CN101544992A - 发酵制备高光学纯度d-乳酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种发酵制备高光学纯度D－乳酸的方法，其特点是利用D－乳酸高产重组菌，在20～45℃条件下分阶段发酵30～50h，产D－乳酸水平达到12％，D－乳酸的光学纯度达到99.5％以上。本发明通过对D－乳酸高产重组菌的丙酮酸脱氢酶编码基因和NAD依赖性D－乳酸脱氢酶编码基因实行发酵参数控制下表达，使得D－乳酸的生产过程仅需改变发酵温度即可控制，达到以葡萄糖为原料高效合成光学纯度D－乳酸的目的和效果。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵法生产乳酸的菌株及其发酵生产技术，尤其是一种能够高效率的高选择性的生产高光学纯度与高化学纯度的D-乳酸菌株及其相应的制造技术，所属菌株在生产D-乳酸时不产生杂质琥珀酸和富马酸等；另外，本发明还涉及这种D-乳酸高产菌的发酵与代谢控制方法，属于微生物发酵工程技术领域。
背景技术
乳酸，是世界上公认的三大有机酸之一，根据光学纯度可以将乳酸分为L-乳酸、D-乳酸和DL-混合乳酸，由于D-乳酸及DL-混合乳酸因其影响细胞的正常生理代谢，1998年被世界卫生组织禁止药用和食用，L-乳酸及其衍生物主要用作食品添加剂、防腐剂、还原剂等用于食品、啤酒、白酒、医药、化工、石油和皮革加工等行业。
近年来随着对乳酸应用研究的深入，特别是由乳酸聚合获得生物可降解材料——聚乳酸的深入研究，D-乳酸的应用前景和应用需求也越来越广泛。如：1、通过向L-乳酸中添加一定量的D-乳酸，调节用于聚合的D-乳酸的含量而控制聚乳酸的物理特性，使聚乳酸逐步取代各种非降解的石化来源的塑料；2、可以用于研究乳酸抑制和作为酶法分析乳酸的标准品，作为一些反应的试剂盒等；3、纯的D-乳酸作为一个手性中心，是合成多种手性物质的前提，在医药、农药制药和除草剂方面的实际应用正日益引起人们的重视。如钙拮抗剂降压药，皮考啉酸衍生物以及优良除草剂——骠马、威霸、二甲四氯丙酸、氟系等的重要合成前体；4、D-乳酸的一些衍生物也有较广泛的应用，以D-乳酸为原料的乳酸脂类广泛用于香料、合成树脂涂料、胶黏剂印刷油墨等生产中，而且可用石油管道清洗、电子工业清洗及S-2-氯丙酸除草剂Duplosan R的手性合成原料，等。
随着研究的深入，D-乳酸用途不断扩宽，市场需求量也将随之不断增加，但是D-乳酸的工业化生产几乎没有，究其原因，主要是由于缺乏高效的D-乳酸生产技术。
不少微生物可以代谢葡萄糖形成D-乳酸或DL型混合乳酸，同时会形成乳酸以外的副产物例如醋酸、乙醇、丙酮酸等低分子量有机化合物。这些有机酸在纯化过程中很难完全出去，导致最终产物乳酸的品质下降并严重影响其后续运用。另外，由于光学异构体的混入导致光学纯度下降也变成严重的问题。
为了提高D-乳酸的化学纯度，我们需要降低乳酸发酵时副产物特别是有机酸的含量。近年来基因重组技术飞速发展，可以敲出微生物的特定基因，从而可能特异性的阻碍副产物的合成。但是该方法并不适合多种微生物，所以在乳酸菌或丝状真菌等原来能高效生产乳酸的微生物中并不适用。其原因是上述微生物基因组信息不充分，而且作为基因重组的宿主也不能广泛适用。
但是，大肠杆菌的基因组信息丰富，而且常被作为基因重组宿主。特别是从增殖迅速或培养容易等方面考虑，最优选大肠杆菌。由于大肠杆菌只能合成D-乳酸，所以在得到光学纯度高的D-乳酸时，也是最合适的宿主。但是，野生型大肠杆菌的D-乳酸生产效率很低，而且在发酵工程中伴生的低分子量有机酸等副产物含量很高，即不能高效地代谢底物(如葡萄糖)为单一D-乳酸产品。
为了解决这些问题，采用基因重组方法，改变菌株的代谢途径，选择性地高效生产D-乳酸。如，通过基因突变及基因表达，实现大肠杆菌合成同质乳酸，乳酸的合成效率提高到6％；另一个例子是将大肠杆菌代谢葡萄糖过程中的丙酮酸脱氢酶编码基因敲除，然后用乙酸进行菌体生长，再用葡萄糖流加进行乳酸的合成，乳酸的合成效率提高到8％。前一个例子说明了大肠杆菌乳酸合成途径在基因水平上的可操作性；后一个例子则说明，在利用大肠杆菌合成乳酸时，于乳酸合成阶段关闭乳酸前体物质丙酮酸经三羧酸循环被完全代谢掉的代谢途径，对乳酸的合成是有意义的；但乙酸显然不能作为工业化乳酸生产时的原料。
发明内容
