, 수반하는 유전적 변화가 존재할 때에, 그 변화된 표현형은 심지어 선택 압력이 존재하지 않을 때에도 계속해서 존재할 것이다. 특정 유전적 변화들에 의해 수반되는 대사적 진화가 바람직하다. 대사적 진화의 과정 동안 안정적인 유전적 변화를 획득하는 미생물은 그 선택 압력을 갖는 신선한 배지로 그것을 이동시키기 이전에 어느 정도의 시간 동안 어떤 선택 압력 없이도 고유의 성장 배지 내에서 그 미생물을 성장시키는 방법에 의하여 용이하게 식별될 수 있다. 만약 이러한 미생물들이 우수한 성장 및 어떤 지연 기간(leg period) 없이 기대되는 표현형을 보일 수 있다면, 그 미생물은 대사적 진화의 과정 동안 표현형을 수반하는 변화된 유전자형을 획득하였다고 간주된다.

대사적 진화의 과정 동안에 얻어진 유전적 변화의 바탕은 그 생물의 염색체 DNA를 서열화하는 것 및 그 서열 데이터를 그 부모 균주의 그것과 비교하는 것에 의하여 결정될 수 있다. 게놈의 서열 데이터는 본 기술 분야에 잘 알려져 있는 하기의 기술들에 의하여 얻어질 수 있다. 따라서, 이. 콜리 (E. coli ) 균주 ATCC 8739로부터 얻어지는 부모 균주 KJ122는 바람직한 새로운 표현형을 갖는 균주를 얻도록 대사적 진화하에 놓일 수 있다. 부모 균주 KJ122과 함께 대사적으로 진화된 새로운 균주의 게놈은 서열화될 수 있고 또한 변화된 표현형의 원인이 되는 대사적으로 진화된 균주 내에서의 돌연변이들이 확인될 수 있다.

본 발명에서 정의된 바와 같이, 용어 돌연변이는 그 유전자 내에서의 뉴클레오티드 서열 내에서의 어떤 변화를 포함한다. 유전자 내에서의 뉴클레오티드 변화는 하나의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 대체하는 것을 유도하는 트리플 코돈 내에서의 단독 뉴클레오티드 변화일 수 있다. 대체적으로, 유전자의 개방 리딩 프레임 내에서의 뉴클레오티드 변화는 그 개방 리딩 프레임의 일부 또는 전체 개방 리딩 프레임의 결실을 포함할 수 있다. 개방 리딩 프레인 내에서의 뉴클레오티드 변화는 또한 중지 코돈(stop codon)의 삽입을 포함할 수 있고, 또한 결과로서, 상기 개방 리딩 프레임은 완전한 길이의 단백질 대신에 일부가 잘린 (truncataed) 단백질에 대하여 코딩한다. 본 발명에서 사용되는 바와 같이, 용어 돌연변이는 또한 개방 리딩 프레임의 상부 또는 하부에서의 뉴클레오티드 서열들 내에서의 변화들을 포함한다. 개방 리딩 프레임의 상부 및 하부 영역들은 몇 개의 조절 뉴클레오티드 서열들을 포함하고 또한 그 개방 리딩 프레임에 의해 코딩되는 단백질의 발현에 관여된다. 이러한 조절 영역들에서 일어나는 돌연변이는 유전자 기능에 대해 상방-조절(up-regulation) 또는 하방-조절(down-regulation) 중 어느 것을 유도하도록 유전자 발현을 개조할 수 있다. 또 다른 가능성은 프레임 이동 돌연변이의 결과를 가져오는 뉴클레오티드 삽입 또는 결실이다.

본 발명으로부터 얻어진 지식을 바탕으로 하여, 펜토스 및 헥소스 당들의 동시적인 사용을 유도하는 유전적 변형들은, 탄소원으로서 글루코오스를 사용하는 하나 이상의 산업적 화합물들의 생산을 위하여 이미 유전적으로 엔지니어링된 어떤 박테리아 균주 내에서 수행될 수 있다. 대체적으로, 펜토스 및 헥소스 당들의 동시적인 사용을 위해 요구되는 유전적 변형은 어떤 야생형 박테리아 당들에 대해 수행될 수 있으며 또한 이에 따라 동시적인 헥소스 및 펜토스 당 사용을 위해 변형된 야생형 박테리아 균주는 상업적 스케일로 산업적 화합물들의 생산에 대하여 적합한 미생물을 개발하기 위해 추가적인 유전적 변형들 하에 놓일 수 있다.

실험 섹션

일반적 기술들

균주 및 접종물 준비(Strain and inoculum preparations): KJ122 (E. coli C, ㅿldhA, ㅿadhE, ㅿackA, ㅿfocA- pflB, ㅿmgsA, ㅿpoxB, ㅿtdcDE, ㅿcitF, ㅿaspC, ㅿsfcA) 이 본 발명에서 사용되었다. KJ122는 이. 콜리 (E. coli ) C (ATCC 8739) 균주으로부터 잔타마 외(Jantama. et al.)(2008a; 2008b) 및 국제 공개 번호들 WO 2008/115958 및 WO 2010/115067을 갖는 특허 협정 조약 번호들 하에 공개된 국제 특허 출원들에 의하여 기재된 바와 같이 유전자 조작들을 통하여 유도되었다. 모든 이러한 문서들은 여기에 참조로서 포함된다.

이. 콜리 (E. coli ) 균주 KJ122는 염기 첨가에 대하여 표준화된, 88 g/L 숙신산염을 생산하기 위하여 AM1 미네랄 미디아 내의 10% 글루코오스를 72 시간 내에 발효시킬 수 있다. AM1 배지는 2.63 g/L (NH₄)₂HP0₄, 0.87 g/L NH₄H₂P0₄, 1 .5 mM MgS0₄, 1.0 mM 베타인(betaine), 및 1.5 ml/L의 미량 성분들을 포함한다. 미량 성분들은 1000X 스톡(stock)으로 준비되며 및 하기 성분들을 포함했다: 1.6 g/L FeCl₃, 0.2 g/L CoCl₂ㆍ6H₂0, 0.1 g/L CuCl₂, 0.2 g/L ZnCl₂ㆍ4H₂0, 0.2 g/L NaMo0₄, 0.05 g/L H₃B0₃, 및 0.33 g/L MnCl₂ㆍ4H₂0. 발효 배지의 pH는 1:4(6N KOH: 3M K₂CO₃) (1.2N KOH, 2.4M K₂CO₃)에 의해 7로 유지된다.

