TW201538477A - 製備丁二酸酯之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於由存在於發酵液中之丁二酸鹽用於製備丁二酸酯之方法。於本發明之第一階段中，利用可再生碳源經由生物發酵以產生丁二酸鹽形式之丁二酸。將存在於該發酵液中之丁二酸鹽用強酸進行雙置換反應導致丁二酸釋放。丁二酸係藉整合分步結晶與醇洗滌步驟來回收且進行酯化反應以產生丁二酸酯，其係藉分餾而純化。將如此所得到之丁二酸酯經由氫化反應轉化為1,4-丁二醇、γ-丁內酯及四氫呋喃。亦可將該丁二酸酯水解以產生高純度之丁二酸。

Description

製備丁二酸酯之方法
本發明係於生產專業及商品有機化學品之領域中，使用可再生碳源使用經改質之生物催化劑來提高其等之能力以產生一種或其他化學品。本發明係關於由可再生碳源經由包含生物催化劑之生物發酵所得到之丁二酸鹽製造1,4-丁二醇、γ-丁內酯及四氫呋喃。更具體地說，本發明係關於由存在於發酵液中之丁二酸鹽製造丁二酸酯。
1,4-丁二醇(BDO)、γ-丁內酯(GBL)、四氫呋喃(THF)，及晶狀丁二酸為有用的工業化學品。BDO目前係於塑料與聚酯之製造中用作為工業溶劑。BDO亦為有用之化學品像GBL及THF的先質。其係可與水溶混之質子性極性溶劑。目前全球之BDO市場為每年約30億英磅，幾乎全部係由石化過程中生產。GBL係用作為溶劑用來替代環境有害之氯化溶劑。GBL為製備吡咯烷酮之中間產物，其係於製造除莠劑、橡膠添加劑及醫藥品中用作為原料者。THF為使用於有機化學中之非質子混溶性溶劑。其亦廣泛使用於樹脂與聚合物之生產中。
製造BDO之典型的方法係將由石化產品所衍生之乙炔與甲醛進行反應使用雷普化學(Reppe chemistry)而起始。然後將所得到之1,4-丁炔二醇進行氫化而形成BDO。製造BDO最經濟之途徑係使用丁烷作為原料。於該方法之第一階段中，丁烷係被氧化以產生順式丁烯二酸酐，其係經由BP/Lurgi Geminox方法或戴維技術(Davy Technology)方法轉而轉化為BDO。該BP/Lurgi Geminox方法係回收順式丁烯二酸酐為順式丁烯二酸，且進行液相氫化作用而產生BDO與THF及/或GBL之混合物。於該戴維技術方法中，順式丁烯二酸酐係經酯化為順式丁烯二酸二甲酯，然後經蒸發且輸 送至氣相氫化系統而產生丁二酸二甲酯。丁二酸二甲酯接受氫解反應產生GBL及BDO，其可進一步轉化為THF。將此等產品藉蒸餾予以分離，且將甲醇再循環回到酯化反應器。
用於製造BDO、GBL，及THF之此等習用方法不是永續發展的，因為該原料係由石油原料所衍生。一種用於衍生以生物為底之BDO之可能途徑係將生物-丁二酸酯化成丁二酸二烷酯，且將所產生之丁二酸二烷酯氫化以產生BDO、GBL，及THF。於BDO製造中使用生物-丁二酸之主要障礙為製造過程之成本。仍有必要發展以成本有效方式之生物-BDO製造方法。
最近，使用生物催化劑如大腸桿菌、琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogens)及產琥珀酸曼氏桿菌(Mannheimia succiniproducens)經由可再生碳源進行發酵製造丁二酸業已顯著地進展。生物-丁二酸可與BDO聚合以形成可生物降解之聚丁烯丁二酸酯(PBS)聚合物。此外，生物-丁二酸於水性發酵液中可用醇酯化以生成丁二酸二烷酯，其轉而可進行汽相氫化反應以產生BDO、GBL及THF。由生物-丁二酸至BDO經由丁二酸之烷基酯之途徑，於減少二氧化碳(CO2)排放量上具有顯著的優勢，超過習用以石油為主之製造BDO的方法。如反應式[1]中所示者，有用於丁二酸製造之大腸桿菌菌株係直接消耗CO2以便製造丁二酸。該產生丁二酸之大腸桿菌菌株經由發酵過程需要約0.5莫耳CO2以製造每莫耳之丁二酸。
7 C6H12O6(右旋糖)+6 CO2 → 12 C4H6O4(丁二酸)+6 H2O 反應式[1]
涉及細菌性生物催化劑之丁二酸發酵過程，典型地係藉由添加鹼至該發酵器以保持接近中性pH，因為丁二酸正產生中。其結果是，於發酵作用結束時該產物係為丁二酸鹽之形式。為了轉化丁二酸鹽回到丁二酸，業已提出幾種方法。類似地，有幾種方法業已提出用於酯化由發酵液中所回收之丁二酸，以及經由氫化反應轉化丁二酸酯為BDO、GBL，及THF。本發明係提供一種用於由發酵液中回收含最少量雜質之丁二酸且將其烷化以產生丁二酸酯之整合的方法。
用於回收丁二酸及其之鹽之適當下游過程之設計業已進行許多調查與努力及評論。不同下游途徑之核心分離技術包括石灰沉澱法、 包含模擬移動床色層分離之色層分離法、電滲析(ED)、反應萃取、涉及離子交換樹脂或沸石之吸附作用、結晶作用等。此等方法大多數主要係於實驗室且甚至於試驗工廠規模中操作，但工業成就係依擴展性、可操作性、健全性、產率及成本而定。本發明之目的係提供用於由含有丁二酸銨之發酵液回收丁二酸酯之新穎方法，其於擴展至工業程度時係成本有效的。
美國專利案號5,168,055揭示用於由含有丁二酸鹽之發酵液回收丁二酸之方法。根據該方法，硫酸係添加到該汁液中以產生丁二酸及硫酸鈣(石膏)。由該酸化過程所產生之硫酸鈣具有非常小至毫無商業價值且通常於該過程結束時作為掩埋場廢液。
美國專利案號5,034,105及5,143,834揭示了電滲析(ED)方法於發酵液中分解丁二酸鹽以產生鹼與丁二酸。如此之方法具有如，不生成硫酸鹽副產物之優點。然而，電滲析膜經常受制於該發酵液中來自各種蛋白質、大分子及多價離子之結垢，導致非常高的更換費用。
國際專利申請公開案號WO2011/160760及美國專利申請公開案號US 2013/0096343揭示包括酸化步驟以產生丁二酸與硫酸銨之混合物，接著模擬移動床(SMB)色層分離步驟以由硫酸銨中分離丁二酸之方法。將該丁二酸流蒸發且結晶出來以產生純的丁二酸。
用於由含有羧酸或羧酸鹽之發酵液中回收羧酸之反應萃取方法業已於許多美國專利案中說明。一個與反應萃取方法有關之議題為工業規模回收溶劑所面臨之挑戰。
由大維森等(2004)進行試驗超過25項吸附劑用於由水溶液中提取丁二酸。以中等濃度(1-5克/升)之丁二酸，最佳之樹脂具有約0.06克丁二酸/克樹脂之容量。70%回收率係使用熱水再生來達成且該再生過程於該管柱中超過10個循環不穩定。使用酸與鹼之替代再生圖示將增加化學消耗且生成更多廢棄物。以樹脂為主之分離作用，若發酵液未經充分預處理亦容易結垢。
結晶作用係一種已知於人類最古老之分離及純化技術。結晶作用不僅可視為最終之純化步驟，而且係用於丁二酸下游分離之第一回收步驟。由於其之健全性、可操作性及成本效益，由溶液中結晶與沉澱係擔負70%由化學工業所生產之全部固體物質。
WO2011/123269揭示由存在於發酵液中之丁二酸二銨用於製造THF、GBL，及BDO之方法。該方法係涉及以高於大氣壓力及溫度於100-300℃之間煮沸該發酵液。該過程之目的係形成含有水及氨之塔頂餾出物及含有丁二酸與至少20重量%水之液體底部產物，以防止醯胺副產物形成。極性高沸點溶劑可於該步驟中使用。其次，該底部產物係經冷卻以形成含有丁二酸之固體部分。將該固體回收且於氫化催化劑存在下進行氫化以產生THF、GBL及BDO。於本專利申請案之實例4中係用80克之36%丁二酸二銨溶液及80克三甘醇二甲醚起始。於蒸發過程中必須逐漸加進3300克額外量的水至該蒸餾混合物中，以防止形成副產物如丁醯胺酸及琥珀醯亞胺。最後共計提取3313克餾出物。然後將該溶液冷卻以沉澱出7.1克固體。該固體必須進行再一次再結晶，藉由添加7.1克熱水且冷卻以產生3.9克丁二酸。該丁二酸對該結晶之產率經計算只有17%且其仍含有0.099重量%之丁醯胺酸。該方法具有經濟上之不利，因為需要這麼多的水加至該反應(3300克水用於80克進料之情況中)只是被蒸餾掉。若將該方法放大至工業規模，其將需要大量的熱能用來蒸發。