本发明的目的是提供一种发酵制备高光学纯度D-乳酸的方法，能够合成高光学纯度、少有机酸副产物、高选择性的D-乳酸，且发酵工艺简洁易控。
本发明的技术方案是：发酵制备高光学纯度D-乳酸的方法，利用D-乳酸高产重组菌，在20～45℃条件下分阶段发酵30～50h，产D-乳酸水平达到12％，D-乳酸的光学纯度达到99.5％以上。
进一步地，上述的发酵制备高光学纯度D-乳酸的方法，其中，所述D-乳酸高产重组菌，先在20～30℃下利用葡萄糖快速生长，形成菌体而但不形成D-乳酸，然后在37～45℃下菌体停止生产，但利用葡萄糖快速合成D-乳酸且不形成其它有机酸。
更进一步地，上述的发酵制备高光学纯度D-乳酸的方法，其中，所述D-乳酸高产重组菌，其基因组中的一个或多个基因被删除或表达，所涉及到的基因产物包括：NAD依赖性D-乳酸脱氢酶、FAD依赖性的D-乳酸脱氢酶、FAD依赖性L-乳酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸甲酸裂解酶、丙酮酸脱氢酶、乙酸激酶、乙醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶，或苹果酸合酶。
更进一步地，上述的发酵制备高光学纯度D-乳酸的方法，其中，所述D-乳酸高产重组菌，来源于：大肠杆菌、芽孢杆菌类细菌、肠杆菌科细菌，或酵母。
再进一步地，上述的发酵制备高光学纯度D-乳酸的方法，其中，在发酵初期的10～15h内，培养温度控制在20～30℃，进行菌体的快速生长；在余下的发酵阶段，培养温度控制在37～45℃，进行D-乳酸的快速合成。
本发明的突出的实质性特点和显著进步主要体现在：
1、本发明提供的重组菌具有明显的高产高光学纯度及高化学纯度的D-乳酸能力，菌株在20～45℃的条件下发酵30～45h，产D-乳酸水平达到12％，所产D-乳酸的光学纯度达到99.5％以上；
2、本发明的D-乳酸高产菌，在乳酸发酵中，基本没有杂酸等副产物的合成，保障了D-乳酸的聚合级品质；
3、本发明的D-乳酸重组菌的发酵工艺技术：D-乳酸高产菌生长温度在20～30℃下利用葡萄糖快速生长，形成菌体；在37～45℃下菌体停止生产，但利用葡萄糖快速合成D-乳酸，并几乎不形成其它有机酸。即：运用本发明的重组菌及其发酵工艺，D-乳酸的生产过程仅需改变发酵温度控制参数，即可实现以葡萄糖为原料高效合成D-乳酸。
附图说明
图1是发酵时间曲线；
图2是重组菌株发酵产乳酸和其它产物的HPLC分析。
具体实施方式
本发明提供一种发酵制备高光学纯度D-乳酸的方法，利用D-乳酸高产菌在20～30℃下利用葡萄糖快速生长形成菌体，然后在37～45℃下菌体停止生产，利用葡萄糖快速合成D-乳酸，并几乎不形成其它有机酸。其工艺特征是：20～45℃的条件下，发酵30～45h，产D-乳酸水平达到12％，D-乳酸的光学纯度达到99.5％以上。上述D-乳酸高产菌，其基因组中的一个或多个基因被删除或表达，所涉及到的基因产物包括：NAD依赖性D-乳酸脱氢酶、FAD依赖性的D-乳酸脱氢酶、FAD依赖性L-乳酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸甲酸裂解酶、丙酮酸脱氢酶、乙酸激酶、乙醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶，或苹果酸合酶等。
本发明涉及的具体方法有：
基因删除技术：以合成的寡核苷酸引物，将dif特异性重组位点序列引入选择性标记(如KmR或GmR)的两侧，形成可反复使用的选择性标记。运用PCR(多聚酶链反应)从大肠杆菌基因组中扩增获得目标删除基因的上游及下游序列各50-200bp。将可反复使用的选择性标记克隆入目标删除基因的上游和下游序列之间，形成目的基因删除序列，如pfl′-dif-GmR-dif-pfl′，即：pfl′::GmR dif。将此基因删除序列转化入大肠杆菌。在选择性培养基上选择培养出转化子。再在非选择性培养基上传代，筛选出选择性标记消失的转化子。提取转化子染色体DNA，用PCR对转化子的目的基因突变进行验证。由此获得的突变株再用于下一个目的基因删除的出发菌株。
基因克隆与表达：丙酮酸脱氢酶和NAD依赖性D-乳酸脱氢酶的高表达。运用PCR技术，从大肠杆菌基因组中分别克隆出所需表达基因，如pdh和ldhA，将PCR产物酶切，并分别与温控型表达载体如pTHcs18或pPL451连接，获得表达质粒pPDH和pLDHa，再将此表达质粒用CaCl2法转化突变株，获得高产D-乳酸的重组菌。
