CN102812127B

CN102812127B - 琥珀酸的制造方法

Info

Publication number: CN102812127B
Application number: CN201180011827.7A
Authority: CN
Inventors: 吉川胜德; 城户大助; 村濑诚
Original assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp; Mitsubishi Kasei Corp
Priority date: 2010-03-09
Filing date: 2011-03-08
Publication date: 2014-12-03
Anticipated expiration: 2031-03-08
Also published as: US20120329095A1; CN102812127A; BR112012022486A2; EP2546351B1; WO2011111693A1; CA2792257C; EP2546351A4; CA2792257A1; JPWO2011111693A1; US8647843B2; JP5857954B2; EP2546351A1

Abstract

一种琥珀酸的制造方法，其特征在于，是使具有琥珀酸产生能力的微生物与糖反应的琥珀酸制造方法，氧移动速度相对于琥珀酸生产速度的比（mmol-O₂/mol-SA）在0.1以上、240以下，反应中微生物的倍增时间在40小时以上。

Description

琥珀酸的制造方法

本发明中，所谓琥珀酸产生能力是指，在培养基上培养微生物时，在该培养基上蓄积琥珀酸的能力。具体地，虽然没有特别的限制，但琥珀酸产生能力的程度能够通过琥珀酸的糖消费碳收率等来表示。

技术领域

本发明涉及使用能产生琥珀酸的微生物来制造琥珀酸的方法。

背景技术

基于发酵的琥珀酸生产一般在供给足量氧气的好氧条件下、供给少量氧气的微好氧条件下或不供给氧气的厌氧条件下进行。目前为止的记载是，较之于好氧条件，微好氧条件下或厌氧条件下对发酵反应更有利（专利文献1～4，非专利文献1）。特别地，还有这样的记载：以棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum ATCC 13032）为题材，基于模拟（FBA模型）试验结果，供给微量氧气的条件相比于厌氧条件，提高了琥珀酸的生产，以及通过缺损LDH基因进一步提高了琥珀酸的生产（非专利文献1）。

专利文献5和6中记载了，在使用酵母或曲霉等真核细胞生产琥珀酸中，在缺氧条件下，氧气消耗速度（移动速度）控制在0.01～5mmol/L/hr以下，或通过通气进行氧气供给控制时（oxygen limited conditions），氧气消耗速度控制在5.5～7mmol/L/hr。

现有技术文献

专利文献

[专利文献1]日本专利特开2004-194570号公报

[专利文献2]日本专利特开2006-6344号公报

[专利文献3]日本专利特开2005-95169号公报

[专利文献4]国际公开WO2005/026349号小册子

[专利文献5]国际公开WO2009/065778号小册子

[专利文献6]国际公开WO2010/003728号小册子

[非专利文献]

[非专利文献1]Shinfuku et al.,Development and experimental verification of a genome-scale metabolic model for Corynebacterium glutamicum（谷氨酸棒状杆菌的基因组尺度代谢模型的建立和实验证实）.Microbial Cell Factories 2009,vol.8:43

发明内容

但是，由于非专利文献1中记载的模拟（FBA模型）试验是以菌体增殖达最佳状态为目的进行计算的，因此条件是作为原料的糖代谢用于菌体增殖、菌体的代谢物主要产生乳酸（碳收率最大60%）、琥珀酸中碳收率最大20%左右。进而，在微好氧条件下以及厌氧条件下的琥珀酸生产中，氧摄取速度（OUR）/糖摄取速度（GUR）为0.21时，相对于模拟结果的碳收率为19.2%，实施例的碳收率为3.1%，模拟结果与实施例相背离。由此可知，在菌体增殖受到限制的条件下，向基于产生琥珀酸的微生物的发酵反应的氧气供给和琥珀酸生产反应的详细关系尚不明确。

此外，模拟中的发酵条件下菌体增值速度高，在菌体增殖受限制的条件下，向发酵反应的氧气供给和琥珀酸生产反应的详细关系尚不明确。

而且，在工业规模下进行生产时，必须控制为不供给氧气的厌氧环境，具体来说，如专利文献1记载的那样，通过减压将反应水溶液中溶解的气体除去，或通过氮气等将氧气从反应体系中除去。然而，由于增设除去溶解气体用的减压设备和控制氮气供给等要花费大量费用，所以在工业利用上不理想。此外，在工业规模下进行从反应体系除去氧气时，反应开始前要花费大量的时间，因此使用的菌体和培养基等的状态发生了变化，反应本身可能出现障碍。此外，工业规模的琥珀酸生产中，氧气供给和琥珀酸生产效率的关系尚不清楚。

本发明的课题是提供比以往的生产效率高，尤其是可以适应工业规模的琥珀酸的制造方法。

本发明人们，为了解决上述课题而潜心研究，结果发现了通过能产生琥珀酸的微生物从原料糖制造琥珀酸时，在微生物的菌体增殖受到限制的条件下，通过将氧移动速度相对于琥珀酸生产速度的比控制在特定的范围，即在供给极微量的氧的环境下进行琥珀酸生产反应，可提高琥珀酸生产效率，从而完成了本发明。

即，本发明的主旨如下。

［1］一种琥珀酸的制造方法，其特征在于，使具有琥珀酸产生能力的微生物与糖反应的琥珀酸制造方法中，氧移动速度相对于琥珀酸生产速度的比（mmol-O₂/mol-SA）在0.1以上、240以下，反应中微生物的倍增时间在40小时以上。

［2］［1］中所述的琥珀酸的制造方法，其特征在于，反应中的相对琥珀酸的氧移动速度减少率（%/g/L）在1.2以下。

［3］［1］或［2］中所述的琥珀酸的制造方法，其特征在于，氧移动速度（mmol-O₂/L/hr）在0.01以上、5以下。

［4］［1］～［3］的任一项中所述的琥珀酸的制造方法，其特征在于，该微生物选自棒状杆菌、大肠杆菌、厌氧螺菌（Anaerobiospirillum）属、放线杆菌（Actinobacillus）属、丝状真菌、酵母菌。

［5］［1］～［4］的任一项中所述的琥珀酸的制造方法，其特征在于，该微生物是被变异为乳酸脱氢酶活性低于非变异株的微生物，和/或变异为丙酮酸羧化酶活性强于非变异株的微生物。

［6］［1］～［5］的任一项中所述的琥珀酸的制造方法，其特征在于，反应中的pH为5以上、10以下。

［7］一种含琥珀酸聚合物的制造方法，包括根据［1］～［6］的任一项所述的方法制造琥珀酸的工序，和使用所得到的琥珀酸进行聚合反应的工序。

［8］一种琥珀酸衍生物的制造方法，包括根据［1］～［6］的任一项所述的方法制造琥珀酸的工序，和以所得到的琥珀酸为原料合成琥珀酸衍生物的工序。

具体实施方式

以下详细地说明本发明的实施方式。

以下记载的构成要件的说明是本发明的实施方式的一个例子（代表例），只要不超过本发明的主旨，就不被这些内容所限定。

＜本发明的概要＞

本发明是一种琥珀酸的制造方法，其特征在于，使具有琥珀酸产生能力的微生物与糖反应的琥珀酸制造方法中，氧移动速度相对于琥珀酸生产速度的比（mmol-O₂/mol-SA）的范围在0.1以上、240以下，反应中微生物的倍增时间在40小时以上。

