CN105705630A - 一种聚合级乳酸单体生产菌及其构建方法与乳酸制造技术 - Google Patents

一种聚合级乳酸单体生产菌及其构建方法与乳酸制造技术 Download PDF

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Abstract

极高光学纯D-乳酸和L-乳酸发酵生产菌种及其构建方法和用该菌株制备极高光学纯D-乳酸和L-乳酸的方法，其中，D-乳酸发酵生产菌种的保藏号为CGMCC No.11059，L-乳酸发酵生产菌种的保藏号为CGMCC No.11060。

Description

一种聚合级乳酸单体生产菌及其构建方法与乳酸制造技术
技术领域
本发明涉及微生物应用领域，尤其是一种聚合级乳酸单体生产菌及其构建方法与乳酸制造技术。
背景技术
生物可降解材料是指其使用后的废弃物能够被环境(微)生物所降解和利用的一类新颖材料。新一代生物可降解材料以聚乳酸为代表，分为聚L-乳酸和聚D-乳酸，分别通过其单体L-乳酸或D-乳酸聚合而得。预计到2020年，全球聚乳酸的年需求量将达到1500万吨，并且是年需求达5,000万吨的聚对苯二甲酸乙二醇酯(Polyethyleneterephthalate,PET)和聚苯乙烯(Polystyrene,PS)的最可能的替代品。
以高品质D-乳酸为原材料聚合而成的聚D-乳酸材料可以很好的替代普通化工产品聚合而成的纤维、塑料等制品。特别是在高端消费品领域，如尿不湿内置垫片，香烟过滤头等材料加工聚合方面，其独特的生物质材料特性、生物体相容性和无毒无害特性大幅度提升相关产品的品质，市场空间巨大。以聚D-乳酸为原料采用3D打印技术制造的新产品具备环保、机械性能良好、安全性等多重优点，被广泛应用于汽车、一次性用品、电子、医疗等领域。更加值得关注的是极高光学纯D-乳酸和L-乳酸加工聚合而成的高品质聚乳酸(PLA)与同样生物可降解的丁二酸丁二醇酯-己二酸丁二醇酯共聚物(PBSA)混纺可以大幅提高生物可降解材料的强度和韧性，拓展相关产品的应用领域。目前巴斯夫等公司已经完成了PLA与PBSA混纺产品的试制，并成功推出了一系列性能优良的新型生物可降解材料，相关进展大幅度增加了极高光学纯D-乳酸和L-乳酸的市场需求。
米根霉，嗜热乳杆菌等传统乳酸生产菌株由于其自身特性和所需培养基复杂等特点导致所产乳酸光学纯度无法满足聚合级的要求而不能用于极高光学纯D-乳酸和L-乳酸的规模化生产。重组酵母和重组大肠杆菌具备极高光学纯D-乳酸和L-乳酸合成能力，且具备营养要求低，易于高密度培养，工业化规模推广容易的优点，成为极高光学纯D-乳酸和L-乳酸生产菌株的研究热点。与重组酵母，经过多重遗传修饰过的大肠杆菌，能够合成极高光学纯度和极高化学纯度的乳酸，并且由于大肠杆菌培养温度显著高于酵母，重组大肠杆菌用于乳酸发酵生产的周期较重组酵母大为缩短。因此，重组大肠杆菌被认为是工业化规模下生产极高光学纯度D-乳酸和L-乳酸最理想的菌株。
特别是近年来，大肠杆菌作为D-乳酸生产菌种得到广泛的认可。当大肠杆菌同样可以用于高光学纯度L-乳酸的发酵生产时，对于D-乳酸和L-乳酸在同一条生产线上的交替生产意义重大。而且这也有助于高品质乳酸单体及聚乳酸制造业的快速发展。
围绕重组大肠杆菌作为生产菌株用于极高光学纯D-乳酸的发酵生产已经进行了多项成效显著的研究(ZhouL.etal.,CurrentMicrobiology,2011,62:981-989；ZhuY.etal.,AppliedEnvironmentalMicrobiology,2007,73:456-464；ZhouS.etal.,AppliedEnvironmentalMicrobiology,2003,69:399-407；ZhuJ.etal.,AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2004,64:367-375；ZhuJ.etal.,MetabolicEngineering,2005,7:104-115；BunchP.K.etal.,Microbiology,1997,143:187-195)。如，1)严格厌氧发酵提高产酸效率(Lietal.,AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2002,60:101-106)；2)停止通风条件下的低搅拌限氧发酵提高产酸效率(ZhouL.etal.,CurrentMicrobiology,2011,62:981-989)；3)维持微好氧发酵条件提高产酸效率(TianKetal.,2012
AfricanJournalofBiotechnology,11(21):4860-4867；ZhouLetal.,Biotechnologyletters2012,34:11231130)；4)采用适宜培养温度菌体生长和亚适宜生长温度限制菌体生长提高发酵产酸效率(NiuDetal.,MicrobialCellFactories2014,13:78-88；ZhouLetal.,MetabolicEngineering,2012,14:560568)；5)通过菌体生长和发酵产酸采用不同碳源的方式提高发酵产酸效率等(ZhuLetal.,AppliedEnvironmentalMicrobiology,2007,73:456-464).
发明人前期获得的授权专利(中国专利，专利号：ZL201210102731.8)则通过基因转录水平上引入温度调控元件，并配合发酵温度调控策略大幅度提高了D-乳酸的合成效率。本发明在此基础上通过引入菌体生长定量控制调控机制，形成了菌体生长过程和D-乳酸合成过程的双开关机制，进一步提高了D-乳酸合成效率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供了一种聚合级乳酸单体生产菌。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供了上述聚合级乳酸单体生产菌的构建方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供了应用上述聚合级乳酸单体生产菌的乳酸制造技术，具体来说，是结合菌种代谢生长及产酸过程的特性和工业化规模生产的特点形成的低成本易实施的微生物法极高光学纯乳酸单体高效制造技术。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种用于发酵生产极高光学纯D-乳酸的聚合级乳酸单体生产菌，菌株保藏号为CGMCCNo.11059(是实施例中菌株编号为B0013-090B的菌株)。
一种用于发酵生产极高光学纯L-乳酸的聚合级乳酸单体生产菌，菌株保藏号为CGMCCNo.11060(是实施例中菌株编号为B0013-101J的菌株)。
上述用于发酵生产极高光学纯D-乳酸的聚合级乳酸单体生产菌和用于发酵生产极高光学纯L-乳酸的聚合级乳酸单体生产菌分别具备形成极高光学纯度D-乳酸和极高光学纯度L-乳酸的能力，光学纯度可以高于99.9％，所述D-乳酸和L-乳酸的光学纯度特征均可以满足高品质聚乳酸聚合过程对乳酸单体光学纯度的最高要求。
上述用于发酵生产极高光学纯D-乳酸的聚合级乳酸单体生产菌和用于发酵生产极高光学纯L-乳酸的聚合级乳酸单体生产菌分别具备形成高化学纯度D-乳酸和高化学纯度L-乳酸的能力，化学纯度可以高于99％，所述D-乳酸的和L-乳酸的化学纯度特征经过简单的后续处理甚至不处理可以满足高品质聚乳酸聚合过程对乳酸单体化学纯度的最高要求。
上述用于发酵生产极高光学纯D-乳酸的聚合级乳酸单体生产菌和用于发酵生产极高光学纯L-乳酸的聚合级乳酸单体生产菌的构建方法为：
单个或多个基因被敲除进行菌株初步构建，这些基因包括：ldhA，thiE，dld，ackA，pta，pps，pflB，poxB，frdA，adhE，lldD；单个或多个基因被表达，这些基因包括：kan-cIts857-pR-pL-ldhA,ldhBcoa，ldhLca，ldhStrb；
使用了温度诱导型基因转录方式来控制和调节细胞生长过程和乳酸形成过程，包括：菌株初步构建后，菌株在25-50℃条件下分阶段完成细胞发酵培养-诱导-产酸，细胞生长过程在单一发酵因子调控下可以定量控制细胞的积累量，所述单一发酵因子是细胞中央代谢途径关键酶转录过程的调控因子、关键酶翻译过程的调控因子、关键酶分泌过程的调控因子或关键酶表达后催化过程调控因子。
优选的，上述聚合级乳酸单体生产菌的构建方法，所述菌株积累量的定量控制可以通过预先计算，在不同的发酵体系下添加一定量的单一发酵因子按照生产过程的实际需求精确控制。
优选的，上述聚合级乳酸单体生产菌的构建方法，菌株初步构建后菌株的生长过程都与单一发酵因素的调控相关联，所述单一发酵因素可以是碳源，如葡萄糖、甘油；也可以是单元如酵母膏、蛋白胨、硫酸铵、磷酸氢铵；也可以是金属离子，如铁离子、镁离子、钙离子、锌离子、锰离子、钴离子、铜离子、钠离子、钾离子；也可以是营养元素，如VB1、VB6、VB12、生物素、盐酸硫胺素、焦磷酸硫胺素，等等，特别是其中一种单一发酵因素可以定量的控制细胞的积累过程，并保证细胞快速积累且具备高活性；可以以开关控制的方式启动或关闭乳酸的合成过程，并且这一过程可以通过预先定量添加对应的发酵因素完成上述调控过程。
一种乳酸制造技术，具体方法为：应用上述聚合级乳酸单体生产菌，所述菌株的宿主细胞生长过程在全合成的无机盐培养基中快速进行，所述全合成的无机盐培养基为含硫胺素的培养基，所述宿主细胞在全合成培养基中快速生长，其中，7L发酵体系下于8-10h内菌体量积累到细胞干重11.5g/L，通过定量补加单一发酵因子，细胞干重进行更高积累，宿主细胞培养过程中不大量形成乳酸，即乳酸的痕量形成不影响细胞生长，宿主细胞在生长完成后快速积累乳酸。
优选的，上述乳酸制造技术，D-乳酸和L-乳酸的积累过程通过更换相应聚合级乳酸单体生产菌在同一套生产体系下切换式进行。
上述全合成培养基中有机物的添加不影响上述细胞高密度培养的过程，但不添加有机物更有利于上述细胞高密度培养过程的进行。
优选的，上述乳酸制造技术，所述全合成的无机盐培养基主体成分如下：
用于D-乳酸发酵生产的发酵培养基(g/L)：磷酸氢二铵0-25，磷酸二氢钾0-5，磷酸氢二钠0-25，氯化钠0-5，MgSO40-0.5，FeSO40-1，FeCl30-1，CoCl20-1，CuCl20-1，Na2MoO40-1，H3BO30-1，MnCl20-1，柠檬酸0-25，硫胺素0-1，木糖0-50，甘油0-50，葡萄糖0-50，硫酸0-5，pH6.0-7.5。
用于L-乳酸发酵生产的发酵培养基(g/L)：磷酸氢二铵0-25，磷酸二氢钾0-5，磷酸氢二钠0-25，氯化钠0-5，MgSO40-0.5，FeSO40-1，FeCl30-1，CoCl20-1，CuCl20-1，ZnCl20-1，Na2MoO40-1，H3BO30-1，MnCl20-1，柠檬酸0-25，硫胺素0-1，木糖0-50，甘油0-50，葡萄糖0-50，硫酸0-5，pH6.0-7.5。
所述的发酵产酸过程具备可设定型的自动启动特征，通过培养基组分和菌种自身生长特性的组合，细胞生长至特定阶段后由于培养基中对应调控因子组分的含量变化自动启动产酸过程。
优选的，上述乳酸制造技术，所述菌株的生长过程以及乳酸形成过程都与发酵温度的过程相关联，发酵产酸过程在非固定温度下完成的，根据生产菌种产酸特性，其发酵温度的变化呈现梯度上升的趋势，且存在一定组合方式下，温度对产酸过程的影响最显著，产酸效率最高，如：发酵温度升高生长会变缓慢，而发酵温度降低生长会非常迅速，具备积累高活性细胞的特点；发酵温度升高乳酸会快速形成，而发酵温度降低乳酸会缓慢形成，甚至不形成，具备高效积累乳酸的特点。
优选的，上述乳酸制造技术，所述菌株先在25-36℃下利用葡萄糖快速生长形成菌体，然后在37-50℃下利用葡萄糖快速积累乳酸。
由于菌株在较低的温度下，如25-36℃，D-乳酸和L-乳酸合成关键酶编码基因ldhA和BcoaLDH的转录被强烈抑制；而在较高温度下，如37-50℃，D-乳酸和L-乳酸合成关键酶编码基因ldhA和BcoaLDH的转录被强烈启动，由此可见，菌株在生长的温度和形成乳酸的温度可以是单一温度下的持续过程，也可以是多个温度点梯度式的组合过程。更优先使用多个温度点梯度式的组合过程。
优选的，上述乳酸制造技术，具体步骤为：
(1)通过基因工程技术对D-乳酸和L-乳酸高产重组菌染色体上的乳酸脱氢酶编码基因的表达进行简易条件下的动态调控获得产酸菌株；
