JP2011505822A - コハク酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、嫌気条件下での発酵によってコハク酸および／またはコハク酸イオンを製造するための方法に関する。

Description

本発明は、嫌気条件下での発酵によってコハク酸および／またはコハク酸イオンを製造するための方法に関する。

コハク酸（またはブタン二酸）は、半構造（ｓｅｍｉ−ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ）式ＣＯＯＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＯＯＨの２つのカルボキシル基を有する有機酸であり、ミトコンドリアにおけるクレブス回路の代謝中間体として、細胞代謝に関与する。

コハク酸は、化粧品、食品加工、製薬および織物分野、ならびにプラスチックにおいて多くの用途を有する。従って、例えば、コハク酸は、１，４−ブタンジオール、テトラヒドロフランおよびガンマ−ブチロラクトンの製造において、プラスチックのための合成中間体として使用される。

コハク酸から誘導される新しい生成物は、常に開発中である（ポリエステルの開発を含む）。

一般に、コハク酸エステルは、人間および環境にとってより有害である溶媒を交換し得る新しい「グリーン」溶媒である可能性を有する。

再生可能な出発材料からのリンゴ酸、コハク酸またはフマル酸などのカルボン酸の製造（適切な場合には、発酵過程を経る）は当業者に知られている。

コハク酸塩は、プロピオン酸塩を産生する細菌による嫌気性発酵における代謝中間体であるが、これらの発酵過程は、非常に低い収率および力価のコハク酸の製造をもたらす。

近年、例えば、嫌気性ルーメン細菌のバクテロイデス・ルミニコラ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ）およびバクテロイデス・アミロフィラス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｍｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）などの多数のコハク酸産生微生物が単離されている。しかしながら、ルーメンからの生物体は発酵過程において非常に不安定であり、そのため、コハク酸の製造のために工業的に使用することができない。

１９４９年にＪＬ Ｓｔｏｋｅｓの「Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｂｙ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，５７：１４７−１５８によって記載されるように、炭素基質としてグルコースおよびＣＯ_２の存在下でのＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）発酵から、コハク酸を含むいくつかの酸の混合物が製造されることは長い間知られている。しかしながら、発酵されるグルコース１モルに対して０．３〜０．４モルのコハク酸しか製造されない。

そのため、細菌についての研究、特に、コハク酸の産生に必要とされるＮＡＤＨを消費する代謝経路を不活性化するように、そしてコハク酸塩（コハク酸の塩）を産生するための代謝経路を活性化するように遺伝子改変されたエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）についての研究が行われている。

特に、リンゴ酸塩、次にフマル酸塩、そして最終的にはコハク酸塩へのオキサロ酢酸の転化を可能にする発酵代謝手段は、産生されるコハク酸塩１モルあたり２モルのＮＡＤＨを必要とする。従って、コハク酸塩の産生における主な代謝の妨げは、ＮＡＤＨの細胞バイオアベイラビリティである。

この困難に対する解決策として、米国特許第７，２２３，５６７号明細書は、同じ利用可能な量のＮＡＤＨに対してコハク酸塩を過剰産生する組換えエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株の使用について記載している。

このエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株ＳＢＳ５５０ＭＧ ｐＨＬ ４１３は、ａｄｈＥおよびｌｄｈＡ遺伝子の産物（ＮＡＤＨを消費する経路に関与する）の不活性化ならびにａｃｋ−ｐｔａ遺伝子およびｉｃｌＲ遺伝子の産物（グリオキシル酸経路を活性化する）の不活性化を示し、外来ＰＹＣ遺伝子を過剰発現するプラスミドベクターを含有する。

Ｓａｎｃｈｅｚらによる論文（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（２００５年）２２９−２３９中の表題「Ｎｏｖｅｌ ｐａｔｈｗａｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｃｅｎｔｒａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ」）、米国特許第７，２２３，５６７号明細書および米国特許出願公開第２００５／００４２７３６号明細書には、そのコハク酸の産生収率を改善するために、この菌株に関連する新規の培養および産生条件が明らかにされている。

当業者は、コハク酸を製造するための改善された新規の方法を常に捜し求めている。特に、当業者は、得られる収率および生産性を最適化することを目指している。さらに、従来の発酵方法は、大気中に放出されるかなりの量の二酸化炭素廃棄物をもたらし、これは非常に明らかに望ましくない。

１つの態様によると、本発明は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株の嫌気性発酵によってコハク酸および／またはコハク酸イオンを製造するための方法に関し、この方法は、
（Ａ）ＣＯ_２が供給される発酵槽において、菌株によるＣＯ_２の消費によってＣＯ_２の供給が制御されるように発酵槽の通気孔を閉鎖して実行される、炭素源の発酵ステップであって、前記炭素源が完全に欠乏する前にステップ（Ｂ）が行われるステップと、
（Ｂ）残存ＣＯ_２を消費するように、ＣＯ_２を供給せずに残りの炭素源を発酵させるステップと
を含む。

