KR20090066958A

KR20090066958A - 배양액의 결정화에 의한 숙신산 정제방법

Info

Publication number: KR20090066958A
Application number: KR1020070134710A
Authority: KR
Inventors: 홍원희; 이상엽; 홍연기; 원효진; 허윤석; 송효학; 이은주
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2007-12-20
Filing date: 2007-12-20
Publication date: 2009-06-24
Also published as: WO2009082050A1

Abstract

본 발명은 배양액의 결정화를 이용한 고순도 및 고수율의 숙신산 분리 및 정제방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 숙신산 생성 미생물이 제거된 숙신산 함유 배양액으로부터 전처리 공정없이 직접 결정화를 수행함으로써 고순도의 숙신산을 고수율로 분리 및 정제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 별도로 배양액을 전처리할 필요가 없어 공정을 단순화시킴으로써, 공정에 소요되는 비용을 절감할 수 있고, 숙신산 정제 공정 중에 발생하는 슬러지의 발생을 차단하여 환경오염 방지의 효과를 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 고수율 및 고순도로 숙신산을 정제하여 비용 대비 효율 측면에서 종래기술에서 기대할 수 없었던 효과를 나타낸다.

숙신산, 분리, 정제, 배양

Description

배양액의 결정화에 의한 숙신산 정제방법{Method for Purifying Succinic Acid by Crystallization of Culture Broth}

본 발명은 배양액의 결정화를 이용한 고순도 및 고수율의 숙신산 분리 및 정제방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 숙신산 생성 미생물이 제거된 배양액을 전처리 공정없이 저온에서 산성 용액을 첨가하여 직접 결정화를 수행함으로써 고순도의 숙신산을 고수율로 생산할 수 있는 숙신산의 정제방법에 관한 것이다.

화석원료의 고갈과 급격한 원유가격의 상승, 그리고 환경오염에 대한 인식의 증가로 인하여, 재생가능한 원료물질로부터 다양한 바이오기반 화학물질을 생산할 수 있는 방법에 대한 연구가 전 세계적으로 활발히 진행되고 있다. 특히 바이오기반 화학물질 생산에 소요되는 막대한 비용을 절감하기 위한 일환으로, 친환경적이면서 고순도의 화학물질을 고수율로 분리·정제할 수 있는 공정 개발을 위한 노력이 집중적으로 이루어지고 있다.

4개의 탄소로 이루어진 2가 유기산인 숙신산은 식품, 의약품, 화장품,용매 제조 등에 광범위하게 사용되고 있으며, 산업적으로 중요한 많은 종류의 화학물질 전구체로서 사용이 가능함에 따라 향후 급격한 수요증가가 예상되는 매우 중요한 기초화학물질이다. (Zeikus et al ., Appl . Microbiol . Biotechnol ., 51:545, 1999; Song et al ., Enzyme Microbial Technol ., 39: 352, 2006; Shekhawat et al ., Biores. Technol ., 97: 342, 2006; McKinlay et al ., Appl . Microbiol . Biotechnol., 76:727, 2007). 특히 합성고분자의 취약점인 난분해성을 극복할 수 있는 생분해성 고분자의 원료물질로서 크게 주목을 받고 있다. (Gottschalk et al., Bacterial . Metabolism ., 2nd ed., Springer - Verlag, NY, USA, 1986; Wood A, Chem. Week, 166:15, 2004). 현재까지 산업용으로 사용되고 있는 대부분의 숙신산은 원유를 이용한 화학적 합성법에 의하여 생산되고 있으며, 식품 및 의약용으로 사용되어지는 소량의 숙신산만이 미생물 발효를 통하여 생산되고 있다. 하지만 지속적인 원유가격의 상승 및 환경오염에 대한 규제가 증가하고 있는 상황에서 이를 대체할 수 있는 미생물을 이용한 효율적인 숙신산 생산 및 이의 분리·정제 공정의 개발이 시급하다. 최근에는 미생물 배양기술, 가상세포 모델을 이용한 예측기술, 균주 개량에 필요한 다양한 대사공학 기술의 발전에 힘입어 미생물을 이용한 숙신산 생산기술은 전 세계적으로 빠르게 발전하고 있다 (Kim et al ., Biotech . Bioeng. 97:657, 2007; Song et al ., Enzyme Microbial Technol ., 39:352, 2006).

