CN101918574A

CN101918574A - 大规模的微生物培养法

Info

Publication number: CN101918574A
Application number: CN2007801019569A
Authority: CN
Inventors: 劳伦·塞格伊尔哈; 卡-耶·桑; 乔治·班尼特; 艾琳·马丁内斯
Original assignee: Roquette Freres SA; William Marsh Rice University
Current assignee: William Marsh Rice University
Priority date: 2007-12-28
Filing date: 2007-12-28
Publication date: 2010-12-15
Also published as: BRPI0722315A2; US20100317086A1; CA2709515A1; EP2225383A1; US8486686B2; KR20100109902A; JP2011507541A; WO2009083756A1

Abstract

本发明涉及一种新型培养法用于高水平地产生一种代谢产物，例如琥珀酸。该培养法使用没有pH调节的富氧培养物以增加生物质、在贫氧条件(具有低于5％氧分压)下进行驯化，并且在氧剥夺条件下高水平地产生琥珀酸盐。该方法可以在一个单一反应器中进行，并且可进行有效的按比例放大。

Description

大规模的微生物培养法

相关申请的交叉引用

不适用

背景技术

无氧发酵和有氧呼吸一直是用于化学品的工业生产所感兴趣的两种代谢方式。富氧的呼吸作用提供了很有效率的细胞生长(生长速率和产率)并且将高比例的碳源转换成为二氧化碳和细胞物质(见表1)。另一方面，无氧发酵导致细胞生长不良并且以高产率合成几种发酵产物(如乳酸盐、甲酸盐、乙醇、乙酸盐、琥珀酸盐、等等)。

表1呼吸作用对比发酵性代谢

然而，因为两个原因使通过富氧过程来生产化学品比使用无氧的方法成本更高。首先，由于较高的单位成本和需要具有降低的规模经济性的较小的发酵罐，建造有氧发酵罐是更昂贵的。其次，由于氧的溶解度低使得有氧发酵罐比它们对应的无氧发酵罐操作成本更高，这进而要求高能量输入以确保向这些细胞的适当的氧气供应。这对于商业化学品的生产是尤其相关的，其中发酵成本可以占总生产成本的50％至90％。

因此，在有可能时无氧方法通常是优选的，并且它典型地是以有氧方式将细胞培养到很大的数量，然后将这些细胞转换为无氧培养用于生产所希望的分子。然而，该方法经常是不成功的，从而导致不良的产率和速率。

长期以来已知几种酸(包括琥珀酸)的混合物是在由大肠杆菌发酵为起点而生产的，正如1949年由JL Stokes在名称为“Fermentation ofglucose by suspensions of Escherichia coli”(发表在J.Bacteriol，57：147-158中)的文章中所说明的。然而，对于每摩尔的发酵的葡萄糖，通过Stokes法仅仅生产出0.3至0.4摩尔的琥珀酸。

因此，为了提高产率，已经对细菌进行遗传修饰从而使消耗了用于生产琥珀酸所必需要的NADH的代谢途径失活，并且从而激活了用于生产琥珀酸盐(琥珀酸的一种盐)的代谢途径。事实上，这个允许草酰乙酸盐转化成苹果酸盐、然后转化成富马酸盐并且最终转化为琥珀酸盐的发酵代谢途径要求所产生每摩尔的琥珀酸盐中具有2mol的NADH。因此，在琥珀酸盐的生产中主要的代谢瓶颈是NADH的细胞生物利用率。

为了解决这个问题，US7223567说明了使用一种重组大肠杆菌菌株，它对于相同可获得量的NADH过量地生产了琥珀酸盐。大肠杆菌菌株“SBS550MG-pHL413”已经使adhE、ldhA基因(参与了消耗NADH的途径)失活、使ack-pta基因和iclR基因(它们激活乙醛酸途径)失活、并且含有一个过量表达外源pyc基因的质粒载体。

Sanchez等人的论文(题目为″Novel pathway engineering design of theanaerobic central metabolic pathway in Escherichia coli to increase succinateyield and productivity″in Metabolic Engineering 7(2005)229-239)、以及美国专利US 7,223,567和美国专利申请US 2005/0042736已经发展了与该菌株相关联的新型培养和生产条件，以改进它的琥珀酸产率。通过引用将这些专利的全文结合在此。

在Sanchez等人的US7223567和US2005042736中，首先使SBS550MG-pHL413在一个锥形瓶中的LB培养基中在有氧条件下进行培养以产生一种最大量的生物质，使该生物质通过离心作用浓缩，并且然后在无氧状态下转移进入具有富培养基的一个生物反应器中以产生琥珀酸。在这些实验中，在US2005042736中每一摩尔葡萄糖的琥珀酸盐的摩尔产率高达1.2或1.3，但是通常小于1.5，但是在US7223567中高达1.7。