(2)将菌株在25-36℃、200r/min好氧生长6-10h，再在37-45℃静置培养发酵乳酸，并以出发菌种B0013-070作为对照菌种，分析细胞密度、糖耗、乳酸产率、代谢主要中间产物及其它有机酸产物等，确定乳酸合成诱导时机；菌株分别在添加0.06-100μg/L硫胺素、200r/min进行摇瓶培养；
(3)发酵生产极高光学纯D-乳酸时，限氧阶段0-3h发酵温度为33-39℃，3-6h发酵温度为37-42℃，6-10h发酵温度为38-45℃，10-16h发酵温度为40-48℃，16-24h发酵温度为45-50℃。
(3’)发酵生产极高光学纯L-乳酸时，限氧阶段发酵温度为37-50℃，其余同步骤(3)。
优选的，上述乳酸制造技术，还包括发酵结束后乳酸的提取方法，结合生产菌种基因工程改造后的特征，发酵液中D-乳酸和L-乳酸均以极高光学纯度和化学纯度的形式存在，全合成培养基的使用保证了后提取过程的简洁型，其最终产品的提取方式包括酸化，板框去除菌体，超滤去除色素和杂蛋白，离子交换去除阴阳离子干扰，浓缩制备相应浓度的产品，并纳滤精制产品等环节。
优选的，上述乳酸制造技术，所述乳酸形成过程结束后通过低温酸化的方式将D-乳酸和L-乳酸游离出来，且上述乳酸游离的过程不受发酵液中其他残余物的影响，酸化使用的酸可以是硫酸，也可以是盐酸或草酸，更优选使用硫酸。
上述乳酸制造技术，所发酵生产的极高光学纯D-乳酸和L-乳酸过程耗时不多于30-36h，产D-乳酸和L-乳酸水平分别达到150g/L和180g/L或以上，D-乳酸和L-乳酸光学纯度均在99.95以上，化学纯度均在97％以上。
上述乳酸制造技术，还包括具有类似反应过程的其他化学品，如柠檬酸、甲酸、乙酸、丙酮酸、丁二酸、苹果酸、α-酮戊二酸、丁二酸、己二酸、戊二胺、己二胺、甲基丙烯酸、异戊二烯、衣康酸等多种有机酸和有机胺；或脯氨酸、丙氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、精氨酸等多种氨基酸；硫胺素、维生素B12等多种微生物；或乙醇、丙醇等短链醇；或低聚异麦芽糖、低聚果糖、低聚半乳糖等多种功能糖等等。
本发明的有益效果是：
本申请在ZL201210102731.8所述通过基因转录水平上引入温度调控元件，并配合发酵温度调控策略大幅度提高了D-乳酸的合成效率的基础上，通过引入菌体生长定量控制调控机制，形成了菌体生长过程和D-乳酸合成过程的双开关机制，进一步提高了D-乳酸合成效率；本发明中所述极高光学纯L-乳酸产生菌充分利用了外源L-乳酸脱氢酶翻译表达后的酶学特性，并引入了其催化活性的温度调控机制，配合菌体生长定量控制的调控机制，完成了菌体生长和L-乳酸合成的双开关控制。
更为突出的是，本发明中所述极高光学纯D-乳酸生产过程和极高光学纯L-乳酸生产过程可以通过菌种的简单切换在同一生产体系下完成两个产品的规模化生产。
具体有益效果如下：
1、本发明提供的重组菌具有明显的高效合成极高光学纯D-乳酸和L-乳酸的能力，同时上述重组菌具备的合成高化学纯度D-乳酸和L-乳酸的能力。菌种在25-50℃的条件下细胞快速生长8-10h，发酵产酸16-18h，产D-乳酸水平达到15％(w/v)或以上，产L-乳酸水平达到18％(w/v)或以上；
2、本发明的高效合成极高光学纯乳酸单体基因工程菌，在菌体培养过程中，采用全合成培养基，培养液澄清，有利于后续产品分离提取；
3、本发明的高效合成极高光学纯乳酸单体基因工程菌，在菌体生长和发酵产酸过程可以通过温度变化有效控制；
4、本发明的高效合成极高光学纯乳酸单体基因工程菌，在菌体生长和发酵产酸过程可以通过营养元素的添加定量控制和开关控制
5、本发明的极高光学纯乳酸单体高效制造过程：菌体细胞生长温度在25-36℃下利用葡萄糖快速生长6-12h，形成菌体；在37-50℃下利用葡萄糖快速合成极高光学纯D-乳酸和L-乳酸。即：运用本发明的重组菌及其极高光学纯乳酸单体制备工艺，生产过程仅需改变发酵温度控制参数并配合营养元素的添加，即可实现极高光学纯D-乳酸和L-乳酸的高效制备过程。
附图说明
图1突变盒质粒pUC-ldhAp::kan-cIts857-pR-pL的物理图谱；
图2突变盒质粒pUC-thiE’::difGm的物理图谱；
图3突变盒质粒pUC-dld’::difGm的物理图谱；
图4突变盒质粒pUC-ackA-pta’::difGm的物理图谱；
图5突变盒质粒pUC-pps’::difGm的物理图谱；
图6突变盒质粒pSK-pflB’::difGm的物理图谱；
图7突变盒质粒pUC-poxB’::difGm的物理图谱；
图8突变盒质粒pSKsym-frdA’::difGm的物理图谱；
图9突变盒质粒pUC-adhE’::difGm的物理图谱；
图10突变盒质粒pUC-ldhA::difGm的物理图谱；
图11突变盒质粒pUC-lldD’::PldhA-ldhBcoa-difGm的物理图谱；
图12突变盒质粒pUC-lldD’::PldhA-ldhLca-difGm的物理图谱；
图13突变盒质粒pUC-lldD’::PldhA-ldhStrb-difGm的物理图谱，
图14突变盒质粒pUC-ldhA’::PldhA-ldhLca-difGm的物理图谱；
图15突变盒质粒pUC-ldhA’::PldhA-ldhStrb-difGm的物理图谱；
图16突变盒质粒pUC-thiE’::PldhA-ldhLca-difGm的物理图谱；
图17突变盒质粒pUC-thiE’::PldhA-ldhStrb-difGm的物理图谱。
图18突变盒质粒pUC-thiE’::PldhAldhBcoa-difGm的物理图谱。
图19极高光学纯D-乳酸产生菌株筛选结果；
图20极高光学纯L-乳酸产生菌株筛选结果；
图21极高光学纯D-乳酸发酵产生进程；
图22D-乳酸光学纯度检测图谱；
图23极高光学纯L-乳酸发酵产生进程；
图24L-乳酸光学纯度检测图谱。
保藏信息
分类名词：大肠埃希氏菌Escherichiacoli
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2015年7月7日
保藏号：CGMCCNo.11059
参据的生物材料(株)：B0013-090B
分类名词：大肠埃希氏菌Escherichiacoli
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2015年7月7日
保藏号：CGMCCNo.11060
参据的生物材料(株)：B0013-101J
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
本发明提供一种极高光学纯D-乳酸和极高光学纯L-乳酸高产菌株与构建方法及极高光学纯D-乳酸和极高光学纯L-乳酸高效制备工艺，菌体在25-36℃下利用葡萄糖快速生长形成高活性细胞，然后在37-50℃下高效积累极高光学纯D-乳酸和极高光学纯L-乳酸，且所积累乳酸的化学纯度极高。其工艺特征是：25-50℃的条件下，分别经过发酵培养菌体，变温高效产酸阶段，产D-乳酸水平达到15％(w/v)或以上，光学纯度99.9％以上，化学纯度97％以上；产L-乳酸水平达到18％(w/v)或以上，光学纯度99.9％以上，化学纯度98％以上。
本发明涉及的具体方法有：
染色体基因整合技术：运用PCR(多聚酶链反应)从大肠杆菌基因组中扩增获得染色体目标整合位点的上游及下游各50-700bp基因序列。将目的整合表达基因与抗性基因进行连接，所获得的片段克隆入上述目标整合位点的上游和下游基因序列之间，形成目的基因整合序列，如ldhA::kan-cIts857-pR-pL,thiE’::difGm,dld’::difGm,ackA-pta’::difGm,pps’::difGm,pflB’::difGm,poxB’::difGm,frdA’::difGm,adhE’::difGm,ldhA’::difGm,lldD’::PldhA-ldhBcoa-difGm,lldD’::PldhA-ldhLca-difGm,lldD’::PldhA-ldhStrb-difGm,ldhA’::PldhA-ldhLca-difGm,ldhA’::PldhA-ldhStrb-difGm,thiE’::PldhA-ldhLca-difGm，thiE’::PldhA-ldhStrb-difGm，thiE’::PldhA-ldhBcoa-difGm。将上述基因整合序列单独或两两组合或多个组合转化入大肠杆菌。在选择性培养基上选择培养出转化子。提取转化子染色体DNA，用PCR对转化子的目的基因突变进行验证。发酵试验筛选最优的极高光学纯D-乳酸高产菌如B0013-090B和极高光学纯L-乳酸高产菌如B0013-101J。
利用上述重组方法，按照以下步骤完成对动态调控D-乳酸重组菌的构建。
1研究菌种：大肠杆菌B0013(ZhouL.etal.,CurrMicrobiol,2011,62:981-989)。
2利用基因整合技术，将步骤1所获得的出发菌种中的乳酸脱氢酶基因的启动子ldhAp替换为pR-pL启动子(LoveC.A.etal.,Gene,1996,176:49-53)，并获得重组大肠杆菌1。
3利用基因整合技术，构建硫胺素磷酸合成酶(thiE)编码基因删除用突变盒thiE’::difGm，删除步骤2所获重组菌的thiE基因，获得重组大肠杆菌2。
4利用基因整合技术，构建FAD依赖型D-乳酸脱氢酶(dld)编码基因删除用突变盒dld’::difGm，删除步骤3所获重组菌的dld基因，获得重组大肠杆菌3。
5利用基因整合技术，构建乙酸激酶(ackA)和磷酸转乙酰酶(pta)编码基因删除用突变盒ackA-pta’::difGm，删除步骤4所获重组菌的ackA-pta基因，获得重组大肠杆菌4。
6利用基因整合技术，构建磷酸烯醇式丙酮酸合酶(pps)编码基因删除用突变盒pps’::difGm，删除步骤4和步骤5所获重组菌的pps基因，获得重组大肠杆菌5和6。
7利用基因整合技术，构建丙酮酸甲酸裂解酶(pflB)编码基因删除用突变盒pflB’::difGm，删除步骤4，步骤5和步骤6所获重组菌的pflB基因，获得重组大肠杆菌7-10。
8利用基因整合技术，构建丙酮酸氧化酶(poxB)编码基因删除用突变盒poxB’::difGm，删除步骤4，步骤5，步骤6和步骤7所获重组菌的pflB基因，获得重组大肠杆菌11-18。
9利用基因整合技术，构建富马酸还原酶(frdA)编码基因删除用突变盒frdA’::difGm，删除步骤4，步骤5，步骤6，步骤7和步骤8所获重组菌的frdA基因，获得重组大肠杆菌19-34。
10利用基因整合技术，构建乙醇脱氢酶(adhE)编码基因删除用突变盒adhE’::difGm，删除步骤4，步骤5，步骤6，步骤7，步骤8和步骤9所获重组菌的adhE基因，获得重组大肠杆菌35-66。
11利用基因整合技术，构建D-乳酸脱氢酶(ldhA)编码基因删除用突变盒ldhA’::difGm，删除重组菌B0013-070的ldhA基因，获得重组大肠杆菌67。
12利用基因整合技术，构建D-乳酸脱氢酶基因(ldhA)编码基因删除用突变盒ldhA’::PldhA-ldhLca-difGm，删除重组菌B0013-070的ldhA基因，获得重组大肠杆菌68。
13利用基因整合技术，构建D-乳酸脱氢酶基因(ldhA)编码基因删除用突变盒ldhA’::PldhA-ldhStrb-difGm，删除重组菌B0013-070的ldhA基因，获得重组大肠杆菌69。
14利用基因整合技术，构建FMN为辅酶的L-乳酸脱氢酶基因(lldD)编码基因删除用突变盒lldD’::PldhA-ldhBcoa-difGm，删除重组菌B0013-070和步骤11，步骤12以及步骤13所获重组菌的lldD基因，获得重组大肠杆菌70-73。
15利用基因整合技术，构建FMN为辅酶的L-乳酸脱氢酶基因(lldD)编码基因删除用突变盒lldD’::PldhA-ldhLca-difGm，删除重组菌B0013-070和步骤11，步骤12以及步骤13所获重组菌的lldD基因，获得重组大肠杆菌74-77。
16利用基因整合技术，构建FMN为辅酶的L-乳酸脱氢酶基因(lldD)编码基因删除用突变盒lldD’::PldhA-ldhLca-difGm，删除重组菌B0013-070和步骤11，步骤12以及步骤13所获重组菌的lldD基因，获得重组大肠杆菌78-81。
17利用基因整合技术，硫胺素磷酸合成酶(thiE)编码基因删除用突变盒thiE’::difGm，删除步骤11，步骤12，步骤13，步骤14，步骤15和步骤16所获重组菌的thiE基因，获得重组菌种82-96。
18利用基因整合技术，硫胺素磷酸合成酶(thiE)编码基因删除用突变盒thiE’::PldhA-ldhLca-difGm，删除步骤11，步骤12，步骤13，步骤14，步骤15和步骤16所获重组菌的thiE基因，获得重组菌种97-111。