＜微生物＞

a）、克鲁维酵母菌属（Kluyvero

对于琥珀酸的糖消费碳收率（C-mol%）虽然没有特别的限制，但如果糖消费碳收率过低，则相对于作为原料的糖的琥珀酸生产效率有降低的倾向，因此通常在40C-mol%以上，优选在50C-mol%以上，更优选在60C-mol%以上。另一方面，通常在133C-mol%以下，优选在120C-mol%以下，更优选在110C-mol%以下。另外，所谓琥珀酸中的糖消费碳收率（C-mol%）是指，相对于消费的糖所含的碳原子（C原子）的摩尔数，生产的琥珀酸所含碳原子的摩尔数之比。

本发明的方法所使用的微生物，只要具有琥珀酸产生能力就没有特别的限制，可列举从棒状杆菌、大肠杆菌、厌氧螺菌（Anaerobiospirillum）属细菌、放线杆菌（Actinobacillus）属细菌、丝状真菌和酵母菌组成的群组中选择的微生物。其中，优选棒状杆菌、大肠杆菌、厌氧螺菌（Anaerobiospirillum）属细菌、放线杆菌（Actinobacillus）属细菌、酵母菌，更优选棒状杆菌、大肠杆菌、酵母菌，特别优选棒状杆菌。

本发明的方法中使用的棒状杆菌可列举属于棒状杆菌（Corynebacterium）属、短杆菌（Brevibacterium）属、节细菌（Arthrobacter）属、分枝杆菌（Mycobacterium）属、细杆菌（Microbacterium）属、微球菌（Micrococcus）属的细菌。

作为短杆菌属细菌，使用黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）、乳糖发酵短杆菌（Brevibacterium lactofermentum）和谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）等。

另外，黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌和谷氨酸棒杆菌相互的亲缘关系非常近，性质也类似，在现在的分类学中有时也被分类为同一个种。

作为特别优选的棒状杆菌亲株的具体例子可列举，黄色短杆菌MJ-233（FERM BP-1497）、同MJ-233AB-41（FERM BP-1498）、谷氨酸棒杆菌ATCC31831、乳糖发酵短杆菌ATCC13869等。

另外，由于现在黄色短杆菌有时也被分类为谷氨酸棒杆菌（Lielbl,W.,et al.,International Journal of Systematic Bacteriology,1991,vol.41,p255-260），所以本发明中，黄色短杆菌MJ-233株及其变异株MJ-233AB-41株分别与谷氨酸棒杆菌MJ-233株及MJ-233AB-41株是相同的株。

黄色短杆菌MJ-233于1975年4月28日在通商产业省工业技术院微生物工业技术研究所（现独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心）（〒305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6）以受托番号FERM P-3068寄托保藏，1981年5月1日基于布达佩斯条约移交国际寄托保藏，以FERM BP-1497的受托番号寄托保藏。

作为厌氧螺菌（Anaerobiospirillum）属细菌，使用产琥珀酸厌氧螺菌（Anaerobiospirillum succiniciproducens）等。

作为放线杆菌（Actinobacillus）属细菌，使用产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）等。

丝状真菌可列举属于曲霉（Aspergillus）属、青霉（Penicillium）属、根霉（Rhizopus）属等的微生物。

作为曲霉属微生物，使用黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）等。

作为青霉属微生物，使用产黄青霉（Penicillium chrysogenum）、简青霉（Penicillium simplicissimum）等。

作为根霉属微生物，使用米根霉（Rhizopus oryzae）等。

酵母菌可列举属于酵母属（Saccharomyces）、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces）、念珠菌属（Candida）、毕赤酵母属（Pichia）、克鲁维酵母菌属（Kluyveromyces）、接合酵母属（Zygosaccharomyces）等的微生物。

作为酵母属（Saccharomyces）微生物，使用酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、葡萄汁酵母（S.uvarum）、贝酵母（S.bayanus）等。

作为裂殖酵母属（Schizosaccharomyces）微生物，使用粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）等。

作为念珠菌属（Candida）微生物，使用白念珠菌（Candida albicans）、索诺拉念珠菌（C.sonorensis）、光滑念珠菌（C.glabrata）等。

作为毕赤酵母属（Pichia）微生物，使用毕赤酵母（Pichia pastoris）、树干毕赤酵母（Pichia Stipitis）等。

作为克鲁维酵母菌属（Kluyveromyces）微生物，使用乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）、马克斯克鲁维酵母（K.marxianus）、耐热克鲁维酵母（K.thermotolerans）等。

作为接合酵母属（Zygosaccharomyces）微生物，使用拜耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、鲁氏酵母（Z.rouxii）等。

该琥珀酸生产能力可以是本发明的方法中所使用的微生物的野生株所具有的性质，也可以是通过育种赋予的性质。

通过育种赋予琥珀酸生产能力的方法没有特别限制，具体来说可使用通过UV照射或NTG处理等通常的变异处理而得到变异株的方法、通过细胞融合或基因重组法等遗传性方法得到诱导重组体的方法等迄今微生物育种中采用的方法。

上述重组体可使用强化琥珀酸合成酶基因的表达或弱化琥珀酸分解酶基因和副产物合成基因的表达等公知的方法得到。使用本发明方法的重组体可以施加单独的变异，也可以施加2种或3种以上的变异。具体地可列举例如，被变异为乳酸脱氢酶活性比非变异株降低的微生物等。

被变异为丙酮酸羧化酶（以下也称为“PC”或“pc”）活性比非变异株增强的微生物，例如，可以与日本专利特开平11-196888号公报中记载的方法同样地，通过用质粒使pc基因在宿主微生物中高表达来构筑。此外，可以通过同源重组组装于染色体上，也可以通过启动子取代来增强pc基因的表达（日本专利特开2008-259451号公报）。转化可通过例如电脉冲法（Res.Microbiol.,Vol.144,p.181-185,1993）等进行。

所谓“PC活性增强”是指PC活性相对于野生株或亲株等非变异株，每单位重量菌体优选增加1.5倍以上，更优选增加3.0倍以上。PC活性的增强可通过公知的方法，例如，按J.Bacteriol.,158,55-62,(1984)中记载的方法测定PC活性来确认。作为pc基因的具体的导入方法，使用日本专利特开2008-259451号中记载的方法。

此外，变异为乳酸脱氢酶（以下有时称作“LDH”）活性比非变异株降低的微生物，例如，可以通过日本专利特开平11-206385号公报中记载的基于同源重组的方法，或通过使用sacB基因的方法（Schafer,A.et al.Gene 145(1994)69-73）破坏染色体上的LDH基因来构筑。另外，所谓“LDH活性降低”是指与非变异株比较，LDH活性下降。LDH活性完全消失也可以。LDH活性的降低可通过公知的方法（L..Kanarek,et al.,J.Biol.Chem.239,4202(1964)等）测定LDH活性来确认。

进一步，本发明的制造方法中所使用的微生物，除了上述PC活性增强和/或LDH活性降低，还可以是变异为从醋酸激酶（以下也称为“ACK”）、磷酸转乙酰酶（以下也称为“PTA”）、丙酮酸氧化酶（以下也称为“POXB”）和辅酶A转移酶（以下也称为“CTF”）组成的群组中选出的1种以上的酶活性降低的微生物。

虽然可以将PTA和ACK任一方的活性降低，但为了有效降低醋酸副产物的产生，优选降低二者的活性。

所谓“PTA活性”是指，对磷酸向乙酰辅酶A转移生成乙酰磷酸的反应进行催化的活性。所谓“变异为PTA活性降低”是指，PTA的活性比非变异株，例如野生株降低。PTA活性与非变异株比较，优选每单位重量菌体降低至30%以下，更优选降低至10%以下。此外，PTA活性完全消失也可以。PTA活性的降低可通过例如，Klotzsch,H.R.,Meth Enzymol.12,381-386(1969)等记载的方法测定PTA活性来确认。