然而，这些实验性的培养条件是在一个实验室规模上开发的并且也许难以转换为一个工业规模，这是因为在一个锥形瓶中的第一培养步骤以及用于浓缩的生物质回收的离心步骤不容易被适配为用于大体积的操作。此外，使这种菌株的琥珀酸产率和速率甚至更多地增加以及使琥珀酸盐的高产率在大规模下更加可重复将是令人希望的。

在本领域中所需要的是一种新的培养法，该培养法允许高产率和比率地生产多种化合物(如琥珀酸盐)，而又易于按比例放大并且是有成本效益的。

发明内容

本发明总体上涉及一种用于培养微生物的新型工艺，以产生高水平的代谢产物，如琥珀酸盐、富马酸盐、苹果酸盐、乳酸盐、乙醇、甘油、丙醇、丁醇、以及类似物，优选琥珀酸盐。本发明还涉及生产这类化合物的方法。本发明在此是以琥珀酸盐为例证，但是可以被广泛应用于多种微生物的培养以制造多种最终产物。

诸位发明人已经发现：从有氧条件直接转换到无氧条件导致每一摩尔葡萄糖的非常低的琥珀酸盐的摩尔产率，其量级为0.4-0.8摩尔数量级的产率。然而，当使这些细胞更缓慢地转换到无氧条件时(通过经历一个具有某些、尽管是低氧的贫氧期)，这些细胞出人意料地产生一个高得多的摩尔产率(在一次运行中1.68)并且以一个更高的比速率(在一个运行中0.116g/l/hr/OD)产生琥珀酸盐。因此，该新的培养方法提高了摩尔产率至大于1.5、优选至1.6以及甚至高达1.7、并且甚至更重要的是增加该生产速率。若该系统被进一步优化，有可能使每一摩尔葡萄糖的琥珀酸盐进一步增加至1.8、1.9、或2摩尔。因此，该工艺比现有技术方法学是更加有效的和可重复的，并且可以显著按比例放大。

在这样的实验之后，研制了一种新的培养法(允许在相同生物反应器中细胞生长和琥珀酸盐生产二者都有高产率和高速率)。这些步骤包括有：1)在富氧条件下没有pH控制的生长期；2)在贫氧条件下的一个驯化期。这典型地是比0.5小时长、并且可能是数小时或更长。3)在氧剥夺条件下在富含二氧化碳的环境中的一个生产期。在这些时期过程中碳可以根据需要来加入。

该驯化阶段的重要性可以由以下实验证明，其中供氧总是丰富的。在这种实验中，这些细胞是在800RPM的高搅拌速率下生长的并且通过将二氧化碳喷入该反应器直接转换进入无氧期。在这样的情况下所溶解的氧大多数时间是在60％以上(数据未显示)。若没有驯化，则该过程的性能受损。该摩尔产率是小于约1.6的预期值并且该比速率是小于0.06g/L/h/OD。

批号

在富氧期中初始的搅拌(RPM)

在富氧期中最终的搅拌(RPM)

气流速率(L/min)

碱

摩尔产率

比速率(g/L/h/OD)

30

800

2.5

NaCO₃

-1.4

0.06＜

使用了更低的搅拌速率、以及由此更低的氧的另一个运行的结果显示如下。在这样的情况下溶解氧是非常低的(＜5％)，然而摩尔产率以及比生产速率是高很多。该摩尔产率接近1.6的最大理论产率，具有高于0.1g/L/h/OD的高比生产率。

批号

在富氧期中初始的搅拌(RPM)

在富氧期中最终的搅拌(RPM)

气流速率(L/min)

碱

摩尔产率

比速率(g/L/h/OD)

31

50

1.5

NaCO₃

-1.6

＞0.10

“富氧条件”一词的意思是指以存在氧(例如，有氧的)(通常以空气的形式)为特征的培养条件。优选该发酵培养基的氧分压在60％-100％之间、或在t＝0时80％-90％。对该培养基进行搅拌被推荐用于在富氧条件下培养这些微生物，尽管确保足够氧化的其他手段(例如，起泡和使用富氧的头气(head gas))也是可供使用的。

“贫氧条件”一词的意思是指以下培养条件，其中该供氧被该微生物全部消耗，但是该系统没有除尽氧，因此导致在该培养基中的氧分压(pO₂)＜5％、优选＜2％、优选0-1％。驯化或贫氧条件可以通过多种方法获得。这些包括搅动或搅拌的速度(例如，降低至4-500rpm)的变化、在该气流速率或该入口气体的构成方面的改变、或通过加入更多葡萄糖以增加该细胞密度(因此更高的氧需求)、或它们的组合。

优选地，当充足的细胞物质已经在富氧条件下积累，例如直到获得以下在600nm的吸光度：大于大约15、16、17、18、19、或20、或更高(即直到至少4g/l的微生物干重)时驯化就开始。还优选该低氧驯化步骤是在t＝0时引入该培养基的大多数的或全部的碳源消耗之后被实施的。