어떤 실시예들에서, 콘 스티프 리쿼(corn steep liquor)가 사용되었다. 그것은 콘 습식-제분 산업으로부터의 부산물이다. 이스트 추출물 및 펩톤(peptone)과 비교할 때, 그것은 비타민 및 미량 성분들의 저렴한 소스이다.

발효( Fermentations ): 발효는 신선한 NBS-2% 자일로스 플레이트 상에 숙신산을 생산하도록 유전적으로 조작된 이. 콜리 (E. coli ) 균주의 글리세롤 스톡을 배열하는 것(streaking)에 의하여 개시되었으며 또한 -80℃ 냉동실에 보관되었다. 16 시간 (37℃) 후에, 플레이트로부터의 세포가 스크랩 되었고 또한 발효 용기 내로 직접적으로 접종되었다. 상기 발효 용기는 350 ml의 작업 부피를 갖는 것이다. 이러한 일차 발효는 "시드(seed)" 컬쳐로서 참조되며, 또한 데이터를 축적하기 위해서는 사용되지 않는다. 모든 발효들에서의 배지는 전통적인 0.03 M KHC)₃, 1 mM 베타인 및 8% 자일로스(다르게 표시되지 않는 한)로 보충되고 또한 1.2N KOH 및 2.4M K₂CO₃로 이루어지는 염기로 중성화되는 AM1 배지였다. 발효 용기는 150 rpm 스터링과 함께 37℃에서 pH 7.0으로 유지되었다. 24 시간 후에, 상기 시드 컬쳐는 0.05의 개시 OD₅₅₀ 에 대하여 새로운 컬쳐(배치 실험들 또는 "이동들(transfers)"인)를 접종하기 위하여 사용되었다. 매일의 이동들을 제외하고, 모든 실험들은 트리플케이트로 수행되었다. C5/C6 공동-발효 실험은 4% 자일로스, 7% 글루코오스, 0.5% 아라비노스, 0.4% 갈락토오스, 및 0.3% 만노스 (순수한 당들)을 포함하였고 단독 탄소원으로서 자일로스 및 0.8% 푸르푸랄(furfural) 상에서 성장하는 컬쳐로부터 접종되었다. C5/C6 공동-발효는 또한 8% 자일로스 및 1% 글루코오스의 혼합물로 수행되었다. 이러한 실험들은 억제자의 첨가 없이 1% 아세톤을 가지고 또는 0.1% 푸르푸랄을 가지고, 트리플케이트로 수행되었다.

세포 성장(Cell growth): 세포 매스(Cell mass)는 써모 일렉트로닉 스펙트로닉 20 스펙트로포토미터(Thermo Electronic Spectronic 20 spectrophotometer)를 사용하여 550 nm(OD₅₅₀)에서의 광학적 밀도를 측정하는 것에 의하여 측정되었다.

유기산 및 당 분석(Organic acid and sugar analysis): 다양한 유기산들 및 당들의 농도가 HPLC에 의해 측정되었다. 발효 배지 내에 존재하는 숙신산 및 다른 유기산들이 바이오라드 아미넥스 HPX-87H 컬럼을 구비한 에질런트 1200 HPLC 장치 (Agilent 1200 HPLC apparatus with BioRad Aminex HPX-87H column) 상에서 분석되었다. 바이오라드 마이크로가드 카타이온(BioRad Microguard Cation) H⁺가 보호 컬럼(guard column)으로서 사용되었다. HPLC 분석에 대한 표준들은 0.008 N 황산 내에서 준비되었다. HPLC 컬럼 온도는 50℃로 유지되었다. 0.008 N 농도에서의 황산은 0.6 m/분의 흐름 속도에서의 이동상으로서 사용되었다. 다양한 성분들의 정량화가 210 nm에서의 그들의 흡광도를 측정하는 것에 의하여 이루어졌다.

대사적 진화(Metabolic evoution ): pH 조절된 발효들로부터의 세포들은 성장을 바탕으로 하는 선택을 통한 대사적 진화를 장려하기 위하여 24 시간에서 연속적으로 이동되었다. 접종물, 새로운 미디아 부피의 약 1/100가 직접적으로 0.05의 개시 OD₅₅₀ 에 대하여 예비적으로-데워진, 신선한 미디아 내로 부가되었다. 향상된 발효 특성들을 가진 클론들이 분리되었다. 상기 대사적 진화 전략은 자일로스 발효를 향상시키기 위하여 적용되었다.

버개스의 준비(Preparation of bagasse): 사탕수수 버개스가 플로리다에서의 당 제분로부터 얻어지며 이것은 전형적으로 에너지를 위한 연소에 의해 사용되는 폐기 부산물이다. 이 폐기 부산물은 희석된 산 예비 처리물을 사용하는 헤미-셀룰로오스 및 셀룰로오스 분획들의 제조를 위한 개시 물질로서 사용된다.

사탕수수 버개스는 약 10%의 수분 함량까지 건조되며 또한 나이프 밀(knife mill)을 사용하여 제분된다. 상기 물질은 온화한 온도에서 희석된 황산을 사용하는 스팀 반응기(지퍼클레이브 및 파르(Zipperclave & Parr))에서 처리된다. 희석된 산 예비 처리를 위한 전형적인 예비 처리 조건들은 0.1-3% 산 농도, 100-200℃의 온도, 및 반응기 내에서의 1-30 분의 체류 시간이다. 최소한의 당 분해를 가지고 최대 자일로스 수율에 도달하기 위한 최적의 반응기 조건들은 약 0.5%의 산 농도, 160 ℃, 및 반응기 내에서의 10 분 간의 체류 시간이다.

PCR 및 DNA 서열화( PCR and DNA sequencing): 두 개의 galP 특이 프라이머들 BY38 및 BY39의 세트(표 1)가, 이. 콜리(E. coli)의 TG400, KJ122 및 WG37 균주들로부터 galP 유전자를 얻는데에 사용되었다. PCR은 뉴 잉글랜드 바이오랩(New England Biolabs)으로부터의 2 퓨전 HF 마스터 믹스 키트(2phusion HF master mix kit)를 사용하는 표준 프로토콜을 사용하여 수행되었다. 상기 PCR 생성물들은 이. 콜리(E. coli )의 이러한 다른 균주들 각각으로부터의 PCR 생성물들의 사이즈를 결정하기 위하여 0.8% 아가로스 젤 상에서 수행되었다. PCR 생성물들은 또한 터프스 DNA 서열화 코어 퍼실리티, 보스톤, MA, USA(Tufts DNA sequencing core facility in Boston, MA, USA)에 의한 생거 방법(Sanger method)을 사용하여 서열화되었다. 상기 서열 데이터는 벡터 NTI 소프트웨어 프로그램(Vector NTI software program)을 사용하여 분석되었다.