본 발명자들은 한우의 반추위로부터 Mannheimia succiniciproducens MBEL55E (KCTC 0769BP) 균주라는 우수한 숙신산 생산균주를 동정하였으며, 이의 전체 유전정보 및 대사특성을 규명하였다 (Hong et al ., Nature Biotechnol ., 22:1275, 2004). 나아가 상기 균주의 유전정보를 적극적으로 활용하여 젖산 탈수소화효소 유전자 (ldhA), 포스포트랜스아세틸화효소 유전자 (pta)와 아세트산키나제 유전자 (ackA)를 M. succiniciproducens MBEL55E 균주에 결실시킨 우수한 숙신산 생산 변이균주인 M. succiniciproducens PALK (KCTC 10973BP) 균주를 성공적으로 개발하였다.

재생가능한 원료물질을 이용하여 미생물 발효를 통한 바이오기반 화학물질을 생산하는 경우, 목적 화학물질과 함께 유기산과 단백질 등 다양한 대사산물들이 부산물로서 동시에 과량 생산되어 최종 발효 배양액에 존재하기 때문에 이들을 효율적으로 분리하여 최종 목적 화학물질을 고순도로 정제하는 공정의 개발이 반드시 필요하다. 특히, 미생물 발효 공정을 이용한 유기산 생산의 경우, 전체 생산비용의 50 - 70%를 분리·정제 공정이 차지한다는 것은 당업자에게 널리 알려진 사실이다. 따라서 바이오기반 숙신산 생산이 가격 경쟁력을 확보하여 대량생산이 가능하기 위해서는 경제적이고 효율적인 분리·정제 공정의 개발이 매우 절실히 요구된다. (King et al ., Chemtech, 22:285, 1992).

비록 액-액 추출, 막 분리, 반응 추출 등 다양한 종류의 숙신산 분리·정제 공정들이 현재까지 개발되었지만, 이들의 대부분은 숙신산의 수율이 낮거나 혹은 순도가 매우 낮아 바이오기반 숙신산 생산을 위한 최종적인 분리·정제 공정으로서 직접 적용하기에는 많은 한계점을 가지고 있는 것이 사실이다. (Choi et al ., Int . J. Chemical Kinetics, 28:37, 1996; Choi et al ., J. Chemical Eng . Jpn ., 32:184, 1999; Han et al ., Sep . Sci . Techn ., 31:1123, 1996; Zeikus et al ., Chem. Proc ., 58:71, 1995; Tamada et al ., Ph.D. Thesis , Univ . of California at Berkeley, 1989; Hong et al ., Korean J. Chem . Eng ., 21:488, 2004; Huh et al ., Proc. Biochem . 41: 1461, 2006). 더욱이 기존에 개발된 침전 혹은 결정화 방법을 사용하는 경우에는 공정 중 폐기물로서 막대한 양의 슬러지를 발생시키며, 숙신산이 염의 형태로 회수되기 때문에 고농도의 산을 이용하여 다시 재산화 (acidification)시키는 공정이 추가로 필요하다. (Vick Roy et al ., In . comprehensive Biotechnol ., Murray Moo - Young eds ., Vol . 3, Pergamon Press, 761, 1985; Bessling et al ., Chem . Eng . Technol ., 21:393, 1998; Huh, et al ., Proc. Biochem., 41:1461, 2006). 따라서 발효 배양액의 전처리 공정 없이 고순도의 숙신산을 고효율로 회수할 수 있는 간단하면서 저렴한 분리·정제 공정의 개발은 바이오기반 숙신산 생산이 현재의 원유 기반 숙신산 생산 공정과 경쟁력을 가지기 위해서 반드시 필요하다. 특히 환경부담을 줄이기 위하여 공정 중 슬러지의 발생을 최소화하거나 혹은 전혀 발생시키지 않는 환경친화적인 분리·정제 공정의 개발은 매우 중요하다.