美國專利案號5,958,744及6,265,190揭示需要將含有發酵液之丁二酸二鈉濃縮至30%重量/重量且藉添加銨、H2SO4及NH4SO4來調整pH至1.5-1.8以產生丁二酸及硫酸銨之方法。於該pH範圍時，丁二酸之溶解度低導致其沉澱出來。將該沉澱之丁二酸再溶於甲醇中。為了產生純丁二酸，該甲醇係經蒸發且該丁二酸再結晶出來。硫酸銨係不溶於甲醇中。將甲醇加入硫酸銨結晶器中以幫助硫酸銨崩解。該聯產物硫酸銨可，較佳於約290-310℃進行熱崩解成氨及硫酸氫銨。該蒸發之甲醇及水蒸汽可予以冷凝且再利用。該雜質之含量，如根據本發明之方法所得到之硫於丁二酸中者為未知。
因為於丁二酸酯轉化為其之氫化產品，如BDO、GBL及THF中所使用之氫化催化劑係已知對硫污染敏感，有必要用100ppm，較佳低於50ppm且最佳低於10ppm範圍內之最少硫含量來產生丁二酸酯。
本發明係提供用於由含有丁二酸鹽之發酵液中回收丁二酸之新穎與簡單的方法，其係經由酸化與酯化丁二酸以產生二烷基丁二酸酯，其轉而進行氫化反應以產生BDO、GBL及THF。因此，經由本發明之 方法生產以生物為底之BDO、GBL或THF將具有低碳排放量且有助於擴大價值增添之綠色化學品之投資組合。
本發明之摘要
本發明係提供由存在於發酵液中之丁二酸鹽用於製備丁二酸酯之方法。根據本發明所生產之丁二酸酯係經氫化以產生選自於群組包括1,4-丁二醇(BDO)、四氫呋喃(THF)及γ-丁內酯(GBL)之產物。
適用於本發明之丁二酸鹽係使用細菌與真菌之生物催化劑包括酵母來生產。用於生產丁二酸之生物催化劑可利用多種碳源包括葡萄糖、蔗糖、甘油及纖維素水解產物。丁二酸係蓄積於該發酵液中作為具有選自於群組包括鹼金屬、鹼土金屬、銨，或烷基銨基團之平衡離子的鹽。丁二酸係使用強酸將該澄清發酵液酸化而回收為游離酸。於本發明之一個方面中，強無機酸如硫酸係用於處理該含有丁二酸銨之發酵液，導致丁二酸及硫酸銨釋放。於本發明之另一個方面中，磷酸係用於酸化該含有丁二酸銨之發酵液導致丁二酸及磷酸銨釋放。
於可經由根據本發明之生物方法製造之多種丁二酸鹽之中，丁二酸銨係優先使用於本發明中。根據本發明之方法能夠由含有丁二酸銨之發酵液回收最大量之丁二酸且其轉化為丁二酸酯係以成本有效之方式。
於本發明之一個具體例中，丁二酸酯係使用涉及蒸發、過濾、與酸化相關之雙置換反應、控制結晶、酯化及分餾步驟之方法而獲得。於該具體例之第一步驟中，該含有丁二酸銨之發酵液係用強酸，如硫酸或磷酸進行酸化。該含有丁二酸銨之發酵液之酸化會導致雙置換反應，其中陽離子與陰離子交換搭配。丁二酸銨與強酸於雙置換反應中進行反應，導致游離丁二酸及銨鹽如硫酸銨或磷酸銨形成，依添加至該發酵液之強酸的性質而定。於雙置換反應完成後，將經酸化之發酵液於真空於上升溫度下蒸發且於較低溫度進行控制結晶過程。將來自於該第一結晶步驟之丁二酸晶體溶解於醇中且進行酯化反應以產生丁二酸酯，其係經由分餾而純化。
於本發明之一個方面中，該酸化之發酵液係冷卻至結晶出丁 二酸。於本發明之另一個具體例中，該發酵液係於進行酸化之前進行蒸發。於本發明之較佳方面中，該發酵液係於酸化步驟之前進行蒸發與過濾。於本發明之還有另一個方面中，由第一結晶步驟中所得到之丁二酸係進行再結晶步驟以進一步改良該丁二酸晶體之品質。
不管該處理步驟接著完成第一結晶作用，將該酸化之發酵液過濾或離心分離以於第一結晶步驟結束時將丁二酸晶體由母液中分離出來。將來自於第一結晶步驟之母液於上升溫度於真空下進行另一次蒸發步驟，接著於較低溫度於真空下進行第二結晶步驟，導致銨鹽與由雙置換反應所得到之丁二酸共結晶。將來自於第二結晶步驟之共結晶產物溶解或使用甲醇洗滌，以便由丁二酸中分離該銨鹽。銨鹽係不溶於甲醇中且經由離心分離或過濾呈晶狀銨鹽回收，而丁二酸係易於溶解於甲醇中。將含有丁二酸之甲醇相進行酯化反應，分開或與來自於第一結晶步驟中之丁二酸合併以產生丁二酸酯，其係經由分餾而進一步純化。
於本發明之另一個具體例中，含有丁二酸鹽之發酵液係經由蒸發接著鹽析步驟而濃縮。於該鹽析過程中，將濃縮之丁二酸鹽與有機溶劑，例如甲醇、乙醇等混合以回收呈固體沉澱物之丁二酸鹽，而大多數於該發酵液中之雜質係保留於甲醇-水相中。甲醇係由甲醇-水相中藉由蒸餾而回收再利用，且於水相中殘留之丁二酸鹽係再循環回到鹽析步驟以最大化丁二酸鹽回收率。將回收呈固體沉澱物之丁二酸鹽與甲醇混合且與強酸進行雙置換反應，以產生游離丁二酸及新形成之強酸的銨鹽作為雙置換反應之產物。
於本發明之一個方面中，硫酸係使用於該雙置換反應中以得到丁二酸及硫酸銨。於本發明之另一個方面中，磷酸係使用於該雙置換反應中以得到丁二酸及磷酸銨。
丁二酸係完全可溶於甲醇中，而由雙置換反應所得到之銨鹽係不溶於甲醇中且回收為固體沉澱物。因為硫酸亦能夠作用如酯化催化劑，將由於雙置換反應於甲醇存在下所形成之丁二酸酯化至特定程度，而產生含丁二酸、丁二酸一甲酯及丁二酸二甲酯於該甲醇相中之混合物。借助於提供用於酯化反應之適當條件，由雙置換反應所產生之游離丁二酸於甲醇相中可完全被酯化且二甲酯由甲醇相中經由分餾回收。該二甲酯可經 由適當之酯基轉移反應而轉化為其他所需之酯，如丁二酸二乙酯、丁二酸二丙酯及丁二酸二丁酯。
根據本發明所得到之丁二酸酯係適用於催化之汽相氫化過程以產生氫化產物，如BDO、GBL，及THF。該丁二酸酯亦可被水解而產生高純度之丁二酸。
圖式之簡單說明
圖1。用於生產由生物質-所衍生之BDO、GBL及THF之處理流程圖。於根據該流程圖之發酵過程中，丁二酸係產生為丁二酸銨。含有丁二酸銨之發酵液係藉添加硫酸達成酸化導致釋放游離丁二酸，其係根據本發明之方法回收。
圖2。三種流程圖構型根據本發明之方法用於生產丁二酸粗晶體。於流程圖1構型中，含有丁二酸銨之發酵液係用添加硫酸予以酸化，接著發酵液藉由蒸發而濃縮導致醋酸回收為濃縮物。該經酸化、濃縮之發酵液經冷卻導致丁二酸結晶。該晶狀丁二酸係經由過濾而回收。於該流程圖2a構型中，含有丁二酸銨之發酵液係藉蒸發而濃縮，且氨係於該濃縮物中回收接著冷卻。隨後，將該冷卻濃縮之發酵液予以酸化且丁二酸沉澱且經由過濾回收。於該流程圖2b構型中，含有丁二酸銨之發酵液係藉蒸發而濃縮且氨係於該濃縮物中回收。硫酸係用於酸化該濃縮發酵液，且沉澱出來之丁二酸係經加熱且進行再結晶而形成更大且更純之晶狀物質。該酸化/沉澱、加熱及結晶步驟全部可於單一設備中，使用引流管緩衝結晶器連接到再循環回路其中可添加硫酸而進行。由酸化作用所釋放的熱及任意之輔助加熱器，可用於再溶解細屑顆粒。將該引流管緩衝之結晶器中之逗留時間與混合予以控制以便得到具有高純度之大晶體。於所有三種構型中，丁二酸係於結束時經由過濾或離心分離呈粗晶體而回收。將該母液進行進一步之處理步驟以回收剩餘之丁二酸。
圖3。用於酸化含有丁二酸銨之發酵液之一階段與二階段過程。根據用於酸化含有丁二酸銨之發酵液之正常過程，亦稱為一階段過程之酸化，硫酸係於單一步驟中加至該發酵液中使該發酵液之pH由pH 6.5降 至pH 2.2-2.4。於二階段酸化過程中，起始地該發酵液之pH係由pH 6.5降至中間點(通常大約pH 2.8-3.0)接著控制之結晶步驟。由第一階段過程所形成之晶體並未收穫，但用作為晶種到第二階段，其中該溶液之pH進一步降低至pH 2.2-2.5且更多丁二酸隨著溫度降低而結晶出來。縮寫字“SAC”及“AMS”於該圖及整個該專利申請案中分別代表丁二酸及硫酸銨。
