CN106459889A - 使用缺失2,3‑丁二醇合成基因的突变体微生物生产1,3‑丙二醇的方法 - Google Patents

使用缺失2,3‑丁二醇合成基因的突变体微生物生产1,3‑丙二醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及使用缺失2,3‑丁二醇合成基因的突变体微生物生产1,3‑丙二醇的方法；且更具体地涉及突变体微生物，其中在具有自丙三醇生产1,3‑丙二醇的能力的微生物中，编码乳酸脱氢酶的基因和编码牵涉于2,3‑丁二醇合成中的酶的基因缺失，且其中编码丙酮酸脱羧酶的基因和编码醛脱氢酶的基因引入或扩增；并且涉及通过使用上述突变体微生物促进生产1,3‑丙二醇同时抑制生产2,3‑丁二醇的方法。使用本发明的丙三醇‑发酵突变体微生物可显著增加1,3‑丙二醇的产生同时最小化2,3‑丁二醇的产生。

Description

使用缺失2,3-丁二醇合成基因的突变体微生物生产1,3-丙二 醇的方法
技术领域
本发明涉及使用缺失2,3-丁二醇合成基因的突变体微生物生产1,3-丙二醇的方法；且更具体地涉及突变体微生物，其中在具有自丙三醇生产1,3-丙二醇的能力的微生物中，编码乳酸脱氢酶的基因和编码牵涉于2,3-丁二醇合成中的酶的基因缺失，且其中编码丙酮酸脱羧酶的基因和编码醛脱氢酶的基因引入或扩增；并且涉及通过使用上述突变体微生物促进生产1,3-丙二醇同时抑制生产2,3-丁二醇的方法。
背景技术
在目前的生物柴油(biodiesel)生产过程中，粗丙三醇以相当于产品总量的约10％(w/w)的量作为主要副产物产生(Johnson and Taconi,Environ Prog,26:338,2007)。所述粗丙三醇对丙三醇的市价产生影响且也认为是环境问题的起因，这是因为不允许将所述粗丙三醇直接排放至环境(da Silva et al.Biotechnol Adv,27:30,2009)。基于这些原因，开发了许多方法以将便宜的粗丙三醇转化为燃料和工业上具有价值的物质，包括生理学活性物质。
丙三醇可通过微生物发酵转化为各种化学原料，且所述化学原料的典型实例为1,3-丙二醇。1,3-丙二醇可用作合成聚酯、聚醚或聚氨酯的原料，且在各种应用中使用，包括纺织品诸如高功能性衣服、地毯或车用纺织品，和塑料薄膜。具体地，通过1,3-丙二醇和对苯二甲酸的聚合产生的聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)具有优异的物理性质和228℃的熔点，该熔点低于聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的熔点，且因此其实际有效性更高。因此，PTT作为下一代纤维材料是引人注目的。此外，使用1,3-丙二醇作为单体制备的塑料和聚合物产品相比于使用丁二醇或乙二醇制备的产品而言显示出更好的光学稳定性。此外，1,3-丙二醇可用作聚乙二醇型润滑剂和溶剂，且因此评价为相比于丙三醇而言具有更高的商业价值。
时至今日，所报道的丙三醇-发酵微生物显示生产1,3-丙二醇最多的是肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，且已经积极地展开了对肺炎克雷伯氏菌的丙三醇发酵代谢途径的研究(图1)。肺炎克雷伯氏菌通过还原丙三醇产生1,3-丙二醇，并且同时通过氧化丙三醇产生大量的竞争性代谢物诸如2,3-丁二醇。因此，已经积极地尝试在肺炎克雷伯氏菌中通过抑制主要竞争性代谢物的产生而促进1,3-丙二醇的产生。通常发现可通过在其中缺失乳酸脱氢酶的突变体中抑制乳酸的产生来增加1,3-丙二醇的产生(Oh et al.ApplBiochem Biotechnol 166:127-137,2012)。在肺炎克雷伯氏菌中抑制竞争性代谢物的产生不仅对于促进1,3-丙二醇的产生是非常有利的，而且对于1,3-丙二醇的有效纯化也是非常有利的。具体地，由于作为主要竞争性代谢物的2,3-丁二醇具有与1,3-丙二醇非常相似的物理化学性质，当其存在于与1,3-丙二醇的混合物中时，其成为1,3-丙二醇纯化中的重大障碍。近年来，若干研究组已经开发了这样的突变体，其中2,3-丁二醇合成途径在肺炎克雷伯氏菌中缺失(Oh et al.Appl Biochem Biotechnol 166:127-137,2012)。然而，显示出1,3-丙二醇的产生在缺失2,3-丁二醇合成途径的突变体中降低，同时丙三醇的发酵代谢以及细胞生长减少，尽管其原因尚未清晰。
