JP5857954B2 - コハク酸の製造方法 - Google Patents
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Description
さらに、工業的なスケールで生産を行う場合、酸素を供給しない嫌気環境を制御する必要があり、具体的には、特許文献1等に記載されているような、減圧による反応水溶液の溶解ガスの除去や窒素などによる反応系からの酸素の除去を行うことになる。しかしながら、溶解ガス除去用減圧設備の増設並びに窒素ガス供給制御等に多大な費用がかかるために、産業利用上好ましくない。また、反応系からの酸素の除去を工業的なスケールで行う場合には、反応を開始するまでに多大な時間がかかるために、使用する菌体や培地等の状態が変化してしまい、反応自体に支障がでる可能性がある。また、工業的なスケールでのコハク酸生産において、酸素供給とコハク酸生産効率の関係は明らかになっていない。
本発明の課題は、従来よりも生産効率の高い、特に工業的スケールに対応可能な、コハク酸の製造方法を提供することにある。
[1] コハク酸産生能を有するコリネ型細菌、大腸菌、アナエロビオスピリラム(Anaerobiospirillum)属、アクチノバチルス(Actinobacillus)属、糸状菌、酵母菌から選択される微生物と糖を反応させるコハク酸の製造方法において、コハク酸生産速度に対する酸素移動速度の比(mmol− O2/mol−S
A)が0.38以上105.82以下であり、反応中の微生物の倍加時間が40時間以上であることを特徴とするコハク酸の製造方法。
[3] 酸素移動速度(mmol− O2/L/hr)が0.01以上5以下であるこ
とを特徴とする[1]又は[2]に記載のコハク酸の製造方法。
[5] 反応中のpHが5〜10であることを特徴とする[1]〜[4]のいずれかに記載のコハク酸の製造方法。
[6] [1]〜[5]のいずれかに記載の方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸を用いて重合反応を行う工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
[7] [1]〜[5]のいずれかに記載の方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸を原料としてコハク酸誘導体を合成する工程を含む、コハク酸誘導体の製造方法。
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施形態の一例(代表例)であり、本発明のその要旨を超えない限り、これらの内容に特定はされない。
本発明は、コハク酸産生能を有する微生物と糖を反応させるコハク酸の製造方法であって、コハク酸生産速度に対する酸素移動速度の比(mmol− O2/mol−SA)の範囲が0.1以上240以下であり、反応中の微生物の倍加時間が40時間以上であることを特徴とするコハク酸の製造方法にある。
本発明の方法で使用される微生物は、コハク酸産生能を有する微生物であれば、限定されない。
本発明において、コハク酸産生能とは、微生物を培地で培養したときに、該培地中にコハク酸を蓄積する能力をいう。具体的には、特段の制限はないが、コハク酸産生能の程度はコハク酸における消費糖炭素収率等により示すことができる。
はコリネ型細菌、大腸菌、酵母菌であり、特に好ましくはコリネ型細菌である。
ブレビバクテリウム属細菌としては、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)およびコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)等が用いられる。
コリネ型細菌の親株の特に好ましい具体例としては、ブレビバクテリウム・フラバムMJ−233(FERM BP−1497)、同MJ−233 AB−41(FERM BP−1498)、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC31831、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869等が挙げられる。
アクチノバチルス(Actinobacillus)属細菌としては、アクチノバチルス・サクシノジェネス(Actinobacillus succinogenes)等が用いられる。