19利用基因整合技术，硫胺素磷酸合成酶(thiE)编码基因删除用突变盒thiE’::PldhA-ldhStrb-difGm，删除步骤11，步骤12，步骤13，步骤14，步骤15和步骤16所获重组菌的thiE基因，获得重组菌种112-126。
20利用基因整合技术，硫胺素磷酸合成酶(thiE)编码基因删除用突变盒thiE’::PldhA-ldhBcoa-difGm，删除步骤11，步骤12，步骤13，步骤14，步骤15和步骤16所获重组菌的thiE基因，获得重组菌种127-156
21将步骤4，步骤5，步骤6，步骤7，步骤8，步骤9，步骤10，步骤11，步骤12，步骤13，步骤14，步骤15，步骤16，步骤17，步骤18，步骤19和步骤20所获得的重组菌种在30℃和45℃、200r/min进行摇瓶培养，并以出发菌种B0013-070作为对照菌种，分析赖氨酸脱氢酶比活性，鉴定pR-pL启动子和thiE的功能，并筛选出最优菌种。
22将步骤21所获得的最优菌种分别在25-36℃、200r/min进行摇瓶培养，并以出发菌种B0013-070作为对照菌种，分析细胞密度、乳酸、代谢主要中间产物及其它有机酸产物等，确定菌体生长培养温度。
23将步骤21所获得的最优菌种在25-36℃、200r/min好氧生长-10h，再在37-45℃静置培养发酵乳酸，并以出发菌种B0013-070作为对照菌种，分析细胞密度、糖耗、乳酸产率、代谢主要中间产物及其它有机酸产物等，确定乳酸合成诱导时机。
24将步骤最优所获得的最优菌种分别在添加0.06-100μg/L硫胺素、200r/min进行摇瓶培养，并以出发菌种B0013-070作为对照菌种，分析细胞密度、乳酸、代谢主要中间产物及其它有机酸产物等，确定菌体生长硫胺素添加量。
25将步骤20所获得的最优菌种在7L-30,000L发酵罐中进行乳酸发酵试验。发酵过程中定时取样，分析细胞密度、糖耗、乳酸产率、代谢主要中间产物及其它有机酸产物等。
下面以具体实例对本发明技术方案作进一步详细说明。
实施例1——突变盒ldhA::kan-cIts857-pR-pL的构建
用引物ldhA1和ldhA2PCR扩增B0013染色体上的ldhA基因片段ldhA’，克隆入pUC18载体，获得重组质粒pUC-ldhA’。用引物PPL1和PPL2对质粒pPL451进行反向PCR扩增，并与卡那霉素抗性基因片段(质粒pSKsymKm用SmaI酶切，胶回收966bp片段)进行连接，获得重组质粒pPL-Kan。用引物PPL3和PPL4对质粒pPL-Kan进行PCR扩增，产物用EcoRI和EcoRV进行双酶切，并与以pUC-ldhA’为模板用引物Ec-RlA1和Ec-RlA2进行反向PCR扩增并用EcoRI进行酶切的产物连接，从而获得重组质粒pUC-ldhAp::kan-cIts857-pR-pL。所得重组质粒的物理图谱如附图1所示。将重组质粒pUC-ldhAp::kan-cIts857-pR-pL用KpnI酶切，并胶回收线性化质粒，用引物ldhA1和ldhA2进行PCR扩增，获得ldhAp::kan-cIts857-pR-pL基因片段。
实施例2——突变盒thiE::difGm的构建
以E.coliB0013染色体DNA为模板，ThiE1p和ThiE2p为引物扩增获得长度为0.6kb的thiE基因部分序列。将此克隆入pUC18，获得重组质粒pUC-thiE。将长度为1.2kb的difGm片段克隆入thiE中间的StuI位点，获得重组质粒pUC-thiE::difGm。所得重组质粒的物理图谱如附图2所示。将重组质粒pUC-thiE::difGm用ApaLI酶切，并胶回收线性化质粒，用引物ThiE1p和ThiE2p进行PCR扩增，获得thiE::difGm基因片段。
实施例3——突变盒dld::difGm的构建
以菌株B0013染色体DNA为模板，用引物Dld1和Dld2PCR扩增dld’基因片段(0.9kb)，PCR产物克隆于载体pUC18SmaI位点，获得重组质粒pUC-dld’。用EcoRV酶切该重组质粒，去除dld’基因中部0.4kb基因片段，并克隆入dif-Gm-dif片段，获得重组质粒pUC-dld’::difGm。所得重组质粒的物理图谱如附图3所示。将重组质粒pUC-dld’::difGm用EcoRI酶切，并胶回收线性化质粒，用引物Dld1和Dld2进行PCR扩增，获得dld’::difGm基因片段。
实施例4——突变盒ackA-pta::difGm的构建
以菌株B0013染色体DNA为模板，用引物AckA-Pta1和AckA-Pta2PCR扩增ackA-pta’基因片段(2.8kb)，PCR产物克隆于载体pUC18中，获得重组质粒pUC-ackA-pta’。用EcoRV酶切该重组质粒，去除ackA-pta’基因中部2.6kb基因片段，并克隆入dif-Gm-dif片段，获得重组质粒pUC-ackA-pta’::difGm。所得重组质粒的物理图谱如附图4所示。将重组质粒pUC-ackA-pta’::difGm用KpnI酶切，并胶回收线性化质粒，用引物AckA-Pta1和AckA-Pta2进行PCR扩增，获得ackA-pta’::difGm基因片段。
实施例5——突变盒pps::difGm的构建
以菌株B0013染色体DNA为模板，用引物Pps1和Pps2PCR扩增pps基因片段(2.3kb)，PCR产物克隆于载体pUC18中，获得重组质粒pUC-pps’。以质粒pUC-pps’为模板，用引物RPps1和RPps2进行反向PCR扩增，去除pps’基因中部2.1kb基因片段，并克隆入dif-Gm-dif片段，获得重组质粒pUC-pps’::difGm。所得重组质粒的物理图谱如附图5所示。将重组质粒pUC-pps’::difGm用ApaLI酶切，并胶回收线性化质粒，用引物Pps1和Pps2进行PCR扩增，获得pps’::difGm基因片段。
实施例6——突变盒pflB::difGm的构建
以大肠杆菌B0013染色体DNA为模板，PflB1和PflB2为引物进行PCR扩增，其扩增产物PflB’克隆于载体pSK的EcoRV和SmaI位点(在这过程中PstI和EcoRI消失)，获得重组质粒pSK-pflB’。PstI酶切重组质粒pSK-pflB’，补平并与pSK-EcdifGm中的difGm连接获得重组质粒pSK-pflB’::difGm。所得重组质粒的物理图谱如附图6所示。重组质粒pSK-pflB’::difGm用ApaLI酶切，并胶回收线性化质粒，用引物PflB1和PflB2进行PCR扩增，获得pflB’::difGm基因片段。
实施例7——突变盒poxB::difGm的构建
用引物PoxB1和PoxB2扩增大肠杆菌的poxB基因片段，PCR产物克隆入质粒pUC18的SmaI酶切位点获得重组质粒pUC-poxB’。该重组质粒用EcoRⅤ酶切，克隆入dif-Gm片段获得重组质粒pUC-poxB’::difGm。所得重组质粒的物理图谱如附图7所示。将重组质粒pUC-poxB’::difGm用ApaLI酶切，并胶回收线性化质粒，用引物PoxB1和PoxB2进行PCR扩增，获得poxB’::difGm基因片段。
实施例8——突变盒frdA::difGm的构建
以菌株B0013染色体DNA为模板，用引物FrdA1和FrdA2PCR扩增frdA’基因片段(1.6kb)，PCR产物克隆于载体pSKsymSmaI位点，获得重组质粒pSKsym-frdA’。用PstI酶切该重组质粒，去除frdA’基因中部1.3kb基因片段，用T4DNApolymerase使PstI粘性末端平滑化，并克隆入dif-Gm-dif片段，获得重组质粒pSKsym-frdA’::difGm。所得重组质粒的物理图谱如附图8所示。将重组质粒pSKsym-frdA’::difGm用ApaLI酶切，并胶回收线性化质粒，用引物FrdA1和FrdA2进行PCR扩增，获得frdA’::difGm基因片段。
实施例9——突变盒adhE::difGm的构建
以菌株B0013染色体DNA为模板，用引物AdhE1和AdhE2PCR扩增adhE’基因片段(1.4kb)，PCR产物克隆于载体pUC19SmaI位点，获得重组质粒pUC-adhE’。用EcoRV酶切该重组质粒，去除adhE’基因中部1kb基因片段，并克隆入dif-Gm-dif片段，获得重组质粒pUC-adhE’::difGm。所得重组质粒的物理图谱如附图9所示。重组质粒pUC-adhE’::difGm用EcoRI和PstI双酶切重组质粒pUC-adhE’::difGm，胶回收adhE1-dif-Gm-dif-adhE2基因片段。
实施例10——突变盒ldhA::difGm的构建
以大肠杆菌B0013染色体DNA为模板，ldhA3和ldhA4为引物，运用PCR扩增获得了乳酸脱氢酶基因(ldhA)，将此PCR产物克隆入pUC18的EcoRI位点中，获得重组质粒pUC-ldhA。用PstI酶切去除其中的400bps的片段并用T4DNA多聚酶将粘性末端补平，再与difGm片段连接，获得重组质粒pUC-ldhA::Gmdif。所得重组质粒的物理图谱如附图10所示。用EcoRI酶切该重组质粒，获得乳酸脱氢酶的基因删除序列，ldhA'-dif-Gm-dif-ldhA，即：ldhA::Gmdif。
实施例11——突变盒lldD::PldhA-ldhBcoa-difGm的构建
以E.coliCICIMB0013染色体DNA为模板，扩增(引物ldhA5和ldhA6)获得ldhA基因的全部启动子和部分结构区片段，并将片段ldhA’克隆入亚克隆载体pUC18获得重组质粒pUC-ldhA’。以pUC-ldhA’为模板用引物RldhA1和RldhA12进行反向PCR扩增并进行产物自连接，从而获得重组质粒pUC-PldhA。以BacilluscoagulansCICIMB1821染色体DNA为模板运用PCR技术扩增(引物BcoaLDH1和BcoaLDH4)获得ldhBcoa基因片段经BamHI和EcoRI酶切后克隆入质粒pUC-PldhA’的BglII和EcoRI，获得重组质粒pUC-PldhA-ldhBcoa。然后将difGm片段克隆入重组质粒pUC-PldhA-ldhBcoa的EcoRV位点。获得重组质粒pUC-PldhA-ldhBcoa-difGm。
通过PCR扩增(引物lldD1和lldD2)获得lldD基因片段，并将该片段克隆入亚克隆载体pUC18获得重组质粒pUC-lldD。重组质粒pUC-PldhA-ldhBcoa-difGm经BamHI酶切获得PldhA-ldhBcoa-difGm片段克隆入重组质粒pUC-lldD的BamHI位点。获得重组质粒pUC-lldD::PldhA-ldhBcoa-difGm。所得重组质粒的物理图谱如附图11所示。将重组质粒pUC-lldD::PldhA-ldhBcoa-difGm用SmaI酶切，并胶回收获得lldD::PldhA-ldhBcoa-difGm基因片段。
实施例12——突变盒lldD::PldhA-ldhLca-difGm的构建
以E.coliCICIMB0013染色体DNA为模板，扩增(引物ldhA5和ldhA6)获得ldhA基因的全部启动子和部分结构区片段，并将片段ldhA’克隆入亚克隆载体pUC18获得重组质粒pUC-ldhA’。以pUC-ldhA’为模板用引物RldhA1和RldhA12进行反向PCR扩增并进行产物自连接，从而获得重组质粒pUC-PldhA。以LactobacilluscaseiB1192染色体DNA为模板运用PCR技术扩增(引物LcaLDH1和LcaLDH4)获得ldhLca基因片段经BamHI和EcoRI酶切后克隆入质粒pUC-PldhA’的BglII和PstI，获得重组质粒pUC-PldhA-ldhLca。然后将difGm片段克隆入重组质粒pUC-PldhA-ldhLca的EcoRV位点。获得重组质粒pUC-PldhA-ldhLca-difGm。
通过PCR扩增(引物lldD1和lldD2)获得lldD基因片段，并将该片段克隆入亚克隆载体pUC18获得重组质粒pUC-lldD。重组质粒pUC-PldhA-ldhLca-difGm经BamHI酶切获得PldhA-ldhLca-difGm片段克隆入重组质粒pUC-lldD的BamHI位点。获得重组质粒pUC-lldD::PldhA-ldhLca-difGm。所得重组质粒的物理图谱如附图12所示。将重组质粒pUC-lldD::PldhA-ldhLca-difGm用SmaI酶切，并胶回收获得lldD::PldhA-ldhLca-difGm基因片段。
实施例13——突变盒lldD::PldhA-ldhStrb-difGm的构建