이. 콜리(E. coli) 의 WG37 균주의 제조(Construction of WG37 strain of E. col): 이. 콜리(E. coli)의 WG37 균주가 galP 유전자의 전체적인 코딩 영역을 삭제하는 것에 의하여 KJ122 균주으로부터 유도되었다. galP 유전자는 상동성 재조합을 포함하는 두 단계들로 삭제되었다. 제1 단계에서, galP 유전자 서열은 항생제 마커 및 sacB 유전자 서열을 포함하는 카세트에 의해 대체되었다. 그 재조합체들은 항생제를 포함하는 LB 플레이트 상에서 선택되었다. 제2 단계에서, 상기 항생제 카세트는 염색체 DNA로부터 제거되었고 또한 재조합체들은 수크로스를 포함하는 배지 상에서 선택되었다. 수크로스를 함유하는 플레이트들 상에서 성장하는 콜로니들은 sacB 카세트의 손실에 대하여 매우 농축된다.

이. 콜리(E. coli)의 WG37 균주의 제조에서, 칸 카세트(kan cassette)가 프라이머 51a 및 51b(표 1) 및 템플레이트로서 XmnI 소화된 pGW162 플라스미드를 사용하는 PCR에 의해 증폭되었다. kan-sacB 카세트의 DNA 파편이 이. 콜리(E. coli)의 KJ122 균주 내로 도입되었다. 제1 단계에서, 변형체들(transformants)은 이카나마이신(kanamycin)을 포함하는 LB 플레이트 상에서 선택되었고 프라이머들 49a, 49b(표 1)를 사용하는 PCR에 의해 확인되었다. 이러한 균주는 WG35로서 지정되었다. galP 유전자 및 이웃하는 300 bp 영역들이 프라이머들 49a, 49b (표 1)를 사용하여 증폭되었고 또한 플라스미드 pGW180을 생산하기 위하여 pGEMT 에세이 벡터 내로 클론되었다. 이러한 플라스미드 DNA의 희석된 준비물이 프라이머들 50a, 50b(표 1)를 사용하는 인사이드-아웃 증폭(inside -out amplification)을 위한 템플레이트로서 작용하였다. 결과적인 파편이 플라스미드 pGW181을 제조하기 위하여 자가 결찰되었다. pGW181(표 1) 내에서, galP 유전자가 삭제되었다. galP 결실을 포함하는 DNA 파편이 프라이머들 49a, 49b 및 템플레이트로서 플라스미드 pGW181을 사용하는 PCR에 의하여 증폭되었다. PCR 생성물들이 WG35 내로 도입되었고 또한 변형체들이 10% 수크로스를 포함하는 LB 플레이트들 상에서 선택되었다. 결과적인 클론들은 카나마이신 저항성의 손실에 대하여 테스트되었다. 최종적인 galP 결실 균주가 WG37로서 지정되었고 또한 특정 유전자 결실이 프라이머들 49a, 49b(표 1)를 사용하는 PCR에 의하여 확인되었다.

실시예 1

C5 사용

대장균( Escherichia coli ) 균주 KJ122(E. coli C, ΔldhA , ΔadhE , ΔackA , ΔfocA-pflB, ΔmgsA, ΔpoxB, ΔtdcDE, ΔcitF, ΔaspC, ΔsfcA)가 글루코오스, 자일로스 및 아라비노스 상에서 혐기성적으로 성장살 수 있었다. 본 발명의 목적은 이. 콜리(E. coli)의 KJ122 균주를 헥소스 및 다른 펜토스 당들 양자를 포함하는 배지 내에서 미세 호기성적으로 성장시키는 것이며 또한 두 타입의 당들을 동시적으로 사용할 수 있는 생물을 선택하는 것이다. C5 사용에 대한 최초의 스크리닝이 2%의 자일로스로 보충된 NBS 미네랄 배지 플레이트 상에서의 혐기적 성장에 의해 수행되었다. 상기 플레이트들은 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이트되었다. 자일로스 플레이트 상에서 나타나는 콜로니들은 세 개의 연속적인 시간 동안 신선한 플레이트들 상에 배열되었다. 2% 자일로스를 포함하는 솔리드 NBS 미네랄 배지 상에서의 세번 째 이동의 종결 시점에서, 그 플레이트로부터의 세포들이 스크랩되었고 또한 0.03M KHCO₃, 1 mM 베타인 및 8% 자일로스로 보충된 AM1 미네랄 배지를 포함하는 발효 플라스크에 대해 직접적을 접종되었다. 상기 발효 배지는 37℃에서 pH 7.0을 유지하기 위하여 1.2 N KOH 및 2.4 M K₂CO₃를 포함하는 염기로 중성화되었다. 상기 컬쳐는 마그네틱 스터 바로 150 rpm의 속도로 교반되었다. 액상의 컬쳐가 24 시간의 최초 주기 동안 성장되었고 또한 0.5의 최초 OD₅₅₀을 갖는 새로운 컬쳐를 개시하는 시드 컬쳐로서 사용되었다.

자일로스를 갖는 AM1 미네랄 배지 내에서의 이러한 컬쳐는 KJ122의 어떠한 성장도 관찰되지 않는 최초 72 시간의 래그 페이스(lag phase)를 나타냈다. 이러한 최초 래그 주기의 종결 시점에서 KJ122 균주는 성장을 보이기 시작했다. 550 nm 에서의 OD 내에서의 증가에 의하여 측정되는 바로서의 박테리아 세포들의 성장과 함께, 성장 배지 내에서의 숙신산의 농도에서의 비례적인 증가에 의해 동반되는 배지 내에서의 자일로스 농도에서의 감소가 존재하였다.