当这些细胞充分适应低氧时将培养物转换成氧剥夺条件，并且如在此所说明的有可能对最佳点进行试验。通过在此使用的这些细胞、培养基、和培养法，大约两个小时即足够用于驯化，并且pH升高表明了在这些条件下的驯化。

“氧剥夺条件”一词的意思是指没有显著量的氧的培养条件，即无氧的。本领域的普通技术人员将知道如何改变到氧剥夺培养条件。因此，以一种标准方式，这种改变是可能的，例如通过用二氧化碳(总体上以二氧化碳气体、或碳酸盐、或与其他的惰性气体相混合的二氧化碳的形式)来替代氧。

优选地，氧剥夺条件是在以持续地注入CO₂为特征(通常以二氧化碳或碳酸盐的形式)的发酵操作中实现的。根据本发明，例如，将CO₂注入生物反应器的速率是在0.1到0.5wm之间，优选0.3wm(每分钟每一体积的培养基的CO₂的体积)。

“培养基”一词的意思是指一种培养基，它包括对于所述微生物的生长所需的化学元素连同至少一个碳源和一个氮源(优选有机的)。

该培养基总体上包括：

一种钾和磷源(例如K₂HPO₄)
	一种硫源(例如(NH₄)₂SO₄)
一种镁源(例如MgSO₄-7H₂O)
	一种钙源(例如CaCl₂)
一种铁源(例如硫酸铁)
	一种微量元素源(例如Cu、Zn、Co、Ni、B、Ti的盐类)
水
	如有必要一种pH缓冲液
一个或多个碳源，优选有机的(酵母提取物、葡萄糖、甘油、淀粉、玉米副产物类、等等。)
	一个或多个氮源(酵母提取物、玉米浆等等)

可任选地，根据本发明的培养基还可以包含一种抗生素(例如氨比西林、羧苄西林或苯唑西林、等等)，若该微生物包含对所述抗生素耐受的一种基因(例如在一种载体上(如一种质粒)、或整合到该生物体的DNA中)。

作为一种碳源的实例，应提到葡萄糖或淀粉水解产物。优选地根据本发明该碳源是葡萄糖，但是可以使用任何可由该微生物利用的碳源。例如，甘油、右旋糖、玉米副产品类、以及谷类或草类或它们的副产品全部可以被用于提供一种碳源。

以下给出包括一种碳源的培养基的构成的一个实例：

葡萄糖	2g
		胰蛋白胨	20g
酵母提取物	10g
		(NH₄)₂HPO₄	3g
KH₂PO₄	1.2g
		K₂HPO₄	0.7g
MgSO₄	0.25g
		CaCl₂	0.2g
硫胺素	0.99mg
		生物素	1mg
水	使体积至1000mL

优选地，该培养基是一种无机培养基。“无机培养基”一词的意思是指没有蛋白的一种培养基，即对其而言氮是通过一种矿物质的通路来提供的，并且实质上包括溶液中的矿物质连同一种碳源(优选葡萄糖)。

以下给出一种无机培养基的构成的一个实例：

葡萄糖	10g
		(NH₄)₂HPO₄	6g
K₂HPO₄	0.5g
		K₂SO₄	1g
KCL	2g
		MgSO₄.H₂O	2g
H₃BO₃	1mg
		MnSO₄-7H₂O	20mg
ZnSO₄-7H₂O	4mg

CuClr-2H₂O	2mg
		CaClr-2H₂O	30mg
FeSO₄-7H₂O	60mg
		CoClr-6H₂O	8mg
Na2MO₄2H₂O	0.4mg
		生物素	1mg
硫胺素	1mg
		蒸馏水	使体积至1000mL

“能够生产琥珀酸的微生物”一词的意思是指可以产生琥珀酸的任何微生物，这是通过它自然的代谢作用、或作为基因操作的结果来进行的。

优选地，这些微生物是埃希氏菌属或大肠杆菌的菌种。根据本发明特别优选的大肠杆菌的菌株是一种重组菌株，该菌株已经被遗传修饰以便比该自然菌株产生更多的琥珀酸。

再者，更特别优选的是一个菌株，它具有以下基因型：ΔadhE、ΔldhA、ΔiclR、Δackpta PYC、或ΔadhE、ΔldhA、ΔiclR、Δack PYC、或ΔadhE、ΔldhA、ΔiclR、Δpta PYC。这种基因型在CO₂的存在下通过发酵来促进琥珀酸的生成。符号Δ表明所讨论的基因已经被失活，例如通过突变、缺失、中断、插入、或“减量”调节，例如通过引入一种终止密码子、导致阅读框改变的插入或缺失、点突变、等等。

