ES2389582T3 - Materiales y métodos para la producción eficaz de succinato y malato - Google Patents

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Abstract

Una cepa bacteriana modificada genéticamente que comprende modificaciones genéticas para los siguientesgenes objetivo que codifican: a) acetato cinasa, b) lactato deshidrogenasa, c) alcohol deshidrogenasa, d) piruvatoformiatoliasa, e) metilglioxal sintasa, f) piruvato oxidasa, g) citrato liasa, h) aspartato aminotransferasa, i)transportador de formiato, j) fosfato acetiltransferasa, k) enzima málica, y l) propionato cinasa/α-cetobutirato-formiatoliasa, anulando dichas modificaciones genéticas la actividad enzimática del polipéptido producido por dicho genobjetivo.

Description

Materiales y métodos para la producción eficaz de succinato y malato.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
La producción fermentativa de succinato a partir de materias primas renovables será cada vez más competitiva
5 conforme aumenten los precios del petróleo. El succinato puede servir como un sustrato para su transformación en plásticos, disolventes y otros productos químicos actualmente hechos del petróleo (Lee et al., 2004; Lee et al., 2005; McKinlay et al., 2007; Wendisch et al., 2006; Zeikus et al., 1999). Se han descrito muchas bacterias con la capacidad natural de producir succinato como un producto de fermentación principal (patente de EE. UU. Núm. 5.723.322; tabla 1). Sin embargo, frecuentemente se requieren procesos complejos, medios complejos y tiempos de incubación
10 largos.
Anteriormente se han usado una variedad de enfoques genéticos para construir por ingeniería cepas de Escherichia coli para la producción de succinato con grados variables de éxito (tabla 1). En la mayoría de los estudios, los títulos alcanzados fueron bajos, y fueron necesarios ingredientes de medio complejos tales como extracto de levadura o licor de maceración de maíz. La cepa NZN111 produjo succinato 108 mM con un rendimiento molar de 0,98 moles 15 de succinato por mol de glucosa metabolizada (Chatterjee et al., 2001; Millard et al., 1996; Stols y Donnelly, 1997). Esta cepa fue construida por ingeniería desactivando dos genes (pflB, que codifica piruvato formiato liasa, e IdhA que codifica lactato deshidrogenasa), y expresando en exceso dos genes de E. coli, malato deshidrogenasa (mdh) y fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc), de plásmidos multicopia. La cepa HL27659k fue construida por ingeniería mutando los genes de succinato deshidrogenasa (sdhAB), fosfato acetiltransferasa (pta), acetato cinasa (ackA), 20 piruvato oxidasa (poxB), transportador de glucosa (ptsG), y el represor de isocitrato liasa (iclR). Esta cepa produjo succinato menor de 100 mM y requirió condiciones de fermentación de oxígeno limitado (Cox et al., 2006; Lin et al., 2005a, 2005b, 2005c; Yun et al., 2005). El análisis del metabolismo in silico se ha usado para diseñar genes desactivados para crear una ruta en E. coli análoga a la ruta de succinato nativa en Mannheimia succiniciproducens (Lee et al., 2005 y 2006). Sin embargo, la cepa resultante produjo muy poco succinato. Andersson y otros (2007)
25 informaron sobre los valores más altos de producción de succinato (339 mM) por una E. coli construida por ingeniería que contenía solo genes nativos.
Otros investigadores han buscado enfoques alternativos para expresar genes heterólogos en E. coli. La piruvato carboxilasa (pyc) de Rhizobium eteloti fue expresada en exceso a partir de un plásmido multicopia para dirigir el flujo de carbono a succinato (Gokarn et al., 2000; Vemuri et al., 2002a, 2002b). La cepa SBS550MG se construyó
30 desactivando el represor de isocitrato liasa (iclR), adhE, idhA, y ackA, y expresando en exceso citZ (citrato sintasa) de Bacillus subtilis y pyc de R. etli de un plásmido multicopia (Sánchez et al., 2005a). Con esta cepa se produjo succinato 160 mM a partir de glucosa, con un rendimiento molar de 1,6.
También se han investigado procesos más complejos para la producción de succinato (tabla 1). Muchos de estos procesos incluyen una fase de crecimiento aeróbico seguida por una fase de producción anaeróbica. En la fase
35 anaeróbica se suministra frecuentemente dióxido de carbono, hidrógeno, o ambos (Andersson et al., 2007; Sánchez et al., 2005a y 2005b; Sánchez et al., 2006; patente de los Estados Unidos Núm. 5,869,301; Vemuri et al., 2002a y 2002b). En un estudio reciente con un productor de succinato nativo, A. succiniciproducens, se combinó electrodiálisis, rociado con CO2, reciclado celular, y alimentación por lote (Meynial-Salles et al., 2007).
La presente invención provee varias formas de microorganismos, tales como cepas de E. coli, que producen
40 succinato con títulos y rendimientos altos, en medios de sales minerales, durante fermentaciones simples por lote de pH controlado, sin la necesidad de genes heterólogos ni plásmidos. Durante el desarrollo, se caracterizó una cepa intermedia que produjo malato como el producto dominante.
BREVE RESUMEN DE LA INVENCION
El alcance de la presente invención está definido por las reivindicaciones y cualquier información que no se 45 encuentre en las reivindicaciones es proporcionada solamente como información.
La presente invención se refiere a microorganismos novedosos útiles en la producción de ácido láctico, por ejemplo Escherichia coli. Por consiguiente, los materiales y métodos de la presente invención se pueden usar para producir succinato y malato para usarse en una variedad de aplicaciones.
En algunos aspectos de la descripción, se pueden usar derivados de Escherichia coli (también referida aquí como E.
50 coli) para la construcción de cepas que producen succinato, malato y alanina. En varios aspectos se puede usar E. coli C (por ejemplo, ATCC 8739), como se puede usar cualquier otra cepa de E. coli que se pueda obtener de diversos depósitos o fuentes comerciales. También, en algunos aspectos, los microbios de la descripción construidos por ingeniería contienen solo genes nativos (esto es, no contienen material genético de otros organismos). De la siguiente descripción se harán muy evidentes ventajas adicionales de esta exposición.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Figuras 1A-1B. Fermentación de glucosa a succinato. La figura 1A muestra la ruta estándar de fermentación de glucosa en E. coli. Esta ruta ha sido modificada de Unden y Kleefeld (2004). Las flechas en negrita representan las rutas fermentativas centrales. Las cruces representan las supresiones de genes realizadas en este estudio para construir KJ012 (idhA, adhE, ackA). Genes y enzimas: IdhA, lactato deshidrogenasa; pflB, piruvato-formiato liasa; focA, transportador de formiato; pta, fosfato acetil transferasa; ackA, acetato cinasa; adhE, alcohol deshidrogenasa; ppc, fosfoenolpiruvato carboxilasa; pdh, complejo de piruvato deshidrogenasa; gltA, citrato sintasa; mdh, malato deshidrogenasa; fumA, fumB, y fumC, isoenzimas fumarasas; frdABCD, fumarato reductasa; fdh, formiato deshidrogenasa; icd, isocitrato deshidrogenasa; acs, acetil�CoA sintetasa; mgsA, metilglioxal sintasa; poxB, piruvato oxidasa; aldA, aldehído deshidrogenasa; y aldB, aldehído deshidrogenasa. La figura 1B muestra el acoplamiento de la producción de ATP y el crecimiento con la producción de succinato y malato en cepas de E. coli construidas por ingeniería. Las flechas continuas conectan las reservas de NADH. Las flechas de puntos conectan las reservas de NAD+. Durante la glicólisis bajo condiciones anaeróbicas, el crecimiento está acoplado obligadamente con la producción de ATP y la oxidación de NADH.
Figuras 2A-2D. Rutas potenciales de carboxilación para la producción de succinato en E. coli. Los genes que codifican las enzimas clave de carboxilación se muestran en letra negrita. La figura 2A muestra la PEP carboxilasa. No se produce ATP de fosfoenolpiruvato (PEP). Esta es considerada como la ruta principal para la producción de succinato en E. coli durante la fermentación de glucosa.
La figura 2B muestra la enzima málica (NADH). La energía se conserva durante la producción de ATP a partir de ADP y PEP por medio de piruvato cinasa (pykA o pykF). La enzima málica (sfcA) cataliza una carboxilación reductiva conectada con NADH para producir malato. La figura 2C muestra la enzima málica (NADPH). La energía se conserva durante la producción de ATP a partir de ADP y PEP por medio de piruvato cinasa (pykA o pykF). La enzima málica (maeB) cataliza una carboxilación reductiva conectada con NADPH para producir malato. La figura 2D muestra la PEP carboxi cinasa. La energía se conserva por la producción de ATP durante la carboxilación de PEP para producir ácido oxaloacético.
Figuras 3A-3C. Crecimiento durante la evolución metabólica de KJ012 para producir KJ017, KJ032, y KJ060. La cepa KJ012 se transfirió secuencialmente en medio NBS que contenía 5% de glucosa (p/v) (figura 3A) y 10% de glucosa (p/v) (figura 3B), respectivamente, para producir KJ017. Después de la supresión de focA y pflB, la cepa resultante (KJ032) se sub-cultivó inicialmente en medio con un suplemento de acetato (figura 3C). Los niveles de acetato disminuyeron y subsiguientemente se eliminaron durante transferencias adicionales para producir KJ060. La línea quebrada representa la fermentación por KJ017 sin añadir acetato, como comparación. Símbolos: densidad óptica, DO550nn, •.
Figuras 4A-4F. Resumen de productos de fermentación durante la evolución metabólica de cepas para la producción de succinato y malato. Los cultivos se suplementaron con acetato de sodio como se indica. Las flechas negras representan la transición entre las condiciones de fermentación como lo indica el texto. No se detectó formiato y solo se detectaron pequeñas cantidades de lactato durante la evolución metabólica de KJ032. No se detectaron formiato ni lactato durante la evolución metabólica de KJ070 y KJ072. figura 4A (5% de glucosa, p/v) y figura 4B (10% de glucosa, p/v), KJ012 a KJ017; figura 4C (5% de glucosa, p/v) y figura 4D (10% de glucosa, p/v), KJ032 a KJ060; figura 4E, 10% de glucosa, KJ070 a KJ071; figura 4F, 10% de glucosa, KJ072 a KJ073. Símbolos para todos: ., succinato; D, formiato; 1, acetato; ., malato; +, lactato; y T piruvato.
Figura 5. Diagrama que resume los pasos de la ingeniería genética y la evolución metabólica de E. coli C como biocatalizador para la producción de succinato y malato. Este proceso representa 261 transferencias seriadas que proveen más de 2000 generaciones de selección basada en crecimiento. Los clones se aislaron del cultivo final de cada régimen y se les dieron designaciones de cepa, mostradas entre paréntesis en la tabla 3.
Figura 6. Fermentación de glucosa y rutas asociadas. Metabolismo central que indica los genes suprimidos en las construcciones diseñadas por ingeniería para la producción de succinato. Las flechas continuas representan rutas fermentativas centrales. La flecha de trazos representa la ruta microaerófila para la oxidación de piruvato a acetato (poxB). Las flechas de puntos muestran rutas que funcionan normalmente durante el metabolismo aeróbico, piruvato deshidrogenasa (pdh) y la derivación de glioxilato (aceAB). Las cruces dentro de los cuadros representan las tres supresiones iniciales de genes (IdhA, adhE, ackA) que se usaron para construir KJ012 y KJ017. Las cruces simples marcan genes de adición que fueron suprimidos durante la construcción de derivados de KJ017: KJ032 (IdhA, adhE, ackA, focA, pflB), y KJ070 (IdhA, adhE, ackA, focA, pflB, mgsA), y KJ072 (IdhA, adhE, ackA, focA, pflB, mgsA, poxB). Genes y enzimas: IdhA, lactato deshidrogenasa; focA, transportador de formiato; pflB, piruvato-formiato liasa; pta, fosfato acetil transferasa; ackA, acetato cinasa; adhE, alcohol deshidrogenasa; ppc, fosfoenolpiruvato carboxilasa; pdh, complejo de piruvato deshidrogenasa; gltA, citrato sintasa; mdh, malato deshidrogenasa; fumA, fumB, y fumC, isoenzimas fumarasas; frdABCD, fumarato reductasa; fdh, formiato deshidrogenasa; mgsA, metilglioxal sintasa; gloAB, glioxilasa I y II; poxB, piruvato oxidasa; aceA, isocitrato liasa; aceB, malato sintasa; acnAB, aconitasa; y acs, acetil�CoA sintetasa.
Figuras 7A-7C. Producción de succinato y malato en medios de sales minerales (10% de glucosa) por derivados de
E. coli C. La figura 7A muestra la producción de succinato por KJ060 en medio AM1. La figura 7B muestra la producción de succinato por KJ073 en medio AM1. La figura 7C muestra la producción de malato por KJ071 en medio NBS. Las fermentaciones se inocularon en una cantidad de 33 mg de peso seco celular l-1. Símbolos para todos: o, glucosa; •, succinato; ., malato; 1, masa celular.
Figura 8. Construcción de pLOI4162. Las flechas continuas cortas asociadas con pEL04 y pLOI4152 representan cebadores usados para la amplificación de ADN.
Figura 9. Ruta de producción de succinato en KJ073. El gen pck que codifica fosfoenolpiruvato carboxi cinasa, la principal enzima de carboxilación implicada en la producción de succinato en este estudio, se muestra en el tipo inverso. Las flechas continuas indican reacciones que se espera sean funcionales durante la fermentación anaeróbica de la glucosa. Las cruces continuas indican genes suprimidos. Las cruces dentro de los cuadros representan supresiones clave usadas para construir la cepa inicial para la producción de succinato, KJ017 (IdhA, adhE, ackA). La línea de trazos representa la oxidación de piruvato a acetato por PoxB, un proceso que típicamente es funcional solo bajo condiciones microaerófilas. Las líneas de puntos indican reacciones que están asociadas principalmente con el metabolismo aeróbico. Genes y enzimas: IdhA, lactato deshidrogenasa; pflB, piruvato-formiato liasa; focA, transportador de formiato; pta, fosfato acetil transferasa; ackA, acetato cinasa; adhE, alcohol deshidrogenasa; ppc, fosfoenolpiruvato carboxilasa; pdh, complejo de piruvato deshidrogenasa; gltA, citrato sintasa; mdh, malato deshidrogenasa; fumA, fumB, y fumC, isoenzimas fumarasas; frdABCD, fumarato reductasa; fdh, formiato deshidrogenasa; icd, isocitrato deshidrogenasa; acs, acetil CoA sintetasa; mgsA, metilglioxal sintasa; poxB, piruvato oxidasa; aldA, aldehído deshidrogenasa; y aldB, aldehído deshidrogenasa. El gen tdcE (piruvato-formiato liasa, homólogo a pflB) yel gen tcdD (propionato cinasa, homólogo a ackA), se muestran entre paréntesis y son expresados típicamente durante la degradación de treonina.
Figura 10. Porción expandida de metabolismo que ilustra las rutas de genes adicionales que se han suprimido (cruces continuas). El succinato y el acetato son los productos principales (en cuadros) de las fermentaciones de KJ073. Genes y enzimas: citDEF, citrato liasa; gltA, citrato sintasa; aspC, aspartato aminotransferasa; pck, fosfoenolpiruvato carboxi cinasa; sfcA, enzima málica conectada con NAD+; fumA y fumB, fumarasa; frdABCD, fumarato reductasa; pykA y pykF, piruvato cinasa; tdcE, piruvato-formiato liasa (homólogo de pflB); pta, fosfato transacetilasa; tcdD, acetato cinasa (homólogo de ackA).
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
La presente descripción provee materiales y métodos donde se usan combinaciones únicas y ventajosas de mutaciones de genes para dirigir el flujo del carbono a un producto deseado, tal como succinato y/o malato. Las técnicas de la presente descripción se pueden usar para obtener productos a partir de rutas nativas y también de rutas recombinantes. Ventajosamente, la presente descripción provee una plataforma versátil para la producción de estos productos, solo con sales minerales y azúcar como nutrientes.
Un microorganismo de la presente descripción se puede obtener por modificación de uno o más genes objetivo en una bacteria, tal como las que pertenecen a Escherichia. En algunas realizaciones, la bacteria que se modifica puede ser Escherichia coli, o una cepa particular de la misma, tal como E. coli B, E. coli C, E. coli W, o similar. En algunas otras realizaciones de la invención, las bacterias que se pueden modificar de acuerdo con la presente invención, incluyen, sin limitación, Gluconobacter oxydans, Gluconobacter asaii, Achromobacter delmarvae, Achromobacter viscosus, Achromobacter lacticum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Alcaligenes faecalis, Arthrobacter citreus, Arthrobacter tumescens, Arthrobacter paraffineus, Arthrobacter hydrocarboglutamicus, Arthrobacter oxydans, Aureobacterium saperdae, Azotobacter indicus, Brevibacterium ammoniagenes, divaricatum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium globosum, Brevibacterium fuscum, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium helcolum, Brevibacterium pusillum, Brevibacterium testaceum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium immariophilium, Brevibacterium linens, Brevibacterium protopharmiae, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Enterobacter aerogenes, Erwinia amylovora, Erwinia carotovora, Erwinia herbicola, Erwinia chrysanthemi, Flavobacterium peregrinum, Flavobacterium fucatum, Flavobacterium aurantinum, Flavobacterium rhenanum, Flavobacterium sewanense, Flavobacterium breve, Flavobacterium meningosepticum, Micrococcus sp. CCM825, Morganella morganii, Nocardia opaca, Nocardia rugosa, Planococcus eucinatus, Proteus rettgeri, Propionibacterium shermanii, Pseudomonas synxantha, Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas ovalis, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas acidovolans, Pseudomonas mucidolens, Pseudomonas testosteroni, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus sp. ATCC 15592, Rhodococcus sp. ATCC 19070, Sporosarcina ureae, Staphylococcus aureus, Vibrio metschnikovii, Vibrio tyrogenes, Actinomadura madurae, Actinomyces violaceochromogenes, Kitasatosporia parulosa, Streptomyces coelicolor, Streptomyces flavelus, Streptomyces griseolus, Streptomyces lividans, Streptomyces olivaceus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces virginiae, Streptomyces antibioticus, Streptomyces cacaoi, Streptomyces lavendulae, Streptomyces viridochromogenes, Aeromonas salmonicida, Bacillus pumilus, Bacillus circulans, Bacillus thiaminolyticus, Escherichia freundii, Microbacterium ammoniaphilum, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium, Salmonella schottmulleri, Xanthomonas citri, etcétera.
En algunas realizaciones, la presente invención provee cepas bacterianas (tales como E. coli) que carecen de plásmidos, genes de resistencia a antibiótico, y/o material de otros organismos que son adecuados para la producción de succinato o malato. A diferencia de otros sistemas microbianos, los microorganismos de la presente invención se pueden usar en un proceso de producción de un solo paso usando azúcares como sustratos, tienen velocidades altas de producción de producto, rendimientos altos, requerimientos nutricionales simples (por ejemplo medio de sales minerales), y un metabolismo robusto que permite la bioconversión de hexosas, pentosas, y muchos disacáridos.
De esta manera, los microorganismos producidos de acuerdo con la presente descripción pueden tener uno o más genes objetivo desactivados por varios métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los genes objetivo pueden ser desactivados introduciendo inserciones, supresiones o mutaciones aleatorias en el gen objetivo. De esta manera, algunos aspectos de la invención proveen la inserción de por lo menos un codón de detención (por ejemplo de uno a diez codones de detención o más) en el gen objetivo. Algunos aspectos de la invención proveen la inserción o supresión de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 bases o más, para introducir una mutación de desplazamiento de marco en un gen objetivo. Otros aspectos de la invención proveen la inserción o supresión de 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, o 29 bases o más, para introducir una mutación de desplazamiento de marco en un gen objetivo. Otras realizaciones de la presente solicitud proveen la introducción de una o más mutaciones puntuales (por ejemplo, de 1 a 30 o más), dentro de un gen objetivo, mientras que otros aspectos de la invención proveen la supresión parcial, total o completa de un gen objetivo de los microorganismos de la invención. En cada uno de estos aspectos de la invención, las rutas metabólicas son desactivadas por anulación de la actividad enzimática del polipéptido codificado por el gen objetivo.