所谓“ACK活性”是指，对由乙酰磷酸和ADP生成醋酸的反应进行催化的活性。

所谓“变异为ACK活性降低”是指，ACK的活性比非变异株，例如野生株降低。ACK活性与非变异株比较，优选每单位重量菌体降低至30%以下，更优选降低至10%以下。此外，ACK活性完全消失也可以。ACK活性的降低可通过Ramponi的方法（Ramponi G.,Meth.Enzymol.42,409-426(1975)）测定ACK活性来确认。谷氨酸棒杆菌（包括被分类到黄色短杆菌的菌）中，如Microbiology.1999 Feb;145(Pt 2):503-13中记载的那样，由于PTA和ACK两种酶被pta-ack操纵子（GenBank Accession No.X89084）编码，所以破坏pta基因时，可以降低PTA和ACK两种酶的活性。

降低PTA和ACK的活性可以通过公知的方法，例如，利用同源重组的方法或按照使用sacB基因的方法（Schafer,A.et al.Gene 145(1994)69-73）破坏它们的基因来进行。具体地可以按照日本专利特开2006-000091号公报中公开的方法来进行。作为pta基因和ack基因，除了上述具有GenBank Accession No.X89084碱基序列的基因以外，还可以使用具有宿主染色体上的pta基因和ack基因发生同源重组程度的同源性的基因。此处，所谓发生同源重组程度的同源性是指，优选80%以上，更优选90%以上，特别优选95%以上。此外，如果是能与上述基因在严格条件下杂交的DNA，就可以发生同源重组。

所谓“POXB活性”是指对由丙酮酸和水生成醋酸的反应进行催化的活性。所谓“变异为POXB活性降低”是指，POXB的活性比非变异株，例如野生株低。POXB活性与非变异株比较，优选每单位重量菌体降低至30%以下，更优选降低至10%以下。“降低”也包括活性完全消失的情况。POXB活性的降低可通过Chang Y.,et al.,J.Bacteriol.151,1279-1289（1982）等中记载的方法测定活性来确认。

POXB的活性降低，可以通过公知的方法，例如，利用同源重组的方法或按照使用sacB基因的方法（Schafer,A.et al.Gene 145(1994)69-73）等破坏poxB基因来进行。具体地可以按照WO2005/113745号公报等公开的方法来进行。作为poxB基因，可举出例如具有GenBank Accession No.Cgl2610（GenBank Accession No.BA000036的第2776766-2778505号的互补链）的碱基序列的基因，但具有宿主染色体DNA上的poxB基因发生同源重组程度的同源性也可以，因此也可以使用该序列的相同基因。此处，所谓发生同源重组程度的同源性是指，优选80%以上，更优选90%以上，特别优选95%以上。此外，如果是能与上述基因在严格条件下杂交的DNA，就可以发生同源重组。

所谓“CTF活性”是指对将乙酰辅酶A的辅酶A向其他物质转移而生成醋酸的反应进行催化的活性。所谓“变异为CTF活性降低”是指，CTF的活性比非变异株，例如野生株降低。CTF活性与非变异株比较，优选每单位重量菌体降低至30%以下，更优选降低至10%以下。“降低”也包括活性完全消失情况。CTF活性的降低可通过［7］一种含琥珀酸聚合物的制造方法，包括根据［1］～［6］的任一项所述的方法制造琥珀酸的工序，和使用所得到的琥珀酸进行聚合反应的工序。

sion No.BA000036的第2729376-2730917号的互补链）的碱基序列的基因，但具有宿主染色体DNA上的Ctf基因发生同源重组程度的同源性也可以，因此也可以使用该序列的相同基因。此处，所谓发生同源重组程度的同源性是指，优选80%以上，更优选90%以上，特别优选95%以上。此外，如果是能与上述基因在严格条件下杂交的DNA，就可以发生同源重组。

此外，本发明的制造方法中所使用的微生物，除了上述PC活性增强或PC活性增强且LDH活性降低以外，还可以组合上述变异中的2种以上变异所得到的微生物。作为理想的微生物，可列举例如日本专利特开2008-259451号公报等中记载的黄色短杆菌MJ233/PC-4/ΔLDH株、国际公开WO2009/065777号小册子、国际公开WO2009/065778号小册子、国际公开WO2009/065779号小册子、国际公开WO2009/065780号小册子、国际公开WO2010/003728号小册子等中记载的组合了破坏编码乙醇脱氢酶的ADH1和ADH2基因、破坏编码甘油三磷酸脱氢酶的GPD1基因、增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性、增强苹果酸脱氢酶活性、增强富马酸酶活性、增强富马酸还原酶活性、增强苹果酸转运体活性的酵母菌株，例如SUC-200（MATA ura3-52 leu2-112 trp1-289 adh1::lox adh2::lox gpd1::Kanlox,overexpressing PCKa,MDH3,FUMR,FRDg and SpMAE1）等。

＜培养＞

本发明中，所谓培养主要是指，令琥珀酸制造方法中所使用的微生物增殖而制备微生物菌体的工序。可以省略培养工序，也可以将在寒天培养基等固体培养基上斜面培养之物直接用于反应，此外，还可以将培养工序重复数次。

本发明中，将主要制造琥珀酸的工序称为“琥珀酸生产反应”或“反应”，将制备直接供应琥珀酸生产反应的菌体的培养称为“本培养”，将制备供应该本培养的菌体的培养称为“种培养”。

培养所使用的培养基，可以使用上述微生物的培养中所使用的通常的培养基。可以使用例如向硫酸铵、磷酸钾、硫酸镁等无机盐构成的组合中添加肉类提取物、酵母提取物、蛋白胨等天然营养源的一般的培养基。

本反应中使用的令上述微生物增殖而得到菌体的培养条件不受限制，但通常，如果是棒状杆菌，只要是生长最适温度就无特别限制，但通常为25℃以上，另一方面，通常为35℃以下，优选32℃以下，特别优选30℃以下。培养时，通气、搅拌同时供氧。生长最适温度是指琥珀酸生产所使用的条件中生长速度最快的温度。

培养时间只要是得到规定量的菌体的时间就没有特别限制，通常在6小时以上、96小时以下。

此外，作为更适合制造琥珀酸的菌体制备方法，还可以使用日本专利特开2008-259451号公报中记载的短时间内重复交替碳源的枯竭和充足来进行培养的方法。

培养后的菌体，可以将含微生物的培养液直接用于琥珀酸生产反应，也可以将菌体通过离心分离、膜分离等回收后再用于反应。作为本发明的制造方法所使用的微生物，还可以使用该菌体的处理物。作为菌体的处理物，可列举例如，将按上述方法培养、收集的菌体用丙烯酰胺、卡拉胶等固定的固定化菌体、将菌体破碎后的破碎物、该离心分离的上清液或将该上清液通过硫酸铵处理等部分纯化后的部分。

＜培养所使用的糖＞

培养中使用普通的糖。培养所使用的糖，只要是上述微生物能同化吸收并生产琥珀酸的糖就没有特别限制，通常使用半乳糖、乳糖、葡萄糖、果糖、甘油、蔗糖、蔗糖、淀粉或纤维素等碳水化合物，甘油、甘露醇、木糖醇或核糖醇等多元醇等发酵性糖类物质，其中优选葡萄糖、蔗糖、果糖或甘油，特别优选选葡萄糖或蔗糖。