因此，该基因型ΔadhEΔldhAΔiclRΔackpta PYC对应于：

ΔadhE	醇脱氢酶失活
		ΔldhA	乳酸脱氢酶失活
ΔiclR	异柠檬酸裂合酶(也被称为aceA)失活
		Δackpta	乙酸激酶和磷酸转乙酰酶的失活，可以由一种菌株替代，其中乙酸激酶或磷酸转乙酰酶之一(Δack或Δpta)是失活的
PYC	一种丙酮酸羧化酶基因的表达。这表明该菌株表达了PYC基因，例如借助于使用携带该基因的一个功能拷贝的质粒进行转化，或通过PYC的一个功能拷贝的基因组整合。PYC基因有利地是乳酸乳球菌的PYC基因。

根据一个非常优选的方案，该大肠杆菌的菌株是SBS 550MG-pHL413菌株。在Sanchez等人的Metabolic Engineering，7(2005)229-239、以及在US7223567和US20050042736中说明了这种菌株。其他的菌株包括SBS330MG、SBS330MG、SBS330MG、SBS660MG、以及SBS990MG。

可以有利地用于本发明的新方法的其他的生产琥珀酸盐的菌株包括：

菌株	基因型
		SBSII0MG	adhE ldhA，Km^s
SBS330MG	adhE ldhA iclR，Km^s
		SBS440MG	adhE，ldhA，iclR，areA，Km^s
SBS550MG	adhE ldhA iclR Δaekpta::Cm^R，Km^s
		SBS550-P	adhE ldhA iclR，poxB，Δaekpta
SBS550MG/ptsG	adhE ldhA iclR，ptsG，Δaekpta::Cm^R，Km^s，
		SBS660MG	adhE，ldhA，iclR，areA，Δaekpta::Cm^R，Km^s，
SBS990MG	adhE ldhA，Δaekpta::Cm^R，Km^s，
		SBS551MG	adhE ldhA iclR，sdhAB Δaekpta::Cm^R，Km^s
SBS552MG	adhE ldhA iclR，poxB，sdhAB Δaekpta::Cm^R，Km^s
		SBS552MG/ptsG	adhE ldhA iclR，ptsG，poxB，sdhAB Δaekpta::Cm^R，Km^s
PRP01	adhE ldhA iclR Δaekpta::Cm^R，GalP+，Km^s
		PRP02	adhE ldhA iclR，ptsHL Δaekpta::Cm^R，Km^s
SBSIOIOMGC	adhE，IdhA，fdhN Δaekpta::Cm^R，Km^R

在此所说明的羧酸可以是盐、酸、碱或衍生物，这取决于结构、pH、存在的离子、以及是否被酯化，。例如，术语“琥珀酸盐”和“琥珀酸”在此可以互换使用。在此所使用的化学品包括甲酸盐、乙醛酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、草酰乙酸盐(OAA)、磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、以及丙酮酸盐。包括克氏循环(也叫柠檬酸、三羧酸或TCA循环)的细菌代谢途径能够在Lehninger的“生物化学原理(Principles of Biochemistry)”及其他生物化学教科书中找到。

“降低的活性”在此被定义为是与适当的对照组菌株相比蛋白质的活性至少降低75％。优选地，达到活性降低至少80％、85％、90％、95％，并且在最优选的实施方案中，这种活性被消除或失活(100％)。使用抑制剂、通过突变、通过抑制表达或翻译、以及类似方法可以使蛋白失活。

“过量表达”或“过量表达了”在此被定义为是与适当的对照组菌株相比至少150％的蛋白活性。过量表达可以通过将蛋白质突变以生成一种更具活性的形式或一种耐受抑制的形式、通过去除抑制剂或加入激活剂、以及类似方式来实现。过量表达也可以通过去除阻抑物、向细胞中加入基因的多个拷贝、或将该内源基因上调、以及类似方式来实现。

“培养”一词的意思是指对所述微生物持续一段时期的培养直到达到一种希望的目标为止，例如在0.5和72小时之间、在5和48小时之间、更优选在8和24小时之间。优选地，该驯化步骤是至少两个小时，但可以为从0.5-5小时或1-2小时的任何时段。

最佳培养温度在20℃-40℃之间、优选在36℃-39℃左右、并且甚至更优选是37℃。不同的微生物可具有不同的最适宜温度，并且如何评定对于微生物的最适宜温度是熟知的。

优选地，根据本发明的工艺包括至少一个额外的步骤，即：在该驯化和/或生产阶段过程中碳源的第二次(或更多次)加入。优选地，该碳源和量值与首次剂量是相同的，优选在2g/L和10g/L之间的葡萄糖。然而，该碳源和量值也可以不同。

优选地，该培养基的pH在用所述微生物接种之前是在7左右到8左右之间，有利的是在7.5左右、并且当pH已经下降到小于7左右的值时加入该额外剂量的碳。此后，pH将再次升高至大于7左右的值，有利的是在转到氧剥夺条件之前大于7.2左右。