El “gen objetivo”, como se usa aquí, se refiere al gen que codifica acetato cinasa, alcohol deshidrogenasa, aspartato aminotransferasa, citrato liasa, transportador de formiato, lactato deshidrogenasa, metilglioxal sintasa, piruvatoformiato liasa, piruvato oxidasa, fosfato acetiltransferasa, enzima málica, y/o propionato cinasa/a-cetobutiratoformiato liasa. En algunas realizaciones preferidas, los genes son ackA (acetato cinasa), adhE (alcohol deshidrogenasa), aspC (aspartato aminotransferasa), citCDEF (citrato liasa), focA (transportador de formiato), ldhA (lactato deshidrogenasa), mgsA (metilglioxal sintasa), pflB (piruvato-formiato liasa), poxB (piruvato oxidasa), pta (fosfato acetiltransferasa), sfcA (enzima málica) y/o tdcDE (propionato cinasa/a-cetobutirato-formiato liasa). De esta manera, en algunos aspectos de la descripción, uno o más de estos genes están desactivados en un microorganismo (cualquier cepa bacteriana que contenga dichos genes, por ejemplo E. coli). El proceso de selección de las cepas con mejoramiento del crecimiento y producción de succinato o malato, es referido como “evolución metabólica” (ejemplos de la cual se proveen en los ejemplos descritos). Un “gen nativo de E. coli” o “genes nativos de E. coli”, se entiende que es uno o más genes que se encuentran naturalmente en un microorganismo E. coli, a diferencia de un “gen heterólogo” que se introduce en E. coli y que se obtuvo de cualquier microorganismo diferente de E. coli.
Varios aspectos no limitantes de la presente descripción incluyen:
1.- Una cepa bacteriana modificada genéticamente que comprende modificaciones genéticas en uno o más de los siguientes genes objetivo: a) acetato cinasa, b) lactato deshidrogenasa, c) alcohol deshidrogenasa, d) piruvatoformiato liasa, e) metilglioxal sintasa, f) piruvato oxidasa, y/o g) citrato liasa, anulando dichas modificaciones genéticas la actividad enzimática del polipéptido producido por dicho gen objetivo.
2.- La cepa bacteriana modificada genéticamente de acuerdo con el aspecto 1, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente es: Escherichia coli, Gluconobacter oxydans, Gluconobacter asaii, Achromobacter delmarvae, Achromobacter viscosus, Achromobacter lacticum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Alcaligenes faecalis, Arthrobacter citreus, Arthrobacter tumescens, Arthrobacter paraffineus, Arthrobacter hydrocarboglutamicus, Arthrobacter oxydans, Aureobacterium saperdae, Azotobacter indicus, Brevibacterium ammoniagenes, divaricatum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium globosum, Brevibacterium fuscum, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium helcolum, Brevibacterium pusillum, Brevibacterium testaceum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium immariophilium, Brevibacterium linens, Brevibacterium protopharmiae, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Enterobacter aerogenes, Erwinia amylovora, Erwinia carotovora, Erwinia herbicola, Erwinia chrysanthemi, Flavobacterium peregrinum, Flavobacterium fucatum, Flavobacterium aurantinum, Flavobacterium rhenanum, Flavobacterium sewanense, Flavobacterium breve, Flavobacterium meningosepticum, Micrococcus sp. CCM825, Morganella morganii, Nocardia opaca, Nocardia rugosa, Planococcus eucinatus, Proteus rettgeri, Propionibacterium shermanii, Pseudomonas synxantha, Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas ovalis, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas acidovolans, Pseudomonas mucidolens, Pseudomonas testosteroni, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus sp. ATCC 15592, Rhodococcus sp. ATCC 19070, Sporosarcina ureae, Staphylococcus aureus, Vibrio metschnikovii, Vibrio tyrogenes, Actinomadura madurae, Actinomyces violaceochromogenes, Kitasatosporia parulosa, Streptomyces coelicolor, Streptomyces flavelus, Streptomyces griseolus, Streptomyces lividans, Streptomyces olivaceus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces virginiae, Streptomyces antibioticus, Streptomyces cacaoi, Streptomyces lavendulae, Streptomyces viridochromogenes, Aeromonas salmonicida, Bacillus pumilus, Bacillus circulans, Bacillus thiaminolyticus,
Escherichia freundii, Microbacterium ammoniaphilum, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium, Salmonella schottmulleri, o Xanthomonas citri.
3.- La cepa bacteriana modificada genéticamente de acuerdo con el aspecto 1 o 2, donde dicha cepa bacteriana modificada es E. coli B.
4.- La cepa bacteriana modificada genéticamente de los aspectos 1, 2 o 3, donde los siguientes genes objetivo están desactivados: a) acetato cinasa, b) lactato deshidrogenasa, c) alcohol deshidrogenasa, d) piruvato-formiato liasa, y e) piruvato oxidasa.
5.- La cepa bacteriana modificada genéticamente del aspecto 4, donde dicha cepa bacteriana también comprende un gen de metilglioxal sintasa desactivado.
6.- La cepa bacteriana modificada genéticamente de los aspectos 4 o 5, donde dicha cepa bacteriana también comprende un gen de citrato liasa desactivado.
7.- La cepa bacteriana modificada genéticamente de acuerdo con los aspectos 1, 2, 3, 4, o 5, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente está evolucionada metabólicamente.
8.- La cepa bacteriana modificada genéticamente de acuerdo con los aspectos 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7, donde los genes,
o porciones de los mismos, están suprimidos.
9.- La cepa bacteriana modificada genéticamente de acuerdo con los aspectos 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7, donde los genes son desactivados con mutaciones de desplazamiento de marco, mutaciones puntuales, la inserción de codones de detención, o combinaciones de los mismos.
10.- La cepa bacteriana modificada genéticamente de acuerdo con los aspectos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente es una cepa de E. coli y no contiene un gen exógeno o fragmento del mismo (o contiene solo genes nativos de E. coli).
11.- La cepa bacteriana modificada genéticamente de acuerdo con los aspectos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, con la condición de que: 1) dicha cepa bacteriana modificada genéticamente no debe tener uno o más de los siguientes genes desactivados: a) fumarato reductasa b) ATP sintasa; c) 2-cetoglutarato deshidrogenasa (sucAB); d) succinato deshidrogenasa (por ejemplo, sdhAB), fosfato acetiltransferasa (por ejemplo, pta); e) transportador de glucosa (por ejemplo, ptsG); f) represor de isocitrato liasa (por ejemplo, iclR); y/o 2) que dicha cepa modificada genéticamente no contenga un plásmido o un plásmido multicopia que codifique y/o exprese en exceso genes tales como malato deshidrogenasa (mdh) y fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc), piruvato carboxilasa (pyc) y/o citrato sintasa (por ejemplo, Bacillus subtilis citZ).
12.- La cepa bacteriana modificada genéticamente de acuerdo con los aspectos 1-11, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente es KJ012, KJ017, KJ032, KJ044, KJ059, KJ060, KJ070, KJ071, KJ072 o KJ073.
13.- Un método de cultivo o desarrollo de una cepa bacteriana modificada genéticamente, que comprende inocular un medio de cultivo con una o más cepas bacterianas modificadas genéticamente de acuerdo con uno cualquiera de los aspectos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12, y cultivar o desarrollar dicha cepa bacteriana modificada genéticamente.
14.- Un método de producción de succinato o malato, que comprende cultivar una o más cepas bacterianas modificadas genéticamente de acuerdo con uno cualquiera de los aspectos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12, bajo condiciones que permiten la producción de succinato o malato.
15.- El método de acuerdo con el aspecto 14, donde dicha una o más cepas bacterianas modificadas genéticamente son KJ012, KJ034, KJ044, KJ059, KJ060, KJ070, KJ071, KJ072 o KJ073.
16.- El método de acuerdo con uno cualquiera de los aspectos 13, 14 o 15, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente se cultiva en un medio de sales minerales.
17.- El método de acuerdo con el aspecto 16, donde el medio de sales minerales comprende entre 2% y 20% de carbohidrato (p/v).
18.- El método de acuerdo con el aspecto 17, donde el medio de sales minerales contiene 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 10,5%, 11%, 11,5%, 12%, 12,5%, 13%, 13,5%, 14%, 14,5%, 15%, 15,5%, 16%, 16,5%, 17%, 17,5%, 18%, 18,5%, 19%, 19,5%, o 20% de un azúcar (p/v),
19.- El método de acuerdo con el aspecto 17 o 18, donde el carbohidrato es glucosa, fructosa, xilosa, arabinosa, galactosa, manosa, ramnosa, sacarosa, celobiosa, hemicelulosa, o varias combinaciones de las mismas.
20.- El método de acuerdo con los aspectos 14, 15, 16, 17, 18 o 19, donde el succinato o malato es producido a concentraciones de por lo menos 0,20M, 0,25M, 0,30M, 0,35M, 0,40M, 0,45M, 0,50M, 0,55M, 0,60M, 0,65M, o 0,70M,
21.- El método de acuerdo con los aspectos 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20, donde el medio de cultivo es medio de sales minerales NBS o medio AM1 (véase la tabla 4).
22.- El método de acuerdo con los aspectos 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o 21, donde le rendimiento de succinato o malato es de por lo menos 90% o mayor (mayor o igual que 90%).
23.- El método de acuerdo con el aspecto 22, donde el rendimiento es de por lo menos 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, o 99%,
24.- El método de acuerdo con uno cualquiera de los aspectos 13-16 o 20-23, donde el medio de crecimiento comprende glicerol como sustrato para la producción de succinato, malato o fumarato.
25.- El método de acuerdo con los aspectos 17-19, donde dicho medio también comprende glicerol como sustrato para la producción de succinato, malato o fumarato; o
26.- Una composición que comprende una o más cepas bacterianas modificadas genéticamente de acuerdo con uno cualquiera de los aspectos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12, y un medio.
Las siguientes aspectos adicionales también son provistos por la presente solicitud:
1.- Una cepa bacteriana modificada genéticamente que comprende modificaciones genéticas en los siguientes genes objetivo, que codifican: a) acetato cinasa, b) lactato deshidrogenasa, c) alcohol deshidrogenasa, d) piruvatoformiato liasa, e) metilglioxal sintasa, f) piruvato oxidasa, g) citrato liasa, h) aspartato aminotransferasa, i) transportador de formiato, j) fosfato acetiltransferasa, k) enzima málica, y l) propionato cinasa/a-cetobutirato-formiato liasa, anulando dichas modificaciones genéticas la actividad enzimática del polipéptido producido por dicho gen objetivo.
2.- La cepa bacteriana modificada genéticamente de acuerdo con la realización 1, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente es: Escherichia coli, Gluconobacter oxydans, Gluconobacter asaii, Achromobacter delmarvae, Achromobacter viscosus, Achromobacter lacticum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Alcaligenes faecalis, Arthrobacter citreus, Arthrobacter tumescens, Arthrobacter paraffineus, Arthrobacter hydrocarboglutamicus, Arthrobacter oxydans, Aureobacterium saperdae, Azotobacter indicus, Brevibacterium ammoniagenes, divaricatum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium globosum, Brevibacterium fuscum, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium helcolum, Brevibacterium pusillum, Brevibacterium testaceum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium immariophilium, Brevibacterium linens, Brevibacterium protopharmiae, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Enterobacter aerogenes, Erwinia amylovora, Erwinia carotovora, Erwinia herbicola, Erwinia chrysanthemi, Flavobacterium peregrinum, Flavobacterium fucatum, Flavobacterium aurantinum, Flavobacterium rhenanum, Flavobacterium sewanense, Flavobacterium breve, Flavobacterium meningosepticum, Micrococcus sp. CCM825, Morganella morganii, Nocardia opaca, Nocardia rugosa, Planococcus eucinatus, Proteus rettgeri, Propionibacterium shermanii, Pseudomonas synxantha, Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas ovalis, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas acidovolans, Pseudomonas mucidolens, Pseudomonas testosteroni, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus sp. ATCC 15592, Rhodococcus sp. ATCC 19070, Sporosarcina ureae, Staphylococcus aureus, Vibrio metschnikovii, Vibrio tyrogenes, Actinomadura madurae, Actinomyces violaceochromogenes, Kitasatosporia parulosa, Streptomyces coelicolor, Streptomyces flavelus, Streptomyces griseolus, Streptomyces lividans, Streptomyces olivaceus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces virginiae, Streptomyces antibioticus, Streptomyces cacaoi, Streptomyces lavendulae, Streptomyces viridochromogenes, Aeromonas salmonicida, Bacillus pumilus, Bacillus circulans, Bacillus thiaminolyticus, Escherichia freundii, Microbacterium ammoniaphilum, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium, Salmonella schottmulleri, o Xanthomonas citri.
3.- La cepa bacteriana modificada genéticamente de acuerdo con la realización 2, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente es Escherichia coli.
4.- Una cepa bacteriana modificada genéticamente que comprende:
(a)
modificación genética de un gen de citrato liasa y uno o más de los siguientes genes objetivo que codifican: a) acetato cinasa, b) lactato deshidrogenasa, c) alcohol deshidrogenasa, d) piruvato-formiato liasa, e) metilglioxal sintasa, f) piruvato oxidasa, g) aspartato aminotransferasa, h) transportador de formiato, i) fosfato acetiltransferasa, j) enzima málica, y/o k) propionato cinasa/a-cetobutirato-formiato liasa; o
(b)
modificación genética de un gen de citrato liasa, un gen de lactato deshidrogenasa, un gen de alcohol deshidrogenasa, un gen de acetato cinasa, un gen de transportador de formiato, un gen de piruvato-formiato liasa,
un gen de metilglioxal sintasa, un gen de piruvato oxidasa, y uno o más de los siguientes genes objetivo: a) aspartato aminotransferasa, b) fosfato acetiltransferasa, c) enzima málica, y/o d) propionato cinasa/a-cetobutiratoformiato liasa; anulando dicha modificación genética la actividad enzimática del polipéptido producido por dicho gen objetivo.
5.- La cepa bacteriana modificada genéticamente de acuerdo con el aspecto 4, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente es Escherichia coli, Gluconobacter oxydans, Gluconobacter asaii, Achromobacter delmarvae, Achromobacter viscosus, Achromobacter lacticum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Alcaligenes faecalis, Arthrobacter citreus, Arthrobacter tumescens, Arthrobacter paraffineus, Arthrobacter hydrocarboglutamicus, Arthrobacter oxydans, Aureobacterium saperdae, Azotobacter indicus, Brevibacterium ammoniagenes, divaricatum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium globosum, Brevibacterium fusciim, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium helcolum, Brevibacterium pusillum, Brevibacterium testaceum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium immariophilium, Brevibaclerium linens, Brevibacterium protopharmiae, Corynebacterium acelophilum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Enterobacter aerogenes, Erwinia amylovora, Erwinia carotovora, Erwinia herbicola, Erwinia chrysanthemi, Flavobacterium peregrinum, Flavobacterium fucatum, Flavobacterium aurantinum, Flavobacterium rhenanum, Flavobacterium sewanense, Flavobacterium breve, Flavobacterium meningosepticum, Micrococcus sp. CCM825, Morganella morganii, Nocardia opaca, Nocardia rugosa, Planococcus eucinatus, Proteus rettgeri, Propionibacterium shermanii, Pseudomonas synxantha, Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas ovalis, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas acidovolans, Pseudomonas mucidolens, Pseudomonas testosteroni, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus sp. ATCC 15592, Rhodococcus sp. ATCC 19070, Sporosarcina ureae, Staphylococcus aureus, Vibrio metschnikovii, Vibrio tyrogenes, Actinomadura madurae, Actinomyces violaceochromogenes, Kitasatosporia parulosa, Streptomyces coelicolor, Streptomyces flavelus, Streptomyces griseolus, Streptomyces lividans, Streptomyces olivaceus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces virginiae, Streptomyces antibiolicus, Streptomyces cacaoi, Streptomyces lavendulae, Streptomyces viridochromogenes, Aeromonas salmonicida, Bacillus pumilus, Bacillus circulans, Bacillus thiaminolyticus, Escherichia freundii, Microbacterium ammoniaphilum, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium, Salmonella schottmulleri, o Xanthomonas citri.
6.- La cepa bacteriana modificada genéticamente de acuerdo con el aspecto 5, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente es Escherichia coli.
7.- La cepa bacteriana modificada genéticamente de acuerdo con el aspecto 1, 2, 3, 4, 5 o 6, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente está evolucionada metabólicamente.
8.- La cepa bacteriana modificada genéticamente de acuerdo con el aspecto 1, 2, 3, 4, 5 o 6, donde el gen objetivo,
o porciones del mismo, o genes objetivo, o porciones de los mismos, son desactivados por supresión, mutaciones de desplazamiento de marco, mutaciones puntuales, inserción de codones de detención, o combinaciones de los mismos.
9.- La cepa bacteriana modificada genéticamente de acuerdo con el aspecto 1, 2, 3, 4, 5 o 6, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente no contiene ni un gen exógeno ni un fragmento del mismo, o solo contiene genes nativos.
10.- La cepa bacteriana modificada genéticamente de acuerdo con los aspectos 1, 2, 3, 4, 5, o 6, con la condición de que: 1) dicha cepa bacteriana modificada genéticamente no debe tener uno o más de las siguientes enzimas desactivadas: a) fumarato reductasa b) ATP sintasa; c) 2-cetoglutarato deshidrogenasa; d) succinato deshidrogenasa; e) transportador de glucosa; f) represor de isocitrato liasa; y/o 2) que dicha cepa modificada genéticamente no contenga un plásmido o un plásmido multicopia que codifique o exprese en exceso malato deshidrogenasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa, piruvato carboxilasa, o citrato sintasa.
11.- La cepa bacteriana modificada genéticamente de acuerdo con el aspecto 7, 8, 9, 10, u 11, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente está evolucionada metabólicamente.
12.- La cepa bacteriana modificada genéticamente de acuerdo con uno cualquiera de los aspectos 1-10, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente produce: a) concentraciones de succinato de por lo menos 200 mM, 250 mM 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 650 mM, o 700 mM; b) concentraciones de fumarato de por lo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 650 mM, o 700 mM; o c) concentraciones de malato de por lo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM o 500 mM.
13.- Una cepa bacteriana modificada genéticamente, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente es KJ012, KJ017, KJ032, KJ044, KJ059, KJ060, KJ070, KJ071, KJ072, KJ073, KJ076, KJ079, KJ091, KJ098, KJ104, KJ110, KJ119, KJ122, o KJ134.
14.- Un método de cultivo o desarrollo de una cepa bacteriana modificada genéticamente, que comprende inocular un medio de cultivo con una o más cepas bacterianas modificadas genéticamente de acuerdo con uno cualquiera de llos aspectos 1-13, y cultivar o desarrollar dicha cepa bacteriana modificada genéticamente.
15.- Un método de producción de succinato, fumarato o malato, que comprende cultivar una o más cepas bacterianas modificadas genéticamente de acuerdo con uno cualquiera de los aspectos 1-13, bajo condiciones que permiten la producción de succinato o malato o fumarato.
16.- El método de acuerdo con el aspecto 15, donde dichas cepas bacterianas modificadas genéticamente son KJ012, KJ017, KJ032, KJ044, KJ059, KJ060, KJ070, KJ071, KJ072, KJ073, KJ076, KJ079, KJ091, KJ098, KJ104, KJ110, KJ119, KJ122, o KJ134.
17.- El método de acuerdo con uno cualquiera de los aspectos 14-16, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente se cultiva en un medio de sales minerales.
18.- El método de acuerdo con el aspecto 17, donde el medio de sales minerales comprende entre 2% y 20% de carbohidrato (p/v).
19.- El método de acuerdo con el aspecto 18, donde el medio de sales minerales contiene 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 10,5%, 11%, 11,5%, 12%, 12,5%, 13%, 13,5%, 14%, 14,5%, 15%, 15,5%, 16%, 16,5%, 17%, 17,5%, 18%, 18,5%, 19%, 19,5%, o 20% de un azúcar (p/v).
20.- El método de acuerdo con el aspecto 18 o 19, donde el carbohidrato es glucosa, fructosa, xilosa, arabinosa, galactosa, manosa, ramnosa, sacarosa, celobiosa, hemicelulosa, o combinaciones de las mismas.
21.- El método de acuerdo con uno cualquiera de los aspectos 15-20, donde el rendimiento de succinato o malato es mayor o igual que 90%.
22.- El método de acuerdo con el aspecto 21, donde el rendimiento es de por lo menos 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, o 99%,
23.- El método de acuerdo con uno cualquiera de los aspectos 15-22, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente produce concentraciones de succinato de por lo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 650 mM, o 700 mM.
24.- El método de acuerdo con uno cualquiera de los aspectos 15-22, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente produce concentraciones de malato de por lo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM o 500 mM.
25.- El método de acuerdo con uno cualquiera de los aspectos 15-22, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente produce concentraciones de fumarato de por lo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 650 mM, o 700 mM.