한편, 본 발명자들은 숙신산의 정제방법으로서, 미생물 발효액을 아민계 추출제를 이용하여 추출하는 전처리 공정을 거친 다음 감압증발공정 및 결정화공정을 통하여 결정화된 숙신산을 99.76%의 순도 및 73.09%의 수율로 수득하는 방법을 개발한 바 있으나, 발효액을 전처리해야만 하는 공정상의 번거로움과 숙신산 정제 후에도 유기산이 상당량 잔여한다는 문제점을 해결하지 못하였다 (한국등록특허 10-672813).

이에 본 발명자들은 상기 종래기술의 문제점들을 해결하고자 예의 노력한 결과, 맨하이미아 속 미생물의 발효를 통하여 생산된 숙신산을 특별한 전처리 공정 없이 저온에서 산성 용액을 첨가하여 결정화 과정을 수행한 결과, 99.99% 이상의 순도로 74.56% 이상의 수율로 숙신산을 생산할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 배양액의 결정화를 이용한 고순도 및 고수율의 숙신산 분리 및 정제방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하고자 본 발명은 (a) 숙신산 생성 미생물이 제거된 배양액을 농축시키는 단계; (b) 상기 농축된 배양액을 산화시키는 단계; 및 (c) 상기 산화된 배양액을 냉각시켜 결정화된 숙신산을 회수하는 단계를 포함하는 숙신산 생성 미생물의 배양액으로부터 숙신산을 정제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 맨하이미아 숙시니시프로듀센스(Mannheimia succiniciproducens) PALK가 제거된 배양액을 숙신산의 농도가 100~300g/L가 되도록 농축시키는 단계; (b) 상기 농축된 배양액을 pH 1.0~3.0으로 산화시키는 단계; 및 (c) 상기 산화된 배양액을 2~20℃로 냉각시켜 결정화된 숙신산을 회수하는 단계를 포함하는, 맨하이미아 숙시니시프로듀센스(Mannheimia succiniciproducens) PALK 배양액으로부터 숙신산을 정제하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 숙신산 생성 미생물이 제거된 배양액으로부터 별도로 전처리 공정 없이 숙신산을 정제함으로써, 공정 단순화에 따른 비용 절감효과와 숙신 산 정제 공정 중에 발생하는 슬러지의 발생을 차단하여 환경오염 방지 효과를 거둘 수 있을 뿐만 아니라, 고수율 및 고순도로 숙신산을 정제하여 비용 대비 효율 측면에서 종래기술에서 기대할 수 없었던 효과를 나타낸다.

본 발명은 일 관점에서, (a) 숙신산 생성 미생물이 제거된 배양액을 농축시키는 단계; (b) 상기 농축된 배양액을 산화시키는 단계; 및 (c) 상기 산화된 배양액을 냉각시켜 결정화된 숙신산을 회수하는 단계를 포함하는 숙신산 생성 미생물의 배양액으로부터 숙신산을 정제하는 방법에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 숙신산 생산 미생물을 배양하여 수득한 배양액을 별도의 전처리 공정 없이 저온에서 산성화하여 직접 숙신산을 결정화함으로써, 종래기술에 비해 간단한 공정으로 고순도 및 고수율로 숙신산을 정제할 수 있으며, 그로 인하여 숙신산의 정제비용을 절감할 수 있다는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에서 사용되는 배양액은 숙신산 생성 미생물이 제거된 배양액인 것을 특징으로 하므로 배양액을 전처리할 필요가 없어 공정을 보다 단순화시키는 효과가 있다.

본 발명에 있어서, 상기 농축시키는 단계 이전에 숙신산 미생물의 배양액을 탈색시키는 단계는 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 탈색은 1.8~2.5%(w/v)의 활성탄을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.