圖4A及4B。用於生產丁二酸二甲酯涉及蒸發、酸化、分步結晶，及酯化步驟之詳細處理流程圖。用於根據該處理流程圖生產丁二酸二甲酯之啟動物質為經過淨化去除生物質與蛋白質之含有丁二酸銨之發酵液。於圖4A中，H2SO4係用於酸化該發酵液，導致丁二酸質子化且形成硫酸銨呈聯產物。該酸化之溶液係於蒸發步驟中濃縮。或者，如於圖4B中所示者，經淨化之發酵液係於用H2SO4酸化之前蒸發。接著，於第一結晶步驟中，具有比硫酸銨低之溶解度的丁二酸結晶出來且經由離心分離由該母液中分離。將該丁二酸大量減少之母液於蒸發器中進一步濃縮。於第二結晶步驟中，硫酸銨係含(或不含)丁二酸結晶出來。硫酸銨係由該母液中藉離心而分離。該母液可再循環至第一或第二蒸發器中。與硫酸銨餾份共結晶之丁二酸係進一步經由甲醇洗滌步驟由硫酸銨分離出來。不溶於甲醇中之硫酸銨可予以離心分離且回收。於第一結晶步驟中所得到之丁二酸粗晶體與含有丁二酸之甲醇洗滌流二者可用作為進料至該酯化過程。可將來自於第二結晶步驟之高純度硫酸銨乾燥且作為商業肥料出售。
圖5。硫酸銨於水中之溶解度曲線。硫酸銨於水中之溶解度係隨著溫度升高而增加。甚至於0℃時，約70克硫酸銨仍溶於100克水中。
圖6A及6B。用於生產丁二酸二甲酯涉及蒸發、酸化、分步結晶，及酯化步驟之詳細處理流程圖。根據該處理流程圖，用於生產丁二酸二甲酯之啟動物質為經過淨化去除生物質及蛋白質之含有丁二酸銨的發酵液。於圖6A中，H3PO4係用於酸化該發酵液導致丁二酸質子化且形成磷酸銨(ADP)呈聯產物。該酸化之溶液係於蒸發步驟中濃縮。或者，如圖6B中所示，經淨化之發酵液係用磷酸進行酸化之前予以蒸發。接著於第一結晶步驟中，將丁二酸結晶出來且經由離心分離由該母液中分離。將該丁二酸大量減少之母液進一步於蒸發器中濃縮。於第二結晶步驟中，磷酸銨係含(或不含)丁二酸結晶出來。磷酸銨係藉離心分離由該母液中分離。該母液可再 循環至第一或第二蒸發器。將共結晶出來之丁二酸與磷酸銨由磷酸銨中經由甲醇洗滌步驟進一步分離。不溶於甲醇中之磷酸銨可予以離心分離且回收。由第一結晶步驟中所得到之丁二酸粗結晶及含有丁二酸之甲醇洗滌流二者可用作為進料到酯化過程。來自於第二結晶步驟之高純度磷酸銨可予以熱裂解而回收氨及磷酸。
圖7。磷酸對丁二酸銨溶液之滴定。於該溶液中，每克丁二酸銨需要約3克磷酸使硫酸銨水溶液至pH 2.0。
圖8。用於再循環磷酸銨之過程。當磷酸用於酸化該含有丁二酸銨之發酵液時，磷酸銨係以副產物獲得。顯示於該處理流程圖中者為用於熱轉化晶狀磷酸銨成磷酸、多磷酸及/或五氧化磷之步驟，其可於根據本發明之丁二酸回收方法中再循環。
圖9。用於由發酵過程中去除水之丁二酸銨鹽析方法。含有丁二酸銨之發酵液(AMSAC)於上升溫度於真空下進行蒸發，且將該濃縮之發酵液與甲醇混合以使丁二酸銨沉澱，其係經由過濾而回收。甲醇係由甲醇-水相中經由蒸餾及再循環而回收，而剩餘之稀丁二酸銨水溶液返回到蒸發步驟。將該晶狀丁二酸銨於硫酸存在下與甲醇混合以啟動伴隨著酯化反應之雙置換反應。將由雙置換反應所得到之不溶硫酸銨經由過濾而回收，留下包含丁二酸及丁二酸一甲酯與丁二酸二甲酯混合物之甲醇溶液。將該甲醇溶液進一步反應以使丁二酸完全轉化成丁二酸二甲酯，然後經由分餾由甲醇中回收。
圖10。丁二酸銨(AMSAC)晶體與由甲醇處理含有丁二酸銨之發酵液所衍生之母液。該含有丁二酸銨之發酵液的顏色為深色。添加甲醇至該發酵液，丁二酸銨係呈白色晶狀鹽沉澱出來且由母液中過濾出來。該母液保留所有的雜質於原發酵液中且呈現如原始發酵液之暗色。
圖11。甲醇及乙醇處理含有丁二酸銨之發酵液之比較。甲醇作為溶劑特別沉澱出呈白色晶狀固體之丁二酸銨，留下所有的雜質於該母液中。另一方面用乙醇處理，大部份雜質係與丁二酸銨一起沉澱且所得到之丁二酸銨餾份出現深色且該母液為淺色。於圖中所示之樣品從左到右編號為1至8號。樣品1與2具有甲醇：濃縮液比為4，且樣品3與4具有甲醇：濃縮液比為5。樣品1與3係於室溫用甲醇處理，且樣品2與4係用甲醇於60℃處 理。樣品5與6具有4之乙醇：濃縮液比，且樣品7與8具有5之乙醇：濃縮液比。樣品5與7係於室溫用乙醇處理，且樣品6與8係用乙醇於60℃處理。
圖12。涉及固態丁二酸銨(AMSAC餾份係由含有丁二酸銨之發酵液獲得)、甲醇及硫酸之合併的雙置換及酯化反應。由合併雙置換及酯化反應中所得到之液態餾份包含丁二酸、丁二酸一甲酯及丁二酸二甲酯。由該合併雙置換及酯化反應所得到之固態餾份係包含硫酸銨(AMS)。
圖13A、13B及13C。比較含有丁二酸銨之發酵液由一階段及二段酸化所得到之丁二酸晶體。圖13A係提供一階段與二階段酸化過程，就丁二酸產率及純度之比較。而未經洗滌之丁二酸晶體之產率於二個過程下係相似的，丁二酸晶體之乾基純度於二階段酸化過程下如與一階段酸化過程相較係高出約12%。圖13B係提供比較經由一階段與二階段酸化過程所得到之丁二酸晶體中之銨及硫雜質的含量。圖13C係提供比較經由一階段酸化過程與二階段酸化過程所得到之丁二酸晶體中之門冬胺酸、谷胺酸及丙胺酸雜質的含量。於圖13A、13B及13C中，該一階段酸化過程係稱為“正常結晶”過程。
圖14。丁二酸鹽濃度於一階段酸化過程與二階段酸化過程下於丁二酸晶體產率上之影響。將含有丁二酸銨之發酵液蒸發且進行超濾，且該丁二酸鹽之濃度係於來自超濾步驟之滲透物中測定。於該圖中，一階段酸化過程係稱為“正常結晶”。
圖15。經由一階段酸化過程或二階段酸化過程所得到之丁二酸晶體之組成物與顆粒大小分析。圖15A係提供由一階段酸化過程(1階)與二階段酸化過程(2pH階段)中所得到之丁二酸晶體之銨與硫雜質的含量。圖15B係提供由一階段酸化過程(1階段)與二階段酸化過程(2pH階段)中所得到之丁二酸晶體之各種胺基酸雜質的含量。圖15C係提供由一階段酸化過程(1S)與二階段酸化過程(2S)所得到之丁二酸晶體之顆粒大小分佈。
較佳具體例之詳細說明
如使用於本發明中者，”生物-丁二酸”一詞意指由可再生碳源經由發酵過程涉及生物催化劑所衍生之丁二酸。丁二酸於該發酵液中係 蓄積如丁二酸鹽，其係經下游處理而回收丁二酸。
如使用於本發明中者，”生物-BDO”一詞意指由氫化反應涉及生物-丁二酸作為起始物質所衍生之BDO。於用於製造生物-BDO方法之第一步驟中，生物-丁二酸係經酯化以產生生物-丁二酸酯，其轉而於氫化反應中用作為作用物以產生生物-BDO。
如使用於本發明中者，”蒸發”一詞意指將水溶液處於上升溫度以減少該水溶液之水含量。該蒸發過程較佳於真空下進行。
如使用於本發明中者，”濃縮”一詞意指參照其溶質含量，降低水溶液之溶劑含量。
如使用於本發明中者，”酸化”一詞意指添加酸至水溶液以降低該水溶液之pH值。根據本發明含有丁二酸鹽之發酵液的酸化可於單一步驟中或於二步驟中完成。該發酵液之酸化以單一步驟完成者稱為“一階段酸化”或“正常的結晶過程”。當含有丁二酸鹽之發酵液係以二個步驟酸化時，其係稱為“二階段酸化”。於該二階段酸化過程中，起始係該發酵液之pH由pH 6.5降低至中間點(通常大約pH 2.8-3.0)，接著控制之結晶步驟。由第一階段所形成之晶體未予以收穫，但用作為晶種到第二階段，其中該溶液之pH係進一步降低至pH 2.2-2.5且當溫度降低時，更多丁二酸結晶出來。
如使用於本發明中者，”結晶作用”一詞意指用改變水溶液之溫度使水溶液中所溶解之溶質沉澱出來。