26.- El método de acuerdo con uno cualquiera de los aspectos 14-17 o 21-25, donde el medio de crecimiento comprende glicerol como sustrato para la producción de succinato, malato o fumarato.
27.- El método de acuerdo con uno cualquiera de los aspectos 18-20, donde dicho medio también comprende glicerol como sustrato para la producción de succinato, malato o fumarato; o
28.- Una composición que comprende una o más cepas bacterianas modificadas genéticamente de acuerdo con los aspectos 1-13, y un medio.
Los microorganismos se depositaron como se indica en los ejemplos en la Colección de Cultivos del Servicio de Investigación Agrícola, 1815 N. University Street, Peoria, Illinois, 61604 Estados Unidos. Estos cultivos se depositaron bajo condiciones que aseguran la disponibilidad de los cultivos durante el trámite de esta solicitud de patente para la persona designada por el Comisionado de Patentes y Marcas, de acuerdo con 37 CFR 1.14 y 35 USC 122. Los depósitos están disponibles según se requiera en la legislación de patentes extranjeras en los países donde se presentan las contrapartes de la presente solicitud, o su progenie. Sin embargo, se debe entender que la disponibilidad de los depósitos no constituye una licencia para practicar la presente invención al derogarse los derechos de patente concedidos por la acción gubernamental.
Además, los presentes depósitos de cultivos serán almacenados y se pondrán disponibles al público de acuerdo con las provisiones del Tratado de Budapest para el Depósito de Microorganismos, esto es, serán almacenados con todo el cuidado necesario para mantenerlos viables y no contaminados durante un periodo de por lo menos 5 años después de la solicitud más reciente de suministro de una muestra de los depósitos, y en algún caso, durante un periodo de por lo menos 30 (treinta) años después de la fecha de depósito o durante la vigencia de cualquier patente que pueda expedirse que revele los cultivos. El depositante reconoce la obligación de reemplazar los depósitos si el depositario fuera incapaz de suministrar una muestra cuando se le requiera, debido a la condición de los depósitos.
Todas las restricciones sobre la disponibilidad al público de los presentes depósitos de cultivo serán retiradas irrevocablemente tras la concesión de una patente que los revela.
A continuación se dan ejemplos que ilustran los procedimientos para la práctica de la descripción. Todos los porcentajes son en peso y todas las proporciones de mezcla de disolvente son en volumen, a menos que se indique de otra manera.
EJEMPLO 1
Los microorganismos se depositaron en la Colección de Cultivos ARS de la siguiente manera:
Cultivo
Designación de cepa Fecha de depósito
KJ012
B-50022 15 de marzo de 2007
KJ017
B-50023 15 de marzo de 2007
KJ032
B-50024 15 de marzo de 2007
KJ060
B-50025 15 de marzo de 2007
KJ070
B-50026 15 de marzo de 2007
KJ071
B-50027 15 de marzo de 2007
KJ072
B-50028 15 de marzo de 2007
KJ073
B-50029 15 de marzo de 2007
Materiales y métodos
10 Cepas, medios y condiciones de crecimiento
Las cepas usadas en este estudio se resumen en la tabla 2. Los derivados de E. coli C (ATCC 8739) se desarrollaron para la producción de succinato mediante una combinación única de supresiones de gen y selecciones para aumentar la productividad. Los cultivos se desarrollaron a 37 °C en caldo modificado de Luria-Bertani (LB) (por litro: 10 g de triptona Difco, 5 g de extracto de levadura Difco, 5 g de cloruro de sodio) (Miller, 1992), solo durante la
15 construcción de la cepa. Se incluyeron antibióticos según fuera adecuado.
En la mayoría de los estudios y para el mantenimiento de las cepas se usó como caldo de fermentación un medio de sales minerales NBS (Causey et al., 2004) con un suplemento de KHCO3100 mM, betaína HCl 1 mM, y azúcar (2% a 10%). Durante las últimas etapas de esta investigación se desarrolló un medio nuevo, bajo en sales, AMI (4,2 g l-1 en total de sales; Martínez et al., 2007), y se usó en las fermentaciones con KJ060 y KJ073. A este medio se le añadió
20 un suplemento de KHCO3 100 mM y azúcar como se indica, e incluye betaína 1 mM cuando la concentración inicial de azúcar es de 5% o más alta. En las cepas desarrolladas para la producción de succinato no están presentes genes que codifican resistencia a antibiótico, plásmidos, ni otros genes ajenos, excepto como intermedios durante la construcción.
Métodos genéticos
25 Los plásmidos y cebadores usados en este estudio se resumen en la tabla 2. Los métodos para supresiones cromosómicas, integración, y eliminación de genes de resistencia a antibiótico, se han descrito previamente (Datsenko y Wanner, 2000; Grabar et al., 2006; Posfai et al., 1997; Zhou et al., 2006). Los cebadores efectores contienen secuencias que corresponden al extremo N de cada gen objetivo (en negrita) seguidas por 20 p.b. (subrayados) que corresponden a la casete FRT-kan-FRT. Los cebadores antisentido contienen secuencias que
30 corresponden a la región C-terminal de cada gen objetivo (en negrita), seguidas por 20 p.b. (subrayados) que corresponden a la casete. Fragmentos de ADN amplificados se sometieron a electroporación en cepas de E. coli que alojan recombinasa Red (pKD46). En los recombinantes resultantes, la casete FRT-kan-FRT reemplazó a la región suprimida del gen objetivo por recombinación homóloga (evento de doble cruzamiento). Subsiguientemente, el gen de resistencia (FRT-kan-FRT) se cortó del cromosoma con recombinasa FLP usando el plásmido pFT-A, dejando
35 una región de cicatriz que contiene un sitio FRT. Las supresiones e integraciones cromosómicas se verificaron analizando por marcadores de antibiótico, análisis de PCR y análisis de productos de fermentación. Se usó transducción de fago P1 generalizada (Miller, 1992) para transferir la mutación 1focA-pflB::FRT-kan-FRT de la cepa SZ204 a la cepa KJ017, para producir KJ032.
Supresión de los genes mgsA y poxB
Se desarrolló un método modificado para suprimir genes cromosómicos de E. coli usando un proceso de recombinación homóloga de dos pasos (Thomason et al., 2005). Con este método, no quedan en el cromosoma genes de antibiótico ni secuencias de cicatriz después de la supresión del gen. En la primera recombinación, parte del gen objetivo fue reemplazada por una casete de ADN que contenía un gen de resistencia a cloranfenicol (cat) y un gen de levano sucrasa (sacB). En la segunda recombinación, el casete cat-sacB se reemplazó por secuencias nativas omitiendo la región de supresión. Las células que contienen el gen sacB acumulan levano durante la incubación con sacarosa y son destruidas. Los recombinantes sobrevivientes están altamente enriquecidos en cuanto a la pérdida de la casete cat-sacB.
Se construyó una casete para facilitar las supresiones de genes. La región cat-sacB se amplificó partiendo de pEL04 (Lee et al., 2001; Thomason et al., 2005) mediante PCR usando la serie de cebadores JMcatsacB (tabla 2), se digirió con Nhe1, y se ligó en el sitio correspondiente de pLOI3421 para producir pLOI4151. La casete cat-sacB se amplificó por PCR usando pLOI4151 (molde) y la serie de cebadores cat-up2/sacB-down2 (sitio EcoRV incluido en cada cebador), se digirió con EcoRV, y se usó en ligaciones subsiguientes.
El gen mgsA y regiones vecinas de 500 p.b. (yccT’-mgsA-helD’, 1435 p.b.) se amplificaron usando la serie de cebadores mgsA-up/down y se clonaron en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen), para producir el plásmido pLOI4228. Una preparación diluida 1000 veces de este ADN plasmídico sirvió como molde para la amplificación inversa usando la serie de cebadores mgsA-1/2 (ambos cebadores dentro del gen mgsA y mirando hacia fuera). El fragmento resultante de 4958 p.b. que contenía el replicón, se ligó en la casete cat-sacB digerida con EcoRV amplificada de pLOI4151, para producir pLOI4229. Este fragmento de 4.958 p.b. también se usó para construir un segundo plásmido, pLOI4230 (fosforilación y autoligación). En pLOI4230, la región central de mgsA está ausente (yccT’-mgsA’-mgsA"- helD’).
Después de la digestión de pLOI4229 y pLOI4230 con XmnI (dentro del vector), cada uno sirvió como molde para la amplificación usando la serie de cebadores mgsA-up/down para producir los fragmentos de ADN lineales para el paso de integración I (yccT’-mgsA’- cat-sacB-mgsA"-helD’) y el paso II (yccT’-mgsA’-mgsA’’-helD’), respectivamente. Después de la electroporación del fragmento del paso I en KJ060, que contenía pKD46 (recombinasa Red) y 2 h de incubación a 30 °C para permitir la expresión y segregación, los recombinantes se seleccionaron por resistencia al cloranfenicol (40 mg l-1) y ampicilina (20 mg l-1) sobre placas (30 °C, 18 h). Se escogieron tres clones, se desarrollaron en caldo de Luria con ampicilina y 5% p/v de arabinosa, y se prepararon para la electroporación. Después de la electroporación con el fragmento del paso II, las células se incubaron a 37 °C durante 4 horas y se transfirieron a un matraz de 250 ml que contenía 100 ml de LB modificado (tampón MOPS 100 mM añadido y NaCl omitido), que contenía 10% de sacarosa. Después de incubación durante la noche (37 °C), se seleccionaron clones sobre placas de LB modificado (sin NaCl; MOPS 100 mM añadido), que contenía 6% de sacarosa (39 °C, 16 h). Los clones resultantes se probaron por pérdida de resistencia a ampicilina y cloranfenicol. La construcción se confirmó adicionalmente por análisis de PCR. Se seleccionó un clon que carecía del gen mgsA y se designó como KJ070.
El gen poxB se suprimió de KJ071 de manera análoga a la que se usó para suprimir el gen mgsA. Las series de cebadores adicionales (poxB-up/down y poxB-1/2) usadas para construir la supresión de poxB se incluyen en la tabla 2, junto con los plásmidos correspondientes (pLOI4274, pLOI4275, y pLOI4276). La cepa resultante se designó como KJ072.
Análisis enzimático
Las células se desarrollaron en medio NBS con 5% o 10% de glucosa, y se cosecharon durante el crecimiento semilogarítmico por centrifugación (8.000 g durante 5 minutos a 4 °C), se lavaron con tampón Tris-HCl 100 mM (pH 7,0), y se volvieron a suspender en el mismo tampón (5 ml). Las células se rompieron por tratamiento con cuentas de vidrio (MP Biomedicals; Solon, Ohio) y después se centrifugaron a 13.000 g durante 15 minutos para obtener el extracto bruto. Las proteínas se midieron mediante el método BCA, con albúmina de suero bovino como estándar (Protein Assay Kit de Pierce BCA).
La actividad de PEP carboxilasa se midió como se describió antes (Canovas y Romberg, 1969). La mezcla de reacción contiene tampón Tris-HCl 100 mM (pH 8.0), MgCl2 10 mM, DTT 1 mM, NaHCO3 25 mM, NADH 0,2 mM, 20 U de malato deshidrogenasa, y PEP 10 mM. La reacción se inició con la adición del extracto bruto. La actividad de PEP carboxi cinasa se midió como se describió antes (Van der Werf et al., 1997). La mezcla de reacción contiene tampón MES 100 mM (pH 6,6), MgCl2 10 mM, NaHCO3 75 mM, MnCl2 5 mM, ADP 50 mM, DTT 1 mM, NADH 0,2 mM, 20 U de malato deshidrogenasa, y PEP 10 mM. La reacción se inició con la adición del extracto bruto.
La actividad de la enzima málica dependiente de NAD+ se midió en ambas direcciones como se describió antes (Stols y Donnelly, 1997). Para dirigir la carboxilación, la mezcla de reacción contiene tampón Tris-HCl 100 mM (pH 7,5), NaHCO3 25 mM, MnCl2 1 mM, DTT 1 mM, NADH 0,2 mM, y piruvato 25 mM. La reacción se inició agregando el extracto bruto. Sin embargo, este método de análisis no puede medir la actividad de la enzima málica en E. coli C de tipo salvaje debido a la presencia de lactato deshidrogenasa. Para la descarboxilación, la mezcla de reacción
contiene tampón Tris-HCl 100 mM (pH 7,5), NAD+ 2,5 mM, DTT 1 mM, MgCl2 10 mM, KCl 20 mM y L-malato 20 mM. La reacción se inició agregando el extracto bruto.
La actividad de la enzima málica dependiente de NADP+ se midió de la misma forma que la enzima málica dependiente de NADP+, excepto que el NAD(H)+ fue reemplazado por NADP(H)+. Se definió 1 unidad de actividad como la cantidad de enzima necesaria para oxidar o reducir 1 nmol de sustrato por minuto.
Análisis de RT-PCR de tiempo real
Se usó RT-PCR de tiempo real para medir los niveles de ARN mensajero como se describió previamente (Jarboe et al., 2008). Las células se desarrollaron en medio NBS con 5% o 10% de glucosa y se cosecharon durante el crecimiento semilogarítmico, agitando en un baño de hielo seco/etanol, seguido por centrifugación y almacenamiento a -80 °C en RNALater (Qiagen, Valencia California), hasta purificación. Se realizó la purificación de ARN con columnas RNeasy Minicolumn (Qiagen), seguido por digestión con DNaseI (Invitrogen). En la transcripción inversa con Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, California) se usaron como molde 50 ng de ARN en total. La PCR de tiempo real se realizó en un Bio-Rad iCycler con una mezcla SYBR Green RT-PCR (Bio-Rad, Hercules, California). Se verificó si el ARN tenía contaminación de ADN genómico ejecutando una RT-PCR en ausencia de transcripción inversa. La abundancia de transcrito se estimó usando ADN genómico como estándar y los grados de expresión se normalizaron por medio del gen birA, un represor de transcripción (Jarboe et al., 2008). Los cebadores de RT-PCR usados para pck y birA se enumeran en la tabla 2.
Secuenciación de la región pck
Para saber si había ocurrido alguna mutación en el gen pck de KJ073, la región codificante y la región promotora (aproximadamente 800 p.b. delante de la región codificante) del gen pck, tanto en KJ012 como en KJ073, se amplificarno por medio de ADN polimerasa PfuUltra High Fidelity DNA Polymerase (Stratagene; Wilmington, Delaware). Se usó la serie de cebadores pck-F/R para amplificar la región codificante por medio del terminador de transcripción. La serie de cebadores pck-2 se usó para amplificar la región promotora. La secuenciación de ADN fue provista por el Centro Interdisciplinario de Investigación de Biotecnología de la Universidad de Florida (con autosecuenciadores de Applied Biosystems).
Fermentaciones
Se desarrollaron cultivos de siembra y fermentaciones a 37 °C, 100 rpm, en medio de sales minerales NBS o AM1 que contenían glucosa, KHCO3 100 mM y de betaína HCl 1 mM. Estos se mantuvieron a pH 7,0 mediante la adición automática de KOH durante los experimentos iniciales. Subsiguientemente el pH se mantuvo agregando una mezcla
1:1 de K2CO3 3 M y KOH 6N. Las fermentaciones se efectuaron en pequeños recipientes de fermentación con un volumen de trabajo de 350 ml. Las fermentaciones se inocularon a una DO550 inicial de 0,01 (3,3 mg de peso seco celular l-1) o 0,1 (33,3 mg de peso seco celular l-1), como se indica. En las cepas que se probaron no estuvieron presentes genes de resistencia a antibiótico. Los recipientes de fermentación se sellaron excepto por una aguja de calibre 16 que sirvió como una ventilación para la retirada de muestras. La anaerobiosis se alcanzó rápidamente durante el crecimiento, sirviendo el bicarbonato añadido para asegurar una atmósfera de CO2.
Análisis
La masa celular se estimó a partir de la densidad óptica a 550 nm (DO 1,0 = 333 mg de peso seco de célula l-1) con un espectrofotómetro Bausch & Lomb Spectronic 70. Se determinaron los ácidos orgánicos y azúcares usando cromatografía líquida de alta resolución (Grabar et al., 2006).
Resultados y discusión
Construcción de KJ012 para la producción de succinato: supresión de IdhA, adhE, y ackA
Por mucho, la mayor parte del conocimiento científico sobre E. coli deriva de las investigaciones en un medio complejo tal como el caldo de Luria, en lugar de un medio de sales minerales usando concentraciones bajas de sustratos de azúcar (típicamente 0,2% p/v; 11 mM), en lugar del 5% (p/v) de glucosa (278 mM) y 10% p/v (555 mM) de glucosa usados en los estudios referidos en la presente memoria. Se requieren grandes cantidades de azúcar para producir cantidades comercialmente significativas de producto. Investigadores anteriores han descrito la construcción de muchos derivados de E. coli para la producción de succinato en medio complejo (tabla 1). Con el medio complejo, el diseño racional basado en las rutas primarias ha sido razonablemente exitoso para demostraciones académicas de ingeniería metabólica. Sin embargo, el uso de nutrientes complejos para la producción de productos de fermentación bacteriana aumenta el costo de los materiales, el costo de la purificación, y el costo asociado con la disposición de desechos. El uso de un medio de sales minerales, sin componentes de medio complejos debe ser mucho más eficiente en costo.
La E. coli C crece bien en medio de sales minerales NBS que contiene glucosa, y produce una mezcla de lactato, acetato, etanol y succinato como productos de fermentación (figura 1A; tabla 3). A diferencia de otros estudios con
E. coli (tabla 1), los estudios aquí referidos se han centrado en el desarrollo de cepas que son capaces de convertir
una cantidad alta de azúcares en succinato usando un medio de sales minerales para minimizar los costos de materiales, la purificación de succinato y la disposición de desechos. Por inspección de las figuras 1A-1B que ilustran las rutas de fermentación estándares generalmente aceptadas para E. coli, se ideó un diseño racional para la ingeniería metabólica de una cepa productora de succinato, en la que se hicieron supresiones en genes que codifican los pasos finales de todos los productos alternativos: lactato (IdhA), etanol (adhE) y acetato (ackA). Los resultados de esta ingeniería metabólica por diseño racional fueron completamente inesperados. La cepa resultante (KJ012) creció muy débilmente bajo condiciones anaeróbicas en un medio de sales minerales que contenía 5% de glucosa (278 mM), y produjo acetato en lugar de succinato como el producto de fermentación primario. Contrario a las expectativas del diseño racional, el succinato permaneció como un producto menor. Los rendimientos molares de succinato basados en la glucosa metabolizada no cambiaron como resultado de estas mutaciones, 0,2 moles de succinato por mol de glucosa para el progenitor y KJ012 durante la fermentación en medio de sales minerales NBS que contenía 5% de glucosa. Los autores de la presente invención confirmaron que un medio de sales minerales NBS contiene todos los nutrientes minerales necesarios para el crecimiento de KJ012, incubando bajo condiciones aeróbicas (matraz agitado aeróbico; 5% de glucosa). En matraces agitados aeróbicos, los rendimientos celulares para KJ012 fueron 5 veces más altos que durante el crecimiento anaeróbico, y 75% del rendimiento de E. coli C (progenitor) durante el crecimiento anaeróbico. Estos resultados también confirmaron que todas las rutas biosintéticas centrales permanecen funcionales en KJ012.
Cuando estuvieron presentes nutrientes complejos (caldo de Luria), la producción fermentativa de succinato en KJ012 aumentó 20 veces en comparación con KJ012 en medio de sales mínimo, y el rendimiento molar para succinato aumentó 3,5 veces. Claramente, el diseño racional basado en las rutas primarias es más adecuado para demostraciones académicas o para procesos de diseño destinados a usarse con nutrientes complejos.
La base del crecimiento débil, la producción baja de succinato y el aumento de la producción de acetato en KJ012 (1ldhA::FRT 1adhE::FRT 1ackA::FRT) durante el metabolismo anaeróbico en el medio de sales minerales, es desconocida. Estas son consecuencias inesperadas que resultaron de la ingeniería metabólica usando el diseño racional basado en los mapas de la ruta estándar. Claramente, en un medio mínimo los diseños racionales para ingeniería metabólica no son predecibles. La cepa resultante, KJ012, fue inferior al progenitor en crecimiento y no fue mejor que el progenitor para la producción de succinato.