此外，也使用含有上述发酵性糖类物质的淀粉糖化液或糖蜜等，具体地优选从甘蔗、甜菜或糖枫等植物中榨取的糖液。

这些糖可以单独或组合使用。上述糖的使用浓度没有特别限制，在不阻碍琥珀酸的生产的范围内尽可能提高是有利的，相对于反应液，通常在5%（W/V）以上，优选在10%（W/V）以上，另一方面，通常在30%（W/V）以下，优选在20%（W/V）以下。此外，也可以应对随着反应进行的上述糖的减少，进行糖的追加添加。

＜琥珀酸生产反应＞

本发明的琥珀酸生产反应的特征在于，在令具有琥珀酸产生能力的微生物和糖反应的琥珀酸的制造方法中，氧移动速度相对于琥珀酸生产速度之比（mmol-O₂/mol-SA）在0.1以上、240以下，反应中的微生物的倍增时间在40小时以上。

＜氧移动速度＞

本发明中的氧移动速度，只要后述氧移动速度相对于琥珀酸生产速度之比在上述范围之内就没有特别限制，也可以是不向反应槽供给氧的厌氧气氛（氧移动速度为0的条件）。此处，不向反应槽供给氧的厌氧气氛（氧移动速度为0的条件）可以通过例如，将容器密闭而在不通气的条件下反应、供给氮气等惰性气体使其反应，或通入含有二氧化碳气体的惰性气体等方法获得，但存在琥珀酸收率或琥珀酸生产速度低下、丙酮酸等副产物增加造成的琥珀酸纯化成本增加，以及为了实现氧移动速度为0而将反应槽用氮或不含氧的惰性气体等置换而使成本增加等问题。

另一方面，如果氧移动速度过高，也会产生琥珀酸的糖消费碳收率低下或琥珀酸生产速度低下、副产物醋酸的产量增加造成的琥珀酸纯化成本增加，还有为了实现高氧移动速度而将搅拌数设定得高和/或通气速度设定得高所带来的动力成本增加等问题，所以氧移动速度通常为0.01[mmol O₂/L/hr]以上，优选为0.02[mmol O₂/L/hr]以上，更优选为0.05[mmol O₂/L/hr]以上，另一方面，通常为5[mmol O₂/L/hr]以下，优选为3[mmol O₂/L/hr]，更优选为2.5[mmol O₂/L/hr]以下，特别优选为2[mmol O₂/L/hr]以下。

本发明中，反应液中的氧移动速度可以通过将溶液用氮气置换，降低溶解氧的浓度后，进行通气或搅拌，从溶解氧浓度的变化求出的方法（Wise W.S.J.Gen.Microbiol.,1951,vol.5,pp.167-177）等测定。

本发明中，向反应槽供给氧的方法没有特别的限制，可以使用例如，通气的方法或向液体中溶解氧的方法。优选通气的方法。也可以适当进行反应液的搅拌而调节至上述氧移动速度的范围内。为了调节至上述氧移动速度的范围内，可以仅通过反应液的搅拌使氧溶解，也可以进行反应液的搅拌和通气，也可以只进行通气使氧溶解。此外，还可以设置用于有效地产生基于搅拌的乱流的挡板。

本发明中的通气方法没有特别限制，可举出令含氧气体与反应液或进料液接触的方法。为了调节至上述氧移动速度的范围内，可以直接使用纯氧或空气等含氧气体，也可以混合使用。此外，纯氧或空气等含氧气体还可以与氮气或二氧化碳等气体任意混合。此外，还可以将用过一次的气体回收，再度使用。为了调节至上述氧移动速度的范围内，可以将含氧气体用能调节通气量的压缩机，通过孔喷射器（orifice sparger）、喷嘴喷射器（nozzle sparger）或环喷射器（ring sparger）等喷射器（通气管），以及多孔管等向反应槽的气相部通入气体，也可以向反应液中直接通气。此外，为了调节至上述氧移动速度的范围内，可以通过将氧气溶解于反应中进料的进料液中，再供给该液体而间接地添加。也可以在向反应液或进料液等通气时，将气体从配管等直接向液体中流通，可以使用喷射器等气流扩散装置，也可以使用膜等。为了调节至上述氧移动速度的范围内，可以测定通入气体或排除气体的流量、压力或组成，反应液或进料液中的氧浓度或氧化还原电位或进料液的流量等中的任一种，同时调节任一种。

＜琥珀酸生产速度＞

本发明中，所谓琥珀酸生产速度（mmol/L/hr）是指每1L在1小时中生产的琥珀酸的量，如果过小则有需要长反应时间造成的成本增加或琥珀酸以外的副产物的产量增加造成的琥珀酸收率低下的倾向，因此通常为1mmol/L/hr以上，优选5mmol/L/hr以上。另一方面，虽然不被上限所限制，但通常为1000mmol/L/hr以下，优选700mmol/L/hr以下，更优选300mmol/L/hr以下。

＜氧移动速度相对于琥珀酸生产速度之比＞

本发明中，氧移动速度相对于琥珀酸生产速度之比（mmol-O₂/mol-SA）如果过小，则带来如下问题：较之于适合琥珀酸生产的氧供给量减小，琥珀酸收率下降或琥珀酸生产速度下降，副产物丙酮酸的产量增加造成的琥珀酸纯化成本增加，为了实现非常小的氧移动速度条件的要求而将反应层用氮置换等带来的成本增加等，因此在0.1以上，优选0.2以上，更优选0.3以上。另一方面，如果这个比过大，则产生如下问题：较之于适合琥珀酸生产的氧供给量增大，琥珀酸收率下降或琥珀酸生产速度下降，此外，副产物醋酸的产量增加造成的琥珀酸纯化成本增加，氧移动速度增大引起的伴随着菌体增殖的副产物增加，琥珀酸生产速度减小带来的反应时间增加所造成的成本的增加等，因此在240以下，优选200以下，更优选150以下，进一步优选100以下，特别优选50以下。

将氧移动速度相对于琥珀酸生产速度之比作为指标的原因是如下考虑的。通常，琥珀酸生产反应中，为了使琥珀酸收率最大，理论上较好的是使菌体的增殖速度无限小，不供给氧的厌氧环境最佳。但是，本发明的结果显示出，在厌氧环境下的琥珀酸生产反应中，丙酮酸等副产物量变大、琥珀酸收率降低，通过供给微量的氧气，副产物量降低、琥珀酸收率提高，进而琥珀酸生产速度提高。这样，我们判断，在伴随着副产物的产生的琥珀酸生产中，不是在只考虑了琥珀酸生产的理论上优选的厌氧条件下，而是在供给微量氧气的条件下，琥珀酸生产能力得以提高。这意味着，琥珀酸生产反应中，必须控制合适的氧供给。但是仅将氧移动速度作为指标设定某个范围的话，例如，如果在琥珀酸生产速度小的反应时供给了适合高琥珀酸生产速度的氧量，琥珀酸生产变成了好氧状态，导致上述那样的醋酸等副产物增加，所以不理想，因此认为将表示对应于琥珀酸生产速度的氧量的氧移动速度相对于琥珀酸生产速度之比作为指标是优选的。此处，我们认为本发明中，作为主要显示相对于具有琥珀酸生产能力的微生物的琥珀酸代谢需要多少氧量的指标，控制氧移动速度相对于琥珀酸生产速度之比的值是重要的。

该氧移动速度相对于琥珀酸生产速度之比，尤其是可以成为工业上的琥珀酸生产反应的条件设定时的优选指标。工业生产时，琥珀酸生产速度可以根据原料成本或制造设备成本来选择、变化优选的速度。该指标在这样的条件的变更中可以容易地对应，是有用的。