활성탄을 이용한 탈색시에 활성탄의 농도가 1.8%(w/v) 미만이면, 배양액 내 에 불순색소의 제거가 충분히 이루어지지 않고, 활성탄의 농도가 2.5%(w/v)를 초과하면 배양액 내의 불순색소 뿐만 아니라 숙신산의 손실율도 커지는 문제점이 있어, 1.8~2.5%(w/v)의 활성탄을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 농축은 감압증류에 의해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 (a)단계에서 농축된 배양액의 숙신산 농도는 100~300g/L인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 산화는 염산 또는 황산을 이용하여 pH 1.0~3.0 범위에서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다. 이때, pH가 1.0 미만이거나 또는 3.0을 초과하게 되면, 최종 수득되는 숙신산의 수율 및 순도가 낮아지므로 pH 1.0~3.0 범위에서 산화를 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 (c)단계의 냉각은 2~20℃에서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다. 이때, 냉각온도가 2℃ 미만이면 최종 수득되는 숙신산의 수율이 낮아지고, 20℃ 이상이면 냉각이 되지 않으므로, 냉각온도는 2~20℃인 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 숙신산 생성 미생물은 맨하이미아 속인 것을 특징으로 할 수 있으나, 숙신산을 생산할 수 있는 미생물이라면 제한없이 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 맨하이미아 속 미생물은 Mannheimia succiniciproducens LPK, Mannheimia succiniciproducens LPK7, Mannheimia succiniciproducens PALK, Mannheimia succiniciproducens ALK 및 Mannheimia succiniciproducens ALKt로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 숙신산 생성 미생물의 배양액은 종래의 미생물 배양 공정에서 통상적으로 알려진 회분식, 유가식, 연속식 등의 모든 배양 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, (a) 맨하이미아 숙시니시프로듀센스(Mannheimia succiniciproducens) PALK가 제거된 배양액을 숙신산의 농도가 100~300g/L가 되도록 농축시키는 단계; (b) 상기 농축된 배양액을 pH 1.0~3.0으로 산화시키는 단계; 및 (c) 상기 산화된 배양액을 2~20℃로 냉각시켜 결정화된 숙신산을 회수하는 단계를 포함하는, 맨하이미아 숙시니시프로듀센스(Mannheimia succiniciproducens) PALK 배양액으로부터 숙신산을 정제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 맨하이미아 숙시니시프로듀센스(Mannheimia succiniciproducens) PALK는 합성배양배지에서 배양되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 농축시키는 단계 이전에 맨하이미아 숙시니시프로듀센스(Mannheimia succiniciproducens) PALK의 배양액을 탈색시키는 단계는 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 도 1에 나타난 바와 같이, 우수한 숙신산 생산 변이균주인 M. succiniciproducens PALK (KCTC 10973BP) 균주를 유가식 배양을 통하여 수득한 배양액을 원심 분리기를 이용하여 균주들을 제거한 후, 활성탄을 이용하여 배양액에 존재하는 불순색소를 제거한다. 그 후, 감압증류 방법 을 이용하여 배양액의 숙신산 농도를 높이고, 염산(HCl)을 이용하여 pH를 떨어뜨린 후, 낮은 온도에서 냉각시킴으로써 최종산물로서 고순도의 숙신산 결정을 고수율로 회수한다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 숙신산의 정제방법은 숙신산 생성 미생물이 제거된 배양액을 사용하므로 전처리 없이 저온에서 산성용액을 이용하여 직접 결정화함으로써, 간단한 공정으로 고순도의 숙신산을 고수율로 수득하는 것을 가능하므로, 미생물 배양액으로부터 숙신산의 분리 및 정제 공정에 소요되는 비용을 획기적으로 절감할 수 있게 한다.

본 발명에 따른 숙신산의 정제방법은 상기와 같은 비용절감을 통하여 산업화에 크게 기여할 뿐만 아니라, 기존에 개발된 공정들에서 문제점으로 지적되어 온 과량의 슬러지 발생을 원천적으로 차단하여 환경오염 방지의 효과까지 제공한다.

본 발명에 따른 숙신산의 정제방법은 이러한 비용절감 및 환경적인 측면에서의 이점뿐만 아니라 수율 및 순도도 각각 74.65% 및 99.99%까지 높일 수 있어, 종래기술에서 찾아볼 수 없었던 기술상의 효과를 가능하게 한다.

따라서, 본 발명은 현재 화학공정으로 생산되고 있는 숙신산을 바이오기반 숙신산 생산 공정으로 대체하는데 큰 기여를 할 수 있으리라 기대된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실 시예에 한정되는 것은 아니다.