Desarrollo de KJ017 para la producción de succinato por selección de KJ012 basada en crecimiento
KJ012 (1dhA::FRT 1adhE::FRT 1ackA::FRT) creció débilmente en comparación con la E. coli C progenitora, exhibió velocidades de producción de succinato más bajas y no dio mejores rendimientos molares (tabla 3). A pesar de estos resultados, se intentó la transferencia en serie de esta cepa como un método para co-seleccionar crecimiento y producción de succinato mejorados basándose en el siguiente razonamiento. Generalmente se piensa que la ruta principal para la fermentación de glucosa a succinato (figura 1A y figura 2A) es usando fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc) para el paso de carboxilación (Unden y Kleefeld, 2004; Fraenkel 1996; Keseler et al., 2005; Millard et al., 1996; Gottschalk, 1985; Karp et al., 2007). Esta enzima de carboxilación no conserva el fosfato de alta energía en el fosfoenolpiruvato y disminuye el ATP neto disponible para el crecimiento. Se pueden contemplar rutas alternativas para la producción de succinato usando el repertorio conocido de genes de E. coli que podrían aumentar los rendimientos de ATP y podrían así aumentar el crecimiento (figura 1A; figuras 2B, 2C y 2D). Sin embargo, se ha observado que ninguna de estas rutas alternativas funciona para la producción de succinato durante la fermentación con cepas nativas de E. coli. Las enzimas clave en estas rutas alternativas están reprimidas por glucosa y normalmente se activan durante la gluconeogénesis. Típicamente, los niveles de estas enzimas gluconeogénicas varían inversamente con la disponibilidad de glucosa y otros metabolitos (Goldie y Sanwal, 1980a; Wright y Sanwal, 1969; Sanwal y Smando, 1969a), y funcionan en dirección inversa, descarboxilación (Keseler et al., 2005; Oh et al., 2002; Kao et al., 2005; Stols y Donnelly, 1997; Samuelov et al., 1991; Sanwal, 1970a; Delbaere et al., 2004; Goldie y Sanwal, 1980b; Sanwal y Smando, 1969b; Sanwal 1970b).
La enzima clave para una de estas, la enzima málica ligada a NADH (sfcA) (figura 2B), ha mostrado ser capaz de aumentar la producción de succinato en E. coli, pero requiere la expresión en exceso de un plásmido para hacerlo así (Stols y Donnelly, 1997). Sin embargo, sería de esperar que ninguna de estas rutas alternativas fuera funcional en cepas nativas de E. coli o KJ012 durante el crecimiento anaeróbico con altos niveles de glucosa. Las transferencias en serie de KJ012 con selección por crecimiento mejorado ofrecen una oportunidad para seleccionar la activación mutacional de rutas alternativas para la producción de succinato (figura 1B), que mantienen el equilibrio rédox y aumentan los rendimientos de ATP.
KJ012 fue transferida en serie en medio de glucosa NBS bajo condiciones fermentativas tan rápidamente como lo permitió el crecimiento (figura 3A; figura 4A; figura 5). El crecimiento permaneció lento, requiriéndose 4-5 días de incubación entre las primeras 9 transferencias, después aumentó notablemente permitiendo hacer las transferencias a intervalos de 24 horas. Este evento fue acompañado por un aumento en acetato (figura 4A), con poca mejora en la producción de succinato. Después de 27 transferencias (60 días), el KOH se reemplazó con una mezcla 1:1 de K2CO3 3M y KOH 6N para proveer dióxido de carbono adicional (100 mM añadidos inicialmente a todo el medio de sales minerales NBS). La continuación de las transferencias mejora la producción de succinato. Se hicieron un total de 40 transferencias en glucosa al 5% (227 mM), seguido por otras 40 transferencias en glucosa al 10% (555 mM). Durante las transferencias en glucosa al 10%, los rendimientos de succinato permanecieron en aproximadamente
0,7 moles por mol de glucosa metabolizada, con lactato, acetato y formiato como coproductos (tabla 3). Este rendimiento fue 3 veces más alto que el de E. coli C y KJ012. Se aisló un clon y se designó como KJ017. La selección para las mejoras en el crecimiento de KJ012 para producir KJ017 co-seleccionó mejoras en la producción de succinato (velocidad, título, y rendimiento molar).
Base fisiológica del incremento de producción de succinato por KJ017
El succinato producido por E. coli usando la ruta considerada generalmente como la ruta de fermentación natural (fosfoenolpiruvato carboxilasa; ppc) consume la energía del fosfoenolpiruvato produciendo fosfato inorgánico. Se pierde un ATP por succinato producido mediante esta ruta (fig. 1; fig. 6). La conservación de esta energía como ATP usando sistemas de enzima alternativos representa una oportunidad para aumentar el crecimiento celular y coseleccionar un incremento de producción de succinato. Basándose en genes conocidos de E. coli, se contempla que otras tres rutas de enzima para producción de succinato conservarían ATP y así aumentarían el crecimiento (fig. 1; fig. 6). Sin embargo, se piensa que todos los pasos de carboxilación en estas rutas alternativas funcionan en dirección inversa (descarboxilación), principalmente por gluconeogénesis, durante el crecimiento sobre sustratos tales como ácidos orgánicos (Keseler et al., 2005; Oh et al., 2002; Kao et al., 2005; Stols y Donnelly, 1997; Samuelov et al., 1991; Sanwal, 1970a; Delbaere et al., 2004; Goldie y Sanwal, 1980b; Sanwal y Smando, 1969b; Sanwal 1970b). Para probar la hipótesis de que la selección basada en crecimiento para desarrollar KJ017 ha activado en realidad una o más de estas rutas alternativas, se compararon actividades específicas de los pasos clave de carboxilación (tabla 4). Tres de estas fueron similares o más bajas en E. coli C, KJ012, y KJ017. La energía que conserva la fosfoenolpiruvato carboxi cinasa (pck) se incrementó 4 veces en KJ017 en comparación con KJ012, coherente con la hipótesis de que la selección por crecimiento mejorado co-seleccionaría un incremento de producción de succinato por medio del incremento de los rendimientos de ATP, una consecuencia del incremento de la expresión de una ruta conservadora de energía para la producción de succinato.
Se usaron selecciones ulteriores basadas en crecimiento y supresiones de gen adicionales para construir muchas cepas adicionales con más mejoras en el crecimiento y la producción de succinato (fig. 3 y fig. 4). También se examinaron los niveles de enzima en una de estas, KJ073. En esta cepa, la actividad in vitro de la fosfoenolpiruvato carboxi cinasa aumentó adicionalmente a 8 veces la de KJ017, mientras que las otras enzimas de carboxilación permanecieron esencialmente sin cambio (tabla 4).
El pck y regiones circundantes se clonaron de KJ012 y KJ073, y se secuenciaron. No se encontraron cambios en la región codificante. En ausencia de modificaciones posteriores a la traducción, las propiedades catalíticas de la enzima estarían sin cambio. Se detectó una sola mutación en la región promotora de pck, G a A, en el sitio -64 p.b. con respecto al sitio de iniciación de traducción. Esta mutación estaba detrás del sitio de iniciación de transcripción, que es el sitio -139 p.b. con respecto al sitio de iniciación de traducción. La restauración de esta secuencia (A a G) en KJ073 a la de E. coli C, no afecta al crecimiento celular, la fermentación, ni la producción de succinato, indicando que esta mutación no es esencial (datos no mostrados). La RT-PCR confirmó que los niveles de mensaje estaban elevados en KJ073. Estos resultados son coherentes con una mutación reguladora como la base del incremento de expresión de pck.
Investigadores anteriores habían notado que los parámetros cinéticos de fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc) y fosfoenolpiruvato carboxi cinasa (pck) podían tener efectos importantes sobre la carboxilación y la producción de succinato (Millard et al., 1996; Kim et al., 2004). La Km hacia bicarbonato para fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc) de
E. coli es de 0,15 mM (Morikawa et al., 1980), 9 veces más baja (13 mM) que fosfoenolpiruvato carboxi cinasa (pck) de E. coli (Krebs y Bridger 1980). Aunque la expresión en exceso de pck de E. coli en un plásmido multicopia aumentó 50 veces se informó que la actividad de fosfoenolpiruvato carboxi cinasa no tenía efecto sobre la producción de succinato (Millard et al., 1996). La producción de succinato tampoco aumentó cuando la fosfoenolpiruvato carboxi cinasa de Anaerobiospirillum succiniciproducens fue expresada en exceso en E. coli K12 (Kim et al., 2004). Esta enzima también tiene una Km alta para bicarbonato (30 mM; Laivenieks et al., 1997). Sin embargo, cuando pck de A. succiniciproducens fue expresada en exceso en un mutante ppc de E. coli K12, la producción de succinato aumentó 6,5 veces (Kim et al., 2004). En KJ017 y derivados subsiguientes, claramente la fosfoenolpiruvato carboxi cinasa es la actividad de carboxilación dominante, incluso en presencia de fosfoenol piruvato carboxilasa nativa funcional.
Los resultados de las mediciones de enzima de E. coli C fueron muy sorprendentes. La enzima considerada generalmente como la responsable de la actividad dominante de carboxilación en la producción de succinato por E. coli nativa (fosfoenolpiruvato carboxilasa; ppc) durante el crecimiento (Unden y Kleefeld, 2004; Fraenkel 1996; Keseler et al., 2005; Millard et al., 1996; Gottschalk 1985; Karp et al., 2007), no fue la enzima más activa in vitro en
E. coli C. De esta manera, las rutas metabólicas generalmente aceptadas para E. coli (Unden y Kleefeld, 2004; Fraenkel 1996; Sánchez et al., 2006; Cox et al., 2006; Vemuri et al., 2002a; Wang et al., 2006; Sánchez et al., 2005ab; Gokarn et al., 2000; Karp et al., 2007), en las cuales típicamente se basan el diseño racional de ingeniería metabólica y las estimaciones de flujo metabólico, pueden no reflejar con precisión el metabolismo de todas las cepas. Bajo condiciones de saturación de sustrato in vitro, la actividad de fosfoenolpiruvato carboxi cinasa fue la más alta. En E. coli K12, se informó que las actividades tanto de fosfoenolpiruvato carboxilasa como de fosfoenolpiruvato carboxi cinasa eran iguales in vitro (140 nM min-1 mg-1 de proteína celular, Van der Werf et al., 1997), sirviendo la primera como la ruta primaria para succinato.
Estudios previos mostraron que la expresión en exceso de un gen ppc nativo en E. coli dio como resultado una producción de succinato específica más alta (Millard et al., 2000), velocidad de crecimiento específico más alta, y producción de acetato específica más baja, debido a más carboxilación de PEP para reabastecer los intermedios del ciclo de TCA (Farmer y Liao, 1997). Sin embargo, puesto que se requiere PEP para el sistema de transporte de glucosa, la expresion en exceso de ppc también disminuye la velocidad de captación de glucosa en 15%-40% sin aumentar significativamente el rendimiento de succinato (por glucosa), en comparación con un control isogénico (Chao y Liao, 1993; Gokarn et al., 2000). Esta incapacidad de la fosfoenolpiruvato carboxilasa nativa para aumentar los rendimientos de succinato desvió la mayor parte de la atención de investigación a un nuevo diseño metabólico, la expresion en exceso de la PYC (piruvato carboxilasa) de Lactobacillus lactis o Rhizobium etli como el paso de carboxilación (Vemuri et al., 2002ab; Gokarn et al., 2000; Lin et al., 2005abc), en lugar de proseguir con el trabajo con el repertorio nativo de los genes de E. coli.
Bacterias del rumen tales como Actinobacillus succinogenes producen succinato como un producto primario durante la fermentación de glucosa, usando la energía que conserva fosfoenolpiruvato carboxi cinasa para la carboxilación (Kim et al., 2004; McKinlay et al., 2005; McKinlay y Vieille, 2008). Las actividades referidas para este organismo son 5 veces las de KJ017, y la mitad de las obtenidas por selección basada en crecimiento continuo (evolución metabólica) de KJ073. De esta manera, usando una combinación de ingeniería metabólica (IdhA, adhE, ackA) y evolución metábolica (selección de mayor eficiencia de producción de ATP basada en el crecimiento), los estudios aquí referidos demuestran el desarrollo de cepas de E. coli productoras de succinato que se asemejan a un organismo del rumen tal como A. succinogenes, usando solamente el repertorio nativo de genes de E. coli. A pesar de los informente anteriores de que la expresion en exceso de la fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc) de E. coli no es útil para la producción de succinato en ausencia de una mutación en fosfoenolpiruvato sintasa (Chao y Liao, 1993; Kim et al., 2004; Gokarn et al., 2000; Millard et al., 1996), han sido construidos por ingeniería KJ017 y derivados para usar fosfoenolpiruvato carboxi cinasa como la ruta primaria para la producción de succinato y malato.
Construcción de KJ032 y KJ060
Durante el crecimiento con glucosa al 10% (p/v), fueron abundantes coproductos no deseados (acetato, formiato y lactato) en fermentaciones con KJ017 (MldhA::FRT MadhE::FRT MackA::FRT), a pesar de la supresión de genes que codifican las actividades primarias de lactato deshidrogenasa (IdhA) y acetato cinasa (ackA) (tabla 3). La producción de lactato y acetato también podría dar como resultado en rendimientos de ATP más altos, una base para la selección basada en el crecimiento (figura 1A).
El gen que codifica piruvato-formiato liasa (pflB) fue suprimido de KJ017 para eliminar la pérdida de reductor como formiato y un exceso de acetil~CoA, una fuente potencial de acetato. El transportador de formiato aguas arriba (focA) en este operón también se suprimió. Como era de esperar, esta cepa suprimida (KJ032) no creció sin acetato, confirmando que esta es la ruta primaria para la producción de acetil~CoA en KJ017 (figura 3C). Es bien conocido que la supresión de pflB ocasiona auxotrofia de acetato bajo condiciones anaeróbicas (Sawers y Bock, 1988). El crecimiento y la producción de succinato por KJ032 se restauraron agregando acetato 20 mM (fig. 3C, fig. 4C, y fig. 5). La producción de formiato y acetato se redujo sustancialmente como resultado de la supresión de pflB (y focA). Aunque esta cepa requirió acetato para su crecimiento, también se produjo acetato adicional durante la fermentación. Se informó previamente del mismo fenómeno para cepas con pflB suprimido durante la construcción de biocatalizadores de E. coli K-12 para la producción de piruvato (Causey et al., 2004). Los niveles de lactato también se redujeron en KJ032 (tabla 3; figura 4C). Transferencias subsiguientes fueron acompañadas por mejoras en el crecimiento y producción de succinato. El acetato añadido se redujo, el tamaño del inóculo se redujo, y la concentración de glucosa se duplicó (10% p/v) durante transferencias subsiguientes (fig. 4D). Después de reducir la cantidad de acetato a 5 mM, emergió una población inestable que produjo niveles elevados de malato a expensas de succinato. Después de más transferencias, se omitió el acetato y se desarrollo una cepa que ya no era auxotrófica para acetato, presumiblemente debido a un incremento de expresión de otro gen. Sin embargo, los rendimientos de succinato declinaron tras la eliminación del acetato añadido, mientras que aumentaron los niveles de malato y acetato. La fuente de acetato y la base del aumento de malato son desconocidas. También se produjo una pequeña cantidad de piruvato. Se aisló un clon de la última transferencia y se designó como KJ060 (MldhA::FRT MadhE::FRT MackA::FRT MfocA-pflB::FRT). Esta cepa produjo 1 mol de succinato por mol de glucosa metabolizada en medio de sales minerales NBS con 10% de glucosa.
Construcción de KJ070 y KJ071 por supresión de metilglioxal sintasa (mgsA)
Se presume que la pequeña cantidad de lactato presente en los caldos de fermentación de varias cepas se origina de la ruta de metilglioxal sintasa (figura 6; Grabar et al., 2006). Aunque esto representa una pequeña pérdida de rendimiento, la producción de lactato por esta ruta es indicativa de acumulación de metilglioxal, un inhibidor tanto de crecimiento como de glicólisis (Egyud y Szent-Gyorgyi, 1966; Grabar et al., 2006; Hopper y Cooper, 1971). La producción de metilglioxal y lactato se eliminó suprimiendo el gen mgsA (metilglioxal sintasa) en KJ060 para producir KJ070 (1ldhA::FRT 1adhE::FRT 1ackA::FRT 1focA-pflB::FRT 1mgsA). La cepa KJ070 inicialmente se subcultivó en glucosa al 5% (p/v) (fig. 4E y fig. 5). Se presume que la supresión de mgsA tiene un flujo glicolítico incrementado, evidente por la acumulación de piruvato en el medio (tabla 3). Este aumento en el flujo glicolítico también puede ser responsable de la declinación adicional en la proporción de succinato/malato, debido al incremento de producción de oxaloacetato, un inhibidor alostérico de fumarato reductasa (Iverson et al., 2002; Sanwal, 1970c).
En la transferencia 21, la glucosa se duplicó a 10% (p/v) y continuaron las transferencias. Este nivel más alto de glucosa y transferencias subsiguientes dieron más incrementos en la producción de malato, rebasando al succinato en las últimas transferencias (fig. 4E). El incremento de producción de malato en comparación con succinato en glucosa al 10% p/v también es conherente con un incremento del flujo glicolítico e inhibición de fumarato reductasa por oxaloacetato. En la transferencia 50, se produjeron 1,3 moles de malato y 0,71 moles succinato por mol de glucosa metabolizada (tabla 3). También se produjeron cantidades significativas de acetato. Se aisló una nueva cepa del subcultivo final y se designó como KJ071 (1ldhA::FRT 1adhE::FRT 1ackA::FRT 1focA-pflB::FRT 1mgsA). Esta cepa puede ser útil para la producción de malato.
Construcción de KJ072 y KJ073 por supresión de poxB
Aunque la conversión de glucosa en acetato es rédox neutra, el reparto de carbono para acetato disminuye el rendimiento de succinato y malato. La piruvato oxidasa (poxB) representa una fuente potencial de acetato y CO2 durante la incubación bajo condiciones microaerófilas (Causey et al., 2004). Aunque no funcionaría para oxidar piruvato bajo condiciones anaeróbicas, poxB fue escogido para la supresión del gen (fig. 6). Como era de esperar, la supresión de poxB para producir KJ072 (1ldhA::FRT 1adhE::FRT 1ackA::FRT 1focA-pflB::FRT 1mgsA 1poxB) no redujo la producción de acetato, indicando que están involucradas rutas alternativas en la producción de acetato. Sin embargo, la eliminación de poxB dio como resultado cambios inesperados en los productos de fermentación, un aumento de succinato y una disminución de malato (tabla 3; fig. 4F). El mecanismo de esta mejora para la producción de succinato es desconocido, pero puede estar relacionado con otras actividades de piruvato oxidasa, tales como producción de acetoína, descarboxilación y carboligación (AjI y Werkman, 1948; Chang y Cronan, 2000).
La cepa KJ072 se sometió a 40 rondas adicionales de evolución metabólica en medio AM1, un medio con menos sal, con glucosa al 10% (p/v) (tabla 3; fig. 4F y fig. 5). Se observaron mejoras en el crecimiento, rendimiento celular y producción de succinato durante estas transferencias. También aumentaron los niveles de malato, piruvato y acetato. Se aisló un clon de la transferencia final y se designó como KJ073 (1ldhA::FRT 1adhE::FRT 1ackA::FRT 1pflB::FRT 1mgsA 1poxB). Esta cepa retuvo la ruta de fosfoenolpiruvato carboxi cinasa para la carboxilación (tabla 4). La actividad in vitro de esta cepa fue 45 veces más alta que la de KJ012, y 10 veces más alta que la de KJ017, dando más evidencia del estrecho acoplamiento entre la conservación de energía con producción de succinato y el crecimiento, y estableciendo además la base usada para la selección.
Fermentación de KJ060 y KJ073 en medio AM1 que contiene glucosa al 10% (p/v)
La figura 7 muestra fermentaciones por lote con KJ060 y KJ073, los dos mejores biocatalizadores para la producción de succinato. Aunque el crecimiento se completó en el transcurso de las primeras 48 horas de incubación, la producción de succinato continuó durante 96 horas. Un tercio de la producción de succinato ocurrió en ausencia de crecimiento celular. Estas cepas produjeron títulos de succinato de 668-733 mM, con un rendimiento molar de 1,21,6 basado en la glucosa metabolizada. Con medio AM1, típicamente los rendimientos fueron más altos que con medios de sales minerales NBS. El acetato, malato y piruvato se acumularon como coproductos indeseables y disminuyeron el rendimiento potencial de succinato (tabla 3). El rendimiento máximo teórico de succinato a partir de glucosa y CO2 (exceso) es de 1,71 moles por mol de glucosa, basados en la siguiente ecuación:
7 C6H12O6 + 6 CO2 - 12 C4H6O4 + 6 H2O
Sin embargo, no hay ruta directa de succinato en E. coli que alcance este rendimiento (fig. 6).
