CN101029316A - 大肠杆菌生产琥珀酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大肠杆菌发酵生产琥珀酸的方法，包括如下步骤：(1)将活化的大肠杆菌接种于含有特定碳源的培养基中，好气培养，扩增菌体，也可使用葡萄糖为初始碳源，消耗后继续以特定碳源培养；(2)将所说的菌体于含有葡萄糖及MgCO3或NaHCO3或Na2CO3的培养基中厌氧发酵生产琥珀酸。本发明的方法，通过对大肠杆菌代谢的控制，使得大肠杆菌高表达其本身固有的糖异生及补给途径相关酶，能够在琥珀酸生产过程中实现高生产速率。
Description
技术领域
本发明涉及生产琥珀酸的方法，具体涉及一种利用大肠杆菌发酵生产琥珀酸的方法。
背景技术
以琥珀酸为代表的四碳二元酸是一类重要的化工原料，广泛地用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品、塑料和照相材料工业。近年来，由于不断开拓新的应用领域，琥珀酸的需求猛增。以琥珀酸为原料可取代苯合成约250种化工产品。琥珀酸是直链饱和二元羧酸，可以合成1，4-丁二酯、四氢呋喃、γ-丁内酯、丁二醇、己二酸等。发酵法生产的琥珀酸是以可再生资源取代石油生产的一种绿色平台化学品。
目前用于发酵法生产琥珀酸的主要有厌氧瘤胃细菌和大肠杆菌。厌氧瘤胃细菌包括Anaerobiospirillum succiniciproducens，Actinobacillussuccinogenes，都是严格厌氧的微生物，要求在严格的厌氧条件下培养和操作，发酵周期较长。最近S.Y.Lee实验室从牛瘤胃中分离得到了细菌Mannheimia succiciproducens MBEL55E(Appl Microbiol Biotechnol58：663～8，2002)，为兼性厌氧菌，具有较高的琥珀酸生产能力，琥珀酸的生产速率达到1.87g/L·h，比生产速率达到544mg/g(DCW)·h。
大肠杆菌(Escherichia coli)是兼性厌氧菌，它在有氧或无氧的情况下都能生长。在无氧条件下，大肠杆菌进行混合酸发酵，主要的发酵产物有乙酸、乙醇、乳酸、甲酸、琥珀酸等，但琥珀酸的产量很低。为了提高大肠杆菌生产琥珀酸的能力，许多研究人员进行了大肠杆菌的代谢工程，敲除副产物形成途径的有关基因，过量表达有利于琥珀酸合成的基因。例如在大肠杆菌突变株AFP111(ptsG，pflAB，ldhA)中过量表达外源丙酮酸羧化酶(pyc)，在复合培养基中并且添加适量H2的情况下，琥珀酸对葡萄糖的摩尔得率达到了1.80mol/mol，生产速率为1.30g/L·h，比生产速率127mg/g(DCW)·h(J Ind Microbiol Biotechnol 28：325～32，2002)。大肠杆菌突变株SBS550MG(adhE，ldhA，iclR，ack-pta)和SBS990MG(adhE，ldhA，ack-pta)过量表达外源丙酮酸羧化酶，在复合培养基中厌氧发酵，琥珀酸对葡萄糖的摩尔得率分别达到1.6和1.7mol/mol，生产速率分别达0.616和0.604g/L·h，比生产速率分别为176和173mg/g(DCW)·h(Metab Eng8：209～226，2006)。以上两种情况虽然达到了较高的琥珀酸关于葡萄糖的得率，但琥珀酸的生产率和比生产速率都不高。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种大肠杆菌生产琥珀酸的方法，以克服现有技术所存在的上述缺陷。
本发明主要包括两个部分：第一、利用特定的碳源在好气条件下增殖大肠杆菌细胞，这些碳源包括三羧酸循环的中间代谢物或含二、三碳的有机酸，也可使用葡萄糖，葡萄糖消耗后添加上述有机酸作为碳源继续好氧发酵增殖大肠杆菌细胞。第二、将上述大肠杆菌细胞在含有葡萄糖的培养基中厌氧发酵，生产琥珀酸。厌氧环境的建立可以通过两种方式：在密闭的反应器中不通空气，细胞在短时间将反应器系统中存在的氧消耗即进行厌氧发酵；或在反应器中通入CO2、N2等气体达到无氧状态。