利用上述重组方法，按照以下步骤完成对D-乳酸重组菌的构建。
①研究菌株：大肠杆菌947(孙金凤等。微生物学报2004)。
②利用基因删除技术，将步骤①所获得的原始菌株中的目的基因如编码丙酮酸脱氢酶的基因删除，并获得重组菌株EC947(Δpdh)。
③利用基因删除技术，将步骤②所获得的重组菌株中的目的基因如编码丙酮酸甲酸裂解酶的基因删除，并获得重组菌株EC947(Δpdh，Δpfl)。
④利用基因删除技术，将步骤③所获得的重组菌株中的目的基因如编码FAD依赖性的D-乳酸脱氢酶的基因删除，并获得重组菌株EC947(Δpdh，Δpfl，Δdld)。
⑤利用基因克隆与表达技术，提高步骤④所获得的重组菌株的D-乳酸脱氢酶的表达量并表达丙酮酸脱氢酶，并获得重组菌株如EC947(Δpdh，Δpfl，Δdld，pPDH，pLDHa)。
⑥将步骤⑤所获得的重组菌株15L全自动发酵罐中进行乳酸发酵试验。发酵过程中定时取样，分析细胞密度、糖耗、乳酸产率、代谢主要中间产物及其它有机酸分析等。
下面以具体实例对本发明技术方案作进一步详细说明。
实施例1——删除丙酮酸脱氢酶的编码基因
以合成的寡核苷酸引物P1和P2为引物，P1和P2分别为：
P1：5′-ATAGGATCCTATCGAAATCAAAGTACCGGACATCGGGG-3′
P2：5′-CATCAGGATCCAGACGGCGAATGTCAGA-3′
以大肠杆菌947染色体DNA为模板，运用PCR(多聚酶链反应，Maties，1989)从基因组中扩增获得丙酮酸脱氢酶基因，将此PCR产物克隆入pUC18的BamHI位点中，获得重组质粒pUC-PDH。用EcoRV酶切去除其中的963bp的片段并与difEc-GmR连接，获得丙酮酸脱氢酶的基因删除序列，pdh′-dif-GmR-dif-pdh′，即：pdh′::GmR dif。将此基因删除序列转化入大肠杆菌。在选择性培养基上选择培养出转化子。再在非选择性培养基上传代，筛选出选择性标记消失的转化子。提取转化子染色体DNA，用PCR验证目的基因突变，获得转化子947(Δpdh)并用于后续研究的出发菌株。
实施例2——删除丙酮酸甲酸裂解酶的编码基因
以合成的寡核苷酸引物P3和P4为引物，P3和P4分别为：
P3：5′-ATAGGATCCTGATTACCGCTGGCAACAACGA-3′
P4：5′-CATCAGGATCCATTGGCAACCAGGCAAGCGA-3′
以大肠杆菌947染色体DNA为模板，运用PCR从基因组中扩增获得丙酮酸甲酸裂解酶基因，将此PCR产物克隆入pUC18的BamHI位点中，获得重组质粒pUC-PFL。用EcoRV酶切去除其中的1773bp的片段并与difEc-GmR连接，获得丙酮酸甲酸裂解酶的基因删除序列，pfl′-dif-GmR-dif-pfl′，即：pfl′::GmR dif。将此基因删除序列转化入大肠杆菌947(Δpdh)。在选择性培养基上选择培养出转化子。再在非选择性培养基上传代，筛选出选择性标记消失的转化子。提取转化子染色体DNA，用PCR验证目的基因突变，获得转化子947(Δpdh、Δpfl)并用·于后续研究的出发菌株。
实施例3——删除FAD依赖性的D-乳酸脱氢酶的编码基因
以合成的寡核苷酸引物P5和P6为引物，P5和P6分别为：
P5：5′-ATAGGATCCGCGATGTCTTCCATGACAACAACTG-3′
P6：5′-CATCAGGATCCGGATTCATGCTGTTGGTCGGATC-3′
以大肠杆菌947染色体DNA为模板，运用PCR从基因组中扩增获得丙酮酸甲酸裂解酶基因，将此PCR产物克隆入pUC18的BamHI位点中，获得重组质粒pUC-DLD。用StuI和EcoRV酶切去除其中的700bp的片段并与difEc-GmR连接，获得FAD依赖性的D-乳酸脱氢酶的基因删除序列，dld′-dif-GmR-dif-dld′，即：dld′::GmR dif。将此基因删除序列转化入大肠杆菌947(Δpdh、Δpfl)。在选择性培养基上选择培养出转化子。再在非选择性培养基上传代，筛选出选择性标记消失的转化子。提取转化子染色体DNA，用PCR验证目的基因突变，获得转化子947(Δpdh、Δpfl、Δdld)并用于后续研究的出发菌株。