＜倍增时间＞

本发明中，所谓倍增时间是指，上述微生物的菌体数增加到2倍所消耗的时间，以某2点的菌体浓度（OD）或干燥菌体重量的值为变量，用以下计算式（1）表示。

[数1]

另外，T2和T1表示某2点的取样时间，X1和X2表示这2点对应的菌体浓度或干燥菌体重量的值。

本发明中，微生物的倍增时间如果过小，由于糖被菌体增殖所利用，琥珀酸生产量减少，伴随增殖而产生的副产物增加导致琥珀酸纯化过程中的成本增加，因此在40小时以上，优选50小时以上，更优选100小时以上。另一方面，上限没有特别限定，但倍增时间过大的话，由于作为催化剂的菌体死亡，有琥珀酸生产减少的倾向，因此通常在500小时以下，优选在300小时以下，更优选在200小时以下。

作为控制倍增时间的要素，没有特别限制，可列举氧供给量或温度等反应条件、反应液的组成、微生物的基因变异等。例如，通过将氧的供给量控制在极微量或0，将温度控制为偏离生长最适温度的范围的值和/或控制反应培养基组成的氮源或磷源等培养基组成的一部分等，可以延长倍增时间。此外，涉及基因变异，通过令棒状杆菌中与乳酸生产相关联的LDH基因缺损，倍增时间延长，同样地，通过令酵母菌中与乙醇生产相关联的基因缺损（作为一个例子，ADH1基因（Mol Cell Biol.1986,vol.6,pp.70-79），PDC1、PDC5基因的二重缺损或PDC1、PDC5、PDC6基因的三重缺损（Hohmann,J Bacteriol.1991,vol.173,pp.7963-7969））等，倍增时间延长。通过这些基因的缺损，ATP的获得效率变差是原因之一。有时只控制这些中的一个参数，随着其他参数变化，倍增时间变化，有时通过组合多个这些参数可以控制倍增时间。上述列举的参数的具体控制方法和适用范围等如各项目的记载。

此外，文献1（Shinfuku et al.,Microbial Cell Factories 2009,8:43）、文献2（国际公开WO2010/003728号小册子）的琥珀酸生产反应中的倍增时间用上述计算式（1）同样地计算，文献1记载的倍增时间为27.4小时（从文献1的Additional file2的图读取OD，从培养开始后第9小时的OD（12.2）和第24小时的OD（17）计算出来）和7.3小时（从文献1的Additional file3的图读取OD，从培养开始后第9小时的OD（6.5）和第25小时的OD（26）计算出来），文献2的倍增时间为30小时（根据文献2的Example1、2的记载，从培养开始时的干燥菌体重量1g biomass dry weight和第90小时的干燥菌体重量8gbiomass dry weight计算出来），可知其都比40小时短。

＜相对琥珀酸的氧移动速度减少率＞

本发明中，相对琥珀酸的氧移动速度减少率（%/g/L）表示，每1L反应液生产1g琥珀酸过程中减少的氧移动速度的比例，用以下计算式（2）的公式表示。

[数2]

另外，OTR_t1和OTR_t2分别表示反应开始后t1小时和之后的t2小时时的氧移动速度（mmol-O₂/L/hr），SA_t1和SA_t2分别表示t1小时和t2小时时的反应液的琥珀酸浓度（g/L）。此外，伴随反应液的流出和流入的连续反应中，例如，SA_t1可以作为“t1小时前被提取的反应液和反应槽内的反应液中所含的琥珀酸量的总和（g）”的相对于“反应槽内的反应液量（L）”的值来计算。

相对琥珀酸的氧移动速度减少率（%/g/L）在反应中的任意时间，通常在1.2（%/g/L）以下，更优选1.1（%/g/L）以下。没有特别的下限，也可是0。通过使相对琥珀酸的氧移动速度减少率在1.2（%/g/L）以下，可以通过抑制氧移动速度的降低来保证最适合琥珀酸生产的氧量，可以抑制琥珀酸收率的降低和琥珀酸生产速度的降低，此外，可以通过抑制副产物丙酮酸的产量降低琥珀酸纯化成本，因此是理想的。

本发明中，仅控制琥珀酸生产速度、氧移动速度和微生物的倍增时间的各单独的参数，不能得到本发明的效果。例如，如果仅通过完全除去氧来延长微生物的倍增时间，则乳酸和醋酸等杂质大量产生，出现琥珀酸生产速度减少的问题。以增强生产琥珀酸的反应为目的，增强氧移动速度的话，伴随着氧移动速度的增强，微生物增殖活性化，作为琥珀酸原料的大部分糖被用于微生物的增殖，因此产生琥珀酸产量减少的问题。本发明的效果是为了提高琥珀酸收率和生产速度，通过控制琥珀酸生产速度、氧移动速度和微生物的倍增时间等多个参数才达到的。

＜琥珀酸生产反应的温度和时间＞

琥珀酸生产反应的温度没有特别限定，但通常比使用的上述微生物的生长最适温度高2℃以上、优选高7℃以上。另一方面，通常为比使用的上述微生物的生长最适温度高20℃的温度以下、优选高15℃的温度以下。具体地，如果是棒状杆菌，通常在37℃以上，优选39℃以上，另一方面通常在45℃以下，优选43℃以下，特别优选41℃以下。虽然不需要琥珀酸的生产反应过程中始终为37～45℃，但理想的是包括种培养在内的总反应时间的50％以上、优选80％以上的时间在上述温度范围内。

反应时间没有特别限定，但通常在1小时以上，优选在3小时以上，另一方面，通常在168小时以下，优选在72小时以下。

＜琥珀酸生产反应所使用的微生物的制备方法＞

本发明的琥珀酸制造方法中，可以通过令上述微生物与糖反应来制造琥珀酸，也可以通过令预先在上述培养中增殖得到的微生物在含糖的反应液中与糖反应来制造琥珀酸。尤其是后者的情况下，主要是在增殖微生物的工序和制造琥珀酸的工序中可选择各自的最适条件，添加的糖可以有效地用于琥珀酸的制造，因此是有用的。

琥珀酸生产反应中使用的上述微生物的菌体量，没有特别规定，但作为湿菌体的重量，通常为1g/L以上，优选10g/L以上，更优选20g/L以上，另一方面，通常为700g/L以下，优选500g/L以下，进一步优选400g/L以下。

＜琥珀酸生产反应中使用的糖＞

琥珀酸生产反应中使用的糖与上述培养中使用的糖相同。

琥珀酸制造中糖的使用浓度没有特别限定，在不阻碍琥珀酸生成的范围内尽可能地提高是有利的，通常为5.0%（W/V）以上，优选10%（W/V）以上，另一方面，通常为30%（W/V）以下，优选20%（W/V）以下。此外，也可以应对伴随着反应的进行的糖的减少，进行糖的追加添加。

＜反应液＞

本发明的琥珀酸生产反应中的反应液，只要是含有上述微生物、上述糖的水溶液就没有特别限制，例如可以是用于培养上述微生物的培养基，也可以是磷酸缓冲液等缓冲液。

反应液优选为含有氮源或无机盐等的水溶液。此处，作为氮源，只要是上述微生物同化生成琥珀酸等的氮源就没有特别限制，具体地可列举，铵盐、硝酸盐、尿素、大豆水解物、水解酪蛋白、蛋白胨、酵母提取物、肉提取物或玉米浆等各种有机或无机的氮化合物。作为无机盐可使用各种磷酸盐、硫酸盐、镁、钾、锰、铁或锌等金属盐。此外，根据需要添加生物素、泛酸、肌醇或烟酸等维生素类、核苷酸或氨基酸等生长促进因子。此外，为了抑制反应时的发泡，优选在反应液中适量添加市售的消泡剂。