因此，发明人已经非常努力地开发在缺失2,3-丁二醇合成途径的突变体中提高1,3-丙二醇的产生的方法，且结果发现，当使用表达丙酮酸脱羧酶和醛脱氢酶基因的突变体菌株时，1,3-丙二醇的产量可提高，同时2,3-丁二醇的产生得到抑制，由此完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明的目标是提供这样的突变体微生物，其产生高产量的1,3-丙二醇同时抑制2,3-丁二醇的产生。
本发明的另一目标是提供通过培养丙三醇-发酵突变体微生物而以高产量产生1,3-丙二醇同时抑制2,3-丁二醇的产生的方法。
技术方案
为了实现上述目标，本发明提供了突变体微生物，其中在具有自丙三醇生产1,3-丙二醇的能力的微生物中，编码乳酸脱氢酶的基因和编码牵涉于2,3-丁二醇合成中的酶的基因缺失，且其中编码丙酮酸脱羧酶的基因和编码醛脱氢酶的基因引入或扩增。
本发明还提供了生产1,3-丙二醇的方法，其包括以下步骤：(a)在含有丙三醇的培养基中培养突变体(Δ(ldhA als)/pPdc-AldB)以产生1,3-丙二醇；和(b)回收所产生的1,3-丙二醇。
附图说明
图1显示了肺炎克雷伯氏菌中的丙三醇代谢途径。
图2显示了构建肺炎克雷伯氏菌Δ(ldhA als pta)突变体的方法。
图3显示了在肺炎克雷伯氏菌突变体(ΔldhA、Δ(ldhA als)、Δ(ldhA als pta)和Δ(ldhA als)/pPdc-AldB)中检查丙三醇代谢和细胞生长的结果。
图4显示了构建丙酮酸脱羧酶/醛脱氢酶表达载体的方法。
图5显示了检查肺炎克雷伯氏菌突变体Δ(ldhA als)/pPdc-AldB的酶活性的结果。
图6显示了针对由肺炎克雷伯氏菌突变体ΔldhA、Δ(ldhA als)和Δ(ldhA als)/pPdc-AldB的丙三醇发酵的分批补料(fed-batch)培养方法的结果。A:ΔldhA(2.0vvm)；B:Δ(ldhA als)(2.0vvm)；和C:Δ(ldhA als)/pPdc-aldB(2.0vvm)。
图7显示了在针对由肺炎克雷伯氏菌突变体的丙三醇发酵的分批补料培养方法中分析丙酮酸盐(pyruvate)的结果。
图8显示了在针对由肺炎克雷伯氏菌突变体Δ(ldhA als)/pPdc-AldB的丙三醇发酵的分批补料培养方法中检查氧浓度的效果的结果。
具体实施方式
除非另作说明，本申请所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。大体上，将在如下所述的本申请使用的命名以及实验方法为本领域中所熟知的且通常采用的。
在一个方面，本发明涉及突变体微生物，其中在具有自丙三醇生产1,3-丙二醇的能力的微生物中，编码乳酸脱氢酶的基因和编码牵涉于2,3-丁二醇合成中的酶的基因缺失，且其中编码丙酮酸脱羧酶的基因和编码醛脱氢酶的基因引入或扩增。
本申请使用的“缺失”基因是指这样的状态，其中基因自染色体或质粒中缺失，由此不能产生由该基因编码的蛋白质。
在本发明中，具有自丙三醇产生1,3-丙二醇的能力的微生物可为肺炎克雷伯氏菌，且优选地为其中缺失编码乳酸脱氢酶的基因的肺炎克雷伯氏菌。
在本发明的实例中，通过将存在于肺炎克雷伯氏菌(ΔldhA))染色体上的2,3-丁二醇合成基因替换为抗生素安普霉素-抵抗基因以自染色体移除2,3-丁二醇合成基因由此使乙酰乳酸合酶基因(als)缺失，或通过使磷酸转乙酰酶基因(pta)缺失来构建突变体Δ(ldhA als pta)，从而检查乙酸产生增加对1,3-丙二醇产生的效果(图2和表2)。
在本发明的另一实例中，通过将促进丙酮酸盐向乙醇转化的丙酮酸脱羧酶基因(pdc)和醛脱氢酶基因(aldB)引入至缺失2,3-丁二醇合成途径的突变体Δ(ldhA als)中来制备重组体菌株Δ(ldhA als)/pPdc-AldB，并且检查在突变体Δ(ldhA als)/pPdc-AldB中Pdc和AldB酶的活性。结果显示，酶活性增加(图4和5和表3)。
在另一方面，本发明涉及生产1,3-丙二醇的方法，包括以下步骤：(a)在含有丙三醇的培养基中培养突变体(Δ(ldhA als)/pPdc-AldB)以产生1,3-丙二醇；和(b)回收所产生的1,3-丙二醇。
在本发明中，经培养以产生1,3-丙二醇的突变体Δ(ldhA als)/pPdc-AldB可不表达2,3-丁二醇合成基因(als)且可表达Pdc和AldB基因，其在丙三醇代谢过程中促进丙酮酸盐向乙醇的转化。
在本发明中，编码丙酮酸脱羧酶的基因可为衍生自突变体微生物、优选运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)(其具有丙酮酸脱羧酶活性)的pdc。此外，编码醛脱氢酶的基因可为衍生自突变体微生物、优选运动发酵单胞菌(其具有丙酮酸脱羧酶活性)的aldB。