实施例4——D-乳酸合成途径工程
以一组寡核苷酸为引物，
LDHa1：5′-CATGAATTCATGAAACTCGCCGTTTATAGCAC-3′
LDHa2：5′-TTTGAATTCAAAGGAGTTCGTTCGGGCAGGT-3′
从菌株947基因组中克隆出NAD依赖性的D-乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)，克隆入pPL451中，获得表达质粒pLDHa。
相似地，将丙酮酸脱氢酶编码基因从菌株947基因组中克隆出，克隆入pTH18cs1中，获得表达质粒pPDH。
将表达质粒pLDHa和表达质粒pPDH转化入菌株947(Δpdh、Δpfl、Δdld)中，获得D-乳酸高产重组菌947(Δpdh、Δpfl、Δdld、pLDHa、pPDH)。
实施例5——15L发酵罐中发酵葡萄糖生产乳酸
重组菌947(Δpdh、Δpfl、Δdld、pLDHa、pPDH)产D-乳酸性能分析和鉴定在15L发酵罐中进行。发酵培养基(g/L)：酵母膏15，蛋白胨0.5，无水MgSO4 0.25，轻质CaCO3 75，pH 7.0～7.2。葡萄糖初始浓度为100g/L，以500g/L进行流加。发酵第一阶段的温度为20～30℃，第二阶段为37～45℃，发酵周期为30～50h。在此条件下，发酵产D-乳酸水平达到10％～12％，光学纯度达到99.5％以上，详见图1、图2和表1。
其中图1当中，10h以内菌体在30℃下生长，此时不产乳酸；然后在菌体生长完成后，发酵温度升为45℃，此阶段产乳酸但菌体不生长。
表1：15L发酵罐中不同批次乳酸发酵试验结果
| 发酵批次 | 发酵周期(h) | 葡萄糖消耗量(g/L) | D-乳酸浓度(％) | 光学纯度(％) |
| 20071201 | 43 | 160 | 10.3 | 99.1 |
| 20071203 | 40 | 164 | 11.3 | 99.5 |
| 20080305 | 46 | 163 | 10.6 | 99.6 |
| 20080308 | 44 | 165 | 11.9 | 99.5 |
| 20080318 | 40 | 167 | 10.6 | 99.8 |
综上所述，本申请通过基因工程技术在获得D-乳酸高产重组菌的基础上，对重组菌的丙酮酸脱氢酶编码基因和NAD依赖性D-乳酸脱氢酶编码基因的表达实行发酵参数控制下表达，实现了重组菌从葡萄糖高效单一生产D-乳酸的简洁发酵工艺。本发明经适当修改后，也可用于从葡萄糖高效单一生产L-乳酸及其它有机酸。
Claims (5)
1、发酵制备高光学纯度D-乳酸的方法，其特征在于：利用D-乳酸高产重组菌，在20～45℃条件下分阶段发酵30～50h，产D-乳酸水平达到12％，D-乳酸的光学纯度达到99.5％以上。
2、根据权利要求1所述的发酵制备高光学纯度D-乳酸的方法，其特征在于：所述D-乳酸高产重组菌，先在20～30℃下利用葡萄糖快速生长，形成菌体而但不形成D-乳酸，然后在37～45℃下菌体停止生产，但利用葡萄糖快速合成D-乳酸且不形成其它有机酸。
3、根据权利要求1或2所述的发酵制备高光学纯度D-乳酸的方法，其特征在于：所述D-乳酸高产重组菌，其基因组中的一个或多个基因被删除或表达，所涉及到的基因产物包括：NAD依赖性D-乳酸脱氢酶、FAD依赖性的D-乳酸脱氢酶、FAD依赖性L-乳酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸甲酸裂解酶、丙酮酸脱氢酶、乙酸激酶、乙醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶，或苹果酸合酶。
4、根据权利要求1所述的发酵制备高光学纯度D-乳酸的方法，其特征在于：所述D-乳酸高产重组菌，来源于：大肠杆菌、芽孢杆菌类细菌、肠杆菌科细菌，或酵母。
5、根据权利要求1所述的发酵制备高光学纯度D-乳酸的方法，其特征在于：在发酵初期的10～15h内，培养温度控制在20～30℃，进行菌体的快速生长；在余下的发酵阶段，培养温度控制在37～45℃，进行D-乳酸的快速合成。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20090930 |