以E.coliCICIMB0013染色体DNA为模板，扩增(引物ldhA5和ldhA6)获得ldhA基因的全部启动子和部分结构区片段，并将片段ldhA’克隆入亚克隆载体pUC18获得重组质粒pUC-ldhA’。以pUC-ldhA’为模板用引物RldhA1和RldhA12进行反向PCR扩增并进行产物自连接，从而获得重组质粒pUC-PldhA。以Steptococcus.bovis1.1624染色体DNA为模板运用PCR技术扩增(引物StrbLDH1和StrbLDH2)获得ldhStrb基因片段经BamHI和EcoRI酶切后克隆入质粒pUC-PldhA’的BglII和EcoRI，获得重组质粒pUC-PldhA-ldhStrb。然后将difGm片段克隆入重组质粒pUC-PldhA-ldhStrb的EcoRV位点。获得重组质粒pUC-PldhA-ldhBcoa-difGm。
通过PCR扩增(引物lldD1和lldD2)获得lldD基因片段，并将该片段克隆入亚克隆载体pUC18获得重组质粒pUC-lldD。重组质粒pUC-PldhA-ldhBcoa-difGm经BamHI酶切获得PldhA-ldhStrb-difGm片段克隆入重组质粒pUC-lldD的BamHI位点。获得重组质粒pUC-lldD::PldhA-ldhStrb-difGm。
所得重组质粒的物理图谱如附图13所示。将重组质粒
pUC-lldD::PldhA-ldhStrb-difGm用SmaI酶切，并胶回收获得
lldD::PldhA-ldhStrb-difGm基因片段。
实施例14——突变盒ldhA::PldhA-ldhLca-difGm的构建
以实施例10中的重组质粒pUC-ldhA用PstI酶切去除其中的400bps的片段并用pfu多聚酶将粘性末端补平，与实施例12中的重组质粒pUC-PldhA-ldhLca-difGm经BamHI酶切经pfu多聚酶将粘性末端补平片段PldhA-ldhLca-difGm连接，获得重组质粒pUC-ldhA::PldhA-ldhLca-difGm。所得重组质粒的物理图谱如附图14所示。将重组质粒pUC-ldhA::PldhA-ldhLca-difGm用ApaLI酶切，并胶回收线性化质粒，用引物ldhA3和ldhA4进行PCR扩增，获得ldhA::PldhA-ldhLca-difGm基因片段。
实施例15——突变盒ldhA::PldhA-ldhStrb-difGm的构建
以实施例10中的重组质粒pUC-ldhA用PstI酶切去除其中的400bps的片段并用pfu多聚酶将粘性末端补平，与实施例13中的重组质粒pUC-PldhA-ldhStrb-difGm经BamHI酶切经pfu多聚酶将粘性末端补平片段PldhA-ldhStrb-difGm连接，获得重组质粒pUC-ldhA::PldhA-ldhStrb-difGm。所得重组质粒的物理图谱如附图15所示。将重组质粒pUC-ldhA::PldhA-ldhStrb-difGm用ApaLI酶切，并胶回收线性化质粒，用引物ldhA3和ldhA4进行PCR扩增，获得ldhA::PldhA-ldhStrb-difGm基因片段。
实施例16——突变盒thiE::PldhA-ldhLca-difGm的构建
将实施例12中的重组质粒pUC-PldhA-ldhLca-difGm经BamHI酶切获得PldhA-ldhLca-difGm片段，DNA聚合酶pfu作用下补平片段PldhA-ldhLca-difGm并克隆入实施例2中的重组质粒pUC-thiE的StuI位点。获得重组质粒pUC-thiE::PldhA-ldhLca-difGm。所得重组质粒的物理图谱如附图16所示。将重组质粒pUC-thiE::PldhA-ldhLca-difGm用ApaLI酶切，并胶回收线性化质粒，用引物ThiE1p和ThiE2p进行PCR扩增，获得thiE::PldhA-ldhLca-difGm基因片段。
实施例17——突变盒thiE::PldhA-ldhStrb-difGm的构建
将实施例13中的重组质粒pUC-PldhA-ldhStrb-difGm经BamHI酶切获得PldhA-ldhStrb-difGm片段，DNA聚合酶pfu作用下补平片段ldhA-ldhStrb-difGm并克隆入实施例2中的重组质粒pUC-thiE的StuI位点。获得重组质粒pUC-thiE::PldhA-ldhStrb-difGm。所得重组质粒的物理图谱如附图17所示。将重组质粒pUC-thiE::PldhA-ldhStrb-difGm用ApaLI酶切，并胶回收线性化质粒，用引物ThiE1p和ThiE2p进行PCR扩增，获得thiE::PldhA-ldhStrb-difGm基因片段。
实施例18——突变盒thiE::PldhA-ldhBcoa-difGm的构建
将实施例11中的重组质粒pUC-PldhA-ldhBcoa-difGm经BamHI酶切获得PldhA-ldhBcoa-difGm片段，DNA聚合酶pfu作用下补平片段PldhA-ldhBcoa-difGm并克隆入实施例2中的重组质粒pUC-thiE的StuI位点。获得重组质粒pUC-thiE::PldhA-ldhBcoa-difGm。所得重组质粒的物理图谱如附图18所示。将重组质粒pUC-thiE::PldhA-ldhBcoa-difGm用ApaLI酶切，并胶回收线性化质粒，用引物ThiE1p和ThiE2p进行PCR扩增，获得thiE::PldhA-ldhBcoa-difGm基因片段。
实施例19——温控型极高光学纯D-乳酸产生菌株的构建
利用基因整合技术，将出发菌株B0013中的乳酸脱氢酶基因的启动子ldhAp替换为pR-pL启动子(LoveC.A.etal.,Gene,1996,176:49-53)，并获得重组菌种大肠杆菌B0013-010B(B0013ldhA::kan-cIts857-pR-pL)。
实施例20——生长可定量调控型极高光学纯D-乳酸产生菌株的构建
利用基因整合技术，构建硫胺素磷酸合成酶(thiE)编码基因删除用突变盒thiE’::difGm，删除步骤2所获重组菌的thiE基因，获得重组菌种大肠杆菌B0013-020B(B0013-010BthiE::dif)。
实施例21——D-乳酸代谢利用途径阻断型极高光学纯D-乳酸产生菌株的构建
利用基因整合技术，构建FAD依赖型D-乳酸脱氢酶(dld)编码基因删除用突变盒dld’::difGm，删除步骤3所获重组菌的dld基因，获得重组菌种大肠杆菌B0013-030B(B0013-020Bdld::dif)。
实施例22——厌氧乙酸合成途径阻断型极高光学纯D-乳酸产生菌株的构建
利用基因整合技术，构建乙酸激酶(ackA)和磷酸转乙酰酶(pta)编码基因删除用突变盒ackA-pta’::difGm，删除步骤4所获重组菌的ackA-pta基因，获得重组菌种大肠杆菌B0013-040B(B0013-030BackA-pta::dif)。
实施例23——丙酮酸回流途径阻断型极高光学纯D-乳酸产生菌株的构建
利用基因整合技术，构建磷酸烯醇式丙酮酸合酶(pps)编码基因删除用突变盒pps’::difGm，删除步骤4和步骤5所获重组菌的pps基因，获得重组菌种大肠杆菌B0013-040C(B0013-030Bpps::dif)和B0013-050B(B0013-040Bpps::dif)。
实施例24——甲酸厌氧合成途径阻断型极高光学纯D-乳酸产生菌株的构建
利用基因整合技术，构建丙酮酸甲酸裂解酶(pflB)编码基因删除用突变盒pflB’::difGm，删除步骤4，步骤5和步骤6所获重组菌的pflB基因，获得重组菌种大肠杆菌B0013-040D(B0013-030BpflB::dif)，B0013-050C(B0013-040BpflB::dif)，B0013-050D(B0013-040CpflB::dif)和B0013-060B(B0013-050BpflB::dif)。
实施例25——乙酸好氧合成途径阻断型极高光学纯D-乳酸产生菌株的构建
利用基因整合技术，构建丙酮酸氧化酶(poxB)编码基因删除用突变盒poxB’::difGm，删除步骤4，步骤5，步骤6和步骤7所获重组菌的pflB基因，获得重组菌种大肠杆菌B0013-040E(B0013-030BpoxB::dif)，B0013-050E(B0013-040BpoxB::dif)，B0013-050F(B0013-040CpoxB::dif)，B0013-060C(B0013-050BpoxB::dif)，B0013-050G(B0013-040DpoxB::dif)，B0013-060D(B0013-050CpoxB::dif)，B0013-060F(B0013-050DpoxB::dif)和B0013-070B(B0013-060BpoxB::dif)。
实施例26——丁二酸合成途径阻断型极高光学纯D-乳酸产生菌株的构建
利用基因整合技术，构建富马酸还原酶(frdA)编码基因删除用突变盒frdA’::difGm，删除步骤4，步骤5，步骤6，步骤7和步骤8所获重组菌的frdA基因，获得重组菌种大肠杆菌B0013-040F(B0013-030BfrdA::dif)，B0013-050H(B0013-040BfrdA::dif)，B0013-050I(B0013-040CfrdA::dif)，B0013-060G(B0013-050BfrdA::dif)，B0013-050J(B0013-040DfrdA::dif)，B0013-060H(B0013-050CfrdA::dif)，B0013-060I(B0013-050DfrdA::dif)，B0013-070C(B0013-060BfrdA::dif)，B0013-050K(B0013-040EfrdA::dif)，B0013-060J(B0013-050EfrdA::dif)，B0013-060K(B0013-050FfrdA::dif)，B0013-070D(B0013-060CfrdA::dif)，B0013-060L(B0013-050GfrdA::dif)，B0013-070E(B0013-060DfrdA::dif)，B0013-070F(B0013-060FfrdA::dif)和B0013-080B(B0013-070BfrdA::dif)。
实施例27——乙醇合成途径阻断型极高光学纯D-乳酸产生菌株的构建
利用基因整合技术，构建乙醇脱氢酶(adhE)编码基因删除用突变盒
adhE’::difGm，删除步骤4，步骤5，步骤6，步骤7，步骤8和步骤9所获重组菌的adhE基因，获得重组菌种大肠杆菌B0013-040G(B0013-030BadhE::dif)，B0013-050L(B0013-040BadhE::dif)，B0013-050M(B0013-040CadhE::dif)，B0013-060M(B0013-050BadhE::dif)，B0013-050N(B0013-040DadhE::dif)，B0013-060N(B0013-050CadhE::dif)，B0013-060O(B0013-050DadhE::dif)，B0013-070G(B0013-060BadhE::dif)，B0013-050O(B0013-040EadhE::dif)，B0013-060P(B0013-050EadhE::dif)，B0013-060Q(B0013-050FadhE::dif)，B0013-070H(B0013-060CadhE::dif)，B0013-060R(B0013-050GadhE::dif)，B0013-070I(B0013-060DadhE::dif)，B0013-070J(B0013-060FadhE::dif)，B0013-080C(B0013-070BadhE::dif)。B0013-050P(B0013-040FadhE::dif)，B0013-060S(B0013-050HadhE::dif)，B0013-060T(B0013-050IadhE::dif)，B0013-070K(B0013-060GadhE::dif)，B0013-060U(B0013-050JadhE::dif)，B0013-070L(B0013-060HadhE::dif)，B0013-070M(B0013-060IadhE::dif)，B0013-080D(B0013-070CadhE::dif)，B0013-060V(B0013-050KadhE::dif)，B0013-070N(B0013-060JadhE::dif)，B0013-070O(B0013-060KfrdA::dif)，B0013-080E(B0013-070DadhE::dif)，B0013-070P(B0013-060LadhE::dif)，B0013-080F(B0013-070EadhE::dif)，B0013-080G(B0013-070FadhE::dif)和B0013-090B(B0013-080BadhE::dif)。