反应液的pH优选根据所使用的上述微生物的种类，调节至最有效发挥其活性的范围内。具体地，使用棒状杆菌的情况下，通常在5以上，优选5.5以上，更优选6以上，特别优选7.1以上，另一方面，在10以下，优选9.5以下，更优选9.0以下。反应液的pH在反应中根据需要用碱性物质、碳酸盐或尿素等中和剂调节至上述范围内。具体地可通过添加碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸镁、氢氧化钠、氢氧化钙或氢氧化镁等来调节。

反应液中，除了上述微生物、上述糖、氮源或无机盐等之外，优选含有例如碳酸根离子、碳酸氢根离子或二氧化碳气体（碳酸气）。碳酸根离子或碳酸氢根离子可以由可作为中和剂使用的碳酸镁、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾等供给，但根据需要，也可以从碳酸、碳酸氢盐或它们的盐或二氧化碳气体供给。

作为碳酸盐或碳酸氢盐的具体例子，可列举例如，碳酸镁、碳酸铵、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢铵、碳酸氢钠或碳酸氢钾等。此外，碳酸根离子或碳酸氢根离子通常以1mM以上，优选2mM以上，进一步优选3mM以上的浓度添加。另一方面，通常以500mM以下，优选300mM以下，进一步优选200mM以下的浓度添加。如果含有二氧化碳气体，使每1L溶液通常含有50mg以上，优选100mg以上，进一步优选150mg以上的二氧化碳气体。另一方面，使其含有通常25g以下，优选15g以下，进一步优选10g以下的二氧化碳气体。

＜琥珀酸生产反应中的其他反应条件＞

本发明的琥珀酸制造方法中，除了上述给出的项目以外，还可以通过测定通气气体或排气气体的流量、压力或组成、反应液或进料液中的氧浓度或氧化还原电位，或进料液的流量等中的任一项，同时调节任一项来进行控制。对应于使用的微生物、后述反应槽或氧供给方法等的种类，调节至最有效发挥琥珀酸制造效率的范围内。具体地没有特别限制，如果在缸式发酵槽（Jar fermenter）的反应液上面进行通气，搅拌速度通常在50rpm以上2000rpm以下，每单位液量的通气量通常在0.001vvm以上10vvm以下，通气量的空气含量通常在0.1％以上100％以下。

本发明的制造方法没有特别限制，可适用间歇反应、半间歇反应或连续反应。尤其是在添加上述中和剂的反应或连续反应的情况下，反应环境（反应液量等）逐次变化且其变化量多，氧移动速度相对于琥珀酸生产速度之比常常偏离于最适条件，但本发明的方法由于能够将氧移动速度相对于琥珀酸生产速度之比作为指标进行逐次调节，故而是理想的。

＜工业规模下的琥珀酸生产反应＞

基于工业规模下的发酵的琥珀酸的制造中，可以适用以往将乳酸、醋酸或谷氨酸等在工业规模下发酵时采用的方法（参考生物反应工学（第3版），山根恒夫著，产业图书，p266～276）。

在工业规模下的发酵中，微生物反应槽的类型和氧或二氧化碳等气体的导入方法是重要的。

本发明中，微生物反应槽的类型没有特别限制，可列举气泡搅拌型（向液体中导入气体，使用搅拌机促进气液接触提高吸收速度）、液面吸收型（从液面吸收气体）、液面吸收搅拌型（在液面吸收型上安装搅拌机，提高氧吸收速度）、外部吸收型（为了氧气吸收在外部设置其他装置循环反应液，或者使其被向反应中添加的液体吸收）、标准气泡塔型、引流管（draft tube）型（设置引流管，促进内部循环提高气体吸收速度。也可以从塔侧面附近导入气体，将外缘部作为上升流，中心部作为下降流）、引流管多孔板型（在引流管型上设置多孔板，促进气液接触提高吸收速度）、多段多孔板型或外循环气升（air-lift）型（在外部设置循环流路，导入气体）等。

作为气体导入方法，没有特别限制，可列举基于单孔喷嘴（nozzle）、多孔喷嘴、环喷射器（sparger）、多管（multi-pipe）、气液两相流喷嘴或液体喷射口（jet）的气泡卷吸式等。

本发明中，所谓工业反应规模，没有特别的限制，以反应槽的体积计通常为5m³，优选50m³以上，另一方面，通常在5000m³以下，优选3000m³以下。

本发明适于工业反应规模的理由可举出如下。

如果不通气，向反应液供给的氧只有反应槽的气相部，但在工业规模下，相对于反应槽，气相部比本实施例那样的小规模还要小，从反应槽容量有效化的角度出发是优选的。其结果是，为了维持适宜反应的氧移动速度的氧量变得不足，偏离了氧移动速度相对于琥珀酸生产速度之比的优选范围，但由于根据本发明的制造方法，可以通过通气控制等将该比控制在一定的范围内，从而提高琥珀酸收率，因此是有用的。

此外，工业反应中，虽然根据原料成本和制造设备成本变更了琥珀酸生产速度，但通过使用本发明的制造方法能够容易地设定最适反应条件。

＜后处理＞

通过以上的反应，琥珀酸在反应液中生成、累积。

作为琥珀酸制造过程中的副产物，具体地举例有，醋酸、乙醇、乳酸、丙酮酸或α-酮戊二酸等琥珀酸以外的柠檬酸循环代谢产物，α-氧代丁酸（α-ketovaline）等氨基酸前体，丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸等氨基酸，海藻糖等糖，甘油等醇，蛋白质等。

副产物的量没有特别限制，具体地，如果副产物是丙酮酸或醋酸，相对于琥珀酸，丙酮酸的重量比例（%）通常在5.5%以下，优选5.2%以下，相对于琥珀酸，醋酸的重量比例（%）没有特别限制，通常在15.8%以下，优选15.5%以下。

反应液（培养液）中累积的琥珀酸，可以按照常规方法从反应液中采集。例如，微生物转变后的反应液，在之后的纯化工序中考虑到操作性和效率性，适当地浓缩后，通过离心分离、过滤等除去菌体等固体物质。像这样得到作为主体含有琥珀酸和琥珀酸铵盐、琥珀酸镁盐等琥珀酸盐的溶液或水溶液。此处所谓“作为主体含有”的状态表示，该成分的重量相对于除去溶剂的总成分的重量，通常以50重量%以上，优选60重量％以上，更优选70重量％以上，特别优选90重量％以上含有的状态。