Conversión de otros sustratos en succinato
Aunque este estudio se centro principalmente en la conversión de glucosa en succinato, es muy conocido que E. coli tiene la capacidad nativa para metabolizar todos los azúcares de hexosa y pentosa que son constituyentes de las paredes celulares de las plantas (Asghari et al., 1996; Underwood et al., 2004). Algunas cepas de E. coli también pueden metabolizar sacarosa (Moniruzzaman et al., 1997). La cepa KJ073 se probó para evaluar la utilización de 2% de azúcares de hexosas y pentosas en tubos de suero. En todos los casos, estos azúcares fueron convertidos principalmente en succinato. La cepa KJ073 también metabolizó glicerol a succinato. Durante la incubación con glicerol al 2%, se metabolizó glicerol 143 mM para producir de succinato 127 mM, con un rendimiento molar de 0,89, 89% del máximo teórico.
Producción de malato en medio NBS que contiene betaína 1 mM y glucosa al 10%
Durante las selecciones basadas en crecimiento, se observaron cultivos que varían en su producción de malato (tabla 3), un producto alternativo potencialmente útil. El malato fue el producto más abundante de KJ071 con glucosa al 10% (tabla 3; figura 4E), casi el doble que el succinato. Esta cepa produjo malato 516 mM con un rendimiento molar de 1,44 basado en la glucosa metabolizada (tabla 3).
Conclusiones
El metabolismo fermentativo de E. coli ha mostrado ser notablemente adaptable. Se construyeron por ingeniería derivados y se hicieron evolucionar para evitar muchas supresiones de genes relacionados con las rutas nativas de
fermentación y aumentar los flujos a través de las enzimas remanentes para mantener el equilibrio rédox, aumentar la eficiencia de producción de ATP, y aumentar el crecimiento. Aunque mucho más desafiante, las células pueden hacer estos cambios adaptativos en medio de sales minerales, mientras equilibran el reparto de carbono para cubrir todas las necesidades biosintéticas. Después de eliminar las rutas primarias de oxidación de NADH (lactato 5 deshidrogenasa, alcohol deshidrogenasa) y producción de acetato (acetato cinasa), el crecimiento y producción de ATP permaneció conectado a la oxidación de NADH y a la producción de malato o succinato para el equilibrio rédox (fig. 1B). Las selecciones basadas en el crecimiento anaeróbico aseguran el equilibrio rédox y seleccionan una mayor eficiencia y velocidad de producción de ATP, la base del incremento de crecimiento. Esta selección para equilibrio rédox y producción de ATP no puede distinguir fácilmente entre malato y succinato como productos finales,
10 puesto que los precursores de ambos sirven como aceptores de electrones. Durante estas investigaciones, se desarrolló una cepa (KJ071), que produce más malato que succinato. Esta cepa y derivados adicionales pueden ser útiles para la producción de malato. Otras cepas tales como KJ073 y KJ060 producen succinato como el producto primario, con rendimientos de 1,2 a 1,6 moles por mol de glucosa.
La supresión de pflB, la fuente primaria de acetil~CoA durante crecimiento anaeróbico, dio como resultado un
15 requerimiento auxotrófico para acetato (Sawers y Bock, 1988). Este requerimiento se eliminó por evolución metabólica, debido presumiblemente a un incremento de producción de acetil~CoA por otras rutas, tales como piruvato deshidrogenasa (de Graef et al., 1999). La fuente metabólica del acetato o acetil~CoA que reemplazó esta necesidad auxotrófica es desconocida. Muchas desviaciones de productos metabólicos no eran esperadas. El incremento de malato durante las selecciones después de la supresión de mgsA es inexplicable. El metilglioxal es un
20 inhibidor metabólico producido en respuesta a un desequilibrio de metabolismo (Grabar et al., 2006). La eliminación de la producción de metilglioxal puede haber provisto una ventaja relacionada con el crecimiento, tal como un incremento de la velocidad de crecimiento, una demora más corta después de inoculación, etcétera. La reducción de malato y la desviación a una producción de succinato más alta después la supresión de poxB también fueron sorprendentes. Se observó poco cambio en el nivel de acetato, indicando que esta enzima era una fuente menor de
25 acetato o que fue funcionalmente reemplazada por otras rutas para la producción de acetato. Después de la supresión de poxB, fue producido nuevamente succinato como el ácido dicarboxílico dominante. Con las mejores cepas para la producción de succinato, KJ060 y KJ073, el malato y acetato permanecieron como coproductos abundantes (tabla 3; figs. 4D y 4F). La eliminación de estas representa una oportunidad adicional para aumentar los rendimientos.
30 Toda la E. coli construida previamente por ingeniería para la producción de succinato ha utilizado medio complejo y plásmidos con antibióticos para mantenimiento. La mayoría ha logrado apenas títulos bajos de succinato en fermentaciones por lote simple, requiriéndose procesos más complejos para alcanzar títulos altos (tabla 1). Se ha informado sobre una variedad de enfoques genéticos que aumentan la producción de succinato partiendo de glucosa por E. coli recombinante en medio complejo. En la construcción inicial de los autores de la presente
35 invención, el crecimiento y el metabolismo de azúcar fueron muy débiles en medio de sales minerales, pero fueron muy fuertes en medio complejo (caldo de Luria). El medio complejo que contiene vitaminas, aminoácidos y otros precursores macromoleculares puede enmascarar potenciales problemas reguladores del metabolismo y biosíntesis, que fueron creados por la ingeniería metabólica.
Muchos otros investigadores también han usado genes heterólogos y procesos complicados que incluyen rociado
40 con gas (CO2, H2, O2 o aire) y pasos de procesos dobles, aeróbicos y anaeróbicos. Sería de esperar que esta complejidad de procesos y nutrientes incrementara el costo de construcción, materiales, purificación y disposición de desechos. En contraste, las cepas KJ060 y KJ073 produjeron altos títulos de succinato (600-700 mM) en fermentaciones por lote simples (10% de azúcar) usando medios de sales minerales sin nutrientes complejos ni genes ajenos.
45 EJEMPLO 2
Los microorganismos se depositaron en la Colección de Cultivos ARS de la siguiente manera:
Cultivo
Designación de cepa Fecha de depósito
KJ073
B-50029 15 de marzo de 2007
KJ091
B-50110 20 de febrero de 2008
KJ098
B-50111 20 de febrero de 2008
KJ104
B-50112 20 de febrero de 2008
KJ110
B-50113 20 de febrero de 2008
KJ119
B-50114 20 de febrero de 2008
KJ122
B-50115 20 de febrero de 2008
Materiales y métodos
Cepas, medios y condiciones de cultivo
Se desarrollaron derivados nuevos de E. coli C (ATCC 8739) para la producción de succinato usando una
5 combinación única de supresiones de genes acopladas con selección basada en crecimiento. Las cepas, plásmidos y cebadores usados en este estudio se resumen en la tabla 1. Durante la construcción de las cepas, los cultivos se desarrollaron a 37 °C en caldo modificado de Luria-Bertani (LB) (por litro: 10 g de triptona Difco, 5 g de extracto de levadura Difco, 5 g de cloruro de sodio) (Miller, 1992), y se añadió un suplemento de antibióticos según fuera adecuado (Jantama et al., 2008; Zhang et al., 2007). No estaban presentes genes que codifican resistencia a antibióticos, plásmidos, ni genes ajenos en las cepas finales desarrolladas para la producción de succinato. Después de la construcción, las cepas se desarrollaron y se mantuvieron en un medio AM1 (Martínez et al, 2007). A este medio se le añadió un suplemento de KHCO3 100 mM y glucosa (como se indica). También se añadió betaína (1 mM) cuando las concentraciones iniciales de glucosa eran de 5% (p/v) o más altas.
Supresión de marcadores FRT en las regiones adhE, ldhA, y focA-pflB
15 La estrategia usada para hacer supresiones secuenciales de genes y quitar los marcadores FRT de los locus adhE, ldhA, y focA-pflB ha sido descrita previamente (Datsenko y Wanner, 2000; Grabar et al., 2006; Posfai et al., 1997; Zhou et al., 2006). El plásmido pLOI4151 se usó como una fuente de una casete cat-sacB y se usó Recombinasa Red (pKD46) para facilitar eventos de recombinación homóloga de cruzamiento doble. Se usó la resistencia al cloranfenicol para seleccionar la integración. El crecimiento con sacarosa se usó para seleccionar la pérdida de sacB. Con este enfoque se construyeron supresiones sucesivas para producir derivados de KJ079 que eliminaron todos los sitios FRT. Los cebadores y plásmidos se enumeran en la tabla 1.
Para quitar el sitio FRT de la región 1adhE, se diseñaron cebadores híbridos (WMadhEA/C) para la región objetivo 1adhE::FRT, para contener aproximadamente 50 p.b. de homología con las regiones 5’ y 3’ del sitio 1adhE::FRT, y 20 p.b. que corresponden al gen cat-sacB de pLOI4151. Estos cebadores se usaron para amplificación de PCR de la
25 casete cat-sacB usando como molde pLOI4151. El producto de PCR resultante se usó para reemplazar el sitio FRT en la región 1adhE con una casete cat-sacB mediante un evento de recombinación homóloga de cruzamiento doble, con selección por resistencia a cloranfenicol, para producir TG200.
El gen adhE y la secuencia circundante se amplificaron a partir de E. coli C usando los cebadores up/downadhE. El producto de PCR que contenía ychE’-adhE-ychG’ (3,44 kb) se clonó en pCR2.1-TOPO, produciendo pLOI4413. Se usó una segunda serie de cebadores (IO-adhEup/down) para amplificar el producto inverso con pLOI4413 como molde, y polimerasa Pfu, para producir un producto de extremos romos en el cual se suprimió un segmento interno de 2,6 kb de la secuencia adhE. Este producto de PCR inversa fue tratado con cinasa y autoligado, dando como resultado pLOI4419. El producto de PCR amplificado de pLOI4419 (cebadores up/downadhE) se usó para reemplazar la casete cat-sacB en TG200 con la secuencia cromosómica deseada mediante otro evento doble de
35 recombinación homóloga, con selección de sacarosa para la pérdida de sacB. La cepa resultante se designó como TG201 (KJ079 con FRT eliminado de la región 1adhE).
Los sitios FRT en las regiones MldhA y M(focA-pflB) se eliminaron de manera análoga a la usada para suprimir el sitio 1adhE::FRT. Series de cebadores adicionales (IdhAAIC e IO-ldhAup/down) usados para eliminar el sitio FRT de MldhA se incluyen en la tabla 1, junto con los plásmidos correspondientes (pLOI4430 y pLOI4432). La cepa TG202 se produjo reemplazando esta región en TG201 por el producto de PCR de pLOI4151 (cebadores WMIdhAA/C). El casete cat-sacB en TG202 se reemplazó por el producto de PCR de pLOI4432 (cebadores IdhAA/C) con selección de sacarosa para la pérdida de sacB para producir TG203.
Las series de cebadores (upfocA/MidpflA e IO-ycaOup/IO-midpflAdown) y los plásmidos correspondientes (pLOI4415 y pLOI4421) usados para eliminar el sitio FRT en M(focA-pflB) se incluyen en la tabla 1. La cepa TG204 se produjo
45 reemplazando esta región de TG203 por el producto de PCR de pLOI4151 (cebadores WMpflBA/C). El casete catsacB de TG204 se reemplazó por el producto de PCR de pLOI4421 (cebadores upfocA/MidpflA) con selección de sacarosa para la pérdida de sacB para producir KJ091. KJ091 es un derivado de KJ073 donde todos los sitios de FRT han sido eliminados de las regiones MadhE, MldhA, y MfocA-pflB del cromosoma.
Construcción de pLOI4162 que contiene una casete cat-sacB para supresiones de gen sin marcador
Para facilitar la supresión secuencial de ADN cromosómico, se construyó el plásmido pLOI4162 (figuras 1A-1B) con una casete cat-sacB eliminable y la opción para incluir un segmento de 18 p.b. de ADN sintético con codones de detención en todos los marcos de lectura. Este plásmido está compuesto de secuencias sintéticas y partes de plásmidos pLO12228 (Martínez-Morales et al., 1999), pLOI2511 (Underwood et al., 2002), y pEL04 (Lee et al., 2001; Thomason et al., 2005). Usando pEL04 como molde, se realizó una PCR inversa con los cebadores JMpEL04F1/R1 55 para eliminar los sitios Saml y BamHl no deseados entre los genes cat y sacB. El producto amplificado se digirió con
BglII (dentro de ambos cebadores) y se autoligó para producir pLOI4152. El plásmido pLOI4131 se construyó por ligación del fragmento FRT-cat-FRT (Banl tratado con Klenow, CIaI) de pLOI2228, en sitios compatibles de pLOI2511 (Nhel tratado con Klenow, ClaI). Subsiguientemente el plásmido pLOI4131 se digirió con EcoRI y se autoligó para quitar el fragmento FRT-cat-FRT y producir pLOI4145, reteniendo sitios simples Kasl y XmaI. Se preparó un segmento poliligador (SfPBXPS) recociendo oligonucleótidos complementarios (SfPBXPSsense y SfPBXPScomp). Después de la digestión con Kasl y XmaI, este segmento se ligó en los sitios correspondientes de pLOI4145 para producir pLOI4153. La casete cat-sacB modificada de pLOI4152 se amplificó por PCR usando la serie de cebadores JMcatsacBup3/down3. Después de digestión con BamHl y Xhol, esta casete se ligó en sitios correspondientes de pLOI4153 para producir pLOI4146. Para crear una región de 18 p.b. (5’GCCTAATTAATTAATCCC3’) (SEQ ID NO: 1) con codones de detención en los seis marcos de lectura, pLOI4146 se digirió con PacI y se autoligó para producir pLOI4154 (no mostrado), quitando la casete cat-sacB. Se insertaron dos bases adicionales (T y A) entre los sitios Sfol y PacI de pLOI4154 usando cebadores mutagénicos (JM4161sense/comp) y amplificación de plásmido lineal para producir pLOI4161. Finalmente, el fragmento digerido con PacI de pLOI4146 que contiene la casete cat-sacB se ligó en el sitio digerido con PacI de pLOI4161 para producir pLOI4162 (Núm. de registro GenBank EU531506).
Construcción de supresiones de gen en tdcDE y aspC
El gen tdcDE y regiones vecinas de 1000 p.b. de (tdcG'-tdcFED-tdcC’, 5325 p.b.) se amplificaron usando los cebadores tdcDEup/down y se clonaron en el vector pCR2.1-TOPO para producir el plásmido pLOI4515. Una preparación diluida 1000 veces de este ADN plasmídico sirvió como molde para amplificación inversa usando los cebadores tdcDEF7/R7 (ambos cebadores dentro del gen tdcDE y orientados hacia fuera). El fragmento de 6861
p.b. resultante que contenía el replicón se ligó en la casete cat-sacB digerida con SmalISfoI de pLOI4162 (cebadores JMcatsacBup3/down3) para producir pLOI4516. Este fragmento de 6861 p.b. también se usó para construir un segundo plásmido, pLOI4517 (tratado con cinasa, autoligación), que contiene una supresión de tcdD y tdcE. Los fragmentos de PCR amplificados de pLOI4516 y pLOI4517 (cebadores tdcDEup/down) se usaron para reemplazar la región tdcDE en KJ091. Las clones resultantes se probaron por pérdida de resistencia a ampicilina y cloranfenicol y se designaron como KJ098.
El gen aspC se suprimió de KJ104 de manera análoga a la usada para suprimir el gen tdcDE. La serie de cebadores adicionales (aspCup/down y aspC1/2) usados para construir la supresión de aspC se incluyen en la tabla 1, junto con los plásmidos correspondientes (pLOI4280, pLOI4281, y pLOI4282). La cepa resultante se designó como KJ110. Ni KJ098 ni KJ110 contienen ninguna secuencia intermedia dentro de las regiones suprimidas respectivas (tdcDE y aspC).
Eliminación del sitio FRT en la región ackA y construcción de supresiones de los genes citF, sfcA, y pta-ackA
Para eliminar el sitio de FRT de la región ackA de KJ073, se construyeron plásmidos que contienen secuencias de la mutación deseada, de la siguiente manera. Se usó ADN genómico de E. coli C como molde para la amplificación de PCR de ackA con los cebadores JMackAF1/R1 que se unen aproximadamente 200 p.b. aguas arriba y aguas abajo del gen ackA. El producto lineal se clonó en pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, California) para producir pLOI4158. El plásmido pLOI4158 se usó después como molde para la PCR inversa con los cebadores JMackAup1/down1 y Pfu polimerasa para producir un producto de extremos romos que carece de un segmento interno de 808 p.b. de ackA. La casete cat-sacB flanqueada por PacI (fragmento SmaI/SfoI de pLOI4162) se ligó después en el producto romo de la PCR para producir pLOI4159. El plásmido pLOI4159 sirvió como molde para la amplificación de PCR (cebadores JMackAF1/R1). Este producto de PCR se usó para reemplazar el sitio FRT en la región ackA de KJ073 por recombinación homóloga de cruzamiento doble, con selección por resistencia a cloranfenicol. El clon resultante se designó como KJ076.
El plásmido pLOI4159 también se digirió con PacI para eliminar la casete cat-sacB y se autoligó para producir pLOI4160, reteniendo la secuencia de detención de traducción de 18 p.b. El plásmido pLOI4160 sirvió como molde para PCR (cebadores JMackAF1/R1). Este fragmento amplificado se usó para reemplazar la casete cat-sacB en KJ076 por recombinación homóloga de cruzamiento doble con selección por la pérdida de sacB. Después de la eliminación de pKD46 por crecimiento a temperatura elevada, la cepa resultante se designó como KJ079. En esta cepa, la región suprimida ha sido reemplazada por la secuencia de detención de traducción de 18 p.b.
La estrategia usada arriba para eliminar el sitio FRT de la región ackA se utilizó para hacer supresiones secuenciales de citF, sfcA, y pta-ackA, y para reemplazar las regiones suprimidas con la secuencia de detención de traducción de 18 p.b. Las series de cebadores adicionales (citFup/down y citF2/3) usadas para construir la supresión de citF se incluyen en la tabla 1, junto con los plásmidos correspondientes (pLOI4629, pLOI4630 y pLOI4631). La cepa resultante se designó como KJ104.
El gen sfcA se suprimió de las cepas KJ104 y KJ110, dando como resultado las cepas designadas como KJ119 y KJ122, respectivamente. Las series de cebadores adicionales (sfcAup/down y sfcA1/2) usados para construir las supresiones de sfcA se incluyen en la tabla 1, junto con los plásmidos correspondientes (pLOI4283, pLOI4284 y pLOI4285).
El operón ackA-pta (que incluye la secuencia de detención de traducción sintética) se suprimió de KJ122 para producir la cepa KJ134. Las series de cebadores adicionales (ackAup/ptadown y ackA2/pta2) usados para construir esta supresión se incluyen en la tabla 1, junto con los plásmidos correspondientes (pLOI4710, pLOI4711 y pLO14712). La cepa KJ134 no contiene ningún sitio FRT ni genes ajenos.
Fermentaciones
Se incubaron a 37 °C (100 rpm) cultivos de siembra y fermentaciones en medio de sales minerales AM1 (Martínez et al, 2007) que contiene glucosa al 10% (p/v) (555 mM), KHCO3 100 mM, y de betaína HCl 1 mM. Una mezcla de K2CO3 3M y KOH 6N se añadió para mantener el pH y suministrar CO2. Diferencias en la composición de base (mezclas 1:1, 4:1, 6:1) tuvieron poco efecto sobre la fermentación. Las fermentaciones se efectuaron en pequeños recipientes con un volumen de trabajo de 350 ml. Las fermentaciones se inocularon a una DO550 inicial de 0,01 (3,3 mg de peso seco celular l-1), a menos que se indique de otra manera. Los recipientes de fermentación se sellaron excepto por una aguja de calibre 16 que sirvió como ventilación y orificio para retirar la muestra. La anaerobiosis se alcanzó rápidamente durante el crecimiento. El bicarbonato añadido sirvió para asegurar una atmósfera de CO2.
Análisis
La masa celular se estimó de la densidad óptica a 550 nm (DO 1,0 = 333 mg de peso seco celular l-1), usando un espectrofotómetro Bausch & Lomb Spectronic 70. Los ácidos orgánicos y los azúcares se determinaron usando cromatografía de líquida de alta resolución (Grabar et al, 2006).