Aspergillus属微生物としては、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)等が用いられる。
Penicillium属微生物としては、ペニシリウム・クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)、ペニシリウム・シンプリシシマム(Penicillium simplicissimum)等が用いられる。
酵母菌は、サッカロミセス属(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス属(Shizosaccharomyces)、カンジダ属(Candida)、ピキア属(Pichia)、クルイウェロマイセス属(Kluyveromyces)、チゴサッカロミセス属(Zygosaccharomyces) 等に属する微生物が挙げられる。
シゾサッカロミセス属(Shizosaccharomyces)微生物としては、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等が用いられる。
ピキア属(Pichia)微生物としてはピキア・パストリス(Pichia pastoris)、ピキア・スティピティス(P. stipitis)等が用いられる。
チゴサッカロミセス属(Zygosaccharomyces)微生物としては、チゴサッカロミセス・バイリイ(Zygosaccharomyces bailii)、チゴサッカロミセス・ロウキシ(Z. rouxii)等が用いられる。
育種によってコハク酸生産能を付与するには、特に限定はないが、具体的にはUV照射やNTG処理等の通常の変異処理により変異株を得る方法、細胞融合もしくは遺伝子組み換え法等の遺伝学的手法により誘導される組み換え体を得る方法等の、微生物の育種に採用されてきた方法が用いられる。
PTAとACKはいずれか一方を活性低下させてもよいが、酢酸の副生を効率よく低減させるためには、両方の活性を低下させることがより好ましい。
「ACK活性が低減するように改変された」とは、ACK活性が、非改変株、例えば野生株よりも低くなったことをいう。ACK活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり30%以下に低下していることが好ましく、10%以下に低下していることがより好ましい。また、ACK活性は完全に消失していてもよい。ACK活性が低下したことは、Ramponiらの方法(Ramponi G., Meth. Enzymol. 42,409−426(1975))により、ACK活性を測定することによって確認することができる。
本発明において、培養とは、主として、コハク酸の製造方法に用いられる微生物を増殖させ微生物の菌体を調製する工程を示す。培養工程は省略してもよく、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接反応に用いても良く、また、培養工程を何度か繰り返し行ってもよい。
本発明において、コハク酸を主として製造する工程を「コハク酸生産反応」、または「反応」と示し、コハク酸生産反応に直接供する菌体を調製する培養を「本培養」と示し、該本培養に供する菌体を調製する培養を「種培養」と示す。
本反応に用いる前記微生物を増殖させて菌体を得るための培養条件は限定されないが、通常、コリネ型細菌であれば、生育至適温度であれば特段の制限はないが、通常25℃以上であり、一方、通常35℃以下、好ましくは32℃以下、特に好ましくは30℃以下である。培養時には、通気、攪拌し酸素を供給しながら行う。生育至適温度は、コハク酸の生産に用いられる条件において最も生育速度が速い温度のことを言う。
また、よりコハク酸の製造に適した菌体の調製方法として、特開2008−259451号公報に記載の炭素源の枯渇と充足を短時間で交互に繰り返すように培養を行う方法も用いることができる。
培養には、通常糖を用いる。培養に用いる糖は、前記微生物が資化してコハク酸を生成させうる糖であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン又はセルロース等の炭水化物;グリセリン、マンニトール、キシリトール又はリビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、シュークロース、フルクトース又はグリセロールが好ましく、特にグルコース又はシュークロースが好ましい。