如使用於本發明中者，”控制結晶”一詞意指用改變化水溶液之溫度使於水溶液中所溶解之溶質以預先定義之速度沉澱出來。
如使用於本發明中者，”過濾”一詞意指去除溶液中之顆粒物質，其係借助於溶液通過粗過濾器以保留顆粒物質。該過濾過程係於重力流變或於跨膜壓差下進行。
如使用於本發明中者，”第一結晶作用”一詞意指於酸化步驟之後由含有丁二酸銨之發酵液回收丁二酸。該酸化步驟包括添加酸至含有丁二酸銨之發酵液，使該發酵液之pH至2.4或更低。
如使用於本發明中者，”第二結晶作用”一詞意指由第一結晶步驟去除丁二酸所產生之母液中回收硫酸銨或磷酸銨。首先係使用含有丁二酸銨之發酵液。當硫酸使用於該酸化步驟中時，於第二結晶步驟中係回 收硫酸銨。另一方面，當磷酸使用於該酸化步驟中時，於第二結晶步驟中係回收磷酸銨。
如使用於本發明中者，”鹽析”一詞意指由含有溶解丁二酸銨之發酵液添加甲醇而沉澱出丁二酸銨。所產生之丁二酸銨沉澱物係經由過濾或離心分離而回收。
如使用於本發明中者，”鹽分解”一詞意指雙置換反應其中丁二酸銨係與硫酸於甲醇存在下混合。硫酸之存在導致丁二酸由丁二酸銨質子化伴隨著形成硫酸銨。由雙置換反應所得到之丁二酸，於硫酸作為催化劑存在下與甲醇同時進入酯化反應，導致累積丁二酸一甲酯及丁二酸二甲酯。依雙置換反應與酯化反應之速率而定，於該鹽分解反應結束時，不同數量之丁二酸、硫酸銨、丁二酸一甲酯及丁二酸二甲酯累積於該反應混合物中。
如使用於本發明中者，”雙置換反應”一詞意指一化學反應其中該陰離子與陽離子交換搭配。例如，於涉及丁二酸銨與硫酸之雙置換反應中，來自於硫酸之質子替代丁二酸銨中之銨陽離子導致形成丁二酸。同時，銨陽離子與硫酸之硫酸根陰離子進行反應而形成硫酸銨。
如使用於本發明中者，”丁二酸晶體之品質”一詞意指使用根據本發明之方法所回收之丁二酸晶體的相對純度。例如，本發明之目的係用最小的硫含量由含有丁二酸銨之發酵液回收丁二酸晶體，使得有用於進一步下游處理導致產生BDO、THF及GBL之催化劑之功能沒有干擾。
本發明係提供由發酵過程中所衍生之丁二酸用於製造BDO、GBL及THF之方法。圖1係提供用於生產由生物質所衍生之BDO、GBL與THF之處理流程圖。於適用於本發明之丁二酸產生之發酵中，多種生物催化劑與廣泛適用於微生物發酵之作用物可予以使用。適用於本發明之生物催化劑可由多種微生物所衍生，範圍自格蘭氏陰性菌至真菌包括酵母菌菌種。適用於本發明之碳水化合物物質為葡萄糖、蔗糖、甘油及由多種富含六碳之物質所得到之木質纖維素的水解產物。較佳係具有同時使用六碳與五碳糖二者能力之生物催化劑。一種任何適用於本發明生物之催化劑想要的特徴為，該生物催化劑顯示高的滴定率與高的產率用於丁二酸生產。“丁二酸產率”及“產率”各詞係指消耗每莫耳碳水化合物物質所產生之丁二酸的 莫耳。如使用於本發明中之“丁二酸滴定率”及“滴定率”各詞係指該發酵液每單位時間期間(克/升/小時)每單位體積所產生之丁二酸的數量。另一種適用於本發明之生物催化劑想要的特色為，可於最小無機鹽介質中生長的能力，無需任何額外營養物來源如酵母萃出物或玉米浸出液。該發酵過程可於厭氧條件或好氧條件或微好氧條件下進行。
於生產丁二酸之生物發酵過程中，無機鹼與微量營養物化學品係添加至該發酵器中以保持有機物可發揮最佳功能的條件。例如，經由基因操作所得到之大腸桿菌菌株KJ122，當pH為6.5-7.0左右時以最高之產率產生丁二酸。於發酵過程中隨著丁二酸產生，該發酵介質之pH顯著地降低。為了保持該發酵介質之pH，於發酵之過程中逐漸地添加鹼如氫氧化鉀、氫氧化鈉，及氫氧化銨。其結果是，於發酵過程結束時，該丁二酸聚積於發酵介質中呈丁二酸鹽。例如，於涉及大腸桿菌KJ122菌株之發酵過程中，當氫氧化銨用作為中和之鹼時，於發酵結束時丁二酸係以丁二酸二銨形式蓄積。根據本發明，人們可按照幾種不同的方法由含有丁二酸鹽之發酵液中回收丁二酸，且隨後經由適當之化學反應將其化學轉化為所需之化學分子如BDO、GBL，及THF。
將含有丁二酸鹽形式之發酵液進行離心分離及適當的過濾步驟以去除於該發酵液中之顆粒物質包括細胞塊及蛋白質。該離心分離與過濾步驟稱為澄清步驟，且該發酵液於澄清步驟後稱為澄清之發酵液。由含有丁二酸之鹽的發酵液回收丁二酸，接著是酸化步驟。例如，為了轉化丁二酸銨之稀溶液成丁二酸，需要提供質子源。這可藉由使用離子交換樹脂或酸化步驟來達成。
當離子交換樹脂使用於由含有丁二酸之鹽的發酵液回收丁二酸時，該丁二酸鹽被分解於樹脂之表面上且依於該樹脂上之電荷而定，丁二酸酯或其之平衡陽離子會保留在樹脂之表面上。例如，當使用陽離子交換樹脂且該樹脂加入質子時，該質子由該樹脂被丁二酸酯平衡陽離子所交換且丁二酸出來到流出物中。
當該含有丁二酸之鹽的澄清發酵液用強酸予以酸化時，游離丁二酸及對應鹽累積。例如，當該含有丁二酸銨之發酵液用硫酸予以酸化時，游離丁二酸及丁二酸銨蓄積於該發酵液中。丁二酸需要由硫酸銨中分 離出來且剩餘的溶液，其主要含有水及其他雜質，如未轉化的糖、胺基酸及無機營養物。有幾種技術可用於進一步純化該丁二酸。
當含有丁二酸銨之澄清發酵液用強酸如硫酸或磷酸予以酸化時，丁二酸及對應之銨鹽如硫酸銨或磷酸銨蓄積於該水相中。將該水相予以濃縮，較佳於真空下以去除水及揮發性羧酸如醋酸及甲酸。將該溶液濃縮至約20重量%之丁二酸，且丁二酸之結晶作係藉由降低該混合物之溫度直到其之溶解度極限於對應溫度比丁二酸濃度低而進行。然而，硫酸銨於水溶液中係高度可溶(圖5)，丁二酸於水中之溶解度係高度依賴於溫度。隨著溫度降低而丁二酸溶解度降低。控制該含有丁二酸之水溶液的冷卻速度則可控制丁二酸之溶解度，導致控制結晶出丁二酸。該結晶步驟導致主要晶狀丁二酸由該酸化之發酵液中形成者稱為“第一結晶”步驟(圖2)。將最終之漿料過濾且將該丁二酸晶體乾燥以去除水分。如果需要，可將該丁二酸晶體溶解且再結晶以提高該丁二酸之純度。
藉由結晶用於顆粒形成時有二個基本的步驟，亦即成核與晶體增長。成核與晶體增長之動力過程需要超飽和。然而，過度超飽和通常導致大量細屑與壞晶體形態，其將不利地影響下游處理步驟如離心分離/過濾、乾燥、研磨、固體物處理及防止產品結塊之裝置。較大之細屑表面積通常包埋更多含雜質之母液。為提高產品之純度、晶體尺寸分佈與晶體形成之需要增加，於結晶過程上已添置新的需求。於結晶過程中控制超飽和結晶之含量於決定晶體形態上為關鍵的因素。使用蒸發或控制冷卻是結晶作用最常進行的。於本發明中係提供使用pH作為工具以控制結晶過程之方法。
於由含有丁二酸鹽之發酵液中用於回收丁二酸之正常過程中，該發酵過程之酸化係以單一步驟進行以產生丁二酸用於結晶過程。於用於酸化之一般過程中，目標pH2.0至2.4係以單一步驟接著是產生丁二酸之結晶作用來達成。於本發明中，於結晶過程中係提供包含丁二酸之發酵液之二階段酸化以控制超飽和含量。於根據本發明酸化過程之第一階段中，該發酵液之pH係降低至2.5至3.5接著第一結晶步驟。隨後將該發酵液之pH進一步降低至pH 2.0至2.5接著第二結晶步驟(圖3)。於本發明之另一個方面中，可能進行超過二階段酸化以進一步提高所形成之丁二酸晶體的品質。 酸化導致pH調整可於結晶器內或於晶體細屑之溶解循環中完成。若酸化係於細屑溶解循環中完成，由酸化過程中產生之放熱反應將有助於溶解晶體細屑而不是使用蒸汽。
丁二酸晶體係使用離心分離而由母液中分離。將該固態丁二酸晶體溶解於甲醇中以去除任何剩餘之硫酸銨。硫酸銨於甲醇中具有非常低的溶解度且可由甲醇之溶液中回收如固態沉澱物。該丁二酸係完全溶解於甲醇中。將丁二酸於甲醇溶液中進行酯化反應導致形成丁二酸二甲酯，其係藉分餾而進一步純化。