Resultados y discusión
Construcción de cepas sin marcador para la producción de succinato
Los genes centrales de la fermentación anaeróbica de E. coli C de tipo salvaje se suprimieron secuencialmente mediante la estrategia de Datsenko y Wanner (2000) con productos de PCR y marcadores de antibiótico eliminables (usando sitios de reconocimiento de FRT y recombinasa FLP). Estas construcciones, en combinación con evolución metabólica (selección basada en crecimiento por incremento de eficiencia en la producción de ATP), se usaron para seleccionar una cepa mutante que reclutó la fosfoenolpiruvato carboxi cinasa (pck) conservadora de energía, para aumentar el crecimiento y la producción de succinato (figura 9). La cepa resultante, KJ073, produjo 1,2 moles de succinato por mol de glucosa metabolizada (Jantama et al., 2008) y ahora utiliza una ruta de succinato muy análoga a la bacteria del rumen, Actinobacillus succinogenes (van der Werf et al, 1997) y Mannheimia succiniciproducens (Song et al, 2007). Sin embargo, los métodos usados para construir estas supresiones de gen dejan una cicatriz genética sola de 82 a 85 nt o sitio FRT en la región de cada gen suprimido (ackA, IdhA, adhE, ackA, focA-pflB). Estos sitios FRT sirvieron como sitios de reconocimiento para la recombinasa FLP (Storici et al., 1999) durante la eliminación de los genes de antibiótico. Todas estas secuencias extrañas se quitaron secuencialmente de KJ073 y se reemplazaron por ADN nativo, con solo la supresión del gen deseado, usando métodos que han sido descritos previamente (Grabar et al, 2006; Zhang et al, 2007; Jantama et al, 2008). La cepa resultante, KJ091, contiene supresiones específicas en ackA, IdhA, adhE, ackA, focA-pflB, ackA, mgsA, y poxB, y carece de todos los sitios FRT. Esta cepa carece de todo ADN ajeno y sintético, excepto por una secuencia de detención de traducción de 18
p.b. dentro de ackA. La producción de succinato por la cepa KJ091 fue equivalente a la de KJ073 (tabla 7). Esta cepa se usó como el progenitor para mejoras ulteriores en la producción de succinato.
Reducción de acetato durante la producción de succinato por supresión de tdcD y tdcE
Durante la fermentación anaeróbica de glucosa por E. coli, la piruvato formiato-liasa (pflB) sirve como la fuente primaria de acetil~CoA, el precursor de acetil~P, y la acetato cinasa (ackA) sirve como la ruta primaria para la producción de acetato a partir de acetil~P (Karp et al, 2007; Kessler & Knappe, 1996). La abundancia de acetato como un producto de fermentación en las cepas KJ073 y KJ091 fue sorprendente puesto que estas cepas contienen supresiones tanto en ackA como en pflB (figura 9). Este acetato residual al final de la fermentación representa una oportunidad esencial para redirigir más el metabolismo para mejorar el rendimiento de succinato.
Una enzima relacionada con la actividad de acetato cinasa (y propionato cinasa) es codificada por tdcD, pero físicamente es producida solo por la degradación de treonina (Hesslinger et al, 1998; Reed et al, 2003). Es posible que las mutaciones que ocurren durante la selección tengan un incremento de la expresión de tdcD, como se ilustra en la figura 10. Durante el crecimiento anaeróbico con glucosa al 10% (p/v), la expresión de tdcD podría reemplazar funcionalmente a ackA, aumentando la producción de acetato a partir de acetil~P. El gen tdcE adyacente en el mismo operón es similar a pflB y codifica una actividad de piruvato (y a-cetobutirato) formiato liasa que es coexpresada durante la degradación de treonina (Hesslinger et al, 1998). Es posible que el incremento de la expresión de este gen durante el crecimiento anaeróbico con glucosa al 10% (p/v) pueda aumentar la producción de acetil~CoA, el intermedio precursor de acetil~P, y consuma reductor como formiato (figura 10). Tanto tdcD como tdcE (adyacente) se suprimieron simultáneamente de KJ091 para producir KJ098. La supresión de estos dos genes redujo a la mitad la producción de acetato y aumentó 10% el rendimiento de succinato en KJ098 en comparación con KJ091, estableciendo la importancia de esta ruta inesperada para desviar el flujo de carbono en alejamiento de succinato. Sorprendentemente, la producción de malato por KJ091 también fue eliminada como resultado de las nuevas supresiones en KJ098. El nivel de piruvato producido por KJ098 también disminuyó 40%, un intermedio que
se esperaría que aumentara por eliminación de dos rutas alternativas para el metabolismo de piruvato, la actividad de piruvato formiato liasa (tdcD) y la actividad de acetato cinasa (tdcE). Los mecanismos responsables de la eliminación de malato (un contaminante problemático durante la purificación de succinato), la reducción en piruvato, y el aumento en succinato, que resultaron de la supresión simultánea de tdcD y tdcE, son desconocidos.
Efecto de la supresión de citrato liasa (citDEF) sobre el rendimiento de acetato durante la producción de succinato
Aunque KJ098 representa una mejora significativa sobre KJ091, puede ser posible una mayor reducción de los niveles de acetato y más incrementos en los rendimientos de succinato. Bajo condiciones anaeróbicas, el oxaloacetato es dividido en el producto reducido (malato) y el intermedio oxidado (citrato) (figura 9). El citrato se puede convertir de nuevo en oxoloacetato y acetato por medio de citrato liasa (citDEF) para reciclar la reserva intracelular de OAA para otras funciones metabólicas (Nilekani et al, 1983). La expresión de cantidades significativas de citrato liasa está asociada con crecimiento sobre citrato (Lutgens y Gottschalk, 1980; Kulla y Gottschalk, 1977). La citrato liasa es un complejo multienzimático hecho de tres cadenas de polipéptido diferentes. La subunidad a o grande es una citrato-ACP transferasa que cataliza el primer paso. La subunidad � o media es una citril-ACP liasa que cataliza el segundo paso. La subunidad y o pequeña actúa como una proteína portadora de acilo y también lleva los componentes del grupo prostético. Las tres unidades se requieren para que ocurra la reacción (Quentmeier et al, 1987). La supresión de genes que codifican una o más de estas subunidades eliminaría la actividad de citrato liasa y disminuiría más el nivel de acetato durante la producción de succinato. El gen citF se suprimió de KJ098 para producir KJ104. Sin embargo, esta supresión no tuvo efecto sobre la producción de acetato ni otro rendimiento de succinato (tabla 7). Puesto que la supresión de citF no ocasiona ninguna reducción de acetato, se presume que este intermedio se origina de otras rutas. Por razones desconocidas, la supresión de citF afectó adversamente al crecimiento de KJ104 (rendimiento celular reducido en 22%), y aumentó el nivel de piruvato al final de la fermentación casi en 50% en comparación con KJ098. Sin embargo, el rendimiento de succinato, título, productividad promedio y niveles de acetato con KJ104, fueron comparables a los de KJ098 (tabla 7).
Efectos de las supresiones de aspC y sfcA sobre el rendimiento de succinato
La aspartato aminotransferasa (aspC) es una enzima multifuncional que cataliza la síntesis de aspartato, fenilalanina y otros compuestos por transaminación. En la reacción, el L-aspartato es sintetizado de oxaloacetato, un intermedio de la carboxilación de PEP, mediante una reacción de transaminación con L-glutamato. El aspartato es un constituyente de proteínas y participa en otras diversas rutas biosintéticas. Se ha estimado que aproximadamente 27% del nitrógeno celular fluye a través de aspartato (Reitzer, 2004). La biosíntesis de aspartato y la producción de succinato comparten una reserva intracelular común de oxoloacetato. La supresión de aspC puede aumentar la producción de succinato pero también puede crear requerimientos auxotróficos que impiden el crecimiento anaeróbico en medio de sales mínimo, tal como AM1.
Este gen de aspartato aminotransferasa (aspC) fue suprimido de KJ104 para producir JK110. Inesperadamente, la supresión de aspC no tuvo efecto sobre el rendimiento de succinato ni el rendimiento celular en KJ110, en comparación con KJ104 (tabla 7). De esta manera, parece que la aspartasa no desvía niveles significativos de oxoloacetato en alejamiento de la producción de succinato en la cepa de los autores de la presente invención. Parecen estar disponibles enzimas alternativas que reemplazan las necesidades biosintéticas catalizadas antes por aspartato aminotransferasa.
Cantidades significativas de piruvato están presentes al final de la fermentación con KJ104 y otras cepas de E. coli construidas por ingeniería para la producción de succinato (tabla 7). Este piruvato representa un producto no deseado y una oportunidad adicional de aumentar el rendimiento de succinato. Este nivel alto de piruvato en el caldo de fermentación resultaría de la descarboxilación de malato a piruvato por medio de la enzima málica (sfcA), como se ilustra en la figura 10. Se piensa que esta enzima funciona principalmente durante la gluconeogénesis (Unden y Kleefeld, 2004; Stols y Donnelly, 1997; Oh et al, 2002), más que durante el catabolismo anaeróbico de la glucosa. Aunque la carboxilación reductiva de piruvato para formar malato es favorecida termodinámicamente, los parámetros cinéticos de esta enzima favorecen la deshidrogenación y la descarboxilación bajo condiciones fisiológicas (Stols y Donnelly, 1997). La expresion en exceso de esta enzima para carboxilar piruvato se ha usado previamente como una base para construir cepas de E. coli para la producción de succinato (Stols y Donnelly 1997).
Si la enzima málica (sfcA) es carboxilante en KJ104 (y cepas relacionadas) y contribuye a la producción de succinato, se esperaría que la supresión de este gen redujera los rendimientos de succinato y aumentara los niveles de otros productos como piruvato. Alternativamente, si la enzima málica (sfcA) es descarboxilante en KJ104 y desvía malato a piruvato, sería de esperar que la supresión del gen que codifica esta enzima aumentara los rendimientos de succinato y disminuyera los niveles de piruvato. Inesperadamente, la supresión del gen sfcA de KJ104 para producir KJ119, no tuvo efecto mensurable sobre la producción de succinato, el crecimiento, los niveles de piruvato, etcétera (tabla 7), en comparación con KJ104. Estos resultados muestran claramente que la enzima málica (sfcA) no es importante para la producción de succinato en KJ104 y cepas relacionadas. Este resultado contrasta notablemente con las cepas productoras de succinato desarrolladas por Stols et al. (1997), en las cuales se usó el incremento de producción de enzima málica como la ruta primaria para la producción de succinato.
Aunque no se observaron beneficios significativos ni de la supresión de sfcA ni de la supresión de aspC en KJ104, se hicieron estudios para probar el efecto de la supresión de ambos genes en combinación. Esto se hizo suprimiendo el gen sfcA en KJ110 para producir KJ122, y se espera no ver ningún beneficio. Sin embargo, la supresión combinada tanto de sfcA como aspC (cepa KJ122) dio como resultado un aumento inesperado en el 5 rendimiento y el título de succinato, con una reducción pequeña de acetato (tabla 7), en comparación con la cepa progenitora KJ110 y las cepas relacionadas (KJ104 y KJ119). La supresión combinada (aspC y sfcA) en KJ122 dio como resultado aumentos significativos en el rendimiento de succinato, título de succinato y productividad promedio, de 18%, 24% y 24%, respectivamente, en comparación con KJ104. Aunque el mecanismo es desconocido, es posible que las mutaciones individuales sean ineficaces porque son compensadas en parte por un incremento de
10 flujo a través de la actividad remanente, la enzima málica o aspartato aminotransferasa (figura 10), impidiendo cualquier beneficio potencial. Se presume que el incremento en el rendimiento y el título de succinato resultan de un incremento en la disponibilidad de oxoloacetato, que permite que una fracción más grande prosiga a succinato. Los niveles de malato también permanecieron muy bajos.
La cepa KJ122 (tabla 7) produjo 1,5 moles de succinato por mol de glucosa, 88% del rendimiento teórico máximo
15 (1,71 moles por mol de glucosa). Para producir este nivel alto de succinato y reducir completamente el malato, se requirió reductor adicional. Aunque la fuente de este reductor adicional es desconocida, estos resultados son coherentes con un aumento en el flujo de piruvato por medio de piruvato deshidrogenasa. Se piensa que esta enzima funciona principalmente durante el metabolismo aeróbico (Guest et al, 1989), pero también se ha informado de que funciona a bajos niveles durante la fermentación (de Graef et al, 1999).
20 Reducción en piruvato y acetato por supresión de pta
KJ122 produjo excelentes rendimientos de succinato (1,5 mol mol-1 de glucosa) más cantidades menores de acetato y piruvato. El rendimiento máximo teórico para succinato es 1,71 mol mol-1 de glucosa, y estos intermedios de tres carbonos representan una oportunidad de aumentar más el rendimiento. Se presume que el piruvato se acumula de la glicólisis como un sobreflujo metabólico y puede estar relacionado con la acumulación de acetato. La acetil~CoA 25 es un regulador alostérico de muchas enzimas. La fuente de acetato y la actividad de acetato cinasa son desconocidas puesto que los genes que codifican las dos actividades primarias para acetato cinasa (tdcD y ackA) han sido suprimidas (fig. 9 y fig. 10). Suponiendo que el acetato es producido de acetil~P, el producto de fosfotransacetilasa, se construyó una supresión adicional en KJ122 para desactivar el gen pta. La cepa resultante, KJ134, produjo el nivel casi teórico de succinato (tabla 7). En esta cepa, los niveles de piruvato y acetato se
30 redujeron sustancialmente. La productividad volumétrica también se redujo en 17%. Los rendimientos de succinato con la cepa KJ134 son iguales o mejores que todas las otras cepas a pesar de la complejidad de los procesos de fermentación, medios o condiciones de crecimiento.
TABLA 1 Comparación de la producción de succinato por medio de biocatalizadores microbianosa
Organismo
Medio/Condición Título de succinato (mM)b Rendimiento de succinato (mol/mol) Referencia
E, coli KJ060 (IdhA aadhE ackA focA pftB)
100 g/l de glucosa AM1 con 10 g/l de NaHCO3, fermentación de lote simple, 120 h de incubación, pH mantenido con mezcla 1:1 de KOH 6M + K2CO3 3M 733 [0,90] 1,41 Este documento
E, coli KJ073 (ldhA adhE ackA focA pftB mgsA poxB)
100 g/l de glucosa AM1 con 10 g/l de NaHCO3, fermentación de lote simple, 96 h de incubación, pH mantenido con mezcla 1:1 de KOH 6M + K2CO3 3M 668 [0,82] 1,20 Este documento
E, coli KJ060 (ldhA adhE ackA focA pftB) inóculo alto (200 mg de peso seco celular l-1)
100 g/l de glucosa AM1 con 10 g/l de NaHCO3, fermentación de lote simple, 120 h de incubación, pH mantenido con mezcla 1:1 de KOH 6M + K2CO3 3M 622 [0,61] 1,61 Este documento
Actinobacillus succinogenes FZ53
130 g/l de glucosa con un suplemento de 15 g/l de l,m,m, y 5 g/l de ext, lev,, 80 g/l de MgCO3, fermentación anaeróbica por lote, 78 h de incubación 898 [1,36] 1,25 Guettler et al., 1996a
E, coli AFP111 (pftAB, ldhA, ptsG)
40 g/l de glucosa (90 g de glucosa total) en medio con un suplemento de 841 1,68 Vemuri et al.,
pyc de Rhizobium etli expresado en exceso
20 g/l de triptona, 10 g/l de ext, lev, y 40 g/l de MgCO3, fermentación por lote de alimentación de fase doble, 76 h de incubación [1,31] 2002ab
Anaerobiospirillum succiniciproducen s ATCC 53488
120 g/l de glucosa en medio basado en peptona/ext, lev,, biorreactor de membrana-electrodiálisis integrados con rociado de CO2, 150 h de incubación 703 [0,55] 1,35 Meynial-Salles et al., 2007
Actinobacillus succinogenes 130Z
100 g/l de glucosa con un suplemento de 15 g/l de l,m,m, y ext, lev,, 80 g/l de MgCO3, fermentación anaeróbica por lote, rociado de CO2, 39 h de incubación 678 [2,05] 1,37 Guettler et al., 1996b
E, coli HL27659k/pKK313 (iclR sdhAB ackApta poxB, pstG) pepc de Sorghum vulgare expresado en exceso
106 g/l de glucosa en medio con un suplemento de 20 g/l de triptona, 32 g/l de ext, lev, y 2 g/l de NaHCO3, fermentación por lote con alimentación bajo condiciones aeróbicas completas, 59 h de incubación 499 [1,00] 0,85 Lin et al., 2005d
Anaerobiospirillum succiniproducens ATCC 53488
50 g/l de glucosa y 10 g/l de l,m,m,, rociado de CO2 y Na2CO3 300 mM, fermentación por lote, 24 h de incubación 426 [2,09] 1,37 Glassner y Datta, 1992
TABLA 1 (Continuación) TABLA 1 (Continuación)
Organismo
Medio/Condición Título de succinato (mM)b Rendimiento de succinato (mol/mol) Referencia
Mannheimia succiniciproducen s (ldhA pftB ptaackA)