これらの糖は、単独でも組み合わせても使用できる。前記糖の使用濃度は特に限定されないが、コハク酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、反応液に対して、通常5%(W/V)以上、好ましくは10%(W/V)以上であり、一方、通常30%(W/V)以下、好ましくは20%(W/V)以下である。また、反応の進行に伴う前記糖の減少にあわせ、糖の追加添加を行っても良い。
本発明のコハク酸生産反応は、コハク酸産生能がある微生物と糖を反応させるコハク酸の製造方法において、コハク酸生産速度に対する酸素移動速度の比(mmol− O2/mol−SA)が0.1以上240以下であり、反応中の微生物の倍加時間が40時間以上であることを特徴とする。
本発明において、酸素移動速度は、後述するコハク酸生産速度に対する酸素移動速度の比が前記の範囲に含まれる限り特段の制限はなく、反応槽に酸素を供給しない嫌気的雰囲気(酸素移動速度が0の条件)でもよい。ここで、反応槽に酸素を供給しない嫌気的雰囲気(酸素移動速度が0の条件)は、例えば容器を密閉して無通気で反応させる、窒素ガス等の不活性ガスを供給して反応させる、又は二酸化炭素ガス含有の不活性ガスを通気する等の方法によって得ることができるが、コハク酸収率やコハク酸生産速度の低下や、ピルビン酸などの副生物の増加によるコハク酸精製コストの増加、また、酸素移動速度が0を実現するために反応槽を窒素又は酸素を含まない不活性ガスなどで置換するためのコストの増加などの問題がある。
molO2/L/hr]以下、好ましくは3[mmolO 2 /L/hr]以下、より好ましくは2.5[mmolO2/L/hr]以下、特に好ましくは2[mmolO2/L/hr]以下である。
本発明において、コハク酸生産速度(mmol/L/hr)とは、1Lあたり1時間に生産されるコハク酸量をいい、小さすぎると長時間の反応時間が必要になることによるコストの増加やコハク酸以外の副生物の生産量の増加によるコハク酸収率の低下につながる傾向にあるので、通常1mmol/L/hr以上、好ましくは5mmol/L/hr以上である。一方、上限に制限はないが、通常1000mmol/L/hr以下、好ましくは700mmol/L/hr以下、より好ましくは300mmol/L/hr以下である。。
本発明において、コハク酸生産速度に対する酸素移動速度の比(mmol− O2/mol−SA)は、小さすぎるとコハク酸生産に適した酸素供給量より少なくなり、コハク酸収率の低下やコハク酸生産速度の低下、副生物であるピルビン酸の生産量の増加によるコハク酸の精製コストの増加、非常に小さな酸素移動速度条件が要求されることを実現するために反応層を窒素で置換することなどよるコストの増加、などが問題となるため、0.1以上、好ましくは0.2以上、より好ましくは0.3以上である。一方、この比が大きすぎると、コハク酸生産に適した酸素供給量より多くなり、コハク酸収率の低下やコハク酸生産速度の低下、また、副生物である酢酸の生産量が増加することによるコハク酸精製コストの増加、酸素移動速度が大きくなることにより引き起こされる菌体増殖に伴う副生物の増加、コハク酸生産速度が小さくなることによる反応時間の増加によるコストの増加、などが問題となるため、240以下、好ましくは200以下、より好ましくは150以下、更に好ましくは100以下、特に好ましくは50以下である。
本発明において、倍加時間とは、前記微生物の菌体量が2倍に増加するためにかかる時間であり、ある2点の菌体濃度(OD)もしくは乾燥菌体重量の値を元に、以下の計算式(1)の式で示される。
本発明において、対コハク酸酸素移動速度減少率 (%/g/L)とは、反応液1Lあたり1gのコハク酸が生産される間に減少した酸素移動速度の割合を示し、以下の計算式(2)の式で示される。
コハク酸生産反応温度は、特に限定はないが、通常用いる前記微生物の生育至適温度より2℃以上 好ましくは7℃以上高い温度である。一方、通常用いる前記微生物の生育至適温度より20℃高い温度以下、好ましくは15℃高い温度以下である。具体的には、コリネ型細菌の場合には、通常37℃以上、好ましくは39℃以上であり、一方通常45℃以下、好ましくは43℃以下、特に好ましくは41℃以下である。コハク酸の生産反応の間、常に37〜45℃である必要はないが、種培養を含めた全反応時間の50%以上、好ましくは80%以上の時間、前記温度範囲にすることが望ましい。