在本发明中发现，在通过使来自肺炎克雷伯氏菌菌株(ATCC 20071)的乙酰乳酸合酶(als)基因缺失所获得的突变体Δ(ldhA als)中，未产生2,3-丁二醇，但主要代谢物包括1,3-丙二醇的产生降低，同时丙三醇代谢和细胞生长分别降低44％和62％(表1)。
此外，还显示，在通过额外地使来自突变体Δ(ldhA als)的磷酸转乙酰酶缺失所获得的突变体Δ(ldhA als pta)中，乙酸的产生提高37％，这与作为对照菌株的乳酸突变体ΔldhA不同，并且丙三醇发酵代谢和细胞生长与突变体Δ(ldhA als)类似而低于对照菌株，并且主要代谢物包括1,3-丙二醇的产生降低(图6和表1)。
在本发明的另一实例中，为了分析丙三醇在突变体Δ(ldhA als)/pPdc-AldB中的发酵代谢特征，在含有作为单一碳源的丙三醇的培养基中培养突变体，且结果发现，突变体显示了细胞生长和丙三醇代谢特征，这几乎与对照菌株相似，而相比于突变体Δ(ldhA alspta)和Δ(ldhA als)而言分别增加52％和57％，并且2,3-丁二醇在突变体Δ(ldhA als)/pPdc-AldB中的产生也低至0.12g/L(表1)。
此外，还发现在突变体Δ(ldhA als)生长过程中丙酮酸盐的浓度极大提高，但在突变体Δ(ldhA als)/pPdc-AldB中丙酮酸盐的浓度降低至与在突变体ΔldhA(图7)中相似的水平。
在本发明的另一实例中，为了分析丙三醇在突变体Δ(ldhA als)/pPdc-AldB中的发酵代谢特征，突变体在含有作为单一碳源的丙三醇的培养基中分批补料培养。结果显示，突变体显示出细胞生长和丙三醇代谢特征几乎与对照菌株相似，并且突变体中1,3-丙二醇的产量为63.3g/L，这与对照菌株(65.9g/L)相似，但是突变体中2,3-丁二醇的产量比突变体Δ(ldhA als)中的产量低76％，这表明2,3-丁二醇的浓度相对于1,3-丙二醇的浓度为14％(mol/mol)，其为最低值(图6和表4)。
在本发明的另一实例中，检查了空气喷射的量对突变体Δ(ldhA als)/pPdc-AldB的分批补料培养的效果，并且结果显示，随着空气喷射量自0.5vvm增至2.0vvm和3.0vvm，1,3-丙二醇的产量提高至63.3g/L(28％)和68.2g/L(38％)。然而，2,3-丁二醇的产量也自7.6g/L增至10.5g/L和12.0g/L，这表明2,3-丁二醇与1,3-丁二醇的比例保持在相似水平(表5)。
实施例
如下，本发明将参照实施例进行更详细地描述。对于本领域技术人员显而易见的是这些实施例仅作示例说明的目的并且不应被理解为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由随附的权利要求及其等价形式进行限定。
实施例1：肺炎克雷伯氏菌突变体Δ(ldhA als pta)的代谢物产量
使用经菌株改善和培养过程显示出高1,3-丙二醇产量的CuΔldhA作为基础菌株，通过替换为抗生素安普霉素(apramycin)-抵抗基因，将牵涉于2,3-丁二醇生产的乙酰乳酸合酶(als)基因自染色体中移除。对于替换为安普霉素-抵抗基因，ard上方区域和下方区域经PCR扩增至约600bp且彼此连接，然后将安普霉素-抵抗基因插入其中。将制备的盒(cassette)引入CuΔldhA菌株中，然后将其在含有安普霉素的培养基中培养。将自培养基分离的菌落进行PCR和Southern杂交，且结果发现精确地发生同源重组。最后，构建了缺失als基因的突变体菌株(图2)。
此外，为了防止作为竞争性代谢途径的乙酸产生且提高1,3-丙二醇的产量，通过替换为抗生素安普霉素-抵抗基因，将在如上所述构建的CuΔldhAΔals菌株中的牵涉于乙酸产生的磷酸转乙酰酶(pta)基因自染色体中移除。对于替换为安普霉素-抵抗基因，ard上方区域和下方区域经PCR扩增至约300bp且彼此连接，然后将安普霉素-抵抗基因插入其中。将制备的盒引入CuΔldhAΔals菌株中，然后将其在含有安普霉素的培养基中培养。将自培养基分离的菌落进行PCR和Southern杂交，且结果发现精确地发生同源重组。最后，构建了缺失pta基因的突变体菌株(图2和表2)。
对于摇瓶培养，使用粗丙三醇(约80％)作为碳源将突变体菌株在250mL烧瓶中培养，并检查1,3-丙二醇产生和代谢物的变化。将在固体培养基中培养的菌株用环刮出，并将菌株接种于20mL LB培养基中并在37℃和200rpm培养10-12小时。将在LB培养基中培养的菌株以相当于培养基体积的2.5％的量接种于100mM胚培养基(germ medium)(10.7g/LK2HPO4,5.24g/L KH2PO4,50g/L粗丙三醇,2g/L(NH4)2SO4,0.2g/L MgSO4,0.002g/L CaCl2·2H2O,1g/L酵母提取液,1ml铁溶液(5g/L FeSO4·7H2O,4ml HCl(37％,w/v),1ml微量元素溶液(70mg/L ZnCl2,100mg/L MnCl2·4H2O,60mg/L H3BO3,200mg/L CoCl2·4H2O,20mg/LCuCl2·2H2O,25mg/L NiCl2·6H2O,35mg/L Na2MoO4·2H2O,4ml HCl(37％,w/v))])中，并且在37℃和200rpm培养。在培养过程中，以12小时间隔采集样品，并且经HPLC分析样品中的代谢物。