可以从该溶液中通过结晶化或柱色谱进行纯化等，采集琥珀酸。

＜得到的琥珀酸的用途＞

一般地，琥珀酸是从来自石油化学的原料中制造而得，用于多种多样的用途，对于这样的用途，从生物资源衍生的琥珀酸也能同样适宜地使用。例如可以作为1,4-丁二醇、2-吡咯烷、丁二酰亚胺、马来酸酐、衣康酸、天门冬氨酸、马来酸、富马酸、羟基丁二酰亚胺、马来酰亚胺、4-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、四氢呋喃、丙烯酸、琥珀酸二甲酯、琥珀酸二乙酯等琥珀酸酯、吡咯烷酮或N-甲基吡咯烷酮等琥珀酸衍生物的原料，作为聚酯、聚氨酯或聚酰胺等含琥珀酸的聚合物或制品等的原料，作为酸味剂、调味料、酿造药品或加工食品添加剂等食品添加剂，作为泡沫浴成分，作为植物生长抑制剂、除草剂、抗菌剂、杀虫剂或蚊子引诱剂等医药品和农药的合成原料和成分，作为口腔清洁剂或化妆品等的原料和成分，作为照片或印刷等使用的制品的原料和成分，作为高温熔接剂或耐酸铝处理表面粘合剂等粘合剂和密封胶原料和成分，作为粉末镍制造、钢铁研磨浴、金属加工洗涤溶剂或金属烧结用粘合剂等金属加工用的原料和成分，作为焊料或熔接用助焊剂的原料和成分，作为多孔氧化钛制造、勃姆石（boehmite）制造、光催化剂涂层剂或多孔陶瓷制造等的陶瓷或无机化合物等的制造助剂的原料和成分，作为洗涤剂等的原料和成分，作为漂白剂等的原料和成分，作为染色助剂等的原料和成分，作为电解质溶剂和电镀槽液等的原料和成分，作为除臭剂或空气清新剂等的原料和成分，作为生物体吸收性缝合线等生物体吸收性化合物原料，作为纤维制品的处理或柔顺等的原料和成分，作为溶剂或溶媒等的原料和成分，作为水溶性涂料溶剂的原料和成分，作为生物可降解树脂等的原料和成分，作为无臭密封剂等密封剂的原料和成分，作为对于钢铁制品、铜制品或合金制品的涂层、防冻、金属加工、高氯酸用铅、锅炉水处理用等的防腐蚀剂等的原料和成分，作为合成润滑剂、耐热性塑料用润滑剂或电触点用润滑剂等润滑剂的合成原料和成分，作为树脂或高分子材料等的除溶剂洗涤剂等的原料和成分，作为纤维工业或干洗等中使用的制品的原料和成分，作为油墨用溶剂、脱油墨剂、汽车用面漆涂层剂、绝缘涂料、粉体涂料、三维印刷用油墨、光固化型涂料、光固化型油墨组合物、纳米粒子油墨、喷墨用油墨、印刷网屏洗涤、有机半导体溶液、彩色滤光片制造用油墨、色粉（toner）、喹吖啶酮颜料制造、丁二酰丁二酸制造、染料中间体等、颜料、染料或油墨等的原料和成分，作为含氧型柴油机燃料等的原料和成分，作为水泥混合剂和处理剂等的原料和成分，作为发动机清洁剂等的原料和成分，作为石油精制溶剂等的原料和成分，作为支撑剂（proppant）组合物或析出滤饼除去等的石油和天然气采掘助剂等的原料和成分，作为天然气脱水溶剂等的天然气生产相关制品的原料和成分，作为低起尘性水泥地板材料或沥青铺设剂等的建材的原料和成分，作为油墨用溶剂或脱油墨剂等的原料和成分来使用。

[实施例]

以下通过实施例对本发明进行具体说明，但只要不超过本发明的主旨，就不被以下的例子所限定。

关于各分析项目，如以下测定。

＜氧移动速度的测定＞

氧移动速度的测定使用将溶液用氮置换使溶解的氧的浓度降低后，进行通气或搅拌，从溶解氧的浓度的变化求出的方法（Wise W.S.J.Gen.Microbiol.,1951,vol.5,pp.167-177）。具体地，在1L的缸式发酵槽中注入目标液量的水，通过通氮气并搅拌除去水中的溶解氧。向缸式发酵槽的气相部通入空气进行置换后，以100mL/min从液体的上面或下面通空气，同时以100rpm～500rpm进行搅拌，根据之后的溶解氧的浓度变化计算氧移动速度。此外，通过通入混合了空气和氮气的气体，进行更低的氧移动速度的测定。

＜琥珀酸、丙酮酸和醋酸的测定方法＞

反应液中所含的琥珀酸、丙酮酸和醋酸的分析，通过将反应液离心分离（15,000G，2分钟）处理，将得到的上清液供给液相色谱（LC）来进行。通过琥珀酸生产速度（mmol-SA/L/hr）除以测定的琥珀酸浓度的取样时间（hr）来计算。

＜倍增时间的测定方法＞

倍增时间以某2点的菌体浓度（OD）或干燥菌体重量的值为变量，按照下述计算式（1）求出。

[数3]

另外，T2和T1表示某2点的取样时间，X1和X2表示这2点对应的干燥菌体重量的值。

＜相对琥珀酸的氧移动速度减少率（%/g/L）的计算方法＞

相对琥珀酸的氧移动速度减少率（%/g/L）表示，每1L反应液生产1g琥珀酸过程中减少的氧移动速度的比例，用以下计算式（2）的公式表示。

[数4]

另外，OTR_t1和OTR_t2表示反应开始后t1小时和之后的t2小时时的氧移动速度（mmol-O₂/L/hr），SA_t1和SA_t2表示t1小时和t2小时时的反应液的琥珀酸浓度（g/L）。此外，伴随反应液的流出和流入的连续反应中，例如，SA_t1可以作为“t1小时前被提取的反应液和反应槽内的反应液中所含的琥珀酸量的总和（g）”的相对于“反应槽内的反应液量（L）”的值来计算。

[实施例1]

基于氧供给控制的琥珀酸生产

＜种培养＞

将100mL A培养基（尿素：4g，硫酸铵：14g，磷酸二氢钾：0.5g，磷酸氢钾0.5g，硫酸镁·七水合物：0.5g，硫酸亚铁·七水合物：20mg，硫酸锰·水合物：20mg，D-生物素：200μg，盐酸硫胺：200μg，酵母提取物：1g，酪蛋白氨基酸：1g和蒸馏水：1000mL）加入500mL锥形瓶，以121℃加热灭菌20分钟。将其冷却至室温后，将15mL经灭菌的A培养基加入200mL的锥形瓶，添加预先灭菌的50%葡萄糖水溶液600μL，接种MJ233/PC/ΔLDH株在30℃培养5.5小时。向上述500mL锥形瓶中添加100mLA培养基并灭菌的培养基中，添加预先灭菌的50%葡萄糖水溶液4mL后，将得到的培养液接种，在30℃培养20小时种培养，使O.D.（600nm）达到0.02。

＜本培养＞

将磷酸水溶液（85wt%）：6.68g，氯化钾：4.95g，硫酸铵：2.97g，硫酸镁·七水合物：1.48g，硫酸锰·五水合物：118.8mg，硫酸亚铁·七水合物：118.8mg，CSL（玉米浆）29.93g，10N氢氧化钾水溶液：11.08g，消泡剂（CE457：日本油脂制）：2.54g和蒸馏水共计1833mL的培养基加入5L的缸式发酵槽中，以121℃加热灭菌20分钟。冷却至室温后，添加15mL预先经过滤法灭菌的维生素溶液（D-生物素、盐酸硫胺各0.2g/L水溶液）、110mL预先灭菌的720g/L原料糖水溶液、100mL上述种培养的溶液。根据加热灭菌前后的重量，考虑到蒸发的液量来添加经灭菌的水，使总量为2500mL。将缸式发酵槽在30℃保温，用28%氨水保持pH为7.2，背压0.05MPa，通气为每分钟3L，搅拌为每分钟600转开始本培养。当溶解氧浓度降至几乎为0后，再次开始上升，达到1ppm时添加7g预先灭菌的720g/L原料糖，再次低至0。每次溶解氧浓度再度上升时用上述方法反复添加原料糖溶液，培养开始后持续19小时。