특히, 하기 실시예에서는 숙신산 생산 미생물인 Mannheimia 속 미생물과 유가식 배양 방법만을 예시하였으나, 다른 종류의 숙신산 생산 미생물과 배양 방법들을 사용하는 것 역시 당업자에게 자명한 사항이라 할 것이다.

또한, 하기 실시예에서는 활성탄만을 예시하였으나, 배양액에 존재하는 불순 색소를 제거할 수 있는 다른 종류의 모든 물질을 사용하는 것 역시 당업자에게 자명한 사항이라 할 것이다.

또한, 하기 실시예에서는 감압증류 방법을 통한 농축을 예시하였으나, 배양액에 존재하는 숙신산을 농축할 있는 다른 농축 방법을 사용하는 것 역시 당업자에게 자명한 사항이라 할 것이다.

실시예 1: M. succiniciproducdens PALK 균주를 이용한 유가식 배양

-70℃에서 15% 글리세롤 용액에 보관된 상태의 M. succiniciproducens PALK(KCTC 10973BP) 균주 1 mL을 50 mM 포도당을 함유한 19 mL 복합배지에 접종하여 혐기조건으로 39℃에서 8 시간 동안 배양한 후, 상기의 배양된 배양액 2.5 mL을 50 mM 포도당을 함유한 250 mL 복합배지에 옮겨 39℃에서 8 시간 동안 다시 배양하였다. 상기의 배양된 250 mL 배양액을 2.25 L의 합성 배양배지를 함유한 생물 반응기에 접종하여 발효를 수행하였으며, 배양조건은 초기 100 mM 포도당, 50 mM 글리세롤, 배양온도 39℃, 교반속도 200 rpm으로 하였다. 배양 중 혐기상태를 유지하기 위하여 이산화탄소를 연속적으로 0.2 vvm (500 mL/min)의 유속으로 공급하였으며, 발효 중 pH는 28% (w/v) 암모니아 용액을 사용하여 6.5로 조정하였다. 발효 중 배양액의 포도당 농도가 5 g/L 이하로 낮아질 경우 700 g/L의 농축된 포도당 용액을 유가식으로 공급하여 배양액의 포도당 농도를 5~10 g/L로 항상 유지하였다. 합성 배양배지는 1.0 g/L의 NaCl, 1.0 g/L의 (NH₄)₂SO₄, 8.708 g/L의 K₂HPO₄, 9.996 g/L의 NaHCO₃, 0.02 g/L의 CaCl₂·2H₂O, 0.2 g/L의 MgCl₂·6H₂O, 5 mL/L의 trace metal solution (Lee et al., J. Environ. Polymer Degrad., 4:131, 1996), 0.5 g/L의 cysteine, 0.5 g/L의 methionine, 0.5 g/L의 alanine, 0.5 g/L의 asparagine, 0.5 g/L의 aspartic acid, 0.5 g/L의 proline, 0.5 g/L의 serine, 0.005 g/L의 nicotinic acid, 0.005 g/L의 Ca-pantothenate, 0.005 g/L의 pyridoxine·HCl, 0.005 g/L의 thiamine, 0.005 g/L의 ascorbic acid, 0.005 g/L의 biotin으로 구성되었다.

배양 중 세포농도는 미리 측정한 흡광도(OD₆₀₀)와 건조세포의 중량 검증선을 이용하여 분광광도계를 이용하여 추정하였다. 배양 중 대사산물로 생산되는 숙신산을 비롯한 각종 유기산과 에탄올, 그리고 탄소원으로 사용되어진 포도당 및 글리세롤의 농도는 생물 반응기로부터 주기적으로 샘플을 채취하여 13,000 rpm, 4℃에서 10분 동안 원심분리한 후, 이의 상등액을 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다.

그 결과, 도 2 및 표 2에 나타낸 바와 같이, M. succiniciproducdens PALK 균주는 15.5 시간 배양 후에, 최종산물로서 60.36 g/L의 숙신산과 부산물로서 3.385 g/L의 피루브산과 1. 539 g/L의 아세트산 및 미량의 다른 유기산들을 생산한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 활성탄 양이 배양액의 숙신산 손실과 불순색소 제거에 미치는 영향

실시예 1에서 수득한 배양액을 원심분리하여 균주들을 제거하고, 배양액에 존재하는 불순색소를 제거하여, 최종산물로서 백색의 결정화된 숙신산을 생산하기 위하여 결정화 이전에 탈색 과정을 수행하였다. 여기서, 탈색을 위하여 활성탄(activated carbon)을 사용하였다. 탈색은 배양액에 1.0~3.0% (w/v)의 활성탄을 첨가한 후, 상온에서 1 시간 동안 교반기를 이용하여 50 rpm 이하로 혼합시키면서 실시하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 활성탄의 양을 증가시킬수록 배양액의 색이 보다 투명해지는 것을 확인할 수 있었고, 이는 활성탄에 의하여 배양액의 불순색소가 제거되기 때문이라는 것을 알 수 있었다.

표 1은 초기 농도 60.36 g/L의 숙신산을 함유한 배양액을 흡착탄을 이용하여 탈색할 경우, 사용된 흡착탄의 농도에 따른 배양액에 존재하는 숙신산의 절대적인 감소량과 숙신산의 상대적인 손실율을 나타낸 것으로, 사용된 흡착탄의 농도가 증가할수록 배양액의 숙신산의 농도는 감소하고, 숙신산의 손실율은 증가하는 것으로 나타났다.

도 3과 표 1을 분석한 결과, 숙신산의 손실을 최소화하면서 가장 효과적으로 배양액에 존재하는 불순색소를 제거하기 위해서는 2.0%(w/v) 흡착탄을 이용하는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있었다.

배양액으로부터 활성탄을 이용한 색소제거 과정에서의 숙신산 손실율 비교

	배양액 초기	흡착탄 1.0% (w/v)	흡착탄 1.5% (w/v)	흡착탄 2.0% (w/v)	흡착탄 2.5% (w/v)	흡착탄 3.0% (w/v)
숙신산 농도 (g/L)	60.36	60.07	59.24	58.45	58.43	58.24
숙신산 손실율(%)	-	0.49	1.87	3.18	3.20	3.53

실시예 3: 농축 과정을 통한 배양액의 숙신산 농도가 결정화 공정에 미치는 영향

실시예 2에서 탈색된 배양액을 감압증류를 통하여 농축시킨 뒤, 결정화시켰다. 우선, 감압증류를 이용하여 배양액에 함유된 숙신산 농도를 100~300 g/L로 농축하였으며, 농축된 배양액에 염산(HCl) 및 황산(H₂SO₄)을 각각 첨가하여 pH를 1.5로 동일하게 맞추고, 2℃에서 냉각시킴으로서 숙신산 결정화 공정을 수행하였다. 여과(filtration)를 통하여 침전된 숙신산 결정을 최종적으로 수득하였으며, 80℃ 오븐에서 수분을 완전히 제거한 후 질량을 측정하여 최종 숙신산 수율을 구하였다.

그 결과, 도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, 각각 염산(HCl)과 황산(H₂SO₄)을 이용하여 결정화 공정을 수행하였을 경우, 농축 배양액 내의 숙신산 농도가 증가할수록 최종 정제되는 숙신산 결정의 수율이 증가하였으며, 특히 배양액 내의 숙신산 농도가 200 g/L일 때, 숙신산 결정의 수율이 급격히 증가함을 확인하였다.

따라서, 배양액으로부터 효과적인 숙신산 결정화를 위해서는, 감압증류 과정의 경제적인 비용 및 결정화된 숙신산의 수율을 고려할 때 농축 배양액의 숙신산 농도가 200 g/L 정도에서 결정화 공정을 수행하는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있었다.