將去除固態晶狀丁二酸後所得到之母液經由蒸發於上升溫度於真空下進一步濃縮，且於較低溫度進行結晶反應以沉澱出硫酸銨。該結晶步驟稱為“第二結晶”步驟。依第一結晶步驟後殘留於母液中之丁二酸的含量而定，由第二結晶步驟中所產生之丁二酸銨沉澱物可具有特定含量之丁二酸晶體。於硫酸銨沉澱物中之丁二酸可借助於將來自於第二結晶反應中之沉澱物溶解於甲醇中而回收。雖然丁二酸係完全可溶於甲醇中，硫酸銨係相對不溶於甲醇中。硫酸銨係回收如白色沉澱物，而丁二酸保持完全溶解於甲醇中。由甲醇溶解步驟中所得到之硫酸銨可用作為肥料或進行熱降解以產生氨及硫酸，其可再循環至由發酵液回收丁二酸之過程中(圖4)。
當使用磷酸作為酸化劑時，磷酸銨係回收為聯產物，其可用作為肥料或進行熱降解以產生磷酸使用於由含有丁二酸銨之發酵液中回收丁二酸之過程中(圖形6A、6B、7及8)。
將由發酵液中經由酸化過程如上所述之如此所回收之丁二酸進行如下所述之進一步下游化學過程而得到所需之化學品如BDO、GBL及THF。該過程係以丁二酸於酯化催化劑存在下進行酯化而開始。於本發明之一個方面中，該酯化係於沒有任何外源酯化催化劑存在下進行，且如此之酯化過程係稱為自動催化酯化反應。
碳酸二甲酯(DMC)已成為非常有吸引力的烷化劑，於最近幾年中作為無毒且更環境友好的替代品。DMC可用於羧酸之酯化作用中，以類似之反應性能程度替代甲醇。丁二酸酯化與DMC之副產物為CO2，其可再循環到丁二酸發酵中。
適用於本發明目的之酯化催化劑可為多相或均相催化劑。該 酯化反應可使用多種催化劑運作，其包括；沸石(X、Y、L、β、ZSM-5等)，晶狀與無定形金屬氧化物(二氧化矽與氧化鋁)、鹼改質之沸石(Na、K、Li、Cs、Ru、La等)、陰離子改質之金屬氧化物及沸石(SO4、PO4、BO3等)、陽離子樹脂(大孔樹脂(Amberlyst)-15、大孔樹脂-70等)、鹼性氫氧化物(NaOH、NH4OH、KOH等)及鹼醇鹽。如此所產生之丁二酸酯可經由分餾進一步純化。於一個具體例中，首先產生丁二酸之丁基酯。其他類型的酯，如丁二酸之甲酯、乙酯及丙酯可由丁二酸之丁酯經由酯基轉移過程獲得。當該酯化係於工業規模進行時，其可能需要使用特定之多相酯化催化劑。於那些條件下，其必須確保於該酯化反應中所要使用之丁二酸進料，於此等多相催化劑存在下，沒有可能干擾該酯化催化劑功能之污染物。例如，使用於羧酸工業規模酯化中之特定樹脂係已知對羧酸作用物之特定陽離子及陰離子污染物敏感，且因此必須確保於該酯化反應中用作為基質之晶狀丁二酸係不含任何可能干擾本發明之酯化反應之污染物。
根據本發明之方法，丁二酸係與醇於超大氣壓下及於基本上於100℃及300℃間之上升溫度進行酯化。當使用低級一元醇時，該壓力應足夠高以儘量減少其汽化，否則於如此之溫度下會發生，使該反應於反應區中保持於液體狀態。多種醇可用於該酯化過程中，特別是甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇、己醇、辛醇及類似之一元脂族化合物。較佳者為自身催化地運行該反應，或於該酯化反應中使用均相催化劑。多相酸催化劑，當與尚未經純化去除陽離子之丁二酸流接觸時產生結垢。硫酸、磷酸、氫氯酸，及有機酸如鏈烷磺酸及芳基磺酸為適當之均相催化劑。於該酯化反應中所形成的水係讓該熱反應混合物於上升壓力下由該反應區通過進入大氣壓力區，由此將水閃蒸出來而去除。
於本發明之另一個具體例中係提供由含有丁二酸銨之發酵液用於回收丁二酸與丁二酸二甲酯之新方法。於該方法之第一步驟中，使用蒸發將含有丁二酸銨之發酵液於上升溫度下濃縮4-5五次，且與甲醇或乙醇混合導致丁二酸銨沉澱。用甲醇作為溶劑，丁二酸銨係如純白色晶狀固體沉澱，而原存於該發酵液中之雜質仍保留於該母液中(圖9及10)。另一方面，用乙醇作為溶劑，丁二酸銨係與原存於發酵液中之雜質一起沉澱。其結果是，由乙醇處理發酵液所產生之含有固體餾份之丁二酸銨為深色且該 母液為淺色(圖11)。
於甲醇添加至該發酵液後所得到之白色晶狀丁二酸銨餾份可再懸浮於甲醇中，於足夠數量之硫酸存在下以啟動雙置換反應導致丁二酸與硫酸銨形成。相對不溶於甲醇溶液中之硫酸銨將由甲醇相沉澱出來。由雙置換反應所得到之丁二酸亦於硫酸作為催化劑存在下接受酯化反應，導致二甲基酯形成，其可經由分餾進一步純化(圖12)。
所包含之下列實例係用於闡明本發明之特定方面，且不應視為排他之具體例。所揭示之主題內容能夠相當大地修改、改變、組合，及形式與功能之等同物，如精於此方面技藝中之人士會想到者且具有該揭示內容之利益。
實驗部分 總論
菌株及接種劑製備：將KJ122(大腸桿菌C、△ldhA、△adhE、△ackA、△focA-pflB、△mgsA、△poxB、△tdcDE、△citF、△aspC、△sfcA)使用於本發明中。KJ122係由大腸桿菌C(ATCC 8739)菌株經由基因改造所導生，如由珍塔瑪等(2008a；2008b)及於根據專利合作條約與國際公開案號WO 2008/115958及WO 2010/115067所出版之國際專利申請案中所說明者。所有此等文獻係併入本文中參考。
大腸桿菌菌株KJ122能夠於72小時內發酵10%葡萄糖於AM1礦物質介質中以產生88克/升丁二酸酯，經標準化用於鹼加成。AM1介質含有2.63克/升(NH4)2HPO4、0.87克/升NH4H2PO4、1.5mM MgSO4、1.0mM甜菜鹼，及1.5毫升/升微量元素。該微量元素係製備為1000X儲備液且含有下列之組份：1.6克/升FeCl3、0.2克/升CoCl2˙6H2O、0.1克/升CuCl2、0.2克/升ZnCl2˙4H2O、0.2克/升NaMoO4、0.05克/升H3BO3，及0.33克/升MnCl2˙4H2O。該發酵液之pH係用1：4(6N KOH：3M K2CO3)(1.2N KOH、2.4M K2CO3)或任何其他適當的鹼包括氫氧化銨，維持於pH 7.0。
於一些實驗中係添加玉米浸出液。其為來自於玉米濕磨工業之副產物。當與酵母提出物及蛋白腖相較時，其為維生素與微量元素之廉價的來源。
有機酸與糖分析：各種有機酸與糖之濃度係藉HPLC測定。 存在於該發酵液中之丁二酸、糖及其他有機酸係於具有BioRad Aminex HPX-87H管柱之Agilent 1200 HPLC裝置上分析。將BioRad Microguard陽離子H+用作為保護柱。用於HPLC分析之標準係以0.008N硫酸製備。將該HPLC管柱溫度保持於50℃。將硫酸以0.008N濃度以0.6毫升/分鐘之流速用作為流動相。各種組份之量化係藉測量其等於210毫微米之吸收而完成。糖與其他組份之量化係使用折光率檢測器完成。
使用電感偶合電漿光學放射光譜法(ICP-OES)測定硫與磷含量。由根據本發明之各種方法所衍生之樣品可使用電感偶合電漿光學發射光譜法予以試驗。將該樣品使用2%微量金屬級硝酸稀釋至低於5%有機物。該ICP-OES產生由0.05ppm至10ppm範圍之曲線，因而將該樣品予以稀釋使得目標分子濃度介於此等濃度之間。若該樣品含有任何複雜之基質或不溶性液體，於溶解之前其等將被消化或灰化。然後將該樣品置於一連接到ICP-OES之自動取樣器中，其於第一、中間及最後位置具有質量控制。然後該ICP-OES會將該標準物分析，產生一校準曲線，且分析該樣品。然後該軟體會計算出所檢測之每個物質的ppm，且由那裡，該物質之起始濃度可根據當製備樣品時之稀釋倍數來確定。
使用離子色層分離法(IC)測定氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽及銨。銨與多種陰離子之濃度可使用離子色層分離法予以定量。樣品係使用具有AS-DV自動取樣器之Donex 1100離子色層分離儀分析。由0.04至30ppm之標準係以去離子水製備且於每次運行之前產生校準曲線。將各樣品稀釋，使所關注之分析物落在校準曲線內。於銨分析時，Dionex CS16管柱係與CG16保護柱與CSRS400抑制器使用。35mM甲磺酸係用作為洗提液。於氯化物、硫酸鹽與磷酸鹽分析時，Dionex AS17-HC管柱係與AG17-HC保護柱及ASRS400抑制器使用。於陽離子分析時，28mM氫氧化鈉係用作為洗提液。量化係藉由測量每個組份之導電感應而完成。
胺基酸之測定。胺基酸係藉HPLC測量。樣品係於具有在線衍生及螢光檢測器之Agilent 1100 HPLC上分析。Phenomenex Gemini C18管柱係與磷酸鹽緩衝液及溶劑梯度使用以洗提該化合物。將樣品與標準物用0.1M氫氯酸稀釋且於注射前用OPA試劑衍生。胺基酸之量化係藉由測量由具有激發於338毫微米及發射於450毫微米之螢光檢測器之反應來完成。
實例1 丁二酸之發酵生產
將大腸桿菌菌株KJ122於37℃接種於包含NBS、100mM MOPS、2%葡萄糖、1mM MgSO4、微量元素及0.1mM CaCl2之基礎培養基中。一旦該細胞密度達到OD=5，則將該接種物轉移至含有起始介質包括5mM KH2PO4、3mM MgSO4、2mM甜菜鹼，及8ppm防沫劑204之發酵器中。發酵係以分批進料模式用葡萄糖作為碳水化合物來源而運作。當丁二酸產生時，將含有7M NH4OH與3M NH4HCO3之溶液計量加入該發酵器中以保持pH於約6.5-7且提供CO2之來源。於48小時後發酵完成。將生物質藉由切向流動微過濾裝置予以去除。經過濾之發酵液組成物顯示於表1中。
實例2 發酵液之酸化與丁二酸晶體-1之回收
將實例1中所製備之丁二酸二銨發酵液使用於此實驗中。將49毫升36.25N硫酸用於酸化1200毫升發酵液至pH 2.0。然後將1010克酸化之汁液於旋轉蒸發器中於真空下於70℃蒸發而得到330克濃縮液。將該濃縮物分析且發現含有0.8克/升之醋酸。將該濃縮液藉逐步式冷卻輪廓以每30分鐘減5℃於定軌震盪器中設定200rpm冷卻。將該晶體於真空下過濾而得到55.75克濕晶體。將該晶體隨後用25毫升去離子水洗滌且於50℃乾燥過夜。該過程係對應至圖2中所闡明之過程如“流程圖1”。呈晶體之丁二酸經計算回收率為53%。將該乾晶體之組成物分析且顯示於表2中。該晶體顯示95.9%非常高之丁二酸純度。雜質包括0.17重量%銨離子及0.22重量%硫。
實例3 發酵液之酸化與丁二酸晶體-2之回收
將實例1中所製備之丁二酸二銨發酵液使用於此實驗中。將1038克該汁液於旋轉蒸發器中於真空下濃縮至416克。一些棕色固體由該溶液沉澱出來。將該濃縮物進行分析且發現含有2.8克/升氨。將該濃縮液分成三部分。將部分1(99.92克)過濾以去除固體物且然後用8毫升36.25N H2SO4酸化至pH 2.0。將部分2(84.66克)用8毫升36.25N H2SO4酸化至pH 2.0。將部分3保存作為參考。於酸化步驟中，白色沉澱物於pH 5.2時開始形成且當該pH進一步下降時由溶液中出來更多。讓該溶液冷卻至周遭室溫後，將該沉 澱物由部分1與2過濾出來且各自用10毫升去離子水洗滌。將該固體物於50℃乾燥過夜。此等固體物之組成物分析顯示於表2中。與實例2相比，該過程構型使用更少硫酸使該溶液之pH至2.0。該過程係對應於圖2中所闡明之過程如“流程圖2a”。一般認為由於氨係作為濃縮物去除，而需要較少的酸來降低該溶液之pH，由經濟之觀點而言此係非常想要的。然而，該晶體之純度降低。經過過濾之晶體部分1於蒸發後表現出90重量%丁二酸純度，而晶體部分2僅顯示出82重量%純度。於蒸發後，該過濾步驟顯然實質上有助於純化該晶體；銨離子、硫、磷、鉀離子及胺基酸之數量實質上較少。
實例4 發酵液之酸化與丁二酸晶體之回收
將實例1中所製備之丁二酸二銨發酵液使用於此實驗中。將該汁液1010克於減壓下於70℃於旋轉蒸發器中濃縮至264克。將該濃縮物進行分析且發現含有2.1克/升氨。一些棕色固體物由該溶液沉澱出來。然而，該汁液未經過濾。將該溶液用34.85毫升36.25N H2SO4酸化至pH 2.07。然後，於定軌震盪器中以每30分鐘冷卻5℃至室溫之速率進行控制結晶。將該晶體過濾且用40毫升去離子水洗滌且然後於50℃乾燥過夜。該晶體組成物顯示於表2中。藉由進行適當之控制冷卻結晶步驟，該丁二酸晶體令人驚奇地具有99重量%非常高純度之丁二酸，甚至於蒸發後無需過濾步驟。銨離子、硫、磷，及胺基酸減少之數量大於10倍。該過程係對應於圖2中所闡明之過程如“流程圖2b”。
來自三種流程圖之硫酸使用與晶體品質係於表2中相比。結果顯示，調整pH至2所使用之硫酸，於流程圖2a及2b比流程圖1少。於晶體純度方面，流程圖2a具有最高數量之雜質併入該最終產物中。這可能是由於事實是丁二酸係以未經控制之方式沉澱且該母液攜帶之雜質被截留於該沉澱物內。於流程圖2b中用控制之再結晶步驟，該晶體品質大為改善。該結果表明，最好先將樣品濃縮，隨後酸化且進行結晶。
實例5 溫度於丁醯胺酸形成上之影響
將10重量%合成丁二酸二銨之水溶液藉著將試劑級之丁二酸溶解於水中且然後添加氨水至該溶液而製備。將45毫升之該溶液於大氣 壓下加進5000型Multi-Parr反應器之75毫升容器中。將該溶液加熱至不同之溫度且保持一段時間。之後，將該溶液藉冷水流過冷凝管而立即冷卻。然後將該反應器內容物排空且將該產物之組成物進行分析。該結果顯示於表3中。此等結果表明，提高溫度與曝露期間可增加醯胺副產物形成。根據本發明之方法係建議於減壓下進行蒸發過程，其應有利於降低丁二酸成醯胺之產量損失。
實例6 丁二酸於大量發酵液中之粗結晶作用
將由大量發酵(85,000升)所得到之液體樣品1及2使用KJ122菌株，如實例1中所說明者操作。液體樣品1為經離心分離以分離細胞塊後之丁二酸二銨發酵液。液體樣品2為經離心分離與酸化步驟用硫酸至pH 4.5後之丁二酸二銨發酵液。將大約45公斤之各個液體樣品，使用下列之步驟生成粗的丁二酸晶體：(1)將大約45公斤之各個樣品經由蒸發以下降壓力予以濃縮~3x。(2)將濃縮之丁二酸銨藉使用5-微米壓濾器及0.5-微米膜予以過濾。(3)然後將該過濾之物質分割成4公斤批次用96% H2SO4酸化至pH2；這是於5升Pyrex瓶中使用攪拌棒攪拌進行。(4)加熱且再結晶係於Innova-43培育振盪器中以150rpm及70℃之起始溫度完成。該培育振盪器係經程式設計每小時降低溫度10℃，以便進行緩慢的冷卻。(5)將來自於各個酸化/結晶批次之沉澱晶體與母液一起匯集於20升夾套式濾器反應器中完成過濾。真空係用於吸引母液通過鐵弗龍濾器進入容器中。將晶體用去離子水洗滌且然後於真空下放置乾燥達數小時。(6)之後，將該晶體由反應器中收穫。質量平衡係概述於表4中。該粗晶體之組成物係顯示於表5及6中。
實例7 發酵液之酸化與丁二酸晶體之回收
將實例1中所製備之丁二酸二銨發酵液使用於此實驗中。將36.25N硫酸用於調整該汁液降至pH 2.4。然後將經pH調整之汁液通過0.5微米過濾器。然後將1600毫升經酸化之汁液於旋轉蒸發器中於真空下於70℃蒸發而得到440毫升濃縮液。將該濃縮物進行分析且發現含有8克/升醋酸。將該濃縮液藉逐步式冷卻輪廓於定軌震盪器中設定200rpm以每30分鐘降低5oC之速率冷卻。將該晶體於真空下過濾而得到74.2克濕晶體。隨即將該晶 體用25毫升去離子水洗滌且於真空下乾燥過夜。丁二酸如晶體之回收率經計算為73%。將該乾燥晶體之組成物進行分析且顯示於表7中。該晶體顯示99%非常高的丁二酸純度。