在该实施例中，使用了总计四种菌株(ΔldhA、Δ(ldhA als)、Δ(ldhA als pta)和Δ(ldhA als)/pPdc-aldB)并在含有10μg/mL四环素和0.5mM IPTG的培养基中培养(表1)。
构建缺失肺炎克雷伯氏菌菌株(ATCC 20071)的乙酰乳酸合酶基因(als)的突变体并在含有丙三醇的培养基中培养。结果显示2,3-丁二醇并未在突变体中产生，但主要代谢物包括1,3-丙二醇的产量降低，同时丙三醇代谢和细胞生长减少(表1)。
具体地，显示出突变体Δ(ldhA als)中乙酸产量极大提高，这不同于作为亲本菌株的乳酸突变体ΔldhA。因此，为了检查突变体Δ(ldhA als)中乙酸产量提高的效果，构建了缺失磷酸转乙酰酶(Pta)的突变体Δ(ldhA als pta)(图2)，并且分析了突变体中丙三醇的发酵代谢特征。如在下表1中所示，突变体Δ(ldhA als pta)中乙酸产量降低，但丙三醇发酵代谢和细胞生长降低且并未恢复1,3-丙二醇的产量(图3)。
表1：针对肺炎克雷伯氏菌突变体中丙三醇发酵的分批补料培养
表2：在构建肺炎克雷伯氏菌突变体Δ(ldhA als pta)中使用的引物序列
实施例2：肺炎克雷伯氏菌突变体Δ(ldhA als)/pPdc-aldB的代谢物产量
在通过自肺炎克雷伯氏菌cuΔldhA的染色体移除牵涉于2,3-丁二醇的乙酰乳酸合酶(als)和乙酰乳酸脱羧酶(aldB)所获得的菌株的情况下，可观察到干扰1,3-丙二醇的分离和纯化的2,3-丁二醇的产生可极大降低，但1,3-丙二醇的产生也极大降低。认为如上所述的1,3-丙二醇的产生极大降低的原因之一是由于丙酮酸盐在代谢过程中的累积。基于该设想，为了引入乙醇合成途径，该途径消耗丙酮酸盐以提高细胞生长率和丙三醇产生率由此提高1,3-丙二醇的产量，将牵涉于乙醇产生的生物合成途径引入cuΔldhAΔals菌株中。
来自乙醇-生产菌株，即运动发酵单胞菌ZM4，牵涉于乙醇产生的丙酮酸脱羧酶(pdc)和醛脱氢酶(aldB)经PCR扩增而获得。将获得的基因克隆至pGEM-T easy载体，然后测序以证实扩增的DNA的精确性。将经测序的pdc和aldB基因用bglII-XhoI或XbaI-XhoI消化，然后插入pGEM-PlacZ质粒的lacZ启动子的下游，由此构建pGEM-PlacZaldB-pdc。将构建的pGEM-PlacZ-aldB-pdc用EcoRI-PstI消化，然后插入pBR322，由此构建pBR322-PlacZ-aldB-pdc。将构建的质粒经电穿孔引入cuΔldhAΔals菌株，由此构建经转化的重组体菌株Δ(ldhA als)/pPdc-AldB(图4和表3)。
将促进丙酮酸盐向乙醇转化的丙酮酸脱羧酶(Pdc)和醛脱氢酶(AldB)引入缺失2,3-丁二醇合成途径的突变体Δ(ldhA als)，由此构建突变体微生物菌株(图4和表3)。
具体地，将过表达促进丙酮酸盐向乙醇转化的脱羧酶(Pdc)基因和醛脱氢酶(AldB)基因的质粒经电穿孔引入缺失2,3-丁二醇合成途径的突变体Δ(ldhA als)，由此构建重组体菌株Δ(ldhA als)/pPdc-AldB。检查突变体Δ(ldhA als)/pPdc-AldB中Pdc和AldB酶的活性，且结果显示酶活性增加(图5)。
表3：在构建pPdc-AldB中使用的引物序列
分析了突变体Δ(ldhA als)/pPdc-AldB的丙三醇发酵特征，且结果显示，由于Pdc和AldB酶活性增加所导致的乙醇产量极大提高(表1)以及丙三醇代谢和细胞生长恢复至与突变体ΔldhA中相似的水平(图3)。此外，1,3-丙二醇的产量也提高至与突变体ΔldhA中相似的水平，但基本上未观察到2,3-丁二醇的产生，这与突变体Δ(ldhA als)的情况类似(表1)。
实施例3：肺炎克雷伯氏菌突变体Δ(ldhA als)/pPdc-AldB的分批补料培养
对于分批补料培养，使用5-L发酵罐，并且所使用的培养基与在上述摇瓶培养中所使用的相同，除了其含有20mM磷酸盐缓冲液(3.4g/L K2HPO4和1.3g/LKH2PO4)。使用100mM胚培养基在37℃和200rpm，预培养在1-L烧瓶中进行10-12小时。发酵罐的有效体积为2L，并且接种了200ml预培养液。