실시예 4: 숙신산 결정화에 미치는 온도와 pH 영향

실시예 3에서 수득한 200 g/L의 숙신산을 함유하는 농축 배양액을 이용하여 냉각온도가 숙신산 결정화에 미치는 영양을 조사함으로써 최적의 냉각온도 및 pH를 결정하였다. 우선, 냉각온도가 숙신산 결정화에 미치는 영양을 조사하기 위하여, 상기 200 g/L의 숙신산을 함유하는 농축 배양액에 염산(HCl) 및 황산(H₂SO₄)을 각각 첨가하여 pH를 1.5로 조정하고, 각각의 샘플들을 2℃, 4℃, 7℃, 10℃, 15℃ 및 20℃로 각각 냉각시켰다. 그 후, 여과(filtration)를 통하여 침전된 숙신산 결정을 수득하고, 80℃ 오븐에서 수분을 완전히 제거한 후 각각의 질량을 측정하여 숙신산 수율을 구하여 비교하였다.

그 결과, 각각 염산(HCl)과 황산(H₂SO₄)을 이용하여 결정화 공정을 수행하였을 경우 냉각온도에 따른 결정화된 숙신산의 수율을 나타내고 있는 도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이, 실험이 수행된 냉각온도 중 가장 낮은 2℃에서 가장 높은 숙신산 수율을 얻을 수 있었다.

일반적으로 초기 배양액의 pH는 배양액에 존재하는 유기산들의 해리상수 값보다 높기 때문에 해리된 상태로 존재한다. 따라서 해리상수 값보다 높은 pH 영역에서는 유기산의 용해도 역시 증가하며, 반대로 해리상수 값보다 낮은 pH 영역에서는 H⁺이온을 받아들여 원래의 유기산(carboxylic acid) 형태로 존재함으로 이들의 용해도는 감소한다. 본 발명에서는 염산(HCl)이나 황산(H₂SO₄)을 배양액에 첨가하여 pH를 해리상수 값 이하로 낮춤으로써, 숙신산의 용해도를 낮추어 비해리 형태의 숙신산 결정을 생산할 수 있었다.

또한, pH가 숙신산 결정화에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 200 g/L의 숙신산을 함유하는 농축 배양액에 염산(HCl) 및 황산(H₂SO₄)을 각각 첨가하여 pH를 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 및 3.0으로 조정하고, 최고의 숙신산 수율을 보이는 냉각온도 2℃에서 냉각시킨 후, 여과 (filtration)를 통하여 침전된 숙신산 결정을 수득하고, 80℃ 오븐에서 수분을 완전히 제거한 후 각각의 질량을 측정하여 숙신산 수율을 구하였다.

그 결과, 도 8 및 도 9에 나타난 바와 같이, pH 1.5~2.0 범위에서 결정화된 숙신산 수율이 급격히 증가하였으며, 그 이하의 pH에서는 수율의 증가 정도가 매우 감소함을 확인하였다.

따라서, 효율적인 결정화 공정 수행을 위해서는 첨가되는 산의 경제적인 비용과 숙신산 수율을 고려할 때, pH 1.5~2.0 범위에서 결정화 공정을 수행하는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있었다.

실시예 5: 최적의 분리·정제 공정을 이용한 배양액의 숙신산 결정화

실시예 1에서 수득한 배양액을 이용하여 실시예 2 내지 실시예 4의 결과를 바탕으로 활성탄 2.0% (w/v)을 이용한 불순색소 제거, 감압증류를 통한 200 g/L의 숙신산을 함유한 배양액 농축, 염산(HCl) 또는 황산(H₂SO₄)을 이용하여 pH를 1.5로 낮추고 2℃에서 냉각을 통한 숙신산 결정화, 여과를 통하여 결정화된 숙신산을 회수하였다.

최종적으로 배양액으로부터 회수한 결정화된 숙신산의 수율 및 순도를 결정하기 위하여, 80℃ 오븐에서 수분을 완전히 제거한 후 질량을 측정하여 수율을 구하였으며, 또한 HPLC를 이용하여 순도를 구하였다.

표 2는 실시예 1에서 획득한 배양액 1.0 L를 기준으로 초기 배양액에 존재하는 숙신산을 포함한 유기산들의 조성과 건조 중량을 상기의 분리·정제 공정을 통하여 최종적으로 획득한 결정화된 숙신산과 비교한 것이다. 도 10은 실시예 1에서 획득한 배양액과 결정화 공정 후에 최종적으로 획득한 결정화된 숙신산의 HPLC 분석 그림이다.