자일로스 함유 배지 내에서의 216 시간의 성장 주기의 종결 시점에서, 이러한 컬쳐의 글리세롤 스톡이 준비되었고 또한 -80℃에 보관되었다. 216 시간의 성장 주기의 종결 시점에서의 신선한 컬쳐 또는 216 시간의 성장 주기의 종결 시점에서 준비된 컬쳐의 글리세롤 스톡 어느 것이 8% 자일로스로 보충된 AM1 미네랄 배지를 갖는 신선한 발효 용기를 접종하는데에 사용되었다. 접종의 소스와 관계없이, 그것이 신선한 컬쳐로부터인지 또는 글리세롤 스톡으로부터인지, 이차적 발효 용기 내에서의 컬쳐는 어떤 래그 주기없이 성장하였다. 숙신산 생산은 또한 어떤 래그 주기없이 박테리아 성장을 수반하였다. 이에 따라 216시간 주기 동안의 단일 성장 사이클에 의하여 후속되는 2% 자일로스를 포함하는 솔리드 미네랄 배지 상에서의 성장의 3개 라운드들은 자일로스 함유 배지 상에서의 미세 호기성적으로 성장할 수 있는 KJ122의 "순응된 균주(adapted strain)"의 결과를 가져왔다.

실시예 2

KJ122의 대사적 진화

본 발명의 또 다른 실시예에서, KJ122 균주는 대사적 진화 하에 놓여졌다. 자일로스 당로 보충된 액상 AM1 배지 내에서 미생물학적으로 성장하는 KJ122 컬쳐는 2주의 주기 동안 매 24 시간 마다 85 자일로스를 포함하는 신선한 액상 AM1 배지 내로 이동되었다. 이러한 다중 이동들의 종결 시점에서, KJ122 균주는 8% 자일로스로 보충된 AM1 배지를 포함하는 신선한 발효제로 이동되었다. 그 발효제 내에서의 KJ122의 혐기성적인 성장 속도 및 숙신산 생산 또한 자일로스 사용에 대한 동력학이 모니터되었다. 발효제 내에서의 숙신산 생산은 어떠한 래그 주기 없이 즉각적으로 시작되었으며 또한 더 높은 최종 타이터들을 생산하였고 또한 이러한 균주는 "대사적으로 진화된 균주(metabolically evolved strain)"으로서 참조된다. 우리의 균주 컬렉션 내에서, 이러한 대사적으로 진화된 균주는 TG400으로서 지정되었다.

KJ122의 "순응된 균주(adapted strain)" 및 "대사적으로 진화된(metabolic evolved)" TG400 균주가 그들의 변화된 표현형에 대한 어떤 유전적 바탕을 가지고 있는지를 결정하기 위하여, 하기의 실험들이 수행되었다. 비변형된 KJ122 균주, "KJ122의 순응된 균주(adapted strain)" 및 "대사적으로 진화된(metabolic evolved)" TG400 균주가 2% 글루코오스를 함유하는 신선한 미네랄 배지를 갖는 플레이트 상으로 배열되었다. 결과적인 콜로니들이 2% 글루코오스를 가진 신선한 플레이트 상으로 배열되었다. 이러한 배열은 연속적인 11일 동안 매일 수행되었다. 11일 째의 종결 시점에서, 상기 컬쳐가 자일로스를 함유하는 아가(agar) 플레이트 상으로 배열되었다. 자일로스 플레이트 상에서 성장하는 콜로니들은 또 다시 신선한 자일로스를 함유하는 플레이트 상으로 배열되었다. 이것은 액상의 컬쳐에 대하여 두번 째 자일로스를 함유하는 플레이트 상에서 성장하는 콜로니들의 이동에 의하여 후속되었다. 성장 속도, 숙신산 생산 동력학 및 컬쳐 배지 내에서의 자일로스 농도에서의 감소의 속도가 모니터되었다.

도 1, 2, 및 3 인디케이트에서 보여지는 결과와 같이, 성장 배지 내에서의 자일로스의 사라짐에 의해 모니터되는 바와 같은 자일로스 사용은 고유 KJ122 균주 내에서 및 KJ122의 "순응된" 균주 내에서의 양자에서 96 시간의 래그 주기를 보였다. 대사적으로 진화된 TG400 균주의 경우에서, 배지 내의 대부분의 자일로스가 첫번 째 96 시간 내에 소모되었다. 이에 더하여, TG400에 대하여, 숙신산 생산은 어떤 래그 주기도 보이지 않았다. 유사하게, TG400에 대한 세포 성장은 어떠한 래그 주기로 보이지 않았던 반면, KJ122의 "순응된" 균주 및 고유의 KJ122 균주는 약 72 시간의 최초의 래그 주기를 보였다(도 1 및 2). 이러한 관찰들은 분명하게도 대사적으로 진화된 TG400 균주가 대사적 진화의 과정 동안 자일로스의 사용에 대한 안정적인 유전자형을 획득하였으며, 또한 이러한 능력은 이 균주가 자일로스의 결여 내의 몇 세대 동안 성장되었을 때에도 손실되지 않았다는 것을 확립하였다. 다른 한편, 단지 자일로스를 포함하는 배지 내에서 성장하도록 순응된 KJ122 균주는, 자일로스의 결여 내에서의 글루코오스를 포함하는 배지 내에서 몇 세대 동안 성장되는 경우에, 자일로스를 사용할 수 있는 능력을 잃는다. 자일로스의 결여 내에서 성장된 이러한 KJ122의 "순응된 균주"은 탄소원으로서 자일로스를 사용하도록 그 자체를 다시 순응시키기 위하여 추가적인 96시간을 필요로했다. 이에 따라 KJ122의 "순응된 균주"은 96 시간 동안 자일로스를 포함하는 배지 내에서의 그것의 순응의 과정동안 어떠한 유전적 변형도 획득하지 않았다.

탄소원으로서 자일로스를 사용하는 능력을 획득하는 TG400는 탄소원으로서 글루코오스를 사용하는 그것의 능력을 여전히 보유하였다(표 2).

실시예 3

C5 + C6 공동-발효

혐기성 성장 조건들 하에서의 KJ122 내에서, C5 및 C6 당들은 동시적으로 대사되지 않았다. C6 당들은 일반적으로 일차적으로 대사되며, 또한 래그가 C5 대사 이전에 보여졌다. 따라서 C6 및 C5 당 양자의 동일한 양의 존재하에서 TG400의 발효 특성을 결정하는 것은 필수적이다. 도 4에서 보여지는 바와 같이, TG400은 글루코오스와 자일로스를 동일한 속도로 사용할 수 있었고 또한 어떠한 래그 주기 없이 숙신산을 생산하였다. KJ122는 또한 자일로스 및 글루코오스 양자를 사용할 수 있었다. 그러나 KJ122 균주 내에서, 자일로스 사용은 단지 글루코오스 농도의 실질적인 감소 후에 시작되었다. 나아가 표 3에서 보여지는 바와 같이, TG400은 KJ122에 의한 자일로스 및 글루코오스 사용과 비교할 때, 몰 베이스로서 글루코오스보다 더 많은 자일로스를 사용하였다.