实施例28——D-乳酸合成途径阻断型菌株的构建
利用基因整合技术，构建D-乳酸脱氢酶(ldhA)编码基因删除用突变盒ldhA’::difGm，删除重组菌B0013-070的ldhA基因，获得重组菌种大肠杆菌B0013-080H(B0013-070ldhA::dif)。
实施例29——D-乳酸合成途径阻断型极高光学纯L-乳酸产生菌株的构建
利用基因整合技术，构建D-乳酸脱氢酶基因(ldhA)编码基因删除用突变盒ldhA’::PldhA-ldhLca-difGm，删除重组菌B0013-070的ldhA基因，获得重组菌种大肠杆菌B0013-080I(B0013-070ldhA::PldhA-ldhLca-dif)。
实施例30——D-乳酸合成途径阻断型极高光学纯L-乳酸产生菌株的构建
利用基因整合技术，构建D-乳酸脱氢酶基因(ldhA)编码基因删除用突变盒ldhA’::PldhA-ldhStrb-difGm，删除重组菌B0013-070的ldhA基因，获得重组菌种大肠杆菌B0013-080J(B0013-070ldhA::PldhA-ldhStrb-dif)。
实施例31——L-乳酸代谢利用途径阻断型极高光学纯L-乳酸产生菌株的构建
利用基因整合技术，构建FMN为辅酶的L-乳酸脱氢酶基因(lldD)编码基因删除用突变盒lldD’::PldhA-ldhBcoa-difGm，删除重组菌B0013-070，B0013-080H，B0013-080I和B0013-080J的lldD基因，获得重组菌种大肠杆菌B0013-080K(B0013-070lldD::PldhA-ldhBcoa-dif)，B0013-090C(B0013-080HlldD::PldhA-ldhBcoa-dif)，B0013-090D(B0013-080IlldD::PldhA-ldhBcoa-dif)和B0013-090E(B0013-080JlldD::PldhA-ldhBcoa-dif)。
实施例32——L-乳酸代谢利用途径阻断型极高光学纯L-乳酸产生菌株的构建
利用基因整合技术，构建FMN为辅酶的L-乳酸脱氢酶基因(lldD)编码基因删除用突变盒lldD’::PldhA-ldhLca-difGm，删除重组菌B0013-070，B0013-080H，B0013-080I和B0013-080J的lldD基因，获得重组菌种大肠杆菌B0013-080L(B0013-070lldD::PldhA-ldhLca-dif)，B0013-090F(B0013-080HlldD::PldhA-ldhLca-dif)，B0013-090G(B0013-080IlldD::PldhA-ldhLca-dif)和B0013-090H(B0013-080JlldD::PldhA-ldhLca-dif)。
实施例33——L-乳酸代谢利用途径阻断型极高光学纯L-乳酸产生菌株的构建
利用基因整合技术，构建FMN为辅酶的L-乳酸脱氢酶基因(lldD)编码基因删除用突变盒lldD’::PldhA-ldhLca-difGm，删除重组菌B0013-070，B0013-080H，B0013-080I和B0013-080J的lldD基因，获得重组菌种大肠杆菌B0013-080M(B0013-070lldD::PldhA-ldhStrb-dif)，B0013-090I(B0013-080HlldD::PldhA-ldhStrb-dif)，B0013-090J(B0013-080IlldD::PldhA-ldhStrb-dif)和B0013-090K(B0013-080JlldD::PldhA-ldhStrb-dif)。
实施例34——生长可定量调控型极高光学纯L-乳酸产生菌株的构建
利用基因整合技术，硫胺素磷酸合成酶(thiE)编码基因删除用突变盒thiE’::difGm，删除步骤11，步骤12，步骤13，步骤14，步骤15和步骤16所获重组菌的thiE基因，获得重组菌种B0013-090L(B0013-080HthiE::dif)，B0013-090M(B0013-080IthiE::dif)，B0013-090N(B0013-080JthiE::dif)，B0013-090O(B0013-080KthiE::dif)，B0013-100B(B0013-090CthiE::dif)，B0013-100C(B0013-090DthiE::dif)，B0013-100D(B0013-090EthiE::dif)，B0013-090E(B0013-080LthiE::dif)，B0013-100E(B0013-090FthiE::dif)，B0013-100F(B0013-090GthiE::dif)，B0013-100G(B0013-090HthiE::dif)，B0013-080N(B0013-070thiE::dif)，B0013-100H(B0013-090IthiE::dif)，B0013-100I(B0013-090JthiE::dif)和B0013-100J(B0013-090KthiE::dif)。
实施例35——生长可定量调控型极高光学纯L-乳酸产生菌株的构建
利用基因整合技术，硫胺素磷酸合成酶(thiE)编码基因删除用突变盒thiE’::PldhA-ldhLca-difGm，删除步骤11，步骤12，步骤13，步骤14，步骤15和步骤16所获重组菌的thiE基因，获得重组菌种B0013-090P(B0013-080HthiE::PldhA-ldhLca-dif)，B0013-090Q(B0013-080IthiE::PldhA-ldhLca-dif)，B0013-090R(B0013-080JthiE::PldhA-ldhLca-dif)，B0013-090S(B0013-080KthiE::PldhA-ldhLca-dif)，B0013-100K(B0013-090CthiE::PldhA-ldhLca-dif)，B0013-100L(B0013-090DthiE::PldhA-ldhLca-dif)，B0013-100M(B0013-090EthiE::PldhA-ldhLca-dif)，B0013-090T(B0013-080LthiE::PldhA-ldhLca-dif)，B0013-100N(B0013-090FthiE::PldhA-ldhLca-dif)，B0013-100O(B0013-090GthiE::PldhA-ldhLca-dif)，B0013-100P(B0013-090HthiE::PldhA-ldhLca-dif)，B0013-080O(B0013-070thiE::PldhA-ldhLca-dif)，B0013-100Q(B0013-090IthiE::PldhA-ldhLca-dif)，B0013-100R(B0013-090JthiE::PldhA-ldhLca-dif)和B0013-100S(B0013-090KthiE::PldhA-ldhLca-dif)。
实施例36——生长可定量调控型极高光学纯L-乳酸产生菌株的构建
利用基因整合技术，硫胺素磷酸合成酶(thiE)编码基因删除用突变盒thiE’::PldhA-ldhStrb-difGm，删除步骤11，步骤12，步骤13，步骤14，步骤15和步骤16所获重组菌的thiE基因，获得重组菌种B0013-090U(B0013-080HthiE::PldhA-ldhStrb-dif)，B0013-090V(B0013-080IthiE::PldhA-ldhStrb-dif)，B0013-090W(B0013-080JthiE::PldhA-ldhStrb-dif)，B0013-090X(B0013-080KthiE::PldhA-ldhStrb-dif)，B0013-100T(B0013-090CthiE::PldhA-ldhStrb-dif)，B0013-100U(B0013-090DthiE::PldhA-ldhStrb-dif)，B0013-100V(B0013-090EthiE::PldhA-ldhStrb-dif)，B0013-090Y(B0013-080LthiE::PldhA-ldhStrb-dif)，B0013-100W(B0013-090FthiE::PldhA-ldhStrb-dif)，B0013-100X(B0013-090GthiE::PldhA-ldhStrb-dif)，B0013-100Y(B0013-090HthiE::PldhA-ldhStrb-dif)，B0013-080P(B0013-070thiE::PldhA-ldhStrb-dif)，B0013-100Z(B0013-090IthiE::PldhA-ldhStrb-dif)，B0013-100BB(B0013-090JthiE::PldhA-ldhStrb-dif)和B0013-100BC(B0013-090KthiE::PldhA-ldhStrb-dif)。
实施例37——生长可定量调控型极高光学纯L-乳酸产生菌株的构建
利用基因整合技术，硫胺素磷酸合成酶(thiE)编码基因删除用突变盒thiE’::PldhA-ldhBcoa-difGm，删除步骤11，步骤12，步骤13，步骤14，步骤15和步骤16所获重组菌的thiE基因，获得重组菌种B0013-090Z(B0013-080HthiE::PldhA-ldhBcoa-dif)，B0013-090BB(B0013-080IthiE::PldhA-ldhBcoa-dif)，B0013-090BC(B0013-080JthiE::PldhA-ldhBcoa-dif)，B0013-090BD(B0013-080KthiE::PldhA-ldhBcoa-dif)，B0013-100BD(B0013-090CthiE::PldhA-ldhBcoa-dif)，B0013-100BE(B0013-090DthiE::PldhA-ldhBcoa-dif)，B0013-100BF(B0013-090EthiE::PldhA-ldhBcoa-dif)，B0013-090BE(B0013-080LthiE::PldhA-ldhBcoa-dif)，B0013-100BG(B0013-090FthiE::PldhA-ldhBcoa-dif)，B0013-100BH(B0013-090GthiE::PldhA-ldhBcoa-dif)，B0013-100BI(B0013-090HthiE::PldhA-ldhBcoa-dif)，B0013-080Q(B0013-070thiE::PldhA-ldhBcoa-dif)，B0013-100BJ(B0013-090IthiE::PldhA-ldhBcoa-dif)，B0013-100BK(B0013-090JthiE::PldhA-ldhBcoa-dif)，B0013-100BL(B0013-090KthiE::PldhA-ldhBcoa-dif)，B0013-100BM(B0013-090UthiE::PldhA-ldhBcoa-dif)，B0013-100BN(B0013-090VthiE::PldhA-ldhBcoa-dif)，B0013-100BO(B0013-090WthiE::PldhA-ldhBcoa-dif)，B0013-100BP(B0013-090XthiE::PldhA-ldhBcoa-dif)，B0013-101B(B0013-100TthiE::PldhA-ldhBcoa-dif)，B0013-101C(B0013-100UthiE::PldhA-ldhBcoa-dif)，B0013-101D(B0013-100VthiE::PldhA-ldhBcoa-dif)，B0013-100BQ(B0013-090YthiE::PldhA-ldhBcoa-dif)，B0013-101E(B0013-100WthiE::PldhA-ldhBcoa-dif)，B0013-101F(B0013-100XthiE::PldhA-ldhBcoa-dif)，B0013-101G(B0013-100YthiE::PldhA-ldhBcoa-dif)，B0013-090BF(B0013-080PthiE::PldhA-ldhBcoa-dif)，B0013-101H(B0013-100ZthiE::thiE::PldhA-ldhBcoa-dif)，B0013-101I(B0013-100BBthiE::PldhA-ldhBcoa-dif)和B0013-101J(B0013-100BCthiE::PldhA-ldhBcoa-dif)。