63 g/L de glucosa en MMH3 (medio basado en extracto de levadura), fermentación por lote con alimentación, 0,25 vol/vol/min, rociado de CO2, 30 h de incubación 444 [1,75] 1,16 Lee et al., 2006
Aislado bacteriano 130Z ATCC 55618
50 g/l de glucosa con un suplemento de 1% de l,m,m,, 0,6% de ext, lev, y 2 g/l de MgCO3 neutralizado con NaOH 10 N, 0,3 atm de CO2, 29,5 h de incubación 388 [1,55] 1,40 Guettler et al., 1998
E. coli SBS550MG (IdhA adhE iclR ackA-pta), pyc de L. lactis, citZ de Bacillus subtillis
20 g/l de glucosa (100 g de glucosa total) LB con un suplemento de 1 g/l de NaHCO3, 200 mg/l de ampicilina y IPTG 1 mM, 100% de CO2 a 1L/min, fermentación por lote de alimentación repetida, espacio superior a T, y P, estándar, 95 h de incubación 339 [0,42] 1,61c Sánchez et al., 2005a; Cox et al., 2006
E. coli AFP184 (pflB idhA pts)
102 g/l de glucosa con un suplemento de 15 g/l de l,m,m,, producción anaeróbica y crecimiento aeróbico en fase doble, rociando con aire, seguido por CO2, 32 h de incubación 339 [1,27] 0,72c Andersson et al., 2007
Actinobacillus succinogenes ATCC 55618
70 g/l de glucosa con hidrolizado de harina y 5 g/l de ext, lev,, fermentación anaeróbica por lote con 4% de inóculo, 65 h de incubación 302 [0,55] 1,18 Du et al., 2007
Anaerobiospirillum succiniciproducen s ATCC 53488
50 g/l de glucosa, 2% de l,m,m, y 25 ppm de triptófano, neutralizado con NaCO3 5,5 M, medio saturado de 0,3 atm de presión parcial de CO2, 29,5 h de incubación 289 [1,16] 1,04 Guettler et al., 1998
Succinivibrio dextrinosolvens ATCC 19716
15 g/l de l,m,m, y de ext, lev,, 100 g/l de glucosa y 80 g/l de MgCO3, fermentación por lote, 36 h, 226 [0,74] NR Guettler et al., 1998
Corynebacterium glutanicum R
40 g/l de glucosa (121 g de glucosa total) en medio de sales minerales definido, con NaHCO3 400 mM, fermentación por lote con alimentación, 6 h de incubación 195 [3,83] 0,29 Okino et al., 2005
Prevotella ruminocola ATCC 19188
15 g/l de l,m,m, y de ext, lev,, 100 g/l de glucosa y 80 g/l de MgCO3, fermentación por lote, 36 h de incubación 160 [0,52] NR Gettler et al., 1998
E. coli SBS550MG (IdhA adhE iclR ackA-pta), pyc de L. lactis, citZ de Bacillus subtillis
20 g/l de LB glucosa con un suplemento de 1 g/l de NaHCO3, 200 mg/l de ampicilina e IPTG 1 mM 100% de CO2, a 1L/min, espacio superior a T y P estándar, fermentación por lote, 24 h de incubación 162,6 [0,80] 1,61c Sánchez et al., 2005a; Cox et al., 2006
Organismo
Medio/Condición Título de succinato (mM)b Rendimiento de succinato (mol/mol) Referencia
Mannheimia succiniciproduce ns MBEL55E KCTC 0769BP
18 g/L de glucosa en MH4 (medio basado en ext, lev,) con un suplemento de NaHCO3 119 mM, un reactor de membrana con reciclado celular continuo, con presión parcial de CO2 de 101,3 kPa de gas (100% de CO2), 6 h de incubación 144 [2,83] 1,44 Song et al., 2007
E. coli SBS110MG (ldhA adhE), pyc de Lactococcus lactis
20 g/l de LB glucosa con un suplemento de 1,5 g/l de NaHCO3 y 0,5 g de MgCO3, 200 mg/l de ampicilina e IPTG 1 mM, fase doble con 100% de CO2 a 1L/min, espacio superior a T y P estándar, 168 h de incubación 130 [0,09] 1,24c Sánchez et al., 2005a; Sánchez et al., 2006
E. coli NZN111 (W1485 pflB IdhA), sfcA de E. coli expresado en exceso
20 g/l de LB glucosa con un suplemento de 0,5 g de MgCO3, 1,5 g/l de NaOAc, 0,1 g/l de ampicilina e IPTG 10 μM, 44 h de incubación, tubo de suero sellado, 108 [0,22] 0,98c Stols et al., 1997
E. coli JCL1208, ppc de E. coli expresado en exceso
11 g/l de LB glucosa con un suplemento de 0,15 g de MgCO3, 0,1 g/l de carbenicilina e IPTG 0,1 mM, 44 h de incubación, carga de CO2 anóxico a 1 atm en espacio superior, 18 h de incubación 91 [0,60] 0,44c Millard et al., 1996
E. coli GJTpepC de Sorghum
40 g/l de LB glucosa con un suplemento de 27,78 g/l de MgCO3, fermentación por lote simple en matraz sellado hermético al aire 80 [sin datos] 0,42c Lin et al., 2005c
E. coli HL51276k (iclR icd sdhAB ackA-pta-poxB, pstG), pepC de Sorghum sp. Mutación S8D
10,8 g/l de LB glucosa con un suplemento de 2 g/l de NaHCO3, 50 mg/l de kanamicina, IPTG 1 mM, reactor aeróbico por lote, 50 h de incubación 68 [0,16] 1,09c Lin et al., 2005b
E. coli SBS880MG (IdhA adhE LfdhF), pyc de L. lactis
20 g/l de LB glucosa con un suplemento de 1,5 g/l de NaHCO3 y 0,5 g de MgCO3, 200 mg/l de ampicilina e IPTG 1mM, Fase doble con 100% de CO2 en espacio superior, 168 h de incubación 60 [0,04] 0,94c Sánchez et al., 2005b
TABLA 2 Cepas de Escherichia coli, plásmidos y cebadores usados en este estudio
Cepas de Escherichia coli
Características Relevantes
Fuentes
Cepa C
Tipo salvaje (ATCC 8739) ATCC
KJ012
Cepa C, LldhA::FRT LadhE::FRT LackA::FRT Este estudio
KJ017
KJ012, cepa mejorada seleccionada de glucosa al 10%, NBS Este estudio
KJ032
KJ017, LldhA::FRT LadhE::FRT LackA::FRT L(focA-pftB)::FRT Este estudio
KJ060
KJ032, cepa mejorada seleccionada de glucosa al 10% sin acetato inicial, NBS Este estudio
KJ070
KJ060, LmgsA Este estudio
KJ071
KJ070, cepa mejorada seleccionada de glucosa al 10%, NBS Este estudio
KJ072
KJ071, LpoxB Este estudio
KJ073
KJ072, cepa mejorada seleccionada de glucosa al 10%, AM1 Este estudio
SZ204
L(FocA-pflB)::FRT-kan-FRT Zhou, 2003
Plásmidos
pKD4
Bla FRT-kan-FRT Datsenko, 2000
pKD46
bla y B exo (recombinasa Red), replicón condicional de temperatura Datsenko, 2000
pFT-A
bla flp replicón condicional de temperatura y recombinasa FLP Posfai, 1997
pEL04
casete de dirección cat-sacB Lee, 2001 Thomason 2005
pLOI3421
fragmento SmaI de 1,8 kpb que contiene aac Wood, 2005
pLOI4151
casete bla cat; cat-sacB Este estudio
pCR2.1-TOPO
bla kan; vector de clonación TOPO TA Invitrogen
pLOI4228
bla kan; yccT’-mgsA-helD’ (PCR) de E. coli C clonada en el vector pCR2.1-TOPO Este estudio
pLOI4229
casete cat-sacB amplificada por PCR de pLOI4151 (digerido con EcoRV) clonado en mgsA en pLOI4228 Este estudio
pLOI4230
Fragmento amplificado por PCR de pLOI4228 (usando cebadores mgsA1/2), tratado con cinasa, después autoligación Este estudio
pLOI4274
Bla kan; poxB (PCR) de E. coli C clonado en el vector pCR2.1-TOPO Este estudio
pLOI4275
casete Cat-sacB amplificada por PCR de pLOI4151 (digerido con EcoRV) clonado en poxB de pLOI4274 Este estudio
pLOI4276
Fragmento amplificado por PCR de pLOI4274 (usando iniciadores poxB1/2), tratado con cinasa, después autoligación Este estudio
TABLA 2 (Continuación)
Series de cebadores
Fuentes
IdhA
5’ ATGAACTCGCCGTTTTATAGCACAAAACAGTACG ACAAGAAGTACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC3’ (SEQ ID NO:2) 5’ TTAAACCAGTTCGTTCGGGCAGGTTTCGCCTTTT TCCAGATTGCTCATATGAATATCCTCCTTAG3’ (SEQ ID NO:3) Este estudio
adhE
5’ ATGGCTGTTACTAATGTCGCTGAACTTAACGCAC TCGTAGAGCGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC3’ (SEQ ID NO:4) 5’ TTAGCGGATTTTTTCGCTTTTTTCTCAGCTTTAG CCGGAGCAGCCATATGAATATCCTCCTTAG3’ (SEQ ID NO:5) Zhou, 2003
ackA
5’ATGTCGAGTAAGTTAGTACTGGTTCTGAACTGCG GTAGTTCTTCAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC3’ (SEQ ID NO:6) 5’TCAGGCAGTCAGGCGGCTCGCGTCTTGCGCGATA ACCAGTTCTTCCATATGAATATCCTCCTTAG3’ (SEQ ID NO:7) Zhou, 2003
focA-pftB
5’TTACTCCGTATTTGCATAAAAACCATGCGAGTTA CGGGCCTATAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC3’ (SEQ ID NO: 8) 5’ATAGATTGAGTGAAGGTACGAGTAATAACGTCCT GCTGCTGTTCTCATATGAATATCCTCCTTAG3’ (SEQ ID NO: 9) Este estudio
JMcatsacB
5’TTAGCTAGCATGTGACGGAAGATCACTTCG3’ (SEQ ID NO: 10) 5’CCGCTAGCATCAAAGGGAAAACTGTCCATAT3’ (SEQ ID NO:11) Este estudio
catup2/sacBdown2
5’AGAGAGGATATCTGTGACGGAAGATCACTTCG3’ (SEQ ID NO:12) 5’AGAGAGGATATCGAATTGATCCGGTGGATGAC3’ (SEQ ID NO:13) Este estudio
mgsAup/down
5’CAGCTCATCAACCAGGTCAA3’ (SEQ ID NO: 14) 5’AAAAGCCGTCACGTTATTGG3’ (SEQ ID NO: 15) Este estudio
mgsA-1/2
5’AGCGTTATCTCGCGGACCGT3’ (SEQ ID NO: 16) 5’AAGTGCGAGTCGTCAGTTCC3’ (SEQ ID NO: 17) Este estudio
poxBup/down
5’AAGCAATAACGTTCCGGTTG3’ (SEQ ID NO: 18) 5’CCACTTTATCCAGCGGTAGC3’ (SEQ ID NO: 19) Este estudio
poxB-1/2
5’GACGCGGTGATGAAGTGAT3’ (SEQ ID NO: 20) 5’TTTGGCGATATAAGCTGCAA3’ (SEQ ID NO: 21) Este estudio
pck-F/R
5’TTGGCTAAGG AGCAGTGAAA TGCGCGTTA3’ (SEQ ID NO: 22) 5’CACGACAAAA GAAGGGTAAA TAAAC3’ (SEQ ID NO: 23) Este estudio
pck-2/3
5’TTGTTAACGCGCATTTCACT3’ (SEQ ID NO: 24) 5’GCGATAGCGGCTACTGTCAT3’ (SEQ ID NO: 25) Este estudio
pck (RT-PCR)
5’GACGATACCACTCGCGAT3’ (SEQ ID NO: 26) 5’GTCGACAACGAACAGACGT3’ (SEQ ID NO: 27) Este estudio
birA (RT-PCR)
5’ATCGTGATGGCGGAAGT3’ (SEQ ID NO: 28) 5’CTTGCGATCCTGCAGATAG3’ (SEQ ID NO: 29) Este estudio
TABLA 3Fermentación de glucosa en medio de sales minerales por cepas mutantes de E. coli
Cepaa
Condiciones de cultivo Medio, Gluc (p/v) Rend,celularb (g/L) Rend, desuccinatoc Prod, vol,prom,d (g/L/h) Productos de fermentación (mM)c
mol/mol
g/g Succ Mal Pir Ace Lac For
E, coli C tiposalvajef
DO550 0,1, betaína 0,1 mM0,2 5% de NBS 2,0 0,2 0,19 0,0 2 0,12 0,12 0,01 49 3 -g 33 1 0 152 3 0 98 24 262 19
KJ012
DO550 0,1, betaína 0,1 mM 5% de NBS 0,3 0,1 0,20 0,0 1 0,13 0,04 0,01 6 0,4 - - 26 1 - -
KJ012
DO550 0,1, betaína 0,1 mMde, matraz agitadoh 5% deNBS+MOPS 1,5 0,10 0,06 0,02 10 - - 226 - 16
KJ012
DO550 0,1 caldo Luria 5% de LB 1,5 0,70 0,50 0,09 108 - - 61 <2 14
KJ012(ldhA,ackA,adhE)(KJ017)
1ª TF: sin betaína, DO550 0,1, 120 h de transferencias 5% de NBS 0,3 0,13 0,09 0,072 6 - - 26 <2 -
3ª TF: betaína 2 mM de,DO550 0,1, transferencias de 96 h
5% de NBS 0,7 0,28 0,18 0,128 26 - - 71 <2
40ª TF: betaína 1 m, DO5500,1, transferencias de 24 h,K2 CO3 3M +KOH 6N
5% de NBS 2,3 0,73 0,48 0,251 204 - - 179 <2 151
40ª TF: betaína 1 mM, DO5500,1, transferencias de 24 h,K2 CO3 3M +KOH 6N
10% de NBS 1,7 0,74 0,49 0,354 288 - - 181 38 199
KJ032(IdhA,ackA,adhE,focA, pflB)
2ª TF: betaína 1 mM, DO5500,1, transferencias de 48 h,NaOAc 20 mM, K2 CO3 3M +KOH 6N 5% de NBS 1,0 1,47 0,97 0,260 212 - - 44 - -
15ª TF: 1 mM de betaína,DO550 0,01, transferencias de24 h, NaOAc 5 mM, K2 CO3 3M +KOH 6N
10% de NBS 1,4 1,07 0,71 0,736 596 331 9 170 <2 -
TABLA 3 (Continuación)
Cepaa
Condiciones de cultivo Medio, Gluc (p/v) Rend,celularb (g/L) Rend, desuccinatoc Prod, vol,prom,d (g/L/h) Productos de fermentación (mM)c
mol/mol
g/g Succ Mal Pir Ace Lac For
(KJ060)
5ª TF: betaína 1 mM, DO5500,01, transferencias de 24 h, sinNaOAc, K2 CO3 3M +KOH 6N 10% de NBS 1,4 1,04 0,69 0,711 579 318 9 161 <2 -
KJ070 (ldhA, ackA,adhE, focA, pflB, mgsA) (KJ071)
1ª TF: betaína 1 mM de, DO550 0,01, TF 24 h, K2 CO3 3M +KOH 6N, 5% de NBS 1,0 1,06 0,70 0,361 294 219 25 102 - -
50ª TF: betaína 1mM, DO550 0,01, transferencias de 24 h, K2 CO3 3M +KOH 6N
10% de NBS 1,1 0,71 0,47 0,419 341 626 <2 76 - -
KJ072 (ldhA, ackA,adhE, focA, pflB, mgsA, paxB)(KJ073)
2ª TF: betaína 1 mM, DO550 0,0, transferencias de 24 h, K2 CO3 3M +KOH 6N6ª TF: betaína 1 mM, DO550 0,01, transferencias de 24 h, K2 CO3 3M +KOH 6N 10% de NBS10% de AM1 1,31,2 0,97 1,34 0,64 0,88 0,663 0,733 539596 18638 <24 95112 -- --
45ª TF: betaína 1 mM, DO550 0,01, transferencias de 24 h, K2 CO3 3M +KOH 6N
10% de AM1 1,5 1,26 0,83 0,858 699 313 103 172 - -
KJ073f
betaína 1 mM, K2 CO3 3M +KOH 6N DO550 0,01 inóculo 10% de AM1 2,3 0,1 1,20 0,09 0,77 0,03 0,82 0,01 668 8 11813 55 22 183 27 - -
KJ060f
betaína 1 mM, K2 CO3 3M +KOH 6N DO550 0,01 inóculo 10% de AMI 2,2 0,1 1,41 0,07 0,92 0,05 0,90 0,04 733 39 3917 - 250 36 2 1 -
KJ060f
betaína 1 mM, K2 CO3 3M +KOH 6N DO550 0,60 inóculo 10% de AM1 2,2 0,1 1,61 0,12 1,05 0,09 0,77 0,04 622 8 175 1,5 1 180 13 2 1 -
KJ071f
betaína 1 mM, K2 CO3 3M +KOH 6N DO550 0,01 inóculo 10% de NBS 1,5 0,0 0,78 0,02 0,53 0,01 0,33 0,04 280 7 51614 58 15 64 9 - -
a Los clones se aislaron del caldo de fermentación en varios puntos y se les asignaron números de cepa, indicados por números entre paréntesis. b Rendimiento celular estimado de la densidad óptica (3 DO550nm = 1 g l-1 de peso seco celular). c Los rendimientos de succinato se calcularon basándose en la glucosa metabolizada.
5 d La Productividad Volumétrica Promedio se calculó por el tiempo total de incubación. e Abreviaturas: succ, succinato; mal, malato; pir, piruvato; ace; acetato; lac, lactato; for, formiato. f Promedio de 3 o más fermentaciones con desviaciones típicas. g Los guiones indican ausencia de producto. h Matraz aeróbico agitado (100 rpm; 100 ml de NBS, matraz de 250 ml).
10 TABLA 4 Comparación de actividades de enzima de carboxilación en diferentes cepas
Enzima
Actividad específica [nmol min-1 (mg de proteína)-1]
E. coli C
E. coli KJ012 E. coli KJ017 E. coli KJ073 E. coli K12a Actinobacillus succinogenesa
PEP carboxilasa
20 2 25 2 17 1 27 2 140 10
PEP carboxi cinasa
295 23 162 11 700 68 7341 462 140 4.700
Enzima málica (NADH, carboxilación)
NDb 5 2 12 4 12 3 Desconocida Desconocida
Enzima málica (NADPH carboxilación)
<1 <1 <1 <1 Desconocida Desconocida
a Datos de van der Werf, 1997 b No se pudo medir en E. coli C salvaje debido a la presencia de lactato deshidrogenasa 15 TABLA 5 Composición de medio (excluyendo fuente de carbono)
Componente
Concentración (mol L-1)
aNBS + betaína 1 mM AM1 betaína 1 mM
KH2PO4K2HPO4(NH4)2HPO4NH4H2PO4Total de PO4
25,72 0 28,71 0 26,50 19,92 0 7,56 80,93 27,48
Componente
Concentración (mol L-1)
Total de N bTotal de K MgSO4 7H2O CaCl2 2H2OTiamina HCl Betaína-KCl
53,0184,13 1,00 0,10 0,015 1,00 47,39 1,00 1,50 0 0 1,00
FeCl3 6H2O CoCl2 6H2OCuCl2 2H2OZnCl2Na2MoO4 2H2O H3BO3MnCl2 4H2O2
(μmol L-1)c 5,92 0,84 0,59 1,47 0,83 0,81 0 8,88 1,26 0,88 2,20 1,24 1,21 2,50
Total de sales
12,5 g L-1 4,1 g L-1
TABLA 6 Cepas de Escherichia coli, plásmidos y cebadores usados en este estudio
Cepas de Escherichia coli
Características Relevantes
Fuentes
Cepa B
KJ073
LldhA::FRT LadhE::FRT L(focA-pftB)::FRT LackA::FRT LmgsA LpoxB Jantama et al., 2008
KJ076
KJ073, LackA::cat-sacB, secuencia de detención de traducción Descrito en la presente
KJ079
KJ073, LackA:: secuencia de detención de traducción Descrito en la presente
TG200
KJ079, LadhE::cat-sacB Descrito en la presente
TG201
TG200, LadhE Descrito en la presente
TG202
TG201, LldhA::cat-sacB Descrito en la presente
TG203
TG202, LldhA Descrito en la presente
TG204
TG203, L (focA-pflB)::cat-sacB Descrito en la presente
KJ091
TG204, L(focA-pflB) Descrito en la presente
KJ098
KJ091, LtdcDE Descrito en la presente
KJ104
KJ098, LcitF Descrito en la presente
KJ110
KJ104, LaspC Descrito en la presente
KJ119
KJ104, LsfcA Descrito en la presente
KJ122
KJ110, LsfcA Descrito en la presente
KJ134
KJ122, LackA-pta Descrito en la presente
Plásmidos
pKD46
bla y B exo (recombinasa Red), replicón condicional de temperatura Datsenko, 2000
pEL04
casete cat-sacB Lee, 2001 Thomason 2005
pLOI2228
casete cat; FRT-cat-FRT Martínez Morales et al., 1999
pLOI2511
casete bla kan; FRT-kan-FRT Underwood et al., 2002
pLOI4131
bla; ligación de pLOI2228 (casete FRT-cat-FRT digerido con BanI, tratado con klenow, digerido con ClaI) y pLOI2511 (digerido con NheI, tratado con Klenow, digerido con ClaI) Descrito en la presente
pLOI4145
bla; pLOI4131 digerido con EcoRI, autoligación Descrito en la presente
pLOI4146
bla cat; ligación de casete cat-sacB amplificada por PCR (usando iniciadores JMcatsacBup3/down3) de pLOI4152, pLOI4153 digerido con BamHI/XhoI y digerido con BamHI/XhoI Descrito en la presente
pLOI4151
casete bla cat; cat-sacB Jantama et al., 2008
pLOI4152
casete cat-sacB; amplificada por PCR de pEL04 (usando cebadores JMpEL04F1/R1), digestión con BglII y autoligación Descrito en la presente
TABLA 6 (Continuación)
Plásmidos
pLOI4153
bla; ligación de pLOI4145 (digerido con KasI/XmaI) y poliligador SfPBXPS digerido con KasI/XmaI (recocido de oligonucleótidos complementarios SfPBXPSsense/SfPBXPScomp) Descrito en la presente
pLOI4154
pLOI4146 digerido con pacI, autoligación Descrito en la presente
pLOI4161
casete bla cat; cat-sacB Descrito en la presente
pLOI4162
bla cat; ligación de casete cat-sacB (digerida con PacI) de pLOI4146 y pLOI4161 digerido con PacI Descrito en la presente
pCR2.1-TOPO
bla kan; vector de clonación TOPO TA Invitrogen
pLOI4158
bla kan; ackA (PCR) de E. coli C (usando cebadores JMackA-F1/R1), clonado en el vector pCR2.1-TOPO Descrito en la presente
pLOI4159
casete cat-sacB digerida con SmaI/SfoI de pLOI4162, clonado en el producto inverso amplificado por PCR de pLOI4158 (usando JMackAup1/down1) Descrito en la presente
pLOI4160
Digestión de pLOI4159 con PacI, después autoligado Descrito en la presente
pLOI4515
bla kan; tdcG’-tdcFED-tdcC’ (PCR) de E. coli C (usando cebadores tdcDE-up/down) clonado en el vector pCR2.1-TOPO Descrito en la presente
pLOI4516
casete cat-sacB digerida con SmaI/SfoI de pLOI4162 clonado en el producto inverso amplificado por PCR de pLOI4515 (usando cebadores tdcDE-F7/R7) Descrito en la presente
pLOI4517
Producto inverso amplificado del fragmento por PCR de pLOI415 (usando cebadores tdcDE-F7/R7), tratado con cinasa, después autoligado Descrito en la presente
pLOI4629
bla kan; citF (PCR) de E. coli C (usando cebadores citF-up2/down2) clonado en el vector pCR2.1-TOPO Descrito en la presente
pLOI4630