실시예 4

C5 당들 내에서 농축된 해독된 버개스 가수분해물의 발효

대사적 진화를 통하여 얻어진 TG400 균주는 그것의 버개스 가수분해로부터 유도되는 자일로스를 사용할 수 있는 능력에 대하여 테스트되었다. 농축된 버개스 가수분해물은 그것을 버개스 가수분해물의 1 킬로그램에 대하여 50 그램의 차콜(charcoal)로 35℃에서 60분 동안 200 rpm 에서의 로터리 쉐이커 내에서 처리하는 것에 의하여 해독되었다. 활성화된 차콜 처리된 C5 농축된 버개스는 pH 조정되었고, AM1 미네랄 염들, 베타인, 및 미량 성분들로 보충되었으며, 또한 그런 다음 여과 살균되었다. 가수분해물은 주로 8%(w/v) 자일로스 (C5) 및 대략적으로 0.8% 글루코오스 (C6), 0.1% 갈락토오스 (C6), 0.1% 만노스 (C6) 및 0.002% 아라비노스 (C5)를 포함하였다. 농축된 해독된 C5 당들 농축된 버개스 가수분해물은 추가적으로 2.5% w/v 콘 스팁 리쿼로 보충되었고 또한 0.5의 최초 OD₅₅₀에 대하여 TG400 균주으로 접종되었다. 도 5 인디케이트에서 보여지는 결과와 같이, 120 시간 내에, 컬쳐 배지 내의 모든 당들인 소비되었고 또한 숙신산염의 지속된(steady) 생산이 존재하였다.

실시예 5

대장균(Escherichia coli)의 KJ122 및 TG400 균주들의 게놈 서열화

부모 균주 KJ122 및 대사적 진화를 통하여 KJ122로부터 유도된 TG400 균주에 대한 전체적인 게놈이 터프스 대학 코어 퍼실리티, 보스톤, MA, USA(Tufts University Core Facility in Boston MA, USA)에서 일루미나 서열화 시스템 (Illumina sequencing system)을 사용하여 서열화되었다. 게놈 분석기 II(Genome Analyzer II)가 일루미나 서열화 테크놀로지(Illumina Sequencing Technology)에 의하여 제공된다. KJ122 및 TG400에 대하여 획득된 게놈 데이터는 KJ122로부터의 TG400의 대사적 진화를 수반하는 유전적 변화들을 확인하기 위하여 서로 비교되었다. TG400 및 KJ122의 비교적 분석은 TG400의 galP 유전자 내에서의 돌연변이적 변화를 나타내었다. TG400 내 galP 유전자는 그것의 개방 리딩 프레임의 뉴클레오티드 위치 889에서 점돌연변이를 나타냈다. 이 지점에서의 시토신 뉴클레오티드는 구아노신 잔기로 변화되었다. 이러한 뉴클레오티드 변화의 결과로서, 아미노 잔기 글리신은 아스파테이트로 변화되었다. galP 유전자에서의 돌연변이는 galP ^* 로서 참조된다. 이러한 돌연변이는 단지 뉴클레오티드 수준에서의 박테리아의 KJ122 및 TG400 균주들 사이에서의 차이점이었다.

실시예 6

TG400 및 KJ122 내에서의 galP 유전자 서열들의 PCR 및 서열 분석

그것의 자일로스 및 글루코오스를 동시적으로 사용할 수 있는 능력에 대한 원인이 되는 TG400 균주 내에서의 galP 유전자 서열에서의 돌연변이가 존재한다는 것이 확립되었기 때문에, 우리는 KJ122 및 TG400으로부터의 galP 유전자를 얻기 위하여 PCR 기술들을 사용하였다. TG400으로부터 얻어지는 PCR 생성물들 및 KJ122으로부터 얻어지는 PCR 생성물들이 서열화되었다. 서열화 데이터로서 위치 296에서의 글리신 잔기를 아스파테이트 잔기(Gly296 to Asp)로 변화시키는 점돌연변이가 밝혀졌다.

실시예 7

galP 유전자 결실의 효과

글루코오스 및 자일로스를 동시적으로 사용할 수 있는 능력을 수반하는 TG400 내에서의 galP 유전자 돌연변이가 존재한다는 것이 확립되었으므로, 우리는 전체적인 galP 유전자의 결실이 돌연변이화된 galP 유전자를 가지는 TG400에서 보여지는 바와 같은 동일한 표현형적 효과를 가질 것인지를 결정할 것을 결정하였다. 이러한 실험에서 우리는 이. 콜리(E. coli)의 KJ122를 부모 균주으로서 사용하였다.

우리는 WG37로 불리는 새로운 균주 galP 유전자 서열을 생산하기 위하여 이. 콜리(E. coli)의 KJ122로부터 galP 유전자 서열을 삭제하였다. 우리는 탄소원으로서 글루코오스 및 자일로스 양자를 포함하는 최소한의 배지 내에서 혐기성적으로 성장된 KJ122, TG400 및 WG37 균주들에서의 성장 동력학, 당 사용 패턴 및 숙신산 생산을 측정하였다. WG37은 96 시간의 경로 동안 글루코오스 및 자일로스 양자를 동시적으로 사용할 수 있었다(도 6). 그것의 성장 동력학 및 당 사용 패턴들은 galP 유전자의 돌연변이된 형태를 갖는 TG400의 그것과 유사하였다. KJ122 내에서, 글루코오스는 72 시간 내에 완전히 소비되었고 반면 자일로스 사용은 최초 24 시간의 래그를 보였다. TG400 내에서 및 WG37 내에서 양자에서, 글루코오스는 성장의 96 시간 후에도 소모되지 않았고, 또한 상당한 양의 글루코오스가 96 시간의 성장에서 그 배지 내에 잔존하였다. 이에 더하여, TG400 및 WG37 내 양자에서, 자일로스 사용은 12 시간과 같이 이르게 검출될 수 있었다.

도 7, 8, 및 9는 본 발명에서 사용되는 세 개의 균주들 모두에서의 숙신산 생산의 동력학의 사이드-바이-사이드 비교를 나타낸다. 4% 자일로스 및 7% 글루코오스를 포함하는 배지 내에서 성장되었을 때, 모든 균주들은 숙신산 생산에 대하여 그들이 비손상 galP 유전자 서열을 가지는지 아닌지에 상관 없이, 유사한 동력학을 보였다. 혼합된 당들을 포함하는 배지 내에서, TG400은 숙신산 생산에 대하여 약간 높은 속도를 보였다(도 7).

탄소의 단독 소스로서 자일로스를 포함하는 배지 내에서, TG400 및 WG37 균주 양자는 KJ122 균주에 의한 숙신산 생산의 속도와 비교되었을 때 숙신산 생산에 대하여 훨씬 빠른 속도를 보였다(도 8).

탄소의 단독 소스로서 글루코오스를 포함하는 배지 내에서, galP 유전자 서열 내의 결실들을 포함하는 두 개의 박테리아 균주들 TG400 및 WG37 균주는 KJ122 균주에 의한 숙신산 생산의 속도와 비교되었을 때 숙신산 생산에 대하여 느린 속도를 보였다(도 9).

실시예 8

자일로스 사용에 대한 galP 내에서의 G297D 점돌연변이의 효과

탄소의 단독 소스로서 자일로스를 포함하는 발효 배지 내에서의 성장 및 숙신산 생산에 대한 G297D(GalP 단백질 내에서의 위치 297에서의 글리신 잔기의 아스파테이트 잔기로의 대체)의 결과를 가져오는 점돌연변이의 효과를 검사하기 위하여, G297D 돌연변이가 KJ122 균주 내의 galP 유전자 서열 내로 도입되었다. SI014 (KJ122 ΔgalP::galP^*)는 프라이머들 17ASPgalP(SEQ ID NO. 9) 및 18SPgalP(SEQ ID NO, 10)를 사용하여 TG400으로부터 돌연변이체 galP^* 유전자를 PCR 증폭하는 것에 의하며 및 그런 다음 온도 조절적 플라스미드, pKD46으로부터 람다 레드 리콤비나제(lambda red recombinase)를 발현하였던 WG35(KJ122 ΔgalP: :kan-sacB) 내에서의 재조합에 의하여 형성되었다. 플라스미드, pKD46는 다음으로 상승하는 온도에서의 성장에 의해 제거되었다(다첸코 및 워너(Datsenko and Waner), 2000).

KJ122가 맥코니 락토스 플레이트(MacConkey lactose plate) 오프로 얻어졌다. SI014(KJ122galP^*)가 LB 2% 글루코오스 플레이트로부터 취해졌다. 플레이트로부터의 스크랩들(scrapes)이 25 mls LB 2% 글루코오스를 접종하기 위하여 사용되었다. 컬쳐들은 8 시간 동안 37℃, 150 rpm에서 성장되었다. 이러한 컬쳐들에 대한 최종 OD₆₀₀은 KJ122에 대하여 0.71 및 SI014에 대하여 0.58이었다. 5 mls의 각 LB 글루코오스 컬쳐가 AM1 10% 글루코오스 배지를 포함하는 300 ml의 시드 발효제를 접종하기 위하여 사용되었다. 이러한 발효는 pH 7.0, 37℃에서 24 시간 동안 유지되었다. 이러한 컬쳐들에 대한 최종 OD₆₀₀은 KJ122에 대하여 3.82 및 SI014에 대하여 2.89였다. 이러한 컬쳐들은 AM1 10% 자일로스 배지를 포함하는 트리플케이트 발효제를 접종하기 위하여 사용되었다. 타겟 최종 OD₆₀₀은 0.1이며, 따라서 KJ122에 대하여 7.85 mls가 사용되었고 또한 SI014에 대하여, 10.38 mls가 300 ml의 발효를 접종하기 위하여 사용되었다. 발효들은 pH 7.0에서 및 37℃에서 97 시간 동안 유지되었다. 샘플들은 OD₆₀₀ 및 대사적 분석을 위하여 매일 취해졌다. 모든 대사물 및 성장 데이터는 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)을 사용하여 도식화 및 분석되었다(2 경로 아노바(2 way ANOVA)).

galP 유전자 내에 위치 297에서 1 아미노산 변화의 결과를 가져오는 점돌연변이를 포함하는 이. 콜리 (E. coli ) 균주 SI014에 대한 성장 프로파일이 도 10에 보여진다. OD₆₀₀ 값들에 의해 탄소의 단독 소스로서 자일로스를 포함하는 배지 상에서, SI014 균주는 KJ122에 비해 훨씬 빨리 및 훨씬 조밀하게 성장한다는 것은 매우 분명하다. 이러한 두 개의 균주들 사이에서의 단지 알려진 차이점은 galP 유전자 내에서의 점돌연변이이다. 도 11은 균주 SI014에 대하여 KJ112와 비교할 때 자일로스의 증가된 소비 및 숙신산 생산에서의 부수적인 증가를 보여준다.

출원인들의 발명은 상기 특정한 참조를 가지고 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 기술되었다. 상기 상술된 기술에 익숙한 숙련된 수행자는 뒤이은 청구항들의 범위로부터 벗어나는 일 없이 어떠한 변형도 이룰 수 있다.

본 발명에서 사용된 프라이머들의 뉴클레오티드 서열
프라이머 번호	프라이머 이름	프라이머 서열
SEQ ID No.1	BY38	5' cagcgtttaatctatgatgatataactcaattattttca 3'
SEQ ID No.2	BY39	5' ggcgatagggagacgggatgttttc 3'
SEQ ID No.3	49a	5' ccgattacaccaaccacaac 3'
SEQ ID No.4	49b	5' ggcgaatttcatagctttcc 3'
SEQ ID No.5	50a	5' gaaataggcgctcacgatta 3'
SEQ ID No.6	50b	5' aaacgtcattgccttgtttg 3'
SEQ ID No.7	51a	5' taaccatattggagggcatcatgcctgacgctaaaaaacaggggcggtcaaacaa ggcaactagcgcatgcatccattta 3'
SEQ ID No.8	51b	5' ctgcaagaggtggcttcctccgcgatgggaggaagcttggggagattaatcgtgag cgcctggcgaagaactccagcatga 3'
SEQ ID No.9	17ASPgalP	5' acccagcacgttttccatca 3'
SEQ ID No.10	18SPgalP	5' tgcgttcaaaggccagcctc 3'

이. 콜리(E. coli)의 KJ122 및 TG400 균주들에 의한 글루코오스 발효
	KJ122		TG400
	mM*	g/L*	mM*	g/L*
소비된 글루코오스	573	103	368	66
숙신산	742	88	492	58
수율	1.29(몰/몰)		1.35(몰/몰)
수율(%) (이론적)	75%		78%

* 여기 제공된 모든 값들은 염기 부가에 대하여 표준화되었다(normalized).