发明人发现：好气发酵增殖大肠杆菌采用特定的碳源可提高大肠杆菌在厌氧条件下发酵生产琥珀酸的生产速率，对其他培养条件(如温度、pH、接种量等)没有特殊的要求。
本发明的方法包括如下步骤：
(1)将活化后的大肠杆菌接种于含有特定碳源的培养基中，好气培养增殖大肠杆菌，获得好气培养液或菌体；
大肠杆菌好气增殖的培养基为含有特定碳源的复合培养基(如LB)或基本培养基(如M9)；
LB培养基和M9培养基的组分和配比在Joseph Sambrook主编的Molecular Cloning一书中有详细的说明；
所说的特定碳源选自三羧酸循环的中间代谢物以及C2～C3的有机酸；
所说的三羧酸循环的中间代谢物为苹果酸、延胡索酸、α-酮戊二酸、柠檬酸、草酰乙酸或琥珀酸等及其可溶性盐；
所说的C2-C3的有机酸如乙酸、丙酮酸、乳酸、乙醛酸等及其可溶性盐；
所说的碳源也可使用葡萄糖作为好气培养的初始碳源，葡萄糖完全消耗后补充上述有机酸或其可溶性盐作为碳源，继续增殖大肠杆菌细胞；
大肠杆菌为野生菌或是缺失有关基因或过量表达有关基因的工程菌，例如在丙酮酸节点上，缺失与琥珀酸途径相竞争的途径的大肠杆菌；
步骤(1)的好气培养条件为大肠杆菌常用的好气培养条件，如培养温度37℃，摇瓶振荡培养或发酵罐中通气搅拌下培养，控制或不控制pH。
(2)将步骤(1)所得到的好气培养液或菌体于含有葡萄糖及MgCO3或NaHCO3或Na2CO3的厌氧发酵培养基中，厌氧发酵生产琥珀酸。
所说的厌氧发酵培养基可以是满足菌体生长的完全培养基，也可以是生长限制而能够代谢葡萄糖的不完全培养基，如氮源限制生长的培养基。
厌氧发酵培养基中，葡萄糖的浓度为一般常用的范围，如5～50g/l，MgCO3或NaHCO3或Na2CO3的的浓度与葡萄糖浓度有关，一般可为5～50g/l；
所说的厌氧发酵是指在步骤(1)所得到的菌体分离后转入新的含葡萄糖和MgCO3或NaHCO3或Na2CO3培养基厌氧培养。
也可以在步骤(1)所得到的大肠杆菌培养液中直接补充葡萄糖和MgCO3或NaHCO3或Na2CO3，进而进行厌氧发酵，生产琥珀酸。此时的培养基可以是已消耗某些营养的不完全培养基，
在方法(1)中大量增殖细胞的好气培养阶段，若使用添加上述有机酸或其盐为碳源的复合培养基，可提高细胞的密度，提高大肠杆菌琥珀酸的生产速率，特别是可以提高琥珀酸的比生产速率，即在同样的菌体浓度下以更高速率生产琥珀酸。也可采用以上述有机酸或其盐为碳源的基本培养基来增殖大肠杆菌。
在大肠杆菌好气增殖阶段，上述有机酸碳源可以有效地提高其固有的补给途径相关酶的活性，包括磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、苹果酸酶等等，有利于增加厌氧反应阶段琥珀酸的生成，提高琥珀酸的生产速率。
采用上述好气培养方法增殖的大肠杆菌细胞，在厌氧发酵阶段可以使用支持生长的复合培养基或基本培养基，也可使用不支持生长或限制生长的基本培养基(如缺少氮源等成分)。
在将大肠杆菌好气培养大量增殖的过程中使用含有上述特定碳源的复合培养基或基本培养基，可以诱导大肠杆菌具有高的合成琥珀酸的活性，其在随后的厌氧发酵过程具有高葡萄糖消耗、琥珀酸合成速率。
本发明的方法，通过大肠杆菌代谢的控制，使得大肠杆菌高表达其本身固有的糖异生及补给途径相关的酶，能够在琥珀酸生产过程中实现高生产速率与高比生产速率的结合。
具体实施方式
实施例1
野生型大肠杆菌TG1为Pharmacia公司公开销售的菌种，中国微生物保藏中心等菌株保藏机构均可提供；