当業者は発酵技術に精通している（特に、Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ＆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｈａｎｄｂｏｏｋ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ｐｒｏｃｅｓｓ ｄｅｓｉｇｎ ＆ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ、第２版 １９９６年 Ｈｅｎｒｙ Ｃ．ＶｏｇｅｌおよびＣｅｌｅｓｔｅ Ｌ．Ｔｏｄａｒｏ著に記載されるように）。

発酵は生化学反応であり、通常、微生物酵素の作用下における有機基質からのエネルギーの放出または対象となる特定の代謝産物の産生にある。

発酵は、通常、発酵過程に適した、すなわち所望の条件下で微生物を培養するのに適した装置（発酵槽）内で実行される（装置は、適切な場合に、特に気体の入口および／または出口管、通気孔などによって培地の気体平衡の制御を可能にする；装置は、培地および他の物質の導入を可能にする；装置は、攪拌、温度、ｐＨなどの他の種類のパラメータの制御、調節、修正を可能にする）。

当業者は、嫌気条件下での発酵にも精通している。本発明によると、これは、酸素が存在しない状態での培養条件を示す。好ましくは、嫌気性培養条件は、二酸化炭素の存在下における培養条件である。一実施形態によると、ＣＯ_２の存在下および／またはＣＯ_２が供給されている状態での嫌気性発酵条件は、ＣＯ_２飽和発酵条件である。

ステップ（Ａ）中の「炭素源が完全に欠乏する前」という語句は、発酵培地が、この時点で利用可能な溶液中のＣＯ_２（溶解ＣＯ_２またはＨＣＯ_３ ⁻の形態）の効力によって菌株によりコハク酸および／またはコハク酸塩に完全に転化させることができる残存量の炭素源を含有する、ステップ（Ａ）の時点を意味することが意図される。

ステップ（Ａ）の間、発酵槽の通気孔は閉鎖されており、発酵槽へのＣＯ_２の給送は維持されているので、ＣＯ_２の供給はバッチ式で実行され、コハク酸および／またはコハク酸塩を製造するための菌株によるＣＯ_２の消費に従って自動的に調整される。

「自動的に調整される」という用語は、発酵槽（通気孔は閉鎖）内に存在する液相（発酵培地）と気相（「大気」）との間の熱力学的平衡を仮定すれば、所与の量のＣＯ_２の供給が、発酵（従って、付随するコハク酸および／またはコハク酸塩の産生）によって同じ量が菌株により消費された後にのみ生じ得ることを意味することが意図される。

ステップ（Ｂ）の間、ＣＯ_２の供給は行われず、これは、ステップ（Ａ）中に実行されるＣＯ_２の供給が中断されることを意味する。これは、特にＣＯ_２の給送の遮断によって行うことができる。

有利なことに、本発明によると、ステップ（Ｂ）の間の発酵は、発酵培地中に存在するＣＯ_２（溶解残存）およびＨＣＯ_３ ⁻イオンを消費する。

１つの好ましい実施形態によると、ステップ（Ａ）の開始前に、ＣＯ_２の供給は、ＣＯ_２による発酵培地の飽和を達成するように発酵槽の通気孔を開いて注入により実行される。

例として、ＣＯ_２は、０．１５〜０．４０ｖｖｍ（１分間につき、培養物の体積当たりのＣＯ_２の体積）の流速、好ましくは０．３ｖｖｍの流速で注入によって導入することができる。

「ＣＯ_２で飽和された発酵培地」という語句は、培地が、対応する条件（温度、ｐＨなど）下でその中に溶解可能な最大量のＣＯ_２を含有することを意味することが意図される。例えば、これは、３７℃、ｐＨ７において、１〜２ｇ／ｌの濃度、例えばおよそ１．５ｇ／ｌの濃度に相当し得る。

一実施形態によると、ステップ（Ａ）および／またはステップ（Ｂ）は、６．０〜７．０の範囲、好ましくは６．４〜６．８の範囲、好ましくは６．５〜６．６の範囲のｐＨで実行される。

一実施形態によると、炭素源はグルコースである。

一実施形態によると、ステップ（Ａ）の開始時に、発酵培地は、１５〜４０ｇ／ｌ、好ましくは１５〜２５ｇ／ｌ、好ましくは１５〜２０ｇ／ｌのグルコースを含む。

一実施形態によると、ステップ（Ｂ）の開始時に、発酵培地は、２〜６ｇ／ｌ、好ましくは約４ｇ／ｌのグルコースを含む。

１つの好ましい実施形態によると、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株は、遺伝子型ΔａｄｈＥ ΔｌｄｈＡ ΔｉｃｌＲ Δａｃｋｐｔａ ＰＹＣを有する菌株である。この遺伝子型は、有利に、ＣＯ_２の存在下での発酵によるコハク酸の製造の促進を可能にする。記号Δは、問題の遺伝子が、例えば、変異、欠失、中断、挿入または下方制御によって、例えば、終止コドンの導入、読み枠の変化をもたらす挿入または欠失、点変異などによって不活性化されていることを示す。