實例8 使用甲醇回收來自於母液之硫酸銨
將實例1中所製備之丁二酸二銨發酵液使用於此實驗中。丁二酸晶體係依照實例7中所說明之步驟回收。該濾出液於去除丁二酸晶體之後含有423克母液。將該母液於旋轉蒸發器中於真空下於70℃蒸發而得到215克濃縮之漿液。將該漿液於真空下過濾而得到83克濕晶體。該濕晶體具有15重量%丁二酸及72重量%硫酸銨之組成物。將該濕晶體與200毫升甲醇混合且於真空下過濾而得到54克晶體。將該晶體之組成物及甲醇濾出液進行分析且該結果顯示於表7中。最終之AMS晶體顯示高的硫酸銨濃度，其具有雜質<1%，0.2%丁二酸。
實例9 由甲醇濾出液形成丁二酸甲酯
將來自於實例8之甲醇濾出液與20克大孔樹脂36合併，且於60C於大氣壓下加熱達6小時。於加熱後，將最終液體進行分析且該組成物為71克/升丁二酸二甲酯、14克/升丁二酸一甲酯及0.5克/升丁二酸。
實例10 丁二酸銨藉由H3PO4之酸化與丁二酸晶體之回收
將藉由於60℃溶解258克/升丁二酸銨(相當於200克/升SAC)所製備之丁二酸二銨溶液用濃磷酸滴定至pH2.0、2.5及3.0，且控制結晶於定軌震盪器以每小時降低5℃之速率冷卻至室溫中進行。將所得到之丁二酸晶體過濾且進行分析。用磷酸酸化所得到之丁二酸晶體的組成物係顯示於表8中。於控制冷卻結晶步驟後的結果，所生成之丁二酸晶體具有非常少量之二磷酸銨(ADP)即使未經水漂洗步驟。由於ADP具有於水中高的溶解度(~55%於25C)，母液可保留大約一半之ADP重量。水漂洗丁二酸晶體應該施用，因為其可改良丁二酸晶體之品質。
由於磷酸具有3種pKa值，亦即，pKa1=2.1、pKa2=7.2、pKa3=12.3，丁二酸具有二種pKa1=4.2、pKa2=5.6，理論上H3PO4只有第一個質 子可用於質子化丁二酸酯。滴定曲線(圖7)清楚地顯示，對丁二酸需要雙倍數量之H3PO4以使丁二酸二銨由中性pH至pH 2.5。分析結果確認，於溶液中所生成之磷酸鹽為磷酸二氫銨(ADP)。
表8顯示由磷酸鹽溶液於pH2、pH2.5及pH3回收丁二酸晶體之結果。游離丁二酸於水中之溶解度比其之二銨鹽低很多。當pH係1個單位低於有機酸之第一個pKa值時，約10%之有機酸係為其之鹽形式。若pH係2個單位低於有機酸之第一個pKa值時，只有約1%之有機酸係為其之鹽形式。由於丁二酸之第一個pKa值為4.2，若溶液酸化至2.2，則99%之丁二酸為游離酸形式，這將更容易結晶出來。表8顯示，當於pH 3.0進行結晶時，10.18克丁二酸酯仍保留於溶液中，且該結晶作用只達到42%之產率。然而，當pH值調整至2及2.5時，該SAC晶體之產率分別為69%及58%。為了此等理由，一般認為最好保持丁二酸之工業規模結晶作用於pH範圍較佳大約pH 2.0至pH2.5。
實例11 鹽析與固體形成
將2升發酵液於旋轉蒸發器中，於真空下濃縮。引進蒸發器中之進料化學組成物，由蒸發器所回收之濃縮物及來自於蒸發器之濃縮物係顯示於表9中。該濃縮物流顯示2.96克/升之NH4 +離子及<10ppm之其他離子。NH4 +離子對該濃縮物流之損失觀察為大約9重量%。該濃縮物流顯示少量形成琥珀醯亞胺副產物。
將50毫升由蒸發器所回收之濃縮物樣品使用於下一步驟之鹽析過程中。由蒸發器所回收之50毫升濃縮物樣品具有32.19克丁二酸二銨。甲醇係用於由蒸發器所回收之濃縮物中將固體物沉澱出來。將甲醇對理論上存在於由蒸發器所回收之濃縮物中之丁二酸二銨之各種重量比進行測試，以了解沉澱作用於不同溶劑負載下之有效性。此步驟稱為溶劑沉澱或使用溶劑之鹽析不溶物。該方法之目的在於有效利用銨鹽於醇中之低溶解性。
於三個不同的玻璃燒杯中進行測試甲醇：丁二酸二銨汁液之2x、3x及4x重量比。將3個含有64.38克、96.57克& 128.77克分別代表2x、3x & 4x比例之不同數量的甲醇濃度加至由蒸發器所回收之50毫升濃縮物及該 溶液之玻璃燒杯，於熱板上於室溫攪拌達2小時。該時間足夠由使用0.22微米Nalgene®真空過濾器經分離成固體與液體流之淤漿中所產生之丁二酸二銨溶液中沉澱出固體物。將該固體物與液體稱重且分析。將固體物塊收集起來用於2x、3x & 4x比例分別為26.64克、32.08克& 22.18克之樣品，其中所收集之濾出物塊係用於2x、3x & 4x比例分別為93.76克、120.17克& 160.14克之樣品。該濾出液可送到蒸餾步驟用來回收甲醇。水亦可回收或於濃縮步驟前再循環回到稀釋丁二酸二銨流。
由組成物分析確定的是，丁二酸二銨汁液之單行程回收率於沉澱步驟中，於甲醇：丁二酸二銨重量比為2x、3x及4x時，分別為64%、62% & 60%(表10及11)。此等回收率數字業已觀察到單行程沉澱未再循環濾出液者，由於再循環比率增加，其等應該改善。
將先前沉澱步驟中由甲醇：丁二酸二銨重量比2x、3x及4x實驗中所收集到之固體物合併在一起以製成進料用於下一個步驟稱為鹽分解反應步驟。於該步驟中丁二酸二銨固體係再懸浮於甲醇中，該反應係使用無機酸催化以分解丁二酸二銨成丁二酸及無機鹽。於吾等之情況中，吾人將丁二酸二銨懸浮於甲醇中，於98%硫酸存在下分解丁二酸銨鹽而形成丁二酸與硫酸銨(AMS)。AMS為無機鹽，其於甲醇中具有低的溶解度且因此由該溶液沉澱出來。於鹽分解步驟中所釋放之丁二酸於硫酸作為催化劑存在下接受酯化而導致丁二酸二甲酯形成。
實例12 藉由二階段酸化過程之丁二酸結晶作用
將包含丁二酸銨之發酵液進行離心分離及蒸發，接著超濾步驟。將來自於超濾步驟之滲透物予以濃縮成250.4克/升丁二酸等同物且進行一階段或二階段酸化過程。於一階段酸化過程中，該發酵液之pH係以單一步驟降低至pH 2.2至2.4，且所產生之沉澱物係藉由提高溫度至80℃而再溶解。隨後將該酸化發酵液之溫度以5℃/小時之速度逐漸降低至30℃以啟動結晶過程。於二階段酸化過程中，接著相同的方法進行結晶，除了酸化係以二階段進行。於二階段酸化過程之第一階段中，該發酵液之pH係降低至pH 2.8-3.0接著結晶步驟。於二階段酸化過程之第二階段中，該發酵液之pH係進一步降低至pH 2.2-2.4接著結晶步驟。於結晶作用完成後，將來自於一階 段酸化過程與二階段酸化過程之漿液使用相同類型之Nalgene過濾器(拋棄式2.0微米真空過濾器)於真空下過濾。將來自於一階段酸化過程與二階段酸化過程之粗丁二酸晶體不經任何洗滌而逕行用於分析。該兩個實驗皆係作成三份進行。此等實驗之結果係於表12中提供。圖13A係提供一階段酸化過程與二階段酸化過程之丁二酸晶體的產率與純度之比較。圖13B係提供於經由一階段酸化過程與二階段酸化過程所得到之丁二酸晶體中之銨及硫雜質之比較。圖13C係提供由一階段酸化過程與二階段酸化過程所產生之丁二酸晶體中之門冬胺酸、谷胺酸及丙胺酸之含量的比較。於圖13A、13B及13C中，該一階段酸化過程係稱為“正常的結晶”過程。
實例13 藉由二階段酸化過程之丁二酸結晶作用-鹽濃度之影響
為了進一步了解於一階段與二階段酸化過程下之丁二酸銨的起始濃度，將包含丁二酸銨之發酵液進行離心分離且蒸發接著超濾步驟。來自於超濾步驟之滲透物每升含有66克丁二酸鹽。將來自於超濾步驟之滲透物使用旋轉蒸發器(Rotovap)於70-80℃及大約80-90RPM操作，予以濃縮多至6種不同的濃度(184、210、255、285、316，及360[克/升])。將此等6種樣品全部進行一階段或二階段酸化過程接著如上實例12中所說明之結晶過程，且將每個樣品於二種酸化步驟下：1 pH-階段(正常)及2 pH-階段(新的)結晶作用進行試驗。該試驗係作成三份進行。