实施例38——极高光学纯D-乳酸高产菌株的筛选
将步骤19-27所获得的重组菌种分别在添加0.06-100μg/L硫胺素，25-36℃、200r/min好氧生长-10h，再在37-50℃静置培养发酵乳酸，并以出发菌种B0013-070作为对照菌种，分析D-乳酸合成水平，所产D-乳酸光学纯度和化学纯度，并筛选出最优菌种。筛选结果如附图19和表1所示。
表1：极高光学纯D-乳酸高产菌株的筛选结果
实施例39——极高光学纯L-乳酸高产菌株的筛选
将步骤28-37所获得的重组菌种分别在添加0.06-100μg/L硫胺素，25-36℃、200r/min好氧生长-10h，再在37-50℃静置培养发酵乳酸，并以出发菌种B0013-070作为对照菌种，分析L-乳酸合成水平，所产L-乳酸光学纯度和化学纯度，并筛选出最优菌种。筛选结果如附图20和表2所示。
表2：极高光学纯L-乳酸高产菌株的筛选结果
菌株序号 菌株编号 产酸水平(％, 光学纯度(％, 化学纯度(％,
w/v) w/w) w/w)
0 B0013-070 0 0 0
67 B0013-080H 0 0 019 -->
68 B0013-080I 40 99.96 88
69 B0013-080J 45 99.97 85
70 B0013-080K 49 99.96 88
71 B0013-090C 46 99.96 85
72 B0013-090D 47 99.95 90
73 B0013-090E 47 99.96 90
74 B0013-080L 51 99.97 89
75 B0013-090F 41 99.96 97
76 B0013-090G 48 99.95 92
77 B0013-090H 48 99.97 96
78 B0013-080M 49 99.96 87
79 B0013-090I 42 99.95 88
80 B0013-090J 40 99.96 86
81 B0013-090K 45 99.97 92
82 B0013-090L 58 99.97 98
83 B0013-090M 45 99.95 89
84 B0013-090N 49 99.96 94
85 B0013-090O 46 99.97 87
86 B0013-100B 47 99.95 90
87 B0013-100C 55 99.96 93
88 B0013-100D 56 99.97 86
89 B0013-090E 41 99.97 87
90 B0013-100E 48 99.95 95
91 B0013-100F 48 99.96 91
92 B0013-100G 49 99.95 88
93 B0013-080N 53 99.95 93
94 B0013-100H 46 99.97 89
95 B0013-100I 47 99.96 89
96 B0013-100J 57 99.95 90
97 B0013-090P 56 99.95 88
98 B0013-090Q 41 99.95 81
99 B0013-090R 48 99.97 89
100 B0013-090S 55 99.97 92
101 B0013-100K 49 99.96 97
102 B0013-100L 52 99.95 86
103 B0013-100M 40 99.95 88
104 B0013-090T 49 99.96 90
105 B0013-100N 56 99.95 8720 -->
106 B0013-100O 41 99.97 80
107 B0013-100P 48 99.96 83
108 B0013-080O 48 99.96 89
109 B0013-100Q 49 99.96 77
110 B0013-100R 42 99.95 91
111 B0013-100S 59 99.95 88
112 B0013-090U 45 99.97 93
113 B0013-090V 49 99.95 88
114 B0013-090W 48 99.97 93
115 B0013-090X 56 99.95 89
116 B0013-100T 49 99.95 92
117 B0013-100U 46 99.95 88
118 B0013-100V 47 99.95 88
119 B0013-090Y 47 99.95 87
120 B0013-100W 56 99.96 90
121 B0013-100X 41 99.95 88
122 B0013-100Y 53 99.96 92
123 B0013-080P 48 99.95 92
124 B0013-100Z 49 99.95 94
125 B0013-100BB 42 99.96 89
126 B0013-100BC 49 99.96 90
127 B0013-090Z 46 99.95 88
128 B0013-090BB 57 99.96 86
129 B0013-090BC 47 99.95 90
130 B0013-090BD 56 99.97 93
131 B0013-100BD 60 99.95 95
132 B0013-100BE 48 99.97 97
133 B0013-100BF 48 99.96 89
134 B0013-090BE 53 99.95 90
135 B0013-100BG 42 99.97 88
136 B0013-100BH 40 99.96 81
137 B0013-100BI 49 99.97 89
138 B0013-080Q 54 99.95 94
139 B0013-100BJ 49 99.96 79
140 B0013-100BK 46 99.95 86
141 B0013-100BL 59 99.95 88
142 B0013-100BM 47 99.96 9021 -->
143 B0013-100BN 56 99.95 87
144 B0013-100BO 41 99.97 80
145 B0013-100BP 48 99.95 83
146 B0013-101B 55 99.95 89
147 B0013-101C 59 99.96 77
148 B0013-101D 42 99.95 91
149 B0013-100BQ 60 99.95 90
150 B0013-101E 41 99.97 93
151 B0013-101F 59 99.96 88
152 B0013-101G 49 99.97 90
153 B0013-090BF 48 99.95 89
154 B0013-101H 66 99.96 92
155 B0013-101I 41 99.95 86
156 B0013-101J 67 99.95 98
实施例40——极高光学纯D-乳酸的发酵生产
将实施例38所获得的最优菌种在7L-30,000L发酵罐中进行乳酸发酵试验。发酵过程中定时取样，分析细胞密度、糖耗、乳酸产率、代谢主要中间产物及其它有机酸产物等。在25-36℃进行好氧培养至OD600值约为15-40，将发酵罐温度设定为37-50℃继续好氧培养0-120min，再将通气量设为0-0.2vvm进行限氧发酵，限氧阶段0-3h发酵温度为33-39℃，3-6h发酵温度为37-42℃，6-10h发酵温度为38-45℃，10-16h发酵温度为40-48℃，16-24h发酵温度为45-50℃。其发酵培养基为(g/L)：磷酸氢二铵0-25，磷酸二氢钾0-5，磷酸氢二钠，0-25，氯化钠0-5，MgSO40-0.5，FeSO40-1，FeCl30-1，CoCl20-1，CuCl20-1，Na2MoO40-1，H3BO30-1，MnCl20-1，柠檬酸0-25，硫胺素0-1，木糖0-50，甘油0-50，葡萄糖0-50，硫酸0-5，pH6.0-7.5。
详细发酵结果见附图21和附图22。
实施例41——极高光学纯L-乳酸高产菌株的发酵生产
将实施例39所获得的最优菌种在7L-30,000L发酵罐中进行乳酸发酵试验。发酵过程中定时取样，分析细胞密度、糖耗、乳酸产率、代谢主要中间产物及其它有机酸产物等。在25-36℃进行好氧培养至OD600值约为15-40，将发酵罐温度设定为37-50℃继续好氧培养0-120min，再将通气量设为
0-0.2vvm进行限氧发酵，限氧阶段发酵温度为37-50℃。其发酵培养基为
(g/L)：磷酸氢二铵0-25，磷酸二氢钾0-5，磷酸氢二钠，0-25，氯化钠0-5，MgSO40-0.5，FeSO40-1，FeCl30-1，CoCl20-1，CuCl20-1，ZnCl20-1，Na2MoO40-1，H3BO30-1，MnCl20-1，柠檬酸0-25，硫胺素0-1，木糖0-50，甘油0-50，葡萄糖0-50，硫酸0-5，pH6.0-7.5。
详细发酵结果见附图23和附图24。
实施例42——菌种10吨发酵罐中5批次发酵生产极高光学纯D-乳酸
将实施例38获得的极高纯D-乳酸最优生产菌株在10吨发酵罐中进行5批次的连续生产。
(1)一级种子扩培
取出1ml超低温甘油管保藏菌种，接种专用液体培养基(ZT1培养基)lL/5L瓶。37℃，200r/min培养10-13h。
ZT1培养基配制
配料1组分共计12.6g，加水溶解至700mL，121℃，灭菌20min。
配料2组分共计18g，加水溶解至150mL单独灭菌，接种时添加。
配料3组分共计5g，加水溶解至150mL单独灭菌，接种时添加。
其中ZT1培养基组成包括(g/L)：磷酸氢二铵0-25，磷酸二氢钾0-5，磷酸氢二钠，0-25，氯化钠0-5，MgSO40-0.5，FeSO40-1，FeCl30-1，CoCl20-1，CuCl20-1，ZnCl20-1，Na2MoO40-1，H3BO30-1，MnCl20-1，柠檬酸0-25，硫胺素0-1，木糖0-50，甘油0-50，葡萄糖0-50，硫酸0-5，pH6.0-7.5。
(2)二级种子扩培
上述种子液1L接种100L二级种子罐，装液量50L。33-37℃低强度通气培养10-13h。
二级种子罐ZT2培养基配制
配料1组分共计570g，加水溶解至30L，121℃，灭菌20min。
配料2组分共计810g，加水溶解至5L单独灭菌，接种时添加。
配料3组分共计1350g，加水溶解至5L单独灭菌，接种时添加。
其中ZT1培养基组成包括(g/L)：磷酸氢二铵0-25，磷酸二氢钾0-5，磷酸氢二钠，0-25，氯化钠0-5，MgSO40-0.5，FeSO40-1，FeCl30-1，CoCl20-1，CuCl20-1，ZnCl20-1，Na2MoO40-1，H3BO30-1，MnCl20-1，柠檬酸0-25，硫胺素0-1，木糖0-50，甘油0-50，葡萄糖0-50，硫酸0-5，pH6.0-7.5。
(3)发酵
将上述二级扩培的种子液50L转入10m3发酵罐，工作初始体积为5m3，发酵培养基基础为：ZT2培养基。33-37℃低强度通气培养8-9h，起始通风比1：0.3(料：风)，培养过程中提高转速和通气量控制溶氧不低于20％。加Ca(OH)2维持pH7.0。转入非通风发酵产酸阶段，发酵温度为40-45℃，Ca(OH)2维持pH7.0。补加葡萄糖至终浓度50g/L(按照起始发酵体积计算)，分四批补加，间隔时间3h。发酵20-22h，测定残余葡萄糖低于0.1％，即可放罐。发酵结束按照上述流程重复进行五批次发酵生产。发酵结果见表3。
表3：五批次10吨罐发酵生产极高光学纯D-乳酸结果
实施例43——菌种10吨发酵罐中5批次发酵生产极高光学纯L-乳酸
按照实施例42中的发酵操作流程，将生产菌株替换为实施例39所获得的最优菌种在10吨发酵罐中进行5批次的连续生产。发酵结果见表4。
表4：五批次10吨罐连续转化生产极高光学纯L-乳酸结果
实施例44——极高光学纯D-乳酸和L-乳酸的产品制备
发酵结束直接在发酵液中缓慢加入浓度为1％-50％的硫酸进行酸化。边搅拌边慢慢流加硫酸，先按体积的1％-18％加入；以BaCl2和草酸铵试剂分别检测，偏酸性时，停止加酸搅拌反应6小时，搅拌时间全程；反应终点以BaCl2和草酸铵试剂分别校验。
板框过滤：酸化液经板框过滤机压滤。压滤后以85℃热水洗涤滤饼，清洗至洗液中乳酸浓度低于0.1％。清洗结束用压缩空气压干，洗液并入清液中。菌体和固体钙盐用作水泥或混凝土配料。
超滤滤：经超滤去除色素、蛋白质、氨基酸和残留的菌体等。为了提高超滤效率，超滤前对滤过液进行蒸发浓缩，浓缩比为4:1，浓缩液进行超滤。
离子交换：超滤后获得的滤清液进行离子交换。