従って、ΔａｄｈＥ ΔｌｄｈＡ ΔｉｃｌＲ Δａｃｋｐｔａ ＰＹＣ遺伝子型は以下に相当する：
− ΔａｄｈＥ：アルコールデヒドロゲナーゼの不活性化。
− ΔｌｄｈＡ：乳酸デヒドロゲナーゼの不活性化。
− ΔｉｃｌＲ：イソクエン酸リアーゼ（ａｃｅＡとしても知られている）の不活性化。
− Δａｃｋｐｔａ：酢酸キナーゼ−ホスホトランスアセチラーゼの不活性化。
− ＰＹＣ：ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の発現。これは、例えば、この遺伝子の機能性コピーを保有するプラスミドによる形質転換によって、あるいはＰＹＣの機能性コピーのゲノムの組込みによって、菌株がＰＹＣ遺伝子を発現することを示す。ＰＹＣ遺伝子は、有利に、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ｐｙｃ遺伝子である。

１つの非常に好ましい実施形態によると、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株は、ＳＢＳ５５０ＭＧ−ｐＨＬ４１３菌株である。この菌株は、ＳａｎｃｈｅｚらのＭｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７（２００５年）２２９−２３９、ならびに米国特許第７，２２３，５６７号明細書および米国特許出願公開第２００５／００４２７３６号明細書に記載されている。

１つの態様によると、本発明は、
（ａ）好気条件下でエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株を培養するステップであって、この間、マグネシウム化合物を培地へ添加することによってｐＨが調節されるステップと、
（ｂ）ＣＯ_２の存在下、ステップ（ａ）で培養された菌株の嫌気条件下での発酵によってコハク酸イオンを製造するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で形成されたコハク酸イオンをコハク酸に転化するステップと
を含むコハク酸の製造方法に関する。

当業者は、好気条件下での発酵および培養にも精通している。本発明によると、これは、酸素の存在下での培養条件を示す。一実施形態によると、酸素は大気に由来する。

従って、ステップ（ａ）において、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株の成長および増殖が存在する。従って、バイオマスの製造が存在し、すなわち細胞集団が増大する。このステップは、通常、前培養サブステップを含むことができる。

本発明によると、「ｐＨを調節する」という用語は、培地のｐＨ値を特定の値の範囲または選択内に保持する作用を意味することが意図される。本発明によると、ｐＨは、種々の方法で調節することができる：
− 範囲内の調節：ｐＨ値は特定の値の範囲内に保持される。そして、ｐＨ値は時間と共に変化し得るが、考慮中の範囲から逸脱することはない。
− 「低点」調節：ｐＨ値はしきい値よりも高く保持される。そして、ｐＨ値は時間と共に変化し得るが、しきい値よりも下がることはない。
− 単一の値における調節：ｐＨ値は、時間と共に一定にこの値に保持される。

「化合物の添加」という用語は化合物の培地への導入を意味することが意図される。添加は、種々の方法に従って行うことができる：懸濁液の添加および／または溶液の添加および／または固体（例えば、粉末形態）の添加。

一実施形態によると、ステップ（ａ）のマグネシウム化合物は、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウムおよび炭酸マグネシウムから選択される。

酸化マグネシウム、水酸化マグネシウムまたは炭酸マグネシウムは粉末形態で添加することもできるし、あるいは懸濁液、通常は、例えば２０％〜３０％ｗ／ｖの濃度の水性懸濁液の形態で添加することもできる。

一実施形態によると、ステップ（ａ）および／または（ｂ）は、使用される炭素源、通常はグルコースを、特に１０〜３０ｇ／ｌの濃度、例えば２０ｇ／ｌの濃度で含有する培地において実行される。

一実施形態によると、ステップ（ｂ）の間、マグネシウム化合物（例えば、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウムおよび炭酸マグネシウムから選択される）、カルシウム化合物（例えば、酸化カルシウム、水酸化カルシウムおよび炭酸カルシウムから選択される）、カリウム化合物（例えば、水酸化カリウムおよび炭酸カリウムから選択される）、アンモニウム化合物（例えば、水酸化アンモニウムおよび炭酸アンモニウムから選択される）、およびナトリウム化合物（例えば、水酸化ナトリウムおよび炭酸ナトリウムから選択される）、ならびにこれらの混合物で構成される群から選択される化合物を発酵培地へ添加することによって、ｐＨが調節される。

一実施形態によると、ステップ（ｂ）は、６．０〜７．０の範囲内、好ましくは６．４〜６．８の範囲内のｐＨで実行される。

一実施形態によると、ステップ（ｃ）は酸性化を含む。酸性化は、特に、オルトリン酸、シュウ酸および硫酸から選択される少なくとも１つの酸の添加によって実行することができる。

一実施形態によると、ステップ（ｂ）の間、マグネシウム化合物で構成される群から選択される化合物を発酵培地へ添加し、それによりコハク酸マグネシウムを形成することによって、ｐＨが調節される。

この場合、ステップ（ｃ）は、
（ｃ−１）ステップ（ｂ）で形成されたコハク酸マグネシウムをコハク酸ナトリウムに転化するステップと、
（ｃ−２）ステップ（ｃ−１）で形成されたコハク酸ナトリウムを双極電気透析によってコハク酸に転化するステップと
を含むことができる。

ステップ（ｃ−１）は、通常、炭酸ナトリウムの添加によって実行することができる。炭酸塩は、溶液または粉末の形態，通常、例えば１〜２Ｍの濃度の水溶液の形態で添加することができる。不溶性の炭酸マグネシウムは沈殿する。炭酸マグネシウムは、高温のオーブン、例えば７００℃よりも高温のオーブン内で処理することができる。この結果、ＭｇＯおよびＣＯ_２が得られ、そのうちの少なくとも１つはリサイクルすることができる。

あるいは、炭酸マグネシウムは、そのまま回収することもできる。コハク酸ナトリウムは、有利に、双極電気透析によって処理（コハク酸マグネシウムを用いる場合ではない）して、水酸化ナトリウムおよびコハク酸（結晶化され得る）を生じることができる。さらに、双極電気透析技術も当業者によく知られている。生成される水酸化ナトリウムは、適切な場合には、高温オーブンからこれまでに放出されたＣＯ_２によって、炭酸ナトリウムを形成するように再転化され得る。ステップは全て図３に示される。

１つの好ましい実施形態によると、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株は、ΔａｄｈＥ ΔｌｄｈＡ ΔｉｃｌＲ Δａｃｋｐｔａ ＰＹＣ遺伝子型を有する菌株である。１つの非常に好ましい実施形態によると、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株はＳＢＳ５５０ＭＧ−ｐＨＬ４１３菌株である。

別の態様によると、本発明は、
（ｉ）ＣＯ_２の存在下、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株の嫌気条件下での発酵によってコハク酸マグネシウムを製造するステップであって、この間、マグネシウム化合物を発酵培地へ添加することによってｐＨが調節されるステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で形成されたコハク酸マグネシウムをコハク酸に転化するステップと
を含むコハク酸の製造方法に関する。

「ｐＨを調節する」および「化合物の添加」という語句は、上記で定義される。

一実施形態によると、ステップ（ｉ）のマグネシウム化合物は、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウムおよび炭酸マグネシウムから選択される。好ましくは、酸化マグネシウム（式ＭｇＯのマグネシア）である。

酸化マグネシウム、水酸化マグネシウムまたは炭酸マグネシウムは粉末形態で添加することもできるし、あるいは懸濁液、通常は、例えば２０％〜３０％ｗ／ｖの濃度の水性懸濁液の形態で添加することもできる。

一実施形態によると、ステップ（ｉ）は、６．０〜７．０の範囲内、好ましくは６．４〜６．８の範囲内、好ましくは６．５〜６．６の範囲内のｐＨで実行される。

一実施形態によると、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）は、使用される炭素源、通常はグルコースを、特に１０〜３０ｇ／ｌの濃度、例えば２０ｇ／ｌの濃度で含有する培地において実行される。

一実施形態によると、ステップ（ｉｉ）は酸性化を含む。この酸性化は、種々の方法で実行することができる。一実施形態によると、酸性化は、オルトリン酸、シュウ酸および硫酸から選択される少なくとも１つの酸の添加によって実行される。これらの酸は、純粋な形態または濃縮水溶液の形態で添加することができる。

別の実施形態によると、ステップ（ｉｉ）は、
（ｉｉ−ａ）ステップ（ｉ）で形成されたコハク酸マグネシウムをコハク酸ナトリウムに転化するステップと、
（ｉｉ−ｂ）ステップ（ｉｉ−ａ）で形成されたコハク酸ナトリウムを双極電気透析によってコハク酸に転化するステップと
を含む。

これらのステップは、ステップ（ｃ−１）および（ｃ−２）について上記で説明されている。

１つの好ましい実施形態によると、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株は、ΔａｄｈＥ ΔｌｄｈＡ ΔｉｃｌＲ Δａｃｋｐｔａ ＰＹＣ遺伝子型を有する菌株である。１つの非常に好ましい実施形態によると、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株は、ＳＢＳ５５０ＭＧ−ｐＨＬ４１３菌株である。

別の態様によると、本発明は、
− 例えば上記の方法から選択される、コハク酸および／またはコハク酸イオンの製造方法と、
− 例えば、強酸をマスト（ｍｕｓｔ）に添加することによって、コハク酸イオンを酸性化してコハク酸を生じるステップと、
− 場合により、コハク酸を精製するステップと、
− コハク酸を結晶化するステップと
を含むコハク酸の入手方法に関する。

一実施形態によると、上記の方法の全てにおいて、精製ステップは、以下のように実行されるエタノール精製を含む：
− 例えばブフナー漏斗および／またはろ過土（ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ ｅａｒｔｈ）による酸性化マストのろ過（タンパク質沈殿物の除去）、
− 場合により、真空下での蒸発によるろ液の濃縮（好ましくは、約２〜８の間の濃縮係数に従う）、
− 塩の沈殿を引き起こす（コハク酸は溶解したままである）ように、１／１〜５／１の比率のエタノール、例えば９５％エタノールの添加、
− ろ過、例えば膜によるろ過による塩沈殿物の分離、
− 真空下での蒸発によるエタノールの回収、
− 活性炭における処理、その後、プレートろ過およびろ過土によるろ過。

嫌気性発酵によるコハク酸の製造能力レベルを、ｐＨを調節するために使用した化合物に応じて示す。 ＭｇＯまたはＮａＯＨのいずれがｐＨを調節するために使用されるかによる製造速度の比較。 コハク酸を製造するための実施形態を示す：炭酸ナトリウムの添加によるコハク酸マグネシウムのコハク酸への転化。

本発明は、非限定的である以下の例示的な実施形態によって説明される。

（実施例１：発酵槽の通気孔を開放または閉鎖した２つの異なるＣＯ_２の供給方法に従う嫌気性発酵によるコハク酸の製造）
コハク酸の製造方法は、
− 三角フラスコ内で前培養する段階と、
− 好気条件下、窒素源としてのコーンスティープ（ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ）および炭素源としてのグルコースを含む培地中で培養し、バイオマスの製造を可能にする段階と、
− コハク酸の本質的な製造を可能にする嫌気性の段階と
を含む。

好気条件および嫌気条件下での段階は、同じ発酵槽において実行される。使用される菌株はＳＢＳ５５０ＭＧ−ｐＨＬ４１３菌株である。

好気性段階：
ＳＢＳ５５０ＭＧ−ｐＨＬ４１３菌株を１２５ｒｐｍで振とうさせながら３７℃で１７時間、三角フラスコ内で前培養する。２つのバッフル付きの２リットルの三角フラスコ内で、４００ｍｌの培地に菌株を接種する。

この前培養培地の組成は、次の通りである：
トリプトン（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ） １０ｇ／ｌ
酵母抽出物 ５ｇ／ｌ
ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ
抗生物質（アンピシリン、カルベニシリン、オキサシリン） ６７ｍｇ／ｌ
このように前培養した菌株を、組成が次の通りである培地中で１５ｌの発酵槽内に入れる。

三角フラスコ内の前培養によって得られた接種材料は、発酵槽内で培養される培地の全体積の３％になる。

好気性段階中の培養条件は、３７℃の温度、５００ｒｐｍにおける攪拌、１ｖｖｍの通気であり、そしてｐＨ調節は行わない（ｐＨは、培地の殺菌の前に７．５に調整するだけである）。

嫌気性段階：
ＣＯ_２を連続供給するプロトコール
− 以下のものが培地に添加される：グルコース：開始時に示に２０ｇ／ｌ＋２４時間の時点で１５ｇ／ｌ＋５０時間の時点で４ｇ／ｌ。
− 発酵は、２５０ｒｐｍで攪拌しながら、発酵槽の通気孔を開放し、３７℃において０．３ｖｖｍ（ｌ／ｌ／分）の流速でＣＯ_２を連続注入し、ｐＨ６．４で実行される。
− ６３．５時間で終結し、倍地中の最終コハク酸力価は３０ｇ／ｌである。
− 消費されたＣＯ_２の総量（０．３ｖｖｍ×６０分×６３．５時間／２２．４ｍｏｌ／ｌ×４４ｇ／ｍｏｌ）は２２４５ｇ／ｌになり、すなわち、７３ｇ／ｇのコハク酸が形成される。
− さらに、発酵の最後に、２ｇ／ｌの濃度のＨＣＯ_３ ⁻（１．５ｇ／ｌのＣＯ_２に相当する）が培地中に存在する。

本発明に従うプロトコール
発酵プロトコールは、以下の点を除いて上記のものと同じである。
− 好気性段階による残存空気を追い出すために、嫌気性段階の最初に、０．３ｖｖｍの流速で１分間、ＣＯ_２が発酵槽内に導入される。
− ＣＯ_２系の圧力が０．４バールまで低下される。
− ＣＯ_２が出て行くのを防止するために、発酵槽の通気孔が密閉される。
− このようにしてＣＯ_２の注入は、発酵の間中、正確にその消費量に調整される。
− 培地中に溶解した残存ＨＣＯ_３ ⁻を消費するために、グルコースの残存濃度が４ｇ／ｌに達したらＣＯ_２の注入が停止される。

本発明に従う結果
− 発酵の最後の培地中で製造されたコハク酸の最終濃度：３０ｇ／ｌ（ＣＯ_２を連続供給して得られた濃度と同じである）。
− 発酵の最後の培地中の残存ＨＣＯ_３ ⁻の濃度：０．３ｇ／ｌ（ＣＯ_２を連続供給して得られた濃度と比較して８５％の低下を表す）。
− ＣＯ_２の消費：開始時に０．５９ｇ／ｌ＋コハク酸に結合した６ｇ／ｌ、すなわち０．２ｇ／ｇの酸（ＣＯ_２を連続供給して得られた濃度と比較して９９．７％の低下を表す）。

従って、本発明に従って有利に、そして一方ではコハク酸の製造収率を保持しながら、相当量の二酸化炭素廃棄物が回避される：
− 閉鎖した反応器内での作業は、廃棄物を自然に制限し、そして
− さらに、発酵の最後の培地中の残存ＨＣＯ_３ ⁻の濃度の低下が観察される。しかしながら、発酵の最後の培地中の残存ＨＣＯ_３ ⁻の酸性化はＣＯ_２の放出をもたらす。

（実施例２：無機培地および種々の化合物（そのうちの少なくとも１つはマグネシウム系である）によるｐＨの調節を用いる嫌気性発酵によるコハク酸の製造）
使用される菌株はＳＢＳ５５０ＭＧ−ｐＨＬ４１３菌株である。

嫌気条件下における発酵段階の間、ｐＨは、種々の化合物：ＮａＯＨ、ＮＨ_３、ＫＯＨ、ＣａＯまたはＭｇＯを用いて６．７５の値に調節される。

プロトコールスキームは以下の通りである：
− 三角フラスコ内の前培養、
− 発酵槽内の継代培養、
− 発酵槽内の製造：２段階：
好気性段階：バイオマスの製造、
嫌気性段階：ＣＯ_２の存在下におけるコハク酸の製造。

各ステップは、以下に詳述される：

嫌気性段階：ＣＯ_２を供給したコハク酸塩の製造
− グルコース２０ｇ／ｌの添加、
− ０．２ｖｖｍにおけるＣＯ_２の注入、
− ３７℃、攪拌：２５０ｒｐｍ、
− ５ＮのＮａＯＨ、または２８％ｗ／ｖのＮＨ_３、または５ＮのＫＯＨ、または２０％ｗ／ｖのＣａＯ、または２０％ｗ／ｖのＭｇＯの添加によるｐＨの６．７５における調節。

それぞれのプロトコールについて、製造されたコハク酸の量は、ＨＰＬＣによって測定される。

結果は、２０ｇ／ｌのグルコースの消費に相当する短い製造段階を通して得られた生産性および収率と共に図１に示されている。

本発明に従って、驚くことにそして有利に、嫌気性発酵中のｐＨの調節のためにＭｇＯの使用は、はるかに最良の能力レベルを与え、１００％よりも高い収率と、他の塩基の最も有効なもの（ＮａＯＨ）で得られるよりも２．５倍高い体積による生産性とを有する。

以下の表は、ＭｇＯの使用が、最良のバイオマス製造収率、および最低の副産物の合成も与えることを示すことによって比較を完成する。

製造速度：ＭｇＯの添加とＮａＯＨの添加によるｐＨの調節の比較
図２は、水酸化ナトリウムまたはマグネシアの存在下で製造段階を延長することによって得られるコハク酸力価の変化を比較する。

この比較により、ＭｇＯの使用の別の予期しない利点：コハク酸の蓄積中の速度の低下の程度が低いことが明らかにされる。有利なことに、ＭｇＯの使用は、ＮａＯＨの使用と比較して、コハク酸生産性およびの製造速度の増大を可能にする。さらに、ＭｇＯの使用は、５０ｇ／ｌよりも高いコハク酸濃度（力価）に達することも可能にする。

（実施例３：マグネシウム化合物を用いる好気性成長段階におけるコハク酸の製造およびｐＨの調節）
使用される菌株はＳＢＳ５５０ＭＧ−ｐＨＬ４１３菌株である。

前培養および継代培養のために使用されるプロトコールは、実施例２で記載したものと同じである。

発酵槽における製造のために、本発明に従って、好気性培養段階（菌株の成長、バイオマスの製造）中のｐＨの調節はＭｇＯを用いて実行されるが、嫌気条件下でのコハク酸塩の製造段階中のｐＨの調節は水酸化ナトリウムを用いて実行される。

その他の作業条件は、実施例２のものと同じである。

これは、「ＭｇＯ、その次にＮａＯＨ」という表記によって要約され、好気性培養ステップがＭｇＯの添加により実行され、その後、ＮａＯＨの添加による嫌気性発酵ステップが実行されることを示す。

以下の表は、これらのｐＨ調節条件（「ＭｇＯ、その次にＮａＯＨ」）下で得られる結果を、２段階でＭｇＯのみまたはＮａＯＨのみが使用される（「ＭｇＯ、その次にＭｇＯ」または「ＮａＯＨ、その次にＮａＯＨ」）場合に得られる結果と比較する。