观察到的pH下降至小于7左右的值可以与产生有机酸的现象相联系，然后在消耗了那些有机酸的一部分时pH再次升高至大于7左右的值，因此表示这些细胞已经成功地被驯化。

“调节pH”一词的意思是指在一个给定的间隔上保持培养基的pH值的动作。根据本发明，可以用不同的方式来调节pH。1)在一个间隔上调节：将pH值维持在一定范围的数值内。然后，该pH值可以随时间发生变化，然而并不偏离所考虑的范围。2)“低点”调节：将pH值保持在一个阈值以上。然后，该pH值可以随时间发生变化，然而并不降到该阈值以下。3)调节至一个单一值：使pH值随着时间持续地保持在该数值上。有利的是，若调节pH时，优选地是通过加入NaOH或NH₄OH。

根据本发明的另一个实施方案，根据本发明的工艺包括在用于转变为琥珀酸的生产期结束时将存在于培养基中的琥珀酸盐离子酸化的一个步骤。

本发明的另一个方面涉及一种用于获得琥珀酸的工艺，其特征在于它包括一种用于制备琥珀酸的工艺、一个纯化该琥珀酸的步骤、以及可任选的一个琥珀酸的结晶步骤。有利的是，该纯化步骤包括双极式电渗析，并且该结晶步骤是通过在水中冷却下来通过蒸发结晶和/或结晶来进行的。

附图简要说明

附图说明：

图1：曲线表现了根据实例2的条件在富氧和氧剥夺期的过程中氧分压(pO₂)(左手坐标)和pH(右手坐标)的发展。

图2：根据实例3的条件，在该富氧期中搅拌对在产品中的生物质的性能(在CO₂下培养18小时后测量)的作用。

图3：曲线表现了根据实例4的条件，在富氧和氧剥夺期的过程中氧分压(pO₂)、pH、以及加入到培养基的NaOH的量值的发展。

具体实施方式

以下实例说明了根据本发明的工艺的多个优选的方案，然而并不限制本发明的范围。

实例1：PH控制

由以下资料显示了在富氧的细胞生长过程中pH控制的不利作用。使用或不使用盐添加物并且以500RPM的低速搅动将pH控制在7.0，琥珀酸盐的摩尔产率始终低于约1.6的预期值。

	实验1	实验2
			富氧的培养基	LB	LB+盐添加物
	2g/L葡萄糖	2g/L葡萄糖
				30microl/L消泡剂204	30microl/L消泡剂204
	200mg/L Ap	200mg/L Ap

条件	37℃	37℃
				500rpm	500rpm
	1.5L/min空气	1.5L/min空气
				pH＝7.0	pH＝7.0

			琥珀酸盐摩尔产率	1.2≤	1.2≤

实例2：琥珀酸生产

本实例包括在一个在锥形瓶中预培养以产生充分的接种菌的时期，一个在富培养基中在富氧条件下的培养期，即包括将蛋白和肽作为可以被该微生物吸收的一种氮源。这个时期允许生产生物质，并且继之以一个贫氧驯化期，以及然后一个氧剥夺生产期，从而允许实际生产琥珀酸盐。富氧的、贫氧、以及氧剥夺期是在同一个发酵罐中实施的，并且在此被用来例证的菌株是SBS550MG-pHL413。

本工艺与现有技术相区别之处具体在于在它的富氧期结束时不存在通过离心作用浓缩生物质、并且还在于包括一个贫氧期。

预培养期：在37℃下在以125rpm搅拌下将SBS550MG-pHL413在锥形瓶中预培养达17小时。在具有2个挡板的一个2升的锥形瓶中将该菌株接种在400ml的培养基中。这种预培养培养基的构成如下：

胰蛋白胨 10g/L

酵母提取物 5g/L

NaCl 10g/L

抗生素(氨比西林、羧苄西林、苯唑西林)67mg/L

富氧和贫氧期：将如此预培养的菌株置于一个4升的发酵罐里的一种培养基中，该培养基的构成如下：

葡萄糖在T＝0时的2g/l，+在pH再次升高

之后的2g/l

胰蛋白胨 20g/L

酵母提取物 10g/L

K₂HPO₄ 0.7g/L

KH₂PO₄ 1.2g/L

(NH₄)₂SO₄ 3g/L

MgSO₄ 0.25g/L

CaCl₂ 0.2g/L

硫胺素 1mg/L

生物素 1mg/L

氨比西林 67mg/L

通过在锥形瓶中预培养所获得的接种体代表在该发酵罐中培养的培养基的总容积的3％。在该富氧期过程中的培养条件是：37℃的温度、以500rpm进行搅拌，用2.5wm的空气通气、并且不调节pH(在对该培养基的灭菌前简单将pH调节至7.5)。

图1中示出表示氧分压(pO₂)(左手坐标)以及pH(右手坐标)的一条曲线。在8小时结束时观测到的一个第一pH峰值(7.2)的过程中，加入2g/l的葡萄糖(该培养基的构成中表示为“+在pH再次升高之后的2g/l”)。这次加入葡萄糖之后，观察到了pH下降到低于7，然后在9.5小时之后在7.4处的一个第二pH峰值。