阳离子交换：732交联为7％的苯乙烯·二乙烯共聚体上带有磺酸基(-SO3H)的阳离子交换树脂(·001×7(732)强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂)；离交前料液要冷却到室温。再生处理5％W/v的HCl溶液；中间检查：Fe2+不超过1ppm，交换流速为300ml/min(视检测结果定)。
阴离子交换：330(701)弱碱性阴离子交换树脂(弱碱性环氧系阴离子交换树脂，主要用于水处理中除去Cl-、SO4 2-等离子，除去无机酸，提取有机酸和脱色，并可回收铜、银离子。)；再生处理：5％W/vNaOH溶液；交换流速为300ml/min(视检测结果定)。中间检查：Cl-不超过3ppm；SO4 2-不超过5ppm.
产品浓缩：浓缩至产品要求的乳酸浓度。该产品为聚合级D-乳酸/L-乳酸。
综上所述，本发明通过基因工程技术对D-乳酸和L-乳酸高产重组菌染色体上的乳酸脱氢酶编码基因的表达进行简易条件下的动态调控，从而实现了重组菌从葡萄糖高效单一生产D-乳酸和高效单一生产L-乳酸的简洁发酵工艺。本发明技术经过简单修改后，同样可以用于其它工业上重要的微生物代谢产物，但不限于，如柠檬酸、甲酸、乙酸、丙酮酸、丁二酸、苹果酸、α-酮戊二酸、丁二酸、己二酸、戊二胺、己二胺、甲基丙烯酸、异戊二烯、衣康酸等多种有机酸和有机胺；或脯氨酸、丙氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、精氨酸等多种氨基酸；硫胺素、维生素B12等多种微生物；或乙醇、丙醇等短链醇；或低聚异麦芽糖、低聚果糖、低聚半乳糖等多种功能糖的菌种构建、发酵生产和新工艺技术的建立与应用。
上述实施例中，ldhA1核苷酸序列为序列表<400>1所示序列，ldhA2核苷酸序列为序列表<400>2所示序列，PPL1核苷酸序列为序列表<400>3所示序列，PPL2核苷酸序列为序列表<400>4所示序列，PPL3核苷酸序列为序列表<400>5所示序列，PPL4核苷酸序列为序列表<400>6所示序列，Ec-RlA1核苷酸序列为序列表<400>7所示序列，Ec-RlA2核苷酸序列为序列表<400>8所示序列，ThiE1p核苷酸序列为序列表<400>9所示序列，ThiE2p核苷酸序列为序列表<400>10所示序列，Dld1核苷酸序列为序列表<400>11所示序列，Dld2核苷酸序列为序列表<400>12所示序列，AckA-Pta1核苷酸序列为序列表<400>13所示序列，AckA-Pta2核苷酸序列为序列表<400>14所示序列，Pps1核苷酸序列为序列表<400>15所示序列，Pps2核苷酸序列为序列表<400>16所示序列，RPps1核苷酸序列为序列表<400>17所示序列，RPps2核苷酸序列为序列表<400>18所示序列，PflB1核苷酸序列为序列表<400>19所示序列，PflB2核苷酸序列为序列表<400>20所示序列，PoxB1核苷酸序列为序列表<400>21所示序列，PoxB2核苷酸序列为序列表<400>22所示序列，FrdA1核苷酸序列为序列表<400>23所示序列，FrdA2核苷酸序列为序列表<400>24所示序列，AdhE1核苷酸序列为序列表<400>25所示序列，AdhE2核苷酸序列为序列表<400>26所示序列，ldhA3核苷酸序列为序列表<400>27所示序列，ldhA4核苷酸序列为序列表<400>28所示序列，ldhA5核苷酸序列为序列表<400>29所示序列，ldhA6核苷酸序列为序列表<400>30所示序列，RldhA1核苷酸序列为序列表<400>31所示序列，RldhA2核苷酸序列为序列表<400>32所示序列，BcoaLDH1核苷酸序列为序列表<400>33所示序列，BcoaLDH4核苷酸序列为序列表<400>34所示序列，LldD1核苷酸序列为序列表<400>35所示序列，LldD2核苷酸序列为序列表<400>36所示序列，LcaLDH1核苷酸序列为序列表<400>37所示序列，LcaLDH4核苷酸序列为序列表<400>38所示序列，StrbLDH1核苷酸序列为序列表<400>39所示序列，StrbLDH2核苷酸序列为序列表<400>40所示序列。具体信息如下：
SEQIDNo.1的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：27bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.1
ldhA1：TCCGGTACCCAGCCCGAGCGTCATCAG；KpnI
SEQIDNo.2的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：25bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.2
ldhA2：GTCAAGGTCGACGTTATTGAAACCG；
SEQIDNo.3的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：28bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.3
PPL1：AGCTTGGCTGCAGGTGATGATTATCAGC；
SEQIDNo.4的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：24bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.4
PPL2：ATCGCCGGCAATTCGTAATCATGG；EcoRI
SEQIDNo.5的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.5
PPL3：TAAGATATCCCATGATTACGAATTGCCGGC；EcoRV
SEQIDNo.6的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：37bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.6
PPL4：TAAGAATTCAGTTAACCTCCTTAGGATCCCAATGCTTEcoRI
SEQIDNo.7的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：39bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.7
Ec-RlA1：TAAGAATTCATGAAACTCGCCGTTTATAGCACAAAACAG；EcoRI
SEQIDNo.8的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.8
Ec-RlA2:AAGACTTTCTCCAGTGATGTTGAATCACAT；
SEQIDNo.9的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：29bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.9
ThiE1p：AGAGAATTCATTCATCGCCAACTCCTGCA
SEQIDNo.10的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：32bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.10
ThiE2p：AGAGAATTCGGTGGACAGCGTACAGTGGATCG；
SEQIDNo.11的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：26bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.11
Dld1：AGTACGTCTTGATACCTTCGAAGCGG；
SEQIDNo.12的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：23bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.12
Dld2：GGATTCATGCTGTTGGTCGGATC；
SEQIDNo.13的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：23bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.13
AckA-Pta1：TGAACATCATCACCTGCCACCTG；
SEQIDNo.14的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：19bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.14
AckA-Pta2：CAGCGCAAAGCTGCGGATG
SEQIDNo.15的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：25bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.15
Pps1：CGGCATGAATGATGTAGACAGGGTT
SEQIDNo.16的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：23bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.16
Pps2：TAACCAGGTTTGCACCACGGTGT
SEQIDNo.17的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：21bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.17
RPps1：TGTGGCGAAACCATTCGGAAC
SEQIDNo.18的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：22bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.18
RPps2:GTCCGACCACGAAGACTTTGCC
SEQIDNo.19的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：23bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.19
PflB1：TTCAGACTTCGGACCAACCTGCA
SEQIDNo.20的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：20bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.20
PflB2：CCGCGAACTGGATCCGATGA；
SEQIDNo.21的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：24bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.21
PoxB1：CAAACGGTTGCAGCTTATATCGCC
SEQIDNo.22的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：24bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.22
PoxB2：TGCGGTGGAATGGCTAACTCTTCT
SEQIDNo.23的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：23bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.23
FrdA1：CTTTCAAGCCGATCTTGCCATTG
SEQIDNo.24的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：24bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.24
FrdA2：ACTCTTTACGTGCCATTGCGGAGT