これらの結果は、成長段階においてＭｇＯのみを用いてｐＨを調節することによって製造段階における能力レベルにおいてプラス効果を得ることが可能であることを示す。

（実施例４：嫌気性発酵および酸性化によるコハク酸の入手）
使用される菌株はＳＢＳ５５０ＭＧ−ｐＨＬ４１３菌株である。実施例２のコハク酸の製造方法（ｐＨ調節剤としてＭｇＯを用いる）の後に、種々の酸の添加による酸性化ステップが行われる：
− オルトリン酸：三塩基性リン酸マグネシウム（非常に不溶性）の形成および沈殿による精製。水相中のコハク酸１モルあたり１モルのＨ_３ＰＯ_４が添加される。この結果、非常に可溶性の一塩基性リン酸マグネシウムの形成が起こる。
− シュウ酸：非常に不溶性のシュウ酸マグネシウムの形成および沈殿による精製。コハク酸の損失はない。その対イオンから解放されるコハク酸が急速に得られる。

（実施例５：嫌気性発酵によるコハク酸の入手およびコハク酸ナトリウムへの転化）
使用される菌株はＳＢＳ５５０ＭＧ−ｐＨＬ４１３菌株である。実施例２のコハク酸の製造方法（ｐＨ調節剤としてＭｇＯを用いる）の後に、炭酸ナトリウムの添加による炭酸マグネシウムおよびコハク酸ナトリウムの形成ステップ行われる。

不溶性である炭酸マグネシウムは沈殿する。コハク酸の損失はない。炭酸マグネシウムは、高温のオーブン、例えば７００℃よりも高温のオーブン内で処理することができる。この結果、ＭｇＯおよびＣＯ_２が得られ、そのうちの少なくとも１つはリサイクルすることができる。次に、炭酸マグネシウムは有利に回収される。

コハク酸ナトリウムは、双極電気分解によって処理することができ、水酸化ナトリウムおよびコハク酸（結晶化することができる）が得られる。この水酸化ナトリウムは、高温オーブンからこれまでに放出されたＣＯ_２によって、炭酸ナトリウムを形成するように再転化され得る。

ステップは全て図３に示される。

（実施例６：嫌気性発酵、エタノール精製および結晶化によるコハク酸の入手）
実施例１のコハク酸の製造方法（ｐＨ調節剤としてＮａＯＨを用いる）の後に、以下に記載されるエタノール精製ステップが行われる：
− 発酵培地（マスト）の遠心分離（５０００ｇ、１５分、２０℃）（バイオマスの排除）。
− １．５のｐＨが得られるまで、９５％硫酸の上澄みへの添加。
− Ｓｅｉｔｚ ＥＫプレートおよびＦＷ２０ろ過土を有するブフナー漏斗によるマストのろ過（タンパク質沈殿物の排除）。
− 真空下の蒸発によるろ液の濃縮（濃縮係数はおよそ２と８の間で変動する）。
− ９５％エタノール、塩の沈殿を生じるように濃縮ろ液の体積あたり２体積のエタノールの添加（コハク酸は溶解したままである）。
− ３ミクロンのミリポア膜によるろ過による塩沈殿物の分離。
− 真空下の蒸発によるエタノールの回収。
− 活性炭による処理（乾燥重量ベースで２％のＰｕｒｅｆｌｏｗ Ｃ−８０℃−１時間）、その次に、Ｓｅｉｔｚ ＥＫプレートおよびＦＷ２０ろ過土によるろ過。
− 蒸発結晶化（Ｔｐ水浴７５℃−残留圧力６０ｍｂａｒ−約５０％の調理済み結晶塊（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｃｏｏｋｅｄ ｍａｓｓ）の乾燥物質）。
− ２０℃で攪拌しながら調理済み結晶塊の冷却。
− ３ミクロンのミリポア膜によるろ過による結晶の分離。
− 脱塩水による結晶の清浄化。
− 真空下、６０℃で一晩の結晶の乾燥。

Claims (24)