이. 콜리(E. coli)의 KJ122 및 TG400 균주들에 의한 C5 및 C6 당들의 공동-발효. TG400 및 KJ122는 실험 전에 글루코오스를 포함하는 배지 상에 있었다. TG400***은 실험 전에 자일로스 상에서 활발하게 성장하였다. 결과들은 두 발효의 평균이다.
	TG400		KJ122		TG400***
	mM*	g/L*	mM*	g/L*	mM*	g/L*
소비된 자일로스	195	29	142	221	221	33
소비된 글루코오스	389	70	448	80.8	366	66
숙신산	721	85	633	75	810	96
이론적 수율	945	112	971	115	948	112
수율(%)	76%		65%		86%

* 여기 제공된 모든 값들은 염기 부가에 대하여 표준화되었다(normalized).

배치 발효들(8% 자일로스)로부터의 수율-KJ122 대 TG400
균주	조건들	숙신산염 (g/L)	아세트산염(g/L)	말산염 (g/L)	피루브산염(g/L)	수율b (%)	시간 (hrs)
KJ122c	a,c	54	4	5	8	61	192
KJ122	a	50	4	1	7	61	120
TG400	a	70	7	0	0	76	96
KJ122	C5+C6d	75	7	5	2	65	120
TG400	C5+C6d	96	10	1	0	86	120
TG400	가수분해물e	66	6	1	0	92	120

^a 배치 발효들은 다른 언급이 없는 한, 0.03 M KHCO₂, 1 mM 베타인 및 8% 자일로스로 보충된 AM1 미네랄 염 미디아 내에서 트리플케이트로 수행되었다; pH는 1.2 N KOH 및 2.4 M K₂CO₃의 자동적인 첨가에 의해 7.0 에서 조절되었다. 타이터들은 염기 첨가에 대하여 표준화되었다.

^b 수율들은 자일로스의 g 당 1.12 g의 숙신산의 최대 이론적 수율을 가정하여 대사된 당를 바탕으로 한다.

^c 1차 자일로스 발효(듀플리케이트 내에서)

^d 최초 당 농도: 4% 자일로스, 7% 글루코오스, 0.4% 갈락토오스, 0.3% 만노스, 0.5% 아라비노스

^e 버개스로부터 농축된 해독된 C5 가수분해물(도 5 레전드 참조). 최초 당 농도는 하기와 같았다: 56.6 g/L 자일로스, 4.5 g/L 글루코오스, 0.0009 g/L 갈락토오스, 2.7 g/L 아라비노스. 모든 당들이 소비되었다. 발효 과정 동안 생산된 아세트산을 결정하기 위하여 예비 처리 프로세스로부터의 최초 아세트산 4.04 g/L)이 최종 아세트산염으로부터 감해졌다.

SEQUENCE LISTING <110> Myriant Technologie LLC Grabar, Tammy Gong, Wei Yocum R. Rogers <120> Metabolic Evolution of Escherichia coli Strains that Produce Organic Acids <130> MT2010_02PCT <150> US 61/281,483 <151> 2009-11-18 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> SEQ ID NO. 1 <211> 39 <212> DNA <213> Synthetic Primer <220> Feature: PCR Primer BY38 <400> Sequence cagcgtttaa tctatgatga tataactcaa ttattttca 39 <210> SEQ ID NO. 2 <211> 25 <212> DNA <213> Synthetic Primer <220> Feature: PCR Primer BY39 <400> Sequence ggcgataggg agacgggatg ttttc 25 <210> SEQ ID NO. 3 <211> 20 <212> DNA <213> Synthetic Primer <220> Feature: PCR Primet 49a <400> Sequence ccgattacac caaccacaac 20 <210> SEQ ID NO. 4 <211> 20 <212> DNA <213> Synthetic Primer <220> Feature: PCR Primer 49b <400> Sequence ggcgaatttc atagctttcc 20 <210> SEQ ID NO. 5 <211> 20 <212> DNA <213> Synthetic Primer <220> Feature: PCR Primer 50a <400> Sequence gaaataggcg ctcacgatta 20 <210> SEQ ID NO. 6 <211> 20 <212> DNA <213> Synthetic Primer <220> Feature: PCR Primer 50b <400> Sequence aaacgtcatt gccttgtttg 20 <210> SEQ ID NO. 7 <211> 80 <212> DNA <213> Synthetic Primer <220> PCR Primer 51a <400> Sequence taaccatatt ggagggcatc atgcctgacg ctaaaaaaca ggggcggtca aacaaggcaa 60 ctagcgcatg catccattta 80 <210> SEQ ID NO. 8 <211> 81 <212> DNA <213> Synthetic Primer <220> PCR Primer 51b <400> Sequence ctgcaagagg tggcttcctc cgcgatggga ggaagcttgg ggagattaat cgtgagcgcc 60 tggcgaagaa ctccagcatg a 81 <210> SEQ ID NO. 9 <211> 20 <212> DNA <213> Synthetic Primer >220> PCR Primer 17ASPgalP <400> Sequence acccagcacg ttttccatca 20 <210> SEQ ID NO. 10 <211> 20 <212> DNA <213> Synthetic Primer <220> PCR Primer 18SPgalP <400> Sequence tgcgttcaaa ggccagcctc 20

Claims (26)