SEQIDNo.25的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：24bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.25
AdhE1：ATCTGATCGGCTGGATCGATCAAC
SEQIDNo.26的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：22bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.26
AdhE2：GAACCAGGTTGGCGTCGACAAT
SEQIDNo.27的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：35bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.27
ldhA3：TAAGAATTCTTATGAAACTCGCCGTTTATAGCACAEcoRI
SEQIDNo.28的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：38bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.28
ldhA4：CTTGAATTCAAGCTTGCTGCCGGAAATCATCATTTTTTEcoRI,HindIII
SEQIDNo.29的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：21bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.29
ldhA5：GGGCAGCCCGAGCGTCATCAG
SEQIDNo.30的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：23bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.30
ldhA6：GCTGCCGGAAATCATCATTTTTT
SEQIDNo.31的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.31
RldhA1：GGAAGATCTTCCGCGAGTTTCATAAGACTTBglII
SEQIDNo.32的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：24bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.32
RldhA2：CGGAATTCCGAACGAACTGGTTTAEcoRⅠ
SEQIDNo.33的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：33bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.33
BcoaLDH1CCGGATCCAATCAGGGTGTTGCAGAAGAGCTTGBamHI
SEQIDNo.34的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：34bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.34
BcoaLDH4GCGGAATTCTTACAATACAGGTGCCATCGTTTCTEcoRI
SEQIDNo.35的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：28bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.35
LldD1GGCCCGGGCATGATTATTTCCGCAGCCASmaI
SEQIDNo.36的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.36
LldD2：GGCCCGGGCAGGCAACTCTTTACCCAGCCCSmaI
SEQIDNo.37的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.37
LcaLDH1CGCGGATCCAGTATTACGGATAAGGATCACBamHI
SEQIDNo.38的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：25bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.38
LcaLDH4CGCCTGCAGTCCTGTTCTTCGTTTGPstI
SEQIDNo.39的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：28bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.39
StrbLDH1CGCGGATCCACTAAACAACACAAAAAAGBamHI
SEQIDNo.40的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：28bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQIDNo.40
StrbLDH2CCGGAATTCTACAGGGATTGTTGCCGCAEcoRI
上述参照实施例对该一种用于构建乳酸的菌株及其制备方法与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
PCT/RO/134表

Claims (12)

1.一种用于发酵生产极高光学纯D-乳酸的聚合级乳酸单体生产菌，其特征在于：菌株保藏号为CGMCCNo.11059。
2.一种用于发酵生产极高光学纯L-乳酸的聚合级乳酸单体生产菌，其特征在于：菌株保藏号为CGMCCNo.11060。
3.权利要求1或2所述聚合级乳酸单体生产菌的构建方法，其特征在于：
单个或多个基因被敲除进行菌株初步构建，这些基因包括：ldhA，thiE，dld，ackA，pta，pps，pflB，poxB，frdA，adhE，lldD；单个或多个基因被表达，这些基因包括：kan-cIts857-pR-pL-ldhA,ldhBcoa，ldhLca，ldhStrb；
使用了温度诱导型基因转录方式来控制和调节细胞生长过程和乳酸形成过程，包括：菌株初步构建后，菌株在25-50℃条件下分阶段完成细胞发酵培养-诱导-产酸，细胞生长过程在单一发酵因子调控下可以定量控制细胞的积累量，所述单一发酵因子是细胞中央代谢途径关键酶转录过程的调控因子、关键酶翻译过程的调控因子、关键酶分泌过程的调控因子或关键酶表达后催化过程调控因子。
4.根据权利要求3所述的聚合级乳酸单体生产菌的构建方法，所述菌株初步构建后菌株的生长过程都与单一发酵因素的调控相关联，所述单一发酵因素是葡萄糖、甘油、酵母膏、蛋白胨、硫酸铵、磷酸氢铵、铁离子、镁离子、钙离子、锌离子、锰离子、钴离子、铜离子、钠离子、钾离子、VB1、VB6、VB12、生物素、盐酸硫胺素或焦磷酸硫胺素的一种或几种，所述单一发酵因素能够定量的控制细胞的积累过程，并保证细胞快速积累且具备高活性；以开关控制的方式启动或关闭乳酸的合成过程，并且这一过程通过预先定量添加对应的单一发酵因素完成所述调控过程。
5.一种乳酸制造技术，其特征在于：具体方法为：应用权利要求1和/或2所述聚合级乳酸单体生产菌，所述菌株的宿主细胞生长过程在全合成的无机盐培养基中快速进行，所述全合成的无机盐培养基为含硫胺素的培养基，所述宿主细胞在全合成培养基中快速生长，其中，7L发酵体系下于8-10h内菌体量积累到细胞干重11.5g/L，通过定量补加单一发酵因子，细胞干重进行更高积累，宿主细胞培养过程中不大量形成乳酸，即乳酸的痕量形成不影响细胞生长，宿主细胞在生长完成后快速积累乳酸。
6.根据权利要求5所述的乳酸制造技术，其特征在于：D-乳酸和L-乳酸的积累过程通过更换相应聚合级乳酸单体生产菌在同一套生产体系下切换式进行；所述的发酵产酸过程具备可设定型的自动启动特征，通过培养基组分和菌种自身生长特性的组合，细胞生长至特定阶段后由于培养基中对应调控因子组分的含量变化自动启动产酸过程。
7.根据权利要求5所述的乳酸制造技术，其特征在于：所述全合成的无机盐培养基主体成分如下：
用于D-乳酸发酵生产的发酵培养基(g/L)：磷酸氢二铵0-25，磷酸二氢钾0-5，磷酸氢二钠0-25，氯化钠0-5，MgSO40-0.5，FeSO40-1，FeCl30-1，CoCl20-1，CuCl20-1，Na2MoO40-1，H3BO30-1，MnCl20-1，柠檬酸0-25，硫胺素0-1，木糖0-50，甘油0-50，葡萄糖0-50，硫酸0-5，pH6.0-7.5。
用于L-乳酸发酵生产的发酵培养基(g/L)：磷酸氢二铵0-25，磷酸二氢钾0-5，磷酸氢二钠0-25，氯化钠0-5，MgSO40-0.5，FeSO40-1，FeCl30-1，CoCl20-1，CuCl20-1，ZnCl20-1，Na2MoO40-1，H3BO30-1，MnCl20-1，柠檬酸0-25，硫胺素0-1，木糖0-50，甘油0-50，葡萄糖0-50，硫酸0-5，pH6.0-7.5。
8.根据权利要求5所述的乳酸制造技术，其特征在于：所述菌株的生长过程以及乳酸形成过程都与发酵温度的过程相关联，发酵产酸过程在非固定温度下完成的，根据生产菌种产酸特性，其发酵温度的变化呈现梯度上升的趋势，发酵温度升高生长会变缓慢，而发酵温度降低生长会非常迅速，具备积累高活性细胞的特点；发酵温度升高乳酸会快速形成，而发酵温度降低乳酸会缓慢形成，甚至不形成，具备高效积累乳酸的特点。
9.根据权利要求5所述的乳酸制造技术，其特征在于：所述菌株先在25-36℃下利用葡萄糖快速生长形成菌体，然后在37-50℃下利用葡萄糖快速积累乳酸。
10.根据权利要求5所述的乳酸制造技术，其特征在于：具体步骤为：
(1)通过基因工程技术对D-乳酸和L-乳酸高产重组菌染色体上的乳酸脱氢酶编码基因的表达进行简易条件下的动态调控获得产酸菌株；
(2)将菌株在25-36℃、200r/min好氧生长6-10h，再在37-45℃静置培养发酵乳酸，并以出发菌种B0013-070作为对照菌种，分析细胞密度、糖耗、乳酸产率、代谢主要中间产物及其它有机酸产物等，确定乳酸合成诱导时机；菌株分别在添加0.06-100μg/L硫胺素、200r/min进行摇瓶培养；
(3)发酵生产极高光学纯D-乳酸时，限氧阶段0-3h发酵温度为33-39℃，3-6h发酵温度为37-42℃，6-10h发酵温度为38-45℃，10-16h发酵温度为40-48℃，16-24h发酵温度为45-50℃。
(3’)发酵生产极高光学纯L-乳酸时，限氧阶段发酵温度为37-50℃，其余同步骤(3)。
11.根据权利要求5所述的乳酸制造技术，其特征在于：还包括发酵结束后乳酸的提取方法，结合生产菌种基因工程改造后的特征，发酵液中D-乳酸和L-乳酸均以极高光学纯度和化学纯度的形式存在，全合成培养基的使用保证了后提取过程的简洁型，其最终产品的提取方式包括：酸化，板框去除菌体，超滤去除色素和杂蛋白，离子交换去除阴阳离子干扰，浓缩制备相应浓度的产品，并纳滤精制产品。
12.根据权利要求5所述的乳酸制造技术，其特征在于：所述乳酸形成过程结束后通过低温酸化的方式将D-乳酸和L-乳酸游离出来，且上述乳酸游离的过程不受发酵液中其他残余物的影响，酸化使用的酸是硫酸、盐酸或草酸。
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Denomination of invention: A polymer grade lactic acid monomer producing bacterium and its construction method and lactic acid manufacturing technology

Granted publication date: 20180612

License type: Common License

Record date: 20220720

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