本発明のコハク酸の製造方法においては、前記微生物を糖と反応させることによってコハク酸を製造してもよいし、予め前記培養で増殖させて得られた微生物を糖を含む反応液中で糖と反応させることによってコハク酸を製造してもよい。特に、後者の場合には、主として、微生物を増殖する工程とコハク酸を製造する工程でそれぞれ最適な条件を選択することができ、添加した糖を効率的にコハク酸製造に使用することができるために有用である。
コハク酸生産反応に用いる前記微生物の菌体量は、特に規定されないが、湿菌体重量として、通常1g/L以上、好ましくは10g/L以上、より好ましくは20g/L以上であり、一方、通常700g/L以下、好ましくは500g/L以下、さらに好ましくは400g/L以下である。
コハク酸生産反応に用いる糖は、前記培養に用いる糖と同様である。
コハク酸製造における糖の使用濃度は特に限定されないが、コハク酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、通常5.0%(W/V)以上、好ましくは10%(W/V)以上であり、一方、通常30%(W/V)以下、好ましくは20%(W/V)以下である。また、反応の進行に伴う糖の減少にあわせ、糖の追加添加を行っても良い。
本発明のコハク酸生産反応における反応液は、前記微生物、前記糖を含有する水溶液であれば、特段の制限はなく、例えば、前記微生物を培養するための培地であってもよいし、リン酸緩衝液等の緩衝液であってもよい。
本発明のコハク酸製造方法は、前記にあげた項目以外にも、通気するガス又は排気するガスの流量、圧力若しくは組成、反応液又はフィード液中の酸素濃度若しくは酸化還元電位、又はフィード液の流量等のうちいずれかを測定しながら、いずれかを調節することにより、制御することができる。用いる微生物、後述する反応槽又は酸素供給方法等の種類に応じて、コハク酸製造効率が最も有効に発揮される範囲に調整される。具体的には、特段の制限はないが、ジャーファーメンターで反応液上面通気を行う場合には、攪拌速度としては、通常50rpm以上2000rpm以下であり、液量あたりの通気量としては、通常0.001vvm以上10vvm以下であり、通気量の空気含有量は通常0.1%以上100%以下である。
工業的スケールにおける発酵によるコハク酸の製造には、従来、乳酸、酢酸又はグルタミン酸等を工業的スケールにおいて発酵させる場合に採用されてきた方法を適用することができる(生物反応工学(第3版) 山根恒夫著 産業図書 p.266〜276参照)。
工業的スケールにおける発酵においては、微生物反応槽の型と酸素や二酸化炭素等のガス導入方法が重要である。
本発明において、工業的反応スケールとは、特段の制限はないが、反応槽の体積にして通常5m3以上、好ましくは50m3以上、一方、通常5000m3以下、好ましくは3000m3以下である。
通気しない場合には、反応液に供給される酸素は反応槽の気相部のみであるが、工業的スケールにおいては、反応槽に対して気相部を本実施例のような小スケールのものよりも少なくすることが反応槽容量の効率化から好ましい。結果として反応に好適な酸素移動速度を維持するための酸素量が足りなくなり、コハク酸生産速度に対する酸素移動速度の比の好ましい範囲から逸脱することになるが、本発明の製造方法によれば通気制御などにより当該比を一定の範囲に制御することでコハク酸収率を向上することができるために有用である。
以上のような反応により、コハク酸が反応液中に生成、蓄積する。
コハク酸の製造過程における副生成物としては、具体的には、酢酸、エタノール、乳酸、ピルビン酸やα−ケトグルタル酸等のコハク酸以外のクエン酸回路代謝物、α−ケトバリン等のアミノ酸前駆体、アラニン、バリンやグルタミン酸等のアミノ酸、トレハロース等の糖、グリセロールなどのアルコール、タンパク質等が挙げられる。
副生成物の量としては、特段の制限はないが、具体的には、副生物がピルビン酸又は酢酸の場合、コハク酸に対するピルビン酸の重量割合 (%)は、通常5.5%以下、好ましくは5.2%以下であり、コハク酸に対する酢酸の重量割合 (%)は、特段の制限はないが、通常15.8%以下、好ましくは15.5%以下である。
その溶液から結晶化又はカラムクロマトグラフィーにより精製するなどして、コハク酸を採取することができる。