於結晶過程完成後，將所得到之漿料使用真空Nalgene過濾器(2.0微米)於室溫下過濾。將該濕粗晶體之約1.2克樣品使用1：1(重量/重量)比之室溫去離子水洗滌，使用密理博(Millipore)低黏合表面濾膜(Durapore)PVDF膜(5.0微米)離心管於貝克曼(Beckman Accuspin)台式離心機中以~1000克操作。將每個樣品用一半去離子水洗滌2分鐘，接著用另一半去離子水再洗2分鐘進行第二次洗滌。該2分鐘期間係包括啟動旋轉時間，但不包括達到零RPM所需之時間。如於圖14中所示之結果，隨著起始物質中丁二酸鹽之濃度增加，該二階段酸化過程顯示較高之丁二酸晶體產率。於圖14中，該一階段酸化過程稱為“正常結晶作用”。
實例14 晶體顆粒大小比較
根據上面實例13中之實驗結果。具有較高丁二酸鹽濃度之發酵液將得到較高之丁二酸晶體產率，無論使用一階段酸化過程或二階段酸化過程，具有300克丁二酸鹽/升之發酵液係經選擇用來生產大致0.7公斤丁二酸晶體。將由一階段酸化過程(1S)與二階段酸化過程(2S)二者所得到之丁二酸晶體進行組成物與粒子大小分佈分析。圖15A係提供由一階段酸化過程(1階段)與二階段酸化過程(2pH階段)所得到之丁二酸晶體中之銨及硫雜質之含量。圖15B係提供由一階段酸化過程(1階段)與二階段酸化過程(2pH階段)所得到之丁二酸晶體中之各種胺基酸雜質之含量。圖15C係提供由一階段酸化過程(1S)與二階段酸化過程(2S)所得到之丁二酸晶體之粒子大小分佈。使用二階段酸化過程所得到之SAC晶體具有較少粒子大小為125微米或更小之細屑。通常，該二階段酸化過程所產生之晶體分佈於約300至500微米範圍。此外，發現於二階段酸化過程下之晶體分佈的鐘形曲線較窄，表明該晶體大小分佈於二階段酸化過程下為更均勻。其結果為雜質更低，因為其等於先前的過程中被洗去。
實例15 使用控制蒸發與結晶作用生產硫酸銨
含有丁二酸銨之發酵液係使用於實例1中所說明之發酵過程製造。該汁液係通過超過濾裝置且使用二階段pH控制結晶如實例12中所說明者來產生丁二酸晶體。來自於丁二酸結晶作用之母液具有54克/升丁二酸、47克/升醋酸、270克/升硫酸鹽、123克/升銨及13克/升磷酸鹽之組成物。然後該物質於旋轉蒸發器中蒸發具有該體積之20%。將剩餘的漿料加熱至80C且以每小時攝氏5度緩緩冷卻至30度。然後將該晶體過濾出來且於真空下於室溫乾燥。該晶體之組成物為>98重量%硫酸銨含大約1%丁二酸。
依照該過程所產生之硫酸銨晶體不需要接受進一步之洗滌步驟。於該方法中，該濾出液然後可再循環至第一或第二蒸發步驟。
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Claims (19)

  1. 一種製備丁二酸酯之方法，其包括步驟：(a)碳水化合物基質使用生物催化劑進行發酵以產生丁二酸鹽；(b)淨化發酵液以去除生物催化劑及不溶物；(c)將來自於步驟(b)之該澄清發酵液予以濃縮；(d)將來自於步驟(c)之濃縮發酵液予以酸化；(e)將來自於步驟(d)之經酸化且濃縮之發酵液中的丁二酸進行控制結晶；(f)由母液分離出晶狀丁二酸；(g)將來自於步驟(f)之該晶狀丁二酸晶體溶解於醇中；(h)將於步驟(g)中溶解於醇中之該丁二酸酯化；且(i)經由蒸餾回收丁二酸酯。
  2. 如申請專利範圍第1項所請求之製備丁二酸酯之方法，其中該濃縮發酵液之酸化係於二階段中完成。
  3. 如申請專利範圍第1項所請求之製備丁二酸酯之方法，其中該丁二酸酯之硫含量為低於50ppm程度。
  4. 如申請專利範圍第1項所請求之製備丁二酸酯之方法，其中該丁二酸酯之硫含量為低於10ppm程度。
  5. 如申請專利範圍第1項所請求之製備丁二酸酯之方法，其中於該步驟(c)與該步驟(d)之間有過濾步驟。
  6. 如申請專利範圍第1項所請求之用於製備丁二酸酯之方法，其中該濃縮發酵液之酸化係用硫酸進行。
  7. 如申請專利範圍第1項所請求之用於製備丁二酸酯之方法，其中，該濃縮發酵液之酸化係用磷酸進行。
  8. 如申請專利範圍第1項所請求之製備丁二酸酯之方法，其中該醇為甲醇。
  9. 如申請專利範圍第1項所請求之製備丁二酸酯之方法，其中該醇為乙醇。
  10. 如申請專利範圍第1項所請求之製備丁二酸酯之方法，其進一步包括步驟：(a)將該母液轉移至蒸發器以產生濃縮之母液；(b)將該濃縮母液轉移至結晶器以產生漿料；(c)將來自於步驟(b)之該漿料離心分離以得到沉澱物且將該沉澱物於醇中洗滌以回收呈晶體之硫酸銨及包含丁二酸之醇餾份；(d)將於步驟(c)中該丁二酸於醇中進行酯化；且(e)將來自於步驟(d)之該丁二酸酯蒸餾。
  11. 如申請專利範圍第10項所請求之製備丁二酸酯之方法，其中該醇為乙醇。
  12. 如申請專利範圍第10項所請求之製備丁二酸酯之方法，其中該醇為甲醇。
  13. 一種製備丁二酸之方法，其包括步驟：(a)碳水化合物基質使用生物催化劑進行發酵以產生丁二酸鹽；(b)淨化發酵液以去除生物催化劑及不溶物；(c)將來自於步驟(b)之該澄清發酵液予以濃縮；(d)將來自於步驟(c)之濃縮發酵液予以酸化；(e)將來自步驟(d)經酸化且濃縮之發酵液中的丁二酸進行控制結晶；(f)由母液分離出晶狀丁二酸；(g)將來自於步驟(f)之該晶狀丁二酸晶體溶解於醇中；(h)將該母液轉移至蒸發器以產生濃縮之母液； (i)將該濃縮母液轉移至結晶器以產生漿料；(j)將來自於步驟(i)之該漿料離心分離以得到沉澱物且將該沉澱物於醇中洗滌以回收呈晶體之硫酸銨及包含丁二酸之醇餾份；(k)任意合併於步驟(j)中包含丁二酸之該醇餾份與於步驟(g)中溶解於醇中之該丁二酸；(l)將該丁二酸於醇中於步驟(k)中進行酯化；(m)將來自於步驟(l)之該丁二酸酯蒸餾；且(n)將來自於步驟(m)之丁二酸酯水解以產生丁二酸。
  14. 如申請專利範圍第13項所請求之製備丁二酸之方法，其中該濃縮發酵液之酸化作用係於二階段中完成。
  15. 一種製備丁二酸酯之方法，其包括步驟：(a)碳水化合物基質使用生物催化劑進行發酵以產生丁二酸鹽；(b)淨化發酵液以去除生物催化劑及不溶物；(c)將於步驟(b)中該淨化發酵液予以濃縮；(d)將來自於步驟(c)之該濃縮發酵液與醇混合以鹽析出丁二酸鹽；(e)將於步驟(d)中鹽析之該丁二酸鹽過濾；(f)將於步驟(e)中鹽析之該丁二酸鹽溶解於甲醇中，於硫酸存在下導致硫酸鹽沉澱；(g)將來自於步驟(f)之該硫酸鹽過濾且將包含丁二酸與丁二酸二甲酯之濾出液回收；(h)將於步驟(g)中該丁二酸於該濾出液中進行酯化；且(i)經由蒸餾回收丁二酸酯。
  16. 如申請專利範圍第15項所請求之製備丁二酸酯之方法，其中用於鹽析丁二酸鹽之該醇為甲醇。
  17. 如申請專利範圍第15項所請求之製備丁二酸酯之方法，其中該丁二酸酯之硫含量為低於50ppm程度。
  18. 如申請專利範圍第15項所請求之製備丁二酸酯之方法，其中該丁二酸酯之硫含量為低於10ppm程度。
  19. 如申請專利範圍第15項所請求之製備丁二酸酯之方法，其中於該步驟(c)與該步驟(d)之間有視需要之過濾步驟。
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