应指出作为微生物生长的结果，从7.5小时起氧分压(pO₂)下降至＜1％(氧贫条件)并且保持这样达2小时。这反映了在培养结束时并且持续2小时由微生物几乎完全消耗了提供给培养基的氧。在此这个生长期被称作“贫氧期”。

氧剥夺期：随后将该菌株安置在氧剥夺条件下(通过在37℃下以0.3wm注入CO₂替代氧的供应，以250rpm进行搅拌)。由一个5M NaOH的10M溶液将该培养基的pH调节至pH 7。

将以下化合物加入至该培养基中：

葡萄糖 20g/L

IPTG(诱导物)(若需要的话) 0.238g/L

最终结果如下：

因此观测到：根据本发明的工艺的实现方式允许在最终时期中琥珀酸的显著生产。

实例3：在生长过程中氧的作用

本实例的目的在于研究在不同的搅拌速度下氧的作用。由SBS550MG-pHL413菌株生产琥珀酸是在CO₂下无生长的情况下进行的。生长期是先前在富氧条件根据实例2的“富氧期”的方案进行的，并且图2中示出在CO₂下18小时进行搅拌的作用。

观察到了这个参数对性能的一种非常显著的作用。对于生产能力和产率的最佳值是在400-500rpm，在600rpm则两者均大大降低。

因此，氧的传输对于诱导琥珀酸的生产中所涉及的代谢途径构成了一个重要参数。一种假说应当是：这种诱导要求在富氧期结束时、该系统在氧剥夺期下清除了氧之前、一个具有很少或没有溶解氧含量(pO₂)的时期以使这些细胞适应低氧，换言之，应该具有非常低氧的贫氧期。

实例4：PH调节的作用

本实例包括一个预培养期、一个在富氧条件下在富培养基(与无机培养基相对)中的培养期、一个贫氧期以及一个氧剥夺期，它允许通过发酵实际生产琥珀酸。这些时期是在同一个发酵罐中进行的，并且用来例证的菌株是SBS550MG-pHL413菌株。

本实例与以上那些的主要不同之处在于：在富氧期以及氧剥夺期的过程中将pH调节至6.75的低点。

预培养期：见实例2。

富氧和贫氧期：将以此方式预培养的菌株置于一个15升的发酵罐里的实例2的培养基中。通过在锥形瓶中预培养所获得的接种体代表了在发酵罐中培养的培养基总容积的3％。在富氧期过程中的培养条件是：37℃的温度、以400rpm进行搅拌，用1wm的通气、用5N的NaOH溶液调节至6.75的低点。氧分压是＜1％达两个小时(贫氧期)。

图3中示出多条曲线，它们代表氧分压(pO₂)(左手坐标)、以及pH(右手坐标)以及被用于平衡pH的NaOH的发展。在7小时结束时在7.2处观测到的一个第一pH峰值的过程中，加入2g/l的葡萄糖(在培养基的构成中表示为“+在pH再次升高之后的2g/l)。”在这次加入葡萄糖之后，观察到了pH下降到低于7、然后是在8小时结束时在7.6处的一个第二pH峰值。相伴随地，从7小时起氧分压(pO₂)下降至＜2％(贫氧条件)。然后在培养达8小时后，使该培养改变为氧剥夺期。

氧剥夺期：随后将菌株置于氧剥夺条件下(通过在37℃下用以0.2wm注入CO₂替代氧的供应，以250rpm进行搅拌)。用一种5N的NaOH 溶液将培养基的pH调节至pH 6.75低点。在氧剥夺条件下将葡萄糖以20g/L加入该培养基。

结果如下：

实例5：无机培养基

以下这些表显示了由本项工作开发的两种培养基。培养基MIN-N被定义为与使用氢氧化铵的pH调节一起使用。

	MIN	MIN-N
			K₂HPO₄	0.5	2.8
K₂SO₄	1.0	1.0
			KCl	2.0
(NH₄)₂HPO₄	6.0	0.4
			MgSO₄，7H₂O	2.0	2.0
pH的调节	NaOH	NH3

以上展现的培养基使之有可能(在用20g/l的葡萄糖补足的情况下)获得足够的生物质(600nm处的吸光度＞15)以便在CO₂下在18小时的氧剥夺期中进行一种相当大量的(＞15g/l)琥珀酸生产。

实例6：进行PH调节的无机培养基

用于获得琥珀酸的另一个工艺包括使用以上开发的无机培养基，并且包括预培养期、一个在发酵罐中传代培养期、一个在富氧条件下在无机培养基中的培养期(从而允许生产生物质)、一个贫氧期以及一个氧剥夺期(从而允许通过发酵来实际生产琥珀酸)。这些时期是在同一个发酵罐中进行的，并且被用来例证的菌株是SBS550MG-pHL413。

预培养期：在37℃下伴随以125rpm进行温和搅拌下将SBS550MG-pHL413菌株在一个锥形瓶中预培养小于24小时。将来自一个冰冻试管的接种物在一个2升的锥形瓶中接种到500ml的预培养基中。

这种预培养培养基的构成如下：

胰蛋白胨	10g/l
		酵母提取物	5g/l
NaCl	10g/l
		KH₂PO₄	3g/l
Na₂HPO₄	6g/l
		NH₄Cl	1g/l
MgSO₄，7H₂O	0.25g/l
		NaCl	0.5g/l
抗生素(氨比西林、羧苄西林、苯唑西林)	67mg/L

传代培养期：这种传代培养培养基的构成如下：

葡萄糖	10g/l
		(NH₄)₂PO₄	6g/l
K₂HPO₄	0.5g/l
		K₂SO₄	1g/l

KCl	2g/l
		MgSO₄.7H₂O	2g/l
FeSO₄.7H₂O	60mg/l
		CaCl₂.2H₂O	30mg/l
ZnSO₄.7H₂O	4mg/l
		CuCl₂.2H₂O	2mg/l
MnSO₄.H₂O	20mg/l
		CoCl₂.6H₂O	8mg/l
H₃BO₃	1mg/l
		Na₂MoO₄.2H₂O	0.4mg/l
生物素	1mg/l
		硫胺素	1mg/l
氨比西林	67mg/l

在一个锥形瓶中通过预培养所获得的接种体占在该发酵罐中培养的培养基总体积的6％。在37的温度下伴随以450rpm进行搅拌、具有大于0％的氧分压以及1wm的通气下，使该传代培养在一个发酵罐中进行超过20小时。用一个5N的苏打溶液将该培养基的pH调节至pH 6.75低点。

富氧和贫氧期：在这种传代培养期后，将该菌株置于一个20升的发酵罐里的培养基中，该培养基的构成如下：

葡萄糖：开始时的10g/l，+在消耗后的10g/l

(NH₄)₂HPO₄	6g/l
		K₂HPO₄	0.5g/l
K₂SO₄	1g/l
		KCl	2g/l

MgSO₄.7H₂O	2g/l
		FeSO₄.7H₂O	60mg/l
CaCl₂.2H₂O	30mg/l
		ZnSO₄.7H₂O	4mg/l
CuCl₂.2H₂O	2mg/l
		MnSO₄.H₂O	20mg/l
CoCl₂.6H₂O	8mg/l
		H₃BO₃	1mg/l
Na₂MoO₄.2H₂O	0.4mg/l
		生物素	1mg/l
硫胺素	1mg/l
		氨比西林	67mg/l

在一个锥形瓶中通过预培养获得的接种体占在该发酵罐中培养的培养基总体积的13％。将通气保持在1wm，温度在37℃、并且用5N的苏打溶液将培养基的pH调节至6.75的低点。首先，通过以450rpm对培养基进行搅拌使氧分压保持在20％以上。

在10g/l的葡萄糖已经被菌株消耗时，将搅拌减为400rpm以改变为贫氧条件(具有＜1％的氧分压)。

氧剥夺期：在该富氧的和贫氧期之后，将该菌株安置在氧剥夺条件下(通过在37℃下以0.2wm注入CO₂替代氧的供应，以250rpm进行搅拌)。用一种5N的NaOH溶液将培养基的pH调节至pH 6.75。在氧剥夺条件下将葡萄糖以20g/l加入培养基。

下表归纳了在18小时生产后的结果：

富氧期的碱

富氧期的培养基

贫氧期

富氧期的pH升高

有氧期的比生长速率(＝μ)小时^-1

富氧期OD 600nm

CO₂期琥珀酸盐产率(％g/g)

CO₂期琥珀酸盐比速率(g/h/OD)

NaOH

MIN

是

有

0.31

16.6

92

0.06

一个新方案被用于验证富氧期的三个重要因素对生产的影响：

所使用的碱(NaOH/NH3)。

在富氧期结束时存在的一个贫氧期(低氧含量)。

在贫氧期结束时(消耗了所产生的酸类)pH再次升高。

以下的表归纳了在用这些因子的每一种组合所获得的结果(在18小时的生产之后)，这个表的第三行示出了用以上提出的碱的方案所获得的结果。

富氧期的碱	富氧期的培养基	贫氧期	富氧期的pH升高	有氧期比生长速率(＝μ)小时-1	富氧期的吸光度OD600nm	CO2期的琥珀酸盐产率(％g/g)	CO2期的琥珀酸盐的比速率(g/h/OD)
								NaOH	MIN	不是	没有	0.33	18.0	-	＜0.01
NaOH	MIN	是	没有	0.30	16.1	85	0.03
									MIN	是	有	0.31	16.6	92	0.06
NH3	MIN N	不是	没有	0.39	22.3	-	＜0.01
								NH3	MIN N	是	没有	0.33	17.9	68	0.05
NH3	MIN N	是	有	0.34	17.2	71	0.05