一般的にコハク酸は石油化学由来の原料から製造され、多種多様な用途に使用されているが、このような用途に対してバイオ資源から誘導されたコハク酸も同様に好ましく使用することができる。例えば、1,4−ブタンジオール、2−ピロリジン、スクシンイミド、無水マレイン酸、イタコン酸、アスパルギン酸、マレイン酸、フマル酸、ヒドロキシスクシンイミド、マレイミド、4−アミノ酪酸、γ−アミノ酪酸、テトラヒドロフラン、アクリル酸、コハク酸ジメチルやコハク酸ジエチル等のコハク酸エステル、ピリロリドン若しくはN−メチルピロリドン等のコハク酸誘導体の原料として、ポリエステル、ポリウレタン若しくはポリアミド等のコハク酸含有ポリマー化合物や製品等の原料として、酸味料、調味料、醸造薬品若しくは加工食品添加剤等の食品添加剤として、発泡浴成分として、植物成長抑制剤、除草剤、抗菌剤、殺虫剤若しくは蚊誘引剤等の医薬品及び農薬の合成原料及び成分として、口腔洗浄剤や化粧品等の原料及び成分として、写真や印刷等に使用される製品の原料及び成分として、高温溶接剤やアルマイト処理表面接着剤等、接着剤及びシーラント原料及び成分として、粉末ニッケル製造、鉄鋼研磨浴、金属加工洗浄溶媒若しくは金属シンタリング用バインダー等の金属加工用の原料及び成分として、ハンダ若しくは溶接用フラックスの原料及び成分として、多孔質酸化チタン製造、ベーマイト製造、光触媒コーティング剤もしくは多孔質セラミック製造等のセラミックや無機化合物等の製造助剤の原料及び成分として、洗剤等の原料及び成分として、漂白剤等の原料及び成分として、染色助剤等の原料及び成分として、電解質溶媒及びメッキ浴液等の原料及び成分として、脱臭剤若しくは空気洗浄剤等の原料及び成分として、生体吸収性縫合糸等の生体吸収性化合物原料として、繊維製品の処理やソフトナー等の原料及び成分として、溶剤若しくは溶媒等の原料及び成分として、水溶性塗料溶剤の原料及び成分として、生分解性樹脂等の原料及び成分として、無臭シーラント等、シーラント原料及び成分として、鉄鋼製品、銅製品若しくは合金製品に対するコーティング・凍結防止・金属加工・過塩素酸用鉛・ボイラー水処理用等の防食剤等の原料及び成分として、合成潤滑剤、耐熱性プラスチック用潤滑剤若しくは電気接点用潤滑剤等の潤滑剤の合成原料及び成分として、樹脂若しくは高分子材料等の溶媒除去洗浄剤等の原料及び成分として、繊維工業若しくはドライクリーニング等に使用される製品の原料及び成分として、インク用溶剤、脱インキ剤、自動車用トップコート剤、絶縁塗料、粉体塗料、三次元印刷用インク、光硬化型塗料、光硬化インク組成物、ナノ粒子インク、インクジェット用インク、印刷スクリーン洗浄、有機半導体溶液、カラーフィルタ製造用インク、トナー、キナクドン顔料製造、スクシニルコハク酸製造、染料中間体等、顔料、染料若しくはインク等の原料及び成分として、含酸素型ディーゼル燃料等の原料及び成分として、セメント混和剤及び処理剤等の原料及び成分として、エンジン浄化剤等の原料及び成分として、石油精製溶剤等の原料及び成分として、プロパント組成物若しくは析出フィルターケーキ除去等の石油及び天然ガス採掘助剤等の原料及び成分として、天然ガス脱水溶媒等の天然ガス生産に係る製品の原料及び成分として、低ダスト性コンクリート床材若しくはアスファルト舗装剤等の建材の原料及び成分として、インク用溶剤や脱インク剤等の原料及び成分として、使用できる。
各分析項目については、以下のようにして測定した。
<酸素移動速度測定>
酸素移動速度の測定は、溶液を窒素置換し溶存酸素濃度を低下させた後、通気や攪拌を行い溶存酸素濃度の変化から求める方法を使用した(Wise W.S. J. Gen. Microbiol., 1951, vol. 5, pp.167−177)。具体的には、1Lのジャーファーメンターに目的の液量の水を入れ、窒素を通気し攪拌することで水の溶存酸素を除去した。ジャーファーメンターの気相部に空気を通気して置換した後、100mL/minで液の上面又は下面から空気を通気するとともに100rpm〜500rpmで攪拌し、その後の溶存酸素濃度の変化より酸素移動速度を計算した。また、空気と窒素を混合した気体を通気することで、より低い酸素移動速度の測定を行った。
反応液に含まれるコハク酸、ピルビン酸及び酢酸の分析は、反応液を遠心分離(15,000G、2分)処理し、得られた上澄液を液体クロマトグラフ(LC)に供することで行った。コハク酸生産速度(mmol−SA/L/hr)は、測定したコハク酸濃度をサンプリングした時間(hr)で割ることで計算した。
倍加時間は、ある2点の菌体濃度(OD)もしくは乾燥菌体重量の値を元に、下記の計算式(1)により求めた。