冷冻甘油管保藏的大肠杆菌TG1 1ml接入装有30ml的LB(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提萃取物，0.5％氯化钠)培养基的250ml三角烧瓶中，37℃，转速为220rpm，过夜好气培养活化。取2ml培养液接入装有100ml培养基的500ml三角烧瓶中，培养基分别为加有40mM苹果酸(将pH调到7.0)、80mM乙酸钠、5g/L葡萄糖(作为对照)的LB，37℃好气培养7小时。
无菌离心，收集菌体，重悬于装有15g/L葡萄糖的M9(Na2HP4·12H2O15.12g/L、KH2PO4 3.0g/L、NaCl 0.5g/L、NH4Cl 1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、CaCl2 0.011g/L)中，菌体浓度(干重)为4g/L左右，发酵体系为100ml Schott瓶中加入50ml的上述悬浮液，补充MgCO3 20g/L，密闭瓶盖于37℃水浴摇床，150rpm下厌氧发酵10h。
以苹果酸或乙酸为碳源好气增殖的TG1在厌氧发酵中，琥珀酸对葡萄糖的摩尔得率分别比以葡萄糖为碳源增殖的TG1增加了37.1％和67％(表1)。
实施例2
大肠杆菌NZN111缺失了丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脱氢酶(Microbiology 143：187～95，1997)，厌氧条件下，即使添加了乙酸钠，NZN111基本上不生长也不消耗葡萄糖。大肠杆菌NZN111可由CGSC(The ColiGenetic Stock Center，MCDB Department，Yale University)提供，CGSC号为7726。
甘油管保藏的NZN111取1ml接入装有30ml LB培养基的250ml三角烧瓶中，37℃，转速220rpm过夜好气培养活化。取2ml培养液接入装有100ml培养基的500ml三角烧瓶中，培养基为分别装有40mM苹果酸钠、80mM乙酸钠、60mM乳酸钠、40mM柠檬酸钠、40mM延胡索酸钠、40mM琥珀酸钠、40mM α-酮戊二酸钠为唯一碳源的LB，以不加碳源的LB作为对照，37℃好气培养7小时。此时不加碳源的LB培养的细胞其干重只有1.60g/L，而添加苹果酸钠、延胡索酸钠、α-酮戊二酸钠、乙酸钠、乳酸钠、柠檬酸钠、琥珀酸的LB所得细胞密度明显提高，分别为2.34g/L、2.38g/L、2.20g/L、2.14g/L、2.21g/L、1.88g/L和2.2g/L。无菌离心，收集菌体，分别重悬于装有15g/L葡萄糖的LB中，在100ml Schott瓶中加入50ml的上述重悬液(菌体干重为4.0g/L左右)并补充MgCO3 20g/L，于37℃水浴摇床，150rpm下密闭厌氧发酵10h，结果如表2。
实施例3
同实施例2好气培养NZN111，使用的培养基为含有40mM苹果酸的100ml LB。培养结束后，无菌离心，收集菌体，重悬于装有15g/L葡萄糖和20g/L MgCO3的50ml LB中，此时菌体浓度为8.68g/L，于37℃水浴摇床，150rpm下密闭100ml Schott瓶中厌氧发酵。厌氧发酵2.5h时葡萄糖消耗完毕，有丙酮酸积累，琥珀酸的浓度为9.7g/L。5h时，琥珀酸的浓度达到11.5g/L，没有丙酮酸积累，琥珀酸的得率为1.15mol/mol，葡萄糖消耗平均速率达为3.04g/L·h，琥珀酸的平均生产速率为2.30g/L·h，平均比生产速率达到267mg/g(DCW)·h。
实施例4
甘油管保藏的NZN111取1ml接入装有30ml LB培养基的250ml三角烧瓶中，37℃，转速为220rpm，过夜好气培养活化。取2ml培养液接入装有100ml M9的500ml三角烧瓶中，培养基分别以60mM丙酮酸钠、80mM乙酸钠、40mM乳酸钠、40mM柠檬酸钠、40mM琥珀酸钠，40mM α-酮戊二酸钠、40mM苹果酸钠作为唯一碳源，好气培养9-12小时。无菌离心，收集菌体，重悬于装有15g/L葡萄糖的50ml基本培养基M9中，菌体浓度为4g/L左右，并补充胰蛋白胨0.5g/L，酵母提取物0.25g/L，MgCO3 20g/L，于37℃水浴摇床，150rpm下于密闭100ml Schott瓶厌氧发酵10h。得到结果如表3。