这证明了贫氧期是获得生物质的显著的比生产率(＞0.01g/h/OD)所需要的。在有氧期过程中最后的pH升高还对产率和比速率(根据在生产期过程中消耗的葡萄糖计算琥珀酸的产率并且表示为g/gx100)二者给予一种正面作用。

总的说来，所观测的作用与用该富培养基获得的那些相似，它证实了该方案。

贫氧期的作用：这些试验证实了这种因素的突出作用。这个时期对于诱导琥珀酸的生产绝对是不可缺少的。若没有贫氧期(见粗线)，琥珀酸盐的产率下降至微不足道的。

NH3/Na和pH管理的作用：增加了在一种基于苏打的培养基上在富氧期结束时pH再次升高允许生物质的活性和产率(92％)的明确的改进。

使用氢氧化铵导致在生产期中在生长和葡萄糖的比消耗速度方面的改进。

实例7：没有PH调节的基于玉米的培养基

本实例包括一个预培养期、在一种培养基中(包括玉米浆作为氮源以及葡萄糖作为碳源)的一个富氧条件下的培养期(这个时期允许生产生物质)、一个贫氧期、以及一个氧剥夺期(允许实际生产琥珀酸)。被用来例证的菌株是SBS550MG-pHL413菌株。

预培养期：见实例2。

富氧和贫氧期：在预培养后，将菌株置于一个4升的发酵罐里的一种培养基中以400rpm搅动，该培养基的构成如下：

葡萄糖：开始时的2g/l，+在pH升高之后的2g/l

玉米浆：60g/l

(NH₄)₂SO₄	0.25g/l
		K₂HPO₄	0.7g/l
KH₂PO₄	1.2g/l
		KCl	2g/l
CaCl₂	0.2g/l
		MgSO₄	0.25g/l
氨比西林	0.067g/l
		生物素	0.001g/l
硫胺素	0.001g/l

氧剥夺期：随后将菌株置于在氧剥夺条件下(通过在37℃下以0.3wm注入CO₂替代氧的供应，以250rpm进行搅拌)。由5N的NaOH溶液将培养基的pH调节至pH 6.4。将葡萄糖在氧剥夺条件下以20g/L加入培养基。在氧剥夺条件下培养24小时之后加入15g/l的葡萄糖，在48小时之后加入4g/l的葡萄糖。

所获得的结果如下：

葡萄糖总产率：88％。

Claims

1.一种在单一反应器中培养微生物以生产代谢产物的方法，该方法包括以下步骤：

a)在一个反应器中用能够生产一种代谢产物的一种微生物对一种培养基进行接种，

b)在富氧的条件下在所述反应器中对所述微生物进行培养，对所述培养基的pH进行或不进行调节，优选对所述培养基的pH进行调节，

c)在所述反应器中将所述微生物对小于5％氧的贫氧条件进行驯化，

d)在所述反应器中通过用CO₂或混合有一种惰性气体的CO₂吹洗而改变成氧剥夺条件，

e)在足以产生所述代谢产物的一段时间中在所述氧剥夺条件下对所述微生物进行培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述代谢产物是选自下组，其构成为：琥珀酸、苹果酸、富马酸、乳酸、甘油、乙醇、异丙醇、丁醇，并且优选琥珀酸。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述微生物是选自埃希氏菌属或大肠杆菌。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述微生物是一种重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌组已被遗传修饰以便与野生型菌株相比对于相同量的可供使用的NADH产生更多的琥珀酸盐。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述微生物包含adhE、idhA、ack-pta、和/或iclR基因的失活，并且具有一个过量表达的pyc基因。

6.根据权利要求4所述的方法，其中该微生物具有基因型ΔadhEΔldhA ΔiclR Δackpta PYC、或ΔadhE ΔldhA ΔiclR Δack PYC或ΔadhEΔldhA ΔiclR Δpta PYC。

7.根据权利要求4所述的方法，其中该微生物是SBS550MG-pHL413。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于该培养基是一种无机培养基。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于它在步骤c)或步骤e)的过程中包括至少一次加入额外的碳。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于额外的碳是在所述驯化步骤过程中当该培养基的pH已经下降到低于约7的值时加入的。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于步骤d)是在该培养基的pH已经升高到大约7.2时实施的。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于步骤d)是在当所述培养基已经在贫氧条件下达至少两小时后实施的。

13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c)是在步骤b)的过程中由所述微生物将在t＝0时引入该培养基的碳源的大部分消耗之后进行的。

14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述驯化步骤开始于所述微生物在600nm处产生了大于15的吸光度时。

15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a)至e)是在一个发酵罐中进行的。

16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于它还包括在步骤e)结束时使存在于该培养基中的该琥珀酸根离子酸化而使它们转变成琥珀酸的一个步骤f)。