1. galP 유전자 내에서의 돌연변이를 포함하는 단리된 대장균 박테리아 세포 TG400에 있어서, 상기 박테리아 세포는 PEP-의존성 포스포트랜스퍼라아제 시스템의 활성을 감소시키는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고 C5 및 C6 당들을 동시에 이용하여 공업적으로 유용한 화학물질을 생산하며, 그리고 상기 galP 유전자 내에서의 돌연변이는 위치 297에서 글리신 잔기를 아스파르트산 잔기로 치환하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 대장균 박테리아 세포 TG400.
2. 제 1 항에 있어서,
   적어도 하나의 비-PTS 당 이송자(non-PTS sugar transporter)의 활성을 증가시키는 적어도 하나의 돌연변이를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 대장균 박테리아 세포 TG400.
3. 제 2 항에 있어서,
   상기 비-PTS 당 이송자는 ATP 결합 카세트 이송자(ATP binding cassette transporter)인 것을 특징으로 하는 단리된 대장균 박테리아 세포 TG400.
4. 제 2 항에 있어서,
   상기 비-PTS 당 이송자는 주요 촉진제 상과(major facilitator super family)의 멤버인 것을 특징으로 하는 단리된 대장균 박테리아 세포 TG400.
5. 제 1 항에 있어서,
   발효적 경로에 관여되는 하나 이상의 유전자들의 발현을 비활성화하는 적어도 하나의 돌연변이를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 대장균 박테리아 세포 TG400.
6. 제 1 항에 있어서,
   트리카르복실산 회로에 관여되는 하나 이상의 유전자들을 비활성화하는 적어도 하나의 돌연변이를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 대장균 박테리아 세포 TG400.
7. 제 1 항에 있어서,
   포스포에놀피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 유전자, NADH 의존성 말산 효소를 코딩하는 유전자, 및 NADPH 의존성 말산 효소를 코딩하는 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유전자들 중 적어도 하나에서의 돌연변이를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 대장균 박테리아 세포 TG400.
8. 제 1 항에 있어서,
   외인성 피루베이트 카르복실라제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 대장균 박테리아 세포 TG400.
9. 제 8 항에 있어서,
   상기 외인성 피루베이트 카르복실라제는 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis) 또는 소굼 벌가(Sorghum vulgare) 또는 리조비움 에틀리(Rhizobium etli)로부터 유래된 것을 특징으로 하는 단리된 대장균 박테리아 세포 TG400.
10. 제 1 항에 있어서,
    증가된 포스포에놀 피루베이트 카르복시키나제 활성을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 대장균 박테리아 세포 TG400.
11. 제 10 항에 있어서,
    포스포에놀 피루베이트 카르복시키나제 활성의 증가된 수준은 pck 유전자 내에서의 돌연변이로부터 야기되는 것을 특징으로 하는 단리된 대장균 박테리아 세포 TG400.
12. 제 11 항에 있어서,
    상기 돌연변이는 상기 pck 유전자의 프로모터 영역 내에 있는 것을 특징으로 하는 단리된 대장균 박테리아 세포 TG400.
13. a. galP 유전자 내에 돌연변이를 가지며, PEP-의존성 포스포트랜스퍼라아제 시스템의 활성을 감소시키는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고 C5 및 C6 당들을 동시에 이용하여 공업적으로 유용한 화학물질을 생산하며, 그리고 상기 galP 유전자 내에서의 돌연변이는 위치 297에서 글리신 잔기를 아스파르트산 잔기로 치환하는 것을 포함하는 단리된 대장균 박테리아 세포 TG400을 제공하는 단계;
    b. 펜토스 및 헥소스 당 양자를 동시에 함유하는 배지 내에서 단계 a의 박테리아 세포 TG400을 배양하는 단계; 및
    c. 배양 배지로부터 유기산을 선택적으로 회수하는 단계
    를 포함하는 유기산의 미생물학적 생산을 위한 공정.
14. galP 유전자 내에서의 돌연변이를 포함하는 단리된 대장균 박테리아 세포 WG37에 있어서, 상기 박테리아 세포는 PEP-의존성 포스포트랜스퍼라아제 시스템의 활성을 감소시키는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고 C5 및 C6 당들을 동시에 이용하여 공업적으로 유용한 화학물질을 생산하며, 그리고 상기 galP 유전자 내에서의 돌연변이는 결실인 것을 특징으로 하는 단리된 대장균 박테리아 세포 WG37.
15. 제 14 항에 있어서,
    적어도 하나의 비-PTS 당 이송자(non-PTS sugar transporter)의 활성을 증가시키는 적어도 하나의 돌연변이를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 대장균 박테리아 세포 WG37.
16. 제 15 항에 있어서,
    상기 비-PTS 당 이송자는 ATP 결합 카세트 이송자(ATP binding cassette transporter)인 것을 특징으로 하는 단리된 대장균 박테리아 세포 WG37.
17. 제 15 항에 있어서,
    상기 비-PTS 당 이송자는 주요 촉진제 상과(major facilitator super family)의 멤버인 것을 특징으로 하는 단리된 대장균 박테리아 세포 WG37.
18. 제 14 항에 있어서,
    발효적 경로에 관여되는 하나 이상의 유전자들의 발현을 비활성화하는 적어도 하나의 돌연변이를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 대장균 박테리아 세포 WG37.
19. 제 14 항에 있어서,
    트리카르복실산 회로에 관여되는 하나 이상의 유전자들을 비활성화하는 적어도 하나의 돌연변이를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 대장균 박테리아 세포 WG37.
20. 제 14 항에 있어서,
    포스포에놀피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 유전자, NADH 의존성 말산 효소를 코딩하는 유전자, 및 NADPH 의존성 말산 효소를 코딩하는 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유전자들 중 적어도 하나에서의 돌연변이를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 대장균 박테리아 세포 WG37.
21. 제 14 항에 있어서,
    외인성 피루베이트 카르복실라제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 대장균 박테리아 세포 WG37.
22. 제 21 항에 있어서,
    상기 외인성 피루베이트 카르복실라제는 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis) 또는 소굼 벌가(Sorghum vulgare) 또는 리조비움 에틀리(Rhizobium etli)로부터 유래된 것을 특징으로 하는 단리된 대장균 박테리아 세포 WG37.
23. 제 14 항에 있어서,
    증가된 포스포에놀 피루베이트 카르복시키나제 활성을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 대장균 박테리아 세포 WG37.
24. 제 23 항에 있어서,
    포스포에놀 피루베이트 카르복시키나제 활성의 증가된 수준은 pck 유전자 내에서의 돌연변이로부터 야기되는 것을 특징으로 하는 단리된 대장균 박테리아 세포 WG37.
25. 제 24 항에 있어서,
    상기 돌연변이는 상기 pck 유전자의 프로모터 영역 내에 있는 것을 특징으로 하는 단리된 대장균 박테리아 세포 WG37.
26. a. galP 유전자 내에 돌연변이를 가지며, PEP-의존성 포스포트랜스퍼라아제 시스템의 활성을 감소시키는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고 C5 및 C6 당들을 동시에 이용하여 공업적으로 유용한 화학물질을 생산하며, 그리고 상기 galP 유전자 내에서의 돌연변이는 결실인 것을 특징으로 하는 단리된 대장균 박테리아 세포 WG37을 제공하는 단계;
    b. 펜토스 및 헥소스 당 양자를 동시에 함유하는 배지 내에서 단계 a의 박테리아 세포 WG37을 배양하는 단계; 및
    c. 배양 배지로부터 유기산을 선택적으로 회수하는 단계
    를 포함하는 유기산의 미생물학적 생산을 위한 공정.

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