＜琥珀酸生产反应＞

将磷酸水溶液（85wt%）：5.2g，硫酸镁·七水合物：3.46g，硫酸锰·五水合物：138.2mg，硫酸亚铁·七水合物：138.2mg，10N氢氧化钾水溶液：9.14g和蒸馏水105mL以121℃加热灭菌20分钟后，考虑到经由加热灭菌的蒸发量，添加灭菌水得到320 mL的溶液。将20mL该溶液、88mL 720g/L原料糖水溶液、228.1mL灭菌水、448μL预先经过滤法灭菌的维生素溶液（D-生物素、盐酸硫胺各0.2g/L的水溶液）、135mL上述本培养液加入到1L的缸式发酵槽中。用Na中和剂（碳酸氢钠：113.5g，氢氧化钠：145.9g，灭菌水936.7g）保持pH为7.6，保温在39℃。

将按空气比氮气5:95的量比混合的气体按100mL/min在反应液上面通气，每分钟搅拌100圈。将经过20小时左右的时间点的氧移动速度相对于琥珀酸生产速度之比（mmol-O₂/mol-SA）、琥珀酸生产速度（mmol-SA/L/hr）、氧移动速度（mmol-O₂/L/hr）、琥珀酸的消费碳收率（C-mol%）、相对琥珀酸的氧移动速度减少率（%/g/L）丙酮酸比琥珀酸重量比例（%）和醋酸比琥珀酸重量比例（%）记载于表1。另外，虽然没有测定准确的倍增时间，但从实施例6、7、9的值推测可知其在40小时以上。

[实施例2]

除了通的混合气体的空气比氮气量的量比为10：90以外，其余与实施例1同样地进行，将上述项目的结果记载于表1。另外，虽然没有测定准确的倍增时间，但从实施例6、7、9的值推测可知其在40小时以上。

[实施例3]

除了通的混合气体的空气比氮气量的量比为14：86以外，其余与实施例1同样地进行，将上述项目的结果记载于表1。另外，虽然没有测定准确的倍增时间，但从实施例6、7、9的值推测可知其在40小时以上。

[实施例4]

除了通的混合气体的空气比氮气量的量比为25：75以外，其余与实施例1同样地进行，将上述项目的结果记载于表1。另外，虽然没有测定准确的倍增时间，但从实施例6、7、9的值推测可知其在40小时以上。

[实施例5]

除了通的混合气体的空气比氮气量的量比为50：50以外，其余与实施例1同样地进行，将上述项目的结果记载于表1。另外，虽然没有测定准确的倍增时间，但从实施例6、7、9的值推测可知其在40小时以上。

[实施例6]

除了通的混合气体的空气比氮气量的量比为100：0以及按照上式计算倍增时间以外，其余与实施例1同样地进行，将倍增时间和上述项目的结果记载于表1。

[实施例7]

除了每分钟搅拌200转以外，其余与实施例6同样地进行，将上述项目的结果记载于表1。

[实施例8]

除了每分钟搅拌400转以外，其余与实施例6同样地进行，将上述项目的结果记载于表1。另外，虽然没有测定准确的倍增时间，但从实施例6、7、9的值推测可知其在40小时以上。

[实施例9]

除了每分钟搅拌500转以外，其余与实施例6同样地进行，将上述项目的结果记载于表1。

[比较例1]

除了将缸式发酵槽的气相部用氮气置换后，令所通的混合气体的空气比氮气量的量比为0：100，在反应液上面通气，每分钟搅拌200转以外，其余与实施例1同样地进行，将上述项目的结果记载于表1。另外，虽然没有测定准确的倍增时间，但可推测其在40小时以上。

[比较例1]

除了在反应液下面通气，令所通的混合气体的空气比氮气量的量比为100：0，每分钟搅拌400转进行反应以外，其余与实施例1同样地进行，将上述项目的结果记载于表1。另外，虽然没有测定准确的倍增时间，但可推测其在40小时以上。

[表1]

[实施例10]

氧气供给（相对琥珀酸的氧移动速度减少率）控制效果

实施例10中，由于伴随着上述中和剂的添加液量增加而引起氧移动速度的变化，通过从反应层除去与添加的中和剂同量的反应液来保持反应液量一定，消除液量变化对氧移动速度造成的影响，除此之外，其余与实施例8同样地进行。将经过20小时左右的时间点的氧移动速度（mmol-O₂/L/hr）、氧移动速度维持率（%）、琥珀酸生产速度（mmol-SA/L/hr）、相对琥珀酸的氧移动速度减少率（%/g/L）、琥珀酸浓度（g/L）、氧移动速度相对于琥珀酸生产速度之比（mmol-O₂/mol-SA）及倍增时间记载于表2。

另外，所谓氧移动速度维持率（%）是指经过20小时后的氧移动速度相对于0小时的氧移动速度之比。

除了不进行通气以外，其余与实施例10同样地进行。反应结果记载于表2。

[表2]

结果显示出通过通气控制氧移动速度，具体地说控制氧移动速度使每1L反应液生产1g琥珀酸时氧移动速度不下降1.2%以上是优选的。

基于以上可判断，控制反应层中的氧气供给和琥珀酸生产量的结果是，较之于比较例的厌氧反应及微好氧反应，得到了更高的琥珀酸收率或琥珀酸生产速度。

[产业上的可利用性]

根据本发明的方法，与以往相比可以提高琥珀酸收率或琥珀酸生产速度，可以减少以往厌氧条件下生成的副产物（丙酮酸等）。

进而，根据本发明，可以提供不必为了营造完全的厌氧环境而进行设备增强或反应控制，可应对工业规模的琥珀酸制造方法。得到的琥珀酸可用于食品添加剂、医药品、化妆品、工业原料等。此外，可以通过将得到的琥珀酸作为原料进行聚合反应来制造含有琥珀酸的聚合物。

Claims

1.一种琥珀酸的制造方法，其特征在于，是使具有琥珀酸产生能力的微生物与糖反应的琥珀酸制造方法，

所述微生物属于谷氨棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，

进一步地，所述微生物是被变异为乳酸脱氢酶活性低于非变异株的微生物，且被变异为丙酮酸羧化酶活性强于非变异株的微生物，

氧移动速度在0.01mmol-O₂/L/hr以上、5mmol-O₂/L/hr以下，

琥珀酸生产速度在5mmol-SA/L/hr以上，

氧移动速度相对于琥珀酸生产速度的比在0.1mmol-O₂/mol-SA以上、240mmol-O₂/mol-SA以下，

反应中微生物的倍增时间在40小时以上，

且相对琥珀酸的氧移动速度减少率在1.2％/g/L以下。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该微生物是被变异为从醋酸激酶、磷酸转乙酰酶、丙酮酸氧化酶和辅酶A转移酶组成的群组中选出的1种以上的酶活性低于非变异株的微生物。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该微生物是破坏编码乙醇脱氢酶的ADH1和ADH2基因、或破坏编码甘油三磷酸脱氢酶的GPD1基因的微生物。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该微生物是被变异为磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性、苹果酸脱氢酶活性、富马酸酶活性、富马酸还原酶活性、或苹果酸转运体活性比非变异株增强的微生物。

5.根据权利要求1所述的琥珀酸的制造方法，其特征在于，反应中的pH为5以上、10以下。

6.一种含琥珀酸的聚合物的制造方法，包括按照权利要求1～5的任一项所述的方法制造琥珀酸的工序，和使用所得到的琥珀酸进行聚合反应的工序。

7.一种琥珀酸衍生物的制造方法，包括按照权利要求1～5的任一项所述的方法制造琥珀酸的工序，和以所得到的琥珀酸为原料合成琥珀酸衍生物的工序。