实施例5
大肠杆菌NZN111好气培养同实施例4，使用的培养基为含有40mM苹果酸的100ml M9。好气培养结束后，无菌离心，收集菌体，重悬于装有14.7g/L葡萄糖的基本培养基的M9中，菌体浓度为7.76g/L，补充微量元素混合液0.2ml/L(含FeSO4·7H2O 80g/L、MnSO4·nH2O 10g/L、AlCl3·6H2O10g/L、CoCl2 4g/L、ZnSO4·7H2O 2g/L、NaMoO4·2H2O 2g/L、CuCl2·2H2O1g/L、H3BO4 0.5g/L)， 补充MgCO3 20g/L，37℃水浴摇床，150rpm下于密闭100ml Schott瓶厌氧发酵6h，残糖为0.294g/L，琥珀酸浓度为7.42g/L，葡萄糖的消耗速率和比消耗速率分别达到了2.4g/L·h和309mg/g(DCW)·h，琥珀酸的生产速率和比生产速率分别为1.24g/L·h和160mg/g(DCW)·h。
实施例6
同实施例4好气培养NZN111，在500ml三角烧瓶中，分别以40mM苹果酸和80mM乙酸钠为唯一碳源的M9培养基好气培养NZN1119和12小时，同时用6g/L的葡萄糖作为碳源培养7小时作为对照。无菌离心，收集菌体，重悬于装有约15g/L葡萄糖的无氮源M9培养基(含微量元素混合液0.2ml/L)中，菌体浓度为4g/L左右，并加入10g/L NaHCO3或20g/LNaHCO3，37℃水浴摇床，150rpm下于密闭100ml Schott瓶厌氧发酵10h。得到结果如表4。
实施例7
一级种子：大肠杆菌NZN111冷冻甘油管1ml接入装有30ml LB的250ml三角摇瓶中。37℃，220rpm，过夜培养活化。
二级种子：接1ml一级种子培养液到两瓶装有75ml M9(装有葡萄糖10g/L)的500ml三角摇瓶中，37℃，220rpm，好气培养9h。
发酵：5L发酵罐加入3.5L M9培养基，其中NH4Cl为6.0g/L，碳源为15g/L葡萄糖。37℃好气培养增殖细胞，菌体浓度达到5.9g/L，葡萄糖耗完，开始流加400g/L的乙酸钠继续大肠杆菌NZN111的增殖，再经6小时好气培养(共加入乙酸钠154.4g)，菌体浓度达到9.52g/L。转为厌氧发酵，通入CO2的速率为2.0L/min，全程使用1.5mol/L的H2SO4和8.0mol/L的NaOH来控制pH为7.0。
厌氧发酵阶段分别在21.45h和33.15h各添加葡萄糖17.62g/L和17.49g/L，最终琥珀酸的浓度(厌氧发酵41.0h)为25.3g/L。
厌氧发酵阶段共消耗葡萄糖140.0g，产生琥珀酸103.7g，琥珀酸关于葡萄糖的得率为1.13mol/mol，琥珀酸的总生产速率为0.617g/L·h，比生产速率为92.1mg/g(DCW)·h。
表1
| 好氧增殖碳源 | 厌氧发酵 | |
| 琥珀酸(g/L) | 对糖得率(mol/mol) | |
| 葡萄糖苹果酸乙酸 | 1.351.912.40 | 0.1560.2130.260 |
表2
| 好氧增殖碳源 | 厌氧发酵 | ||||||
| 菌浓(g/L) | 初糖(g/L) | 残糖(g/L) | 琥珀酸(g/L) | 对糖得率(mol/mol) | 生产速率(g/L·h) | 比生产速率(mg/g(DCW)·h) | |
| 无苹果酸乙酸 | 4.084.364.16 | 15.814.514.6 | 2.900 | 7.499.829.00 | 0.881.040.88 | 0.7490.9820.900 | 184225216 |