casete cat-sacB digerida con SmaI/SfoI de pLOI4162, clonado en el producto inverso amplificado por PCR de pLOI4629 (usando cebadores citF-2/3) Descrito en la presente
pLOI4631
digestión con PacI de pLOI4630, después autoligado Descrito en la presente
pLOI4280
bla kan; asp C (PCR) de E. coli C (usando cebadores aspC-up/down), clonado en el vector pCR2.1-TOPO Descrito en la presente
pLOI4281
casete cat-sacB digerida con SmaI/SfoI de pLOI4162, clonado en el producto inverso amplificado por PCR de pLOI4280 (usando cebadores aspC-1/2) Descrito en la presente
pLOI4282
Producto inverso amplificado del fragmento por PCR de pLOI4280 (usando cebadores aspC-1/2), tratado con cinasa, después autoligado Descrito en la presente
pLOI4283
bla kan; sfcA (PCR) de E. coli C (usando cebadores sfcA-up/down), clonado en el vector pCR2.1-TOPO Descrito en la presente
pLOI4284
casete cat-sacB digerida con SmaI/SfoI de pLOI4162, clonado en el producto inverso amplificado por PCR de pLOI4283 (usando cebadores sfcA-1/2) Descrito en la presente
pLOI4285
digestión de pLOI4284 con PacI, después autoligado Descrito en la presente
pLOI4710
bla kan; ackA-pta (PCR) de E. coli C (usando cebadores ackA-up/ptadown), clonado en el vector pCR2.1-TOPO Descrito en la presente
pLOI4711
casete cat-sacB digerida con SmaI/SfoI de pLOI4162, clonado en el producto inverso amplificado por PCR de pLOI4710 (usando cebadores ackA-2/pta-2) Descrito en la presente
TABLA 6 (Continuación)
Plásmidos
pLOI4712
digestión de pLOI4711 con PacI, después autoligado Descrito en la presente
pLOI4413
bla kan; ychE’-adhE-ychG’ (PCR) de E. coli C (usando cebadores up/down-adhE), clonado en el vector pCR2.1-TOPO Descrito en la presente
pLOI4419
Producto inverso amplificado del fragmento por PCR de pLOI4413 (usando cebadores IO-adhE-up/down), tratado con cinasa, después autoligado Descrito en la presente
pLOI4415
bla kan; ycaO’-focA-pflB-pflA’ (PCR) de E. coli C (usando cebadores up-focA/Mid-pftA), clonado en el vector pCR2.1-TOPO Descrito en la presente
pLOI4421
Producto inverso amplificado del fragmento por PCR de pLOI4415 (usando cebadores IO-ycaO-up/IO-midpflB-down), tratado con cinasa, después autoligado Descrito en la presente
pLOI4430
bla kan; hslJ’-IdhA-ydbH’ (PCR) de E. coli C (usando cebadores IdhA-A/C) clonado en el vector pCR2.1-TOPO Descrito en la presente
pLOI4432
Producto inverso amplificado del fragmento por PCR de pLOI4424 (usando cebadores IO-IdhA-up/down), tratado con cinasa, después autoligado Descrito en la presente
Series de cebadores
JM4161 sense/comp
5’ACCGCATCAGGCGCCTAATTAATTAATCCCGG3’ (SEQ ID NO: 30) 5’CCGGATTAATTAATTAGGCGCCTGATGCGGT3’ (SEQ ID NO: 31) Descrito en la presente
JMpEL04F 1/R1
5’CAGCAGATCTAAGTAAATCGCGCGGGTTTG3’ (SEQ ID NO: 32) 5’CAGCAGATCTAGCGGCTATTTAACGACCCT3’ (SEQ ID NO: 33) Descrito en la presente
JMackA-F1/R1
5’GCCTGAAGGCCTAAGTAGTA3’ (SEQ ID NO: 34) 5’GCACGATAGTCGTAGTCTGA3’ (SEQ ID NO: 35) Descrito en la presente
JmackA up1/down1
5’GTTGAGCGCTTCGCTGTGAG3’ (SEQ ID NO: 36) 5’GCCGCAATGGTTCGTGAACT3’ (SEQ ID NO: 37) Descrito en la presente
JmcatsacB up3/down3
5’CTCACCTCGAGTGTGACGGAAGATCACTTCG3’ (SEQ ID NO: 38) 5’GTGCAGGATCCATCAAAGGGAAAACTGTCCATAT3’ (SEQ ID NO: 39) Descrito en la presente
SfPBXPS sense/comp
5’ATGTAGGCGCCATTAATTAATGGATCCACTATCTCGAGA TTAATTAATCCCGGGACTAT3’ (SEQ ID NO: 40) 5’ATAGTCCCGGGATTAATTAATCTCGAGATAGTGGATCCA TTAATTAATGGCGCCTACAT3’ (SEQ ID NO: 41) Descrito en la presente
WMadhE A/C
5’ATGGCTGTTACTAATGTCGCTGAACTTAACGCACTCGTA GAGCGTCGGCACGTAAGAGGTTCCAA3’ (SEQ ID NO: 42) 5’TTAAGCGGATTTTTTCGCTTTTTTCTCAGCTTTAGCCGGA GCAGCACACTGCTTCCGGTAGTCAA3’ (SEQ ID NO: 43) Descrito en la presente
WMIdhA A/C
5’ATGAAACTCGCCGTTTATAGCACAAAACAGTACGACAA GAAGTACGGCACGTAAGAGGTTCCAA3’ (SEQ ID NO: 44) 5’TTAAACCAGTTCGTTCGGGCAGGTTTCGCCTTTTTCCAG ATTGCTACACTGCTTCCGGTAGTCAA3’ (SEQ ID NO: 45) Descrito en la presente
TABLA 6 (Continuación)
Series de iniciadores
WMpflB A/C
5’TTACTCCGTATTTGCATAAAAACCATGCGAGTTACGGGC CTATAACGGCACGTAAGAGGTTCCAA3’ (SEQ ID NO: 46) 5’TTACATAGATTGAGTGAAGGTACGAGTAATAACGTCCTG CTGCTGTTCTACACTGCTTCCGGTAGTCAA3’ (SEQ ID NO: 47) Descrito en la presente
tdcDEup/down
5’CGCCGACAGAGTAATAGGTT3’ (SEQ ID NO: 48) 5’TGATGAGCTACCTGGTATGG3’ (SEQ ID NO: 49) Descrito en la presente
tdcDE- F7/R7
5’CGATGCGGTGGCCAATTAAG3’ (SEQ ID NO: 50) 5’GACGACGTGCTGGATTACGA3’ (SEQ ID NO: 51) Descrito en la presente
citFup2/down2
5’GGGTATTCAGGCGTTCGATA3’ (SEQ ID NO: 52) 5’GCCCGAGAGGATGACTATGT3’ (SEQ ID NO: 53) Descrito en la presente
citF-2/3
5’GGTGATCGATGTTGTGCATC3’ (SEQ ID NO: 54) 5’CCCGTTCTTGTCGTTGAGAT3’ (SEQ ID NO: 55) Descrito en la presente
IO-adhEup/down
5’GCTGCTCCGGCTAAAGCTGA3’ (SEQ ID NO: 56) 5’ACGCTCTACGAGTGCGTTAA3’ (SEQ ID NO: 57) Descrito en la presente
up-focA/MidpflB
5’AGATCGCCAGCCGCTGCAAT3’ (SEQ ID NO: 58) 5’AACCGTTGGTGTCCAGACAG3’ (SEQ ID NO: 59) Descrito en la presente
IO-ycaO-up/IOmidpflB-down
5’GCCTACATTGCGTAGGCTAT3’ (SEQ ID NO: 60) 5’GCAGCAGGACGTTATTACTC3’ (SEQ ID NO: 61) Descrito en la presente
IdhA-A/C
5’ATGAAACTCGCCGTTTATAG3’ (SEQ ID NO: 62) 5’TTAAACCAGTTCGTTGCCC3’ (SEQ ID NO: 63) Descrito en la presente
IO-IdhAup/down
5’CGTTCGATCCGTATCCAAGT3’ (SEQ ID NO: 64) 5’AGGCTGGAACTCGGACTACT3’ (SEQ ID NO: 65) Descrito en la presente
aspCup/down
5’TCCATCGCTTACACCAAATC3’ (SEQ ID NO: 66) 5’TGGGGGATGACGTGATATTT3’ (SEQ ID NO: 67) Descrito en la presente
aspC-1/2
5’AGATAACATGGCTCCGCTGT3’ (SEQ ID NO: 68) 5’AGGAGCGGCGGTAATGTTC3’ (SEQ ID NO: 69) Descrito en la presente
sfcA-up/down
5’CTATGCTTGATCGGCAACCT3’ (SEQ ID NO: 70) 5’ACGATCGCCTGGTTTTAATG3’ (SEQ ID NO: 71) Descrito en la presente
sfcA-1/2
5’TACCGCCGTACCTCCATCTA3’ (SEQ ID NO: 72) 5’CGTAAGGGATATAAAGCGAACG3’ (SEQ ID NO: 73) Descrito en la presente
ackA-up/ptadown
5’CGGGACAACGTTCAAAACAT3’ (SEQ ID NO: 74) 5’ATTGCCCATCTTCTTGTTGG3’ (SEQ ID NO: 75) Descrito en la presente
ackA-2/pta-2
5’AACTACCGCAGTTCAGAACCA3’ (SEQ ID NO: 76) 5’TCTGAACACCGGTAACACCA3’ (SEQ ID NO: 77) Descrito en la presente
TABLA 7Fermentación de glucosa en medio AM1 de sales minerales por cepas mutantes de E. Coli
Cepa
Condiciones de cultivo Medio, Gluc(p/v) Rend.celulara (g/L) Rend. de succinatob Prod. Vol. Prom.c (g/L/h) Productos de fermentación (mM)d,e,f
mol/mol
g/g Suc Mal Pir Ace Lac For
KJ073
betaína 1 mM, K2 CO3 3M +KOH 6N (1:1), DO550 0,01 inóculo 10% de AM1 2,3 0,1 1,20 0,09 0,77 0,03 0,82 0,01 668 8 118 13 55 22 183 27 - -
KJ091
betaína 1 mM, K2 CO3 3M +KOH 6N (1:1) DO550 0,01 inóculo 10% de AM1 2,2 0,1 1,19 0,02 0,78 0,01 0,84 0,01 687 3 109 3 72 5 155 6 - -
KJ098
betaína 1 mM, K2 CO3 3M +KOH 6N (1:1) DO550 0,01 inóculo 10% de AM1 2,3 0,1 1,30 0,04 0,85 0,02 0,79 0,01 644 9 - 42 8 88 1 - -
KJ104
betaína 1 mM, K2 CO3 3M +KOH 6N (4:1) DO550 0,01 inóculo 10% de AM1 1,8 0,1 1,31 0,01 0,86 0,01 0,78 0,03 634 25 5 1 78 5 90 10 - -
KJ104
betaína 1 mM, K2 CO3 3M +KOH 6N (6:1) DO550 0,01 inóculo 10% de AM1 1,9 0,1 1,30 0,01 0,85 0,01 0,77 0,01 625 4 3 2 94 5 81 2 - -
KJ110
betaína 1 mM, K2 CO3 3M +KOH 6N (4:1) DO550 0,01 inóculo 10% de AM1 2,0 0,1 1,28 0,02 0,84 0,01 0,79 0,01 640 10 4 1 76 6 106 11 - -
KJ119
betaína 1 mM, K2 CO3 3M +KOH 6N (4:1) DO550 0,01 inóculo 10% de AM1 2,0 0,1 1,33 0,07 0,87 0,01 0,82 0,01 672 10 4 0 64 18 95 14 - -
KJ122
betaína 1 mM, K2 CO3 3M +KOH 6N (4:1) DO550 0,01 inóculo 10% de AM1 2,3 0,1 1,50 0,02 0,98 0,01 0,92 0,01 750 1 0 0 122 21 94 13 - -
KJ122
betaína 1 mM, K2 CO3 3M +KOH 6N (6:1) DO550 0,01 inóculo 10% de AM1 2,0 0,2 1,54 0,02 1,01 0,01 0,97 0,04 787 35 6 3 59 6 110 7 - -
KJ122
betaína 1 mM, K2 CO3 3M +KOH 6N (6:1) DO550 0,15 inóculo 10% de AM1 2,1 0,01 1,57 0,09 1,03 0,06 0,93 0,06 756 49 0 0 124 13 122 9 - -
KJ134
betaína 1 mM, K2 CO3 3M +KOH 6N (6:1) DO550 0,01 inóculo 10% de AM1 2,3 0,1 1,70g 0, 03 1,11 0,02 0,83 0,02 674 15 13 2 22 9 37 5 -
a Rendimiento celular estimado a partir de la densidad óptica (3 DO550nm = 1 g l-1 de peso seco celular).
b Los rendimientos de succinato se calcularon basándose en la glucosa metabolizada.
c La Productividad Volumétrica Promedio se calculó para el tiempo total de incubación.
d Abreviaturas: succ, succinato; mal, malato; pir, piruvato; ace; acetato; lac, lactato; for, formiato.
c Estuvo presente etanol (153±39 mM) solo en el caldo de E. coli C.
f Todos los datos representan un promedio de 3 o más fermentaciones con desviaciones típicas.
g También se encontraron productos adicionales a pesar de los rendimientos casi teóricos de succinato. Basándose en el total de productos, los coproductos representaron 11%.
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Claims (18)

  1. REIVINDICACIONES
    1.- Una cepa bacteriana modificada genéticamente que comprende modificaciones genéticas para los siguientes genes objetivo que codifican: a) acetato cinasa, b) lactato deshidrogenasa, c) alcohol deshidrogenasa, d) piruvatoformiato liasa, e) metilglioxal sintasa, f) piruvato oxidasa, g) citrato liasa, h) aspartato aminotransferasa, i) transportador de formiato, j) fosfato acetiltransferasa, k) enzima málica, y l) propionato cinasa/a-cetobutirato-formiato liasa, anulando dichas modificaciones genéticas la actividad enzimática del polipéptido producido por dicho gen objetivo.
  2. 2.- La cepa bacteriana modificada genéticamente de la reivindicación 1, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente es: Escherichia coli, Gluconobacter oxydans, Gluconobacter asaii, Achromobacter delmarvae, Achromobacter viscosus, Achromobacter lacticum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Alcaligenes faecalis, Arthrobacter citreus, Arthrobacter tumescens, Arthrobacter paraffineus, Arthrobacter hydrocarboglutamicus, Arthrobacter oxydans, Aureobacterium saperdae, Azotobacter indicus, Brevibacterium ammoniagenes, divaricatum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium globosum, Brevibacterium fuscum, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium helcolum, Brevibacterium pusillum, Brevibacterium testaceum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium immariophilium, Brevibacterium linens, Brevibacterium protopharmiae, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Enterobacter aerogenes, Erwinia amylovora, Erwinia carotovora, Erwinia herbicola, Erwinia chrysanthemi, Flavobacterium peregrinum, Flavobacterium fucatum, Flavobacterium aurantinum, Flavobacterium rhenanum, Flavobacterium sewanense, Flavobacterium breve, Flavobacterium meningosepticum, Micrococcus sp. CCM825, Morganella morganii, Nocardia opaca, Nocardia rugosa, Planococcus eucinatus, Proteus rettgeri, Propionibacterium shermanii, Pseudomonas synxantha, Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas ovalis, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas acidovolans, Pseudomonas mucidolens, Pseudomonas testosteroni, Pseudomonas aeruginosa, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus sp. ATCC 15592, Rhodococcus sp. ATCC 19070, Sporosarcina ureae, Staphylococcus aureus, Vibrio metschnikovii, Vibrio tyrogenes, Actinomadura madurae, Actinomyces violaceochromogenes, Kitasatosporia parulosa, Streptomyces coelicolor, Streptomyces flavelus, Streptomyces griseolus, Streptomyces lividans, Streptomyces olivaceus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces virginiae, Streptomyces antibioticus, Streptomyces cacaoi, Streptomyces lavendulae, Streptomyces viridochromogenes, Aeromonas salmonicida, Bacillus pumilus, Bacillus circulans, Bacillus thiaminolyticus, Escherichia freundii, Microbacterium ammoniaphilum, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium, Salmonella schottmulleri, o Xanthomonas citri.
  3. 3.- La cepa bacteriana modificada genéticamente de la reivindicación 2, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente es Escherichia coli.
  4. 4.- La cepa bacteriana modificada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el gen, o porciones del mismo o los genes objetivo, o las porciones de los mismos, son anulados por deleciones, mutaciones de desplazamiento de marco, mutaciones puntuales, la inserción de codones de detención o combinaciones de los mismos.
  5. 5.- La cepa bacteriana modificada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente no contiene un gen exógeno ni un fragmento del mismo, o solo contiene genes nativos.
  6. 6.- La cepa bacteriana modificada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, con la condición de que: 1) dicha cepa bacteriana modificada genéticamente no debe tener uno o más de las siguientes enzimas desactivadas: a) fumarato reductasa b) ATP sintasa; c) 2-cetoglutarato deshidrogenasa; d) succinato deshidrogenasa; e) transportador de glucosa; f) represor de isocitrato liasa; y/o 2) dicha cepa modificada genéticamente no contenga un plásmido o un plásmido multicopia que codifique y/o exprese en exceso los genes para la malato deshidrogenasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa, piruvato carboxilasa, y/o citrato sintasa.
  7. 7.- La cepa bacteriana modificada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente está evolucionada metabólicamente.
  8. 8.- La cepa bacteriana modificada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente produce:
    a) concentraciones de succinato de por lo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 650 mM, o 700 mM; b) concentraciones de fumarato de por lo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 650 mM, o 700 mM; o c) concentraciones de malato de por lo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM o 500 mM.
  9. 9.- Una cepa bacteriana modificada genéticamente, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente es KJ134 depositada en la Colección de Cultivos ARS con la designación de cepa B50116.
  10. 10.- Un método de cultivo o desarrollo de una cepa bacteriana modificada genéticamente, que comprende inocular un medio de cultivo con una o más de las cepas bacterianas modificadas genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, y cultivar o desarrollar dicha cepa bacteriana modificada genéticamente.
  11. 11.- El método de la reivindicación 10, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente se cultiva en un medio de sales minerales, preferiblemente en un medio que comprende entre 2% y 20% de carbohidrato (p/v), más preferiblemente en un medio que contiene 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 10,5%, 11%, 11,5%, 12%, 12,5%, 13%, 13,5%, 14%, 14,5%, 15%, 15,5%, 16%, 16,5%, 17%, 17,5%, 18%, 18,5%, 19%, 19,5%, o 20% de un azúcar (p/v), siendo preferiblemente dicho carbohidrato glucosa, fructosa, xilosa, arabinosa, galactosa, manosa, ramnosa, sacarosa, celobiosa, hemicelulosa, o combinaciones de las mismas.
  12. 12.- Un método para producir succinato, fumarato o malato que comprende cultivar una o más cepas bacterianas modificadas genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en condiciones que permitan la producción de succinato o malato o fumarato
  13. 13. El método de la reivindicación 12, donde dicha una o más cepa bacteriana modificada genéticamente es KJ134 depositada en la Colección de Cultivos ARS con la designación de cepa B50116.
  14. 14.- El método de una cualquiera de las reivindicaciones 12-13, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente se cultiva en un medio de sales minerales, preferiblemente en un medio que comprende entre 2% y 20% de carbohidrato (p/v), más preferiblemente en un medio que contiene 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 10,5%, 11%, 11,5%, 12%, 12,5%, 13%, 13,5%, 14%, 14,5%, 15%, 15,5%, 16%, 16,5%, 17%, 17,5%, 18%, 18,5%, 19%, 19,5%, o 20% de un azúcar (p/v), siendo preferiblemente dicho carbohidrato glucosa, fructosa, xilosa, arabinosa, galactosa, manosa, ramnosa, sacarosa, celobiosa, hemicelulosa, o combinaciones de las mismas.
  15. 15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, donde el rendimiento de succinato o malato es mayor
    o igual que 90%, más preferiblemente un rendimiento de al menos 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, o 99%,
  16. 16.
    El método de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, donde dicha cepa bacteriana modificada genéticamente produce
    a) concentraciones de succinato de por lo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 650 mM, o 700 mM, b) concentraciones de malato de por lo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM o 500 mM, o c) concentraciones de fumarato de por lo menos 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 650 mM, o 700 mM.
  17. 17.
    El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, donde el medio de crecimiento comprende glicerol como sustrato para la producción de succinato, malato o fumarato.
  18. 18.
    Una composición que comprende una o más cepas bacterianas modificadas genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un medio.
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