1. 嫌気条件下でのエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株の発酵によって、コハク酸および／またはコハク酸イオンを製造するための方法であって、
   （Ａ）ＣＯ_２が供給される発酵槽において、前記菌株によるＣＯ_２の消費によってＣＯ_２の供給が制御されるように前記発酵槽の通気孔を閉鎖して実行される、炭素源の発酵ステップであって、前記炭素源が完全に欠乏する前にステップ（Ｂ）が行われるステップと、
   （Ｂ）残存ＣＯ_２を消費するように、ＣＯ_２を供給せずに残りの炭素源を発酵させるステップと
   を含む方法。
2. ステップ（Ａ）の開始時に、発酵培地がＣＯ_２で飽和される請求項１に記載の方法。
3. ステップ（Ａ）および／またはステップ（Ｂ）が、６．０〜７．０の範囲内、好ましくは６．４〜６．８の範囲内のｐＨで実行される請求項１または２に記載の方法。
4. 前記炭素源がグルコースであり、
   − ステップ（Ａ）の開始時に、前記発酵培地が１５〜４０ｇ／ｌのグルコースを含み、そして
   − ステップ（Ｂ）の開始時に、前記発酵培地が２〜６ｇ／ｌのグルコースを含む
   請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株がΔａｄｈＥ ΔｌｄｈＡ ΔｉｃｌＲ Δａｃｋｐｔａ ＰＹＣ遺伝子型を有し、好ましくは、前記エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株がＳＢＳ５５０ＭＧ−ｐＨＬ４１３菌株である請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. − 請求項１〜５のいずれか一項に記載のコハク酸および／またはコハク酸イオンの製造方法と、
   − 適切な場合には、コハク酸を生じるためのコハク酸イオンの酸性化と、
   − コハク酸を精製する、好ましくはエタノール精製するステップと、
   − 場合により、コハク酸を結晶化するステップと
   を含むコハク酸の入手方法。
7. （ａ）好気条件下でエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株を培養するステップであって、この間、マグネシウム化合物を培地へ添加することによってｐＨが調節されるステップと、
   （ｂ）ＣＯ_２の存在下、ステップ（ａ）で培養された菌株の嫌気条件下での発酵によってコハク酸イオンを製造するステップと、
   （ｃ）ステップ（ｂ）で形成されたコハク酸イオンをコハク酸に転化するステップと
   を含むコハク酸の製造方法。
8. ステップ（ａ）において、前記マグネシウム化合物が、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウムおよび炭酸マグネシウムから選択される請求項７に記載の方法。
9. ステップ（ｂ）の間、マグネシウム化合物、カルシウム化合物、カリウム化合物、アンモニウム化合物、およびナトリウム化合物、ならびにこれらの混合物で構成される群から選択される化合物を発酵培地へ添加することによって、ｐＨが調節される請求項７または８に記載の方法。
10. ステップ（ｂ）が、６．０〜７．０の範囲内、好ましくは６．４〜６．８の範囲内のｐＨで実行される請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. ステップ（ｃ）が酸性化を含む請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記酸性化が、オルトリン酸、シュウ酸および硫酸から選択される少なくとも１つの酸の添加によって実行される請求項１１に記載の方法。
13. ステップ（ｂ）の間、マグネシウム化合物で構成される群から選択される化合物を発酵培地へ添加し、それによりコハク酸マグネシウムを形成することによってｐＨが調節され、そしてステップ（ｃ）が、
    （ｃ−１）ステップ（ｂ）で形成されたコハク酸マグネシウムをコハク酸ナトリウムに転化するステップと、
    （ｃ−２）ステップ（ｃ−１）で形成されたコハク酸ナトリウムを双極電気透析によってコハク酸に転化するステップと
    を含む請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株がΔａｄｈＥ ΔｌｄｈＡ ΔｉｃｌＲ Δａｃｋｐｔａ ＰＹＣ遺伝子型を有し、好ましくは、前記エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株がＳＢＳ５５０ＭＧ−ｐＨＬ４１３菌株である請求項７〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. − 請求項７〜１４のいずれか一項に記載のコハク酸の製造方法と、
    − コハク酸を精製する、好ましくはエタノール精製するステップと、
    − 場合により、コハク酸を結晶化するステップと
    を含むコハク酸の入手方法。
16. （ｉ）ＣＯ_２の存在下、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株の嫌気条件下での発酵によってコハク酸マグネシウムを製造するステップであって、この間、マグネシウム化合物を発酵培地へ添加することによってｐＨが調節されるステップと、
    （ｉｉ）ステップ（ｉ）で形成されたコハク酸マグネシウムをコハク酸に転化するステップと
    を含むコハク酸の製造方法。
17. ステップ（ｉ）において、前記マグネシウム化合物が、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウムおよび炭酸マグネシウムから選択される請求項１６に記載の方法。
18. ステップ（ｉ）が、６．０〜７．０の範囲内、好ましくは６．４〜６．８の範囲内のｐＨで実行される請求項１６または１７に記載の方法。
19. ステップ（ｉｉ）が酸性化を含む請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記酸性化が、オルトリン酸、シュウ酸および硫酸から選択される少なくとも１つの酸の添加によって実行される請求項１９に記載の方法。
21. ステップ（ｉｉ）が、
    （ｉｉ−ａ）ステップ（ｉ）で形成されたコハク酸マグネシウムをコハク酸ナトリウムに転化するステップと、
    （ｉｉ−ｂ）ステップ（ｉｉ−ａ）で形成されたコハク酸ナトリウムを双極電気透析によってコハク酸に転化するステップと
    を含む、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株がΔａｄｈＥ ΔｌｄｈＡ ΔｉｃｌＲ Δａｃｋｐｔａ ＰＹＣ遺伝子型を有し、好ましくは、前記エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株がＳＢＳ５５０ＭＧ−ｐＨＬ４１３菌株である請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
23. − 請求項１６〜２２のいずれか一項に記載のコハク酸の製造方法と、
    − コハク酸を精製する、好ましくはエタノール精製するステップと、
    − 場合により、コハク酸を結晶化するステップと
    を含むコハク酸の入手方法。
24. 発酵マストからのコハク酸および／またはコハク酸イオンを精製するための方法であって、
    − 前記マストに硫酸を添加することによって、コハク酸が生じるようにコハク酸イオンを酸性化するステップと、
    − エタノールの添加によってコハク酸を精製するステップと、
    − 場合により、結晶化と
    を含む方法。

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