표 2 및 도 10에 나타난 바와 같이, 숙신산을 제외한 거의 모든 유기산들이 상기의 분리·정제 방법을 통하여 완전히 제거되었으며, 74.65%의 높은 수율로 99.99% 이상의 고순도로 결정화된 숙신산을 생산할 수 있었다.

배양액 1.0 L를 기준으로 초기 배양액에 존재하는 유기산들의 조성과 건조 중량을 최종적으로 결정화된 숙신산과의 비교

배양액에 존재하는 유기산 조성	배양액	결정화 공정
배양액에 존재하는 유기산 조성	건조 중량(g)	건조 중량(g)	순도(%)
숙신산	60.364	45.0617	99.997
말레산	0.004	-	-
피루브산	3.385	-	-
아세트산	1.539	0.0014	0.003
푸마르산	0.004	-	-
계	65.296	45.0631	100

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 배양액으로부터 결정화된 숙신산을 생산하는 전체 공정을 나타내는 모식도이다.

도 2는 유가식 배양에서 M. succiniciproducens PALK 균주의 숙신산 발효 특성을 나타낸 그래프이다.

도 3은 활성탄의 사용 농도 따른 배양액에 존재하는 불순 색소의 제거를 나타낸 사진이다.

도 4는 염산(HCl)을 이용한 결정화 공정에서 농축된 배양액의 숙신산 농도에 따른 결정화된 숙신산 수율의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 5는 황산(H₂SO₄)을 이용한 결정화 공정에서 농축된 배양액의 숙신산 농도에 따른 결정화된 숙신산 수율의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 6은 염산(HCl)을 이용한 결정화 공정에서 냉각온도에 따른 결정화된 숙신산 수율의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 7은 황산(H₂SO₄)을 이용한 결정화 공정에서 냉각온도에 따른 결정화된 숙신산 수율의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 8은 염산(HCl)을 이용한 결정화 공정에서 pH에 따른 결정화된 숙신산 수율의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 9는 황산(H₂SO₄)을 이용한 결정화 공정에서 pH에 따른 결정화된 숙신산 수율의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 10은 초기 배양액과 결정화된 숙신산의 HPLC 분석 그림이다.

Claims

다음의 단계를 포함하는, 숙신산 생성 미생물의 배양액으로부터 숙신산을 정제하는 방법:

(a) 숙신산 생성 미생물이 제거된 배양액을 농축시키는 단계;

(b) 상기 농축된 배양액을 산화시키는 단계; 및

(c) 상기 산화된 배양액을 냉각시켜 결정화된 숙신산을 회수하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 농축시키는 단계 이전에 숙신산 미생물의 배양액을 탈색시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 탈색은 1.8~2.5%(w/v)의 활성탄을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a)단계의 농축은 감압증류에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a)단계에서 농축된 배양액의 숙신산 농도는 100~300g/L인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b)단계의 산화는 염산 또는 황산을 이용하여 pH 1.0~3.0 범위에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (c)단계의 냉각은 2~20℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 맨하이미아 속인 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 맨하이미아 속 미생물은 Mannheimia succiniciproducens LPK, Mannheimia succiniciproducens LPK7, Mannheimia succiniciproducens PALK, Mannheimia succiniciproducens ALK 및 Mannheimia succiniciproducens ALKt로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
다음의 단계를 포함하는, 맨하이미아 숙시니시프로듀센스(Mannheimia succiniciproducens) PALK 배양액으로부터 숙신산을 정제하는 방법:

(a) 맨하이미아 숙시니시프로듀센스 PALK가 제거된 배양액을 숙신산의 농도가 100~300g/L가 되도록 농축시키는 단계;

(b) 상기 농축된 배양액을 pH 1.0~3.0으로 산화시키는 단계; 및

(c) 상기 산화된 배양액을 2~20℃로 냉각 냉각시켜 결정화된 숙신산을 회수하는 단계.
제10항에 있어서, 상기 농축시키는 단계 이전에 맨하이미아 숙시니시프로듀센스(Mannheimia succiniciproducens) PALK의 배양액을 탈색시키는 단계는 추가로 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 맨하이미아 숙시니시프로듀센스(Mannheimia succiniciproducens) PALK는 합성배양배지에서 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.