在含有培养基的5-L发酵罐中，突变体Δ(ldhA als)/pPdc-AldB的分批补料培养在如下条件下进行：37℃的温度，200rpm的搅动速度，6.5的pH以及2.0vvm的供气率(图6)。
如在下表4中所示，突变体Δ(ldhA als)/pPdc-AldB中的1,3-丙二醇的产量与在突变体ΔldhA中的几乎相似，但2,3-丁二醇的产量低于突变体Δ(ldhA als)中的产量，且由此在突变体Δ(ldhA als)/pPdc-AldB中2,3-丁二醇的浓度相比于1,3-丙二醇的浓度是最低的(14％(mol/mol))。
表4：对于肺炎克雷伯氏菌突变体中丙三醇发酵的分批补料培养
如在图7中所示，在突变体Δ(ldhA als)生长过程中丙酮酸盐的浓度极大提高，但在突变体Δ(ldhA als)/pPdc-AldB中丙酮酸盐的浓度降低至与在突变体ΔldhA中相似的水平。
实施例4：氧浓度对肺炎克雷伯氏菌突变体Δ(ldhA als)/pPdc-aldB中丙三醇的 发酵代谢的效果
为了检查在突变体Δ(ldhA als)/pPdc-AldB的培养过程中在发酵罐中的氧浓度的效果，以0.5和3.0vvm的可变供氧率、同时保持其他条件在相同水平来分析丙三醇的发酵代谢特征(图8)。当发酵罐中的空气喷射量自2.0vvm提高至3.0vvm时，1,3-丙二醇的产量自63.3g/L提高至68.2g/L，并且1,3-丙三醇的产率和产量分别自0.51％增至0.63％以及自1.31g/L/h增至1.42g/L/h。然而，2,3-丙二醇的产量也自10.5g/L提高至12.0g/L，且由此2,3-丁二醇与1,3-丙二醇的比例保持在相似水平。另一方面，当发酵罐中的空气喷射量降低至0.5vvm时，1,3-丙二醇的产量极大降低(表5)。
表5：在突变体Δ(ldhA als)/pPdc-AldB的分批补料培养中在发酵罐中的空气喷 射量的效果
工业实用性
本发明的丙三醇-发酵突变体微生物的使用可显著增加1,3-丙二醇的产生同时最小化2,3-丁二醇的产生。
尽管本发明已经参照具体特征进行了详细描述，但是对于本领域技术人员显而易见的是本说明书仅用于优选的实施方案，而不用于限制本发明的范围。因此，本发明实际的范围由随附的权利要求及其等价形式所限定。
序列表
<110> 韩国生命工学研究院(Korea Research Institute of Bioscience andBiotechnology)
<120> 使用缺失2,3-丁二醇合成基因的突变体微生物生产1,3-丙二醇的方法
<130> PF-B1763
<140> PCT/KR2015/001533
<141> 2015-02-16
<150> 10-2014-0021351
<151> 2014-02-24
<160> 8
<170> PatentIn 3.2版
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 1
acccgcaata attcgagctg 20
<210> 2
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 2
gagcgctgta ccgctttgta gttaacgcga taggtttaaa gacgctcag 49
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 3
ctgagcgtct ttaaacctat cgcgttaact acaaagcggt acagcgctc 49
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 4
agagagcgag cgcgaataaa 20
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 5
agatctatgg cttcttcaac tttttatatt cc 32
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 6
ctcgagtcta gattagaaag cgctcaggaa gagtt 35
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 7
tctagaatga gttatactgt cggtacctat ttagc 35
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 8
ctcgagctgc agctagagga gcttgttaac aggcttac 38