| 乳酸柠檬酸延胡索酸琥珀酸α-酮戊二酸 | 3.684.04.564.64.16 | 15.7916.0514.514.714.8 | 1.241.37000 | 9.589.3510.59.938.39 | 1.000.971.111.030.93 | 0.9580.9351.050.9930.839 | 260234230216202 |
表3
| 好氧增殖碳源 | 厌氧发酵 | ||||||
| 菌浓(g/L) | 初糖(g/L) | 残糖(g/L) | 琥珀酸(g/L) | 对糖得率(mol/mol) | 生产速率(g/L·h) | 比生产速率(mg/g(DCW)·h) | |
| 丙酮酸乙酸琥珀酸α-酮戊二酸苹果酸 | 4.484.064.464.23.8 | 15.316.015.314.914.3 | 1.340000 | 5.477.166.146.677.63 | 0.5970.6820.6110.6820.813 | 0.5470.7160.6140.6670.763 | 122176138159201 |
表4
| 好氧增殖碳源 | 厌氧发酵 | ||||||
| 菌浓(g/L) | NaHCO3(g/L) | 耗糖(g/L) | 琥珀酸(g/L) | 对糖得率(mol/mol) | 生产速率(g/L·h) | 比生产速率(mg/g(DCW)·h) | |
| 葡萄糖乙酸苹果酸苹果酸 | 3.883.83.93.92 | 10101020 | 3.6311.1512.0214.3 | 0.9958.748.7410.52 | 0.4251.201.111.12 | 0.1000.8740.8741.052 | 26230224268 |
Claims (6)
1.一种大肠杆菌生产琥珀酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将活化的大肠杆菌接种于含有特定碳源的培养基中，好气培养，获得好气培养液或菌体；
所说的特定碳源为三羧酸循环中间代谢物或C2～C3的有机酸或其可溶性盐；
(2)将所说的菌体或好气培养液于含有葡萄糖及MgCO3或NaHCO3或Na2CO3的培养基中厌氧发酵，生产琥珀酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的特定碳源为苹果酸、延胡索酸、α-酮戊二酸、柠檬酸、草酰乙酸或琥珀酸等三羧酸循环中间代谢物，或乙酸、丙酮酸、乳酸或乙醛酸等C2～C3的有机酸，或以上有机酸的可溶性盐。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，也可先以葡萄糖为碳源好气增殖大肠杆菌，葡萄糖消耗后继续以权利要求2所述的有机酸或其可溶性盐进一步好气增殖大肠杆菌。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所得到的好气培养液中直接补充葡萄糖和MgCO3或NaHCO3、Na2CO3，进行厌氧培养，或将菌体分离后转入新的含有葡萄糖和MgCO3或NaHCO3、Na2CO3的培养基厌氧培养。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中使用的厌氧培养基可以是可以满足菌体生长的完全培养基，也可以是生长限制而能够代谢葡萄糖的不完全培养基，如氮源限制生长的培养基。
6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，大肠杆菌为野生菌或是缺失有关基因或过量表达有关基因的工程菌。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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Granted publication date: 20100609 Termination date: 20180313 |