対コハク酸酸素移動速度減少率(%/g/L)は、反応液1Lあたり1gのコハク酸が生産される間に減少した酸素移動速度の割合を示し、下記の計算式(2)で計算した。
酸素供給制御によるコハク酸生産
<種培養>
100mLのA培地(尿素:4g、硫酸アンモニウム:14g、リン酸1カリウム:0.5g、リン酸2カリウム0.5g、硫酸マグネシウム・7水和物:0.5g、硫酸第一鉄・7水和物:20mg、硫酸マンガン・水和物:20mg、D−ビオチン:200μg、塩酸チアミン:200μg、酵母エキス:1g、カザミノ酸:1g、及び蒸留水:1000mL)を500mLの三角フラスコにいれ、121℃、20分加熱滅菌した。これを室温まで冷やした後、15mLの滅菌したA培地を200mLの三角フラスコに入れ、あらかじめ滅菌した50%グルコース水溶液を600μL添加し、MJ233/PC/ΔLDH株を接種して5.5時間30℃で培養した。前述した500mLの三角フラスコに100mLのA培地を入れ滅菌した培地に、あらかじめ滅菌した50%グルコース水溶液を4mL添加した後、得られた培養液を、O.D.(660nm)が0.02となるように接種し、30℃20時間で種培養した。
リン酸水溶液(85wt%):6.68g、塩化カリウム:4.95g、硫酸アンモニウム:2.97g、硫酸マグネシウム・7水和物:1.48g、硫酸マンガン・5水和物:118.8mg、硫酸第一鉄・7水和物:118.8mg、CSL(コーンスティープリガー)29.93g、10N水酸化カリウム水溶液:11.08g、消泡剤(CE457:日本油脂製):2.54g及び蒸留水の計1833mLの培地を5Lのジャーファーメンターに入れ、121℃20分加熱滅菌した。室温まで冷やした後、あらかじめフィルター滅菌したビタミン溶液(D−ビオチン、塩酸チアミン各0.2g/L水溶液)を15mL、あらかじめ滅菌した720g/Lの原料糖水溶液を110mL、前述の種培養の溶液を100mL添加した。加熱滅菌前後の重量より蒸発した液量を考慮し全量が2500mLになるように滅菌した水を添加した。ジャーファーメンターを30℃で保温し、pHは28%アンモニア水を用いて7.2に保ち、背圧は0.05MPa、通気は毎分3L、攪拌は毎分600回転で本培養を開始した。溶存酸素濃度がほぼ0まで低下した後、再び上昇を開始して1ppmに達したところであらかじめ滅菌した720g/Lの原料糖を約7g添加したところ、再び0まで低下した。溶存酸素濃度が再び上昇するごとに前記の方法にて原料糖溶液の添加を繰り返して、培養開始後19時間まで継続した。
リン酸水溶液(85wt%):5.2g、硫酸マグネシウム・7水和物:3.46g、硫酸マンガン・5水和物:138.2mg、硫酸第一鉄・7水和物:138.2mg、10N水酸化カリウム水溶液:9.14g及び蒸留水105mLを121℃20分加熱滅菌した後、加熱滅菌による蒸発量を考慮し滅菌水を添加することで320mLの溶液とした。この溶液を20mL、720g/Lの原料糖水溶液を88mL、滅菌水を228.1mL、あらかじめフィルター滅菌したビタミン溶液(D−ビオチン、塩酸チアミン各0.2g/L水溶液)を448μL、前述した本培養液135mLを1Lジャーファーメンターに入れた。pHはNa中和剤(炭酸水素ナトリウム:113.5g、水酸化ナトリウム:145.9g、滅菌水936.7g)を用いて7.6に保ち、39℃に保温した。
通気する混合気体の空気対窒素量の量比を10:90となるようにしたこと以外は、実施例1と同様に行い、上記項目の結果を表1に記載した。なお、正確な倍加時間は測定していないが、実施例6、7、9の値から推測すると、40時間以上であることは明らかである。
通気する混合気体の空気対窒素量の量比を14:86となるようにしたこと以外は、実施例1と同様に行い、上記項目の結果を表1に記載した。なお、正確な倍加時間は測定していないが、実施例6、7、9の値から推測すると、40時間以上であることは明らかである。
通気する混合気体の空気対窒素量の量比を25:75となるようにしたこと以外は、実施例1と同様に行い、上記項目の結果を表1に記載した。なお、正確な倍加時間は測定していないが、実施例6、7、9の値から推測すると、40時間以上であることは明らかである。
通気する混合気体の空気対窒素量の量比を50:50となるようにしたこと以外は、実施例1と同様に行い、上記項目の結果を表1に記載した。なお、正確な倍加時間は測定していないが、実施例6、7、9の値から推測すると、40時間以上であることは明らかである。
通気する混合気体の空気対窒素量の量比を100:0となるようにしたこと及び上記式による倍加時間の計算を行った以外は、実施例1と同様に行い、倍加時間とともに上記項目の結果を表1に記載した。
毎分200回転で攪拌した以外は、実施例6と同様に行い、上記項目の結果を表1に記載した。
毎分400回転で攪拌した以外は、実施例6と同様に行い、上記項目の結果を表1に記載した。なお、正確な倍加時間は測定していないが、実施例6、7、9の値から推測すると、40時間以上であることは明らかである。
毎分500回転で攪拌した以外は、実施例6と同様に行い、上記項目の結果を表1に記載した。
ジャーファーメンターの気相部を窒素で置換した後、通気する混合気体の空気対窒素量の量比を0:100となるようにし、反応液上面に通気し、毎分200回転で攪拌しながら反応を行った以外は、実施例1と同様に行い、上記項目の結果を表1に記載した。なお、正確な倍加時間は測定していないが、40時間以上であると推測される。
反応液下面より、通気する混合気体の空気対窒素量の量比を100:0となるようにし、毎分400回転で攪拌し反応を行った以外は、実施例1と同様に行い、上記項目の結果を表1に記載した。なお、正確な倍加時間は測定していないが、40時間以上であると推測される。
酸素供給(対コハク酸酸素移動速度減少率)制御の効果
実施例10では、前記中和剤の添加に伴い液量が増加して酸素移動速度の変化が引き起こされるため、添加された中和剤と同量の反応液を反応層から除去することで反応液量を一定に保ち、液量変化による酸素移動速度の変化の影響を除いた以外は、実施例8と同様に行った。20時間程度経過した時点での酸素移動速度(mmol− O2/L/hr)、酸素移動速度維持率 (%)、コハク酸生産速度 (mmol−SA/L/hr)、対コハク酸酸素移動速度減少率 (%/g/L)、コハク酸濃度(g/L)、コハク酸生産速度に対する酸素移動速度の比(mmol− O2/mol−SA)及び倍加時間を表2に記載した。
なお、酸素移動速度維持率(%)とは、0時間における酸素移動速度に対する20時間経過後における酸素移動速度の比を示す。
通気を行わない以外は、実施例10と同様に行った。反応結果を表2に記載した。
以上より、反応層中に酸素供給とコハク酸生産量を制御した結果、比較例である嫌気反応および微好気反応より高いコハク酸収率やコハク酸生産速度が得られることが判明した。
さらに、本発明によれば、完全な嫌気環境を作成するための設備増強や反応制御を強いることなく、工業的スケールに対応可能なコハク酸の製造方法を提供可能となる。得られたコハク酸は食品添加物や医薬品、化粧品、工業原料等に用いることができる。また、得られたコハク酸を原料として重合反応を行うことによりコハク酸含有ポリマーを製造することもできる。
Claims (7)
- コハク酸産生能を有するコリネ型細菌、大腸菌、アナエロビオスピリラム(Anaerobiospirillum)属、アクチノバチルス(Actinobacillus)属、糸状菌、及び酵母菌からなる群より選択される微生物と糖を反応させるコハク酸の製造方法であって、コハク酸生産速度に対する酸素移動速度の比(mmol− O2/mo
l−SA)が0.38以上105.82以下であり、反応中の微生物の倍加時間が40時間以上であることを特徴とするコハク酸の製造方法。 - 反応中の対コハク酸酸素移動速度減少率(%/g/L)が1.2以下である、請求項1に記載の方法。
- 反応中の酸素移動速度(mmol− O2/L/hr)が0.01以上5以下である、
請求項1又は2に記載の方法。 - 該微生物が、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が非改変株と比べて低減するように改変された微生物、及び/又はピルビン酸カルボキシラーゼ活性が非改変株と比べて増強するように改変された微生物である、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 反応中のpHが5以上10以下である、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸を用いて重合反応を行う工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸を原料としてコハク酸誘導体を合成する工程を含む、コハク酸誘導体の製造方法。
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