Claims (7)

1.一种突变体微生物，其中在具有自丙三醇生产1,3-丙二醇的能力的微生物中，编码乳酸脱氢酶的基因和编码牵涉于2,3-丁二醇合成中的酶的基因缺失，且其中编码丙酮酸脱羧酶的基因和编码醛脱氢酶的基因引入或扩增。
2.权利要求1的突变体微生物，其中所述牵涉于2,3-丁二醇合成中的酶为乙酰乳酸合酶。
3.权利要求1的突变体微生物，其中所述编码丙酮酸脱羧酶的基因为衍生自菌株的pdc，其具有丙酮酸脱羧酶活性。
4.权利要求1的突变体微生物，其中所述编码醛脱氢酶的基因为衍生自菌株的aldB，其具有丙酮酸脱羧酶活性。
5.权利要求1的突变体微生物，其为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)。
6.一种生产1,3-丙二醇的方法，包括以下步骤：
(a)在含有丙三醇的培养基中培养权利要求1-5中任一项的突变体微生物以生产1,3-丙二醇；和
(b)回收产生的1,3-丙二醇。
7.权利要求6的方法，用于步骤(a)的培养的空气喷射量为2.0～5.0vvm。
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Assignee: ACTIVON CO.,LTD.

Assignor: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology

Contract record no.: 2017990000206

Denomination of invention: Method of continuous and high-yield separating and extracting 1,3-dihydroxypropane from fermentation liquid

License type: Exclusive License

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Address before: Daejeon

Patentee before: KOREA Research Institute OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY