CN102395671B - 用于制造1，3-丙二醇的丙三醇氧化途径中阻隔的突变体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微生物突变体，其中基因编码的转录活化剂或基因编码的二羟丙酮激酶在能够使用丙三醇作为碳源来制造1，3-丙二醇的微生物中被去除或被失活，并且本发明还涉及使用该突变体制造1，3-丙二醇的方法。当使用本发明的突变体时，能够最小化使用现有菌株由丙三醇制备1，3-丙二醇时不可避免产生的副产物，从而能够降低纯化1，3-丙二醇的费用。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物突变体，其中基因编码的转录活化剂或基因编码的二羟基丙酮激酶在能够使用丙三醇作为碳源来制造1，3-丙二醇的微生物中被去除或被失活，并且也涉及使用该突变体制造1，3-丙二醇的方法。
背景技术
1，3-丙二醇能用做合成聚酯、聚醚、聚氨酯等的原料，并用于各种应用中，包括纤维如高性能服装、毯子或汽车织物和塑料膜。特别地，通过1，3-丙二醇与对苯二酸聚合制造的聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)，具有优良的物理性能和低于聚对苯二甲酸乙二酯(PET)熔点的228℃的熔点。因此，聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)具有较高的实用性并作为下一代可替代PET的纤维材料而受到关注。此外，由1，3-丙二醇单体制成的塑料和聚合物，与由丁二醇或乙二醇制成的产品相比，显示出优良的光学稳定性。此外，1，3-丙二醇能够用作聚乙二醇型润滑剂和溶剂，因此其商业价值经评估要高于丙三醇的商业价值。
1，3-丙二醇可通过化学合成或微生物发酵制成。用于制造1，3-丙二醇的化学方法包括通过氢甲酰化将环氧乙烷转变成1，3-丙二醇的方法（美国专利号3，687，981）和通过水合将丙烯醛转变成1，3-丙二醇的方法（美国专利号5，015，789）。然而，这种化学方法存在的问题在于，在1，3-丙二醇的生产中，它们需要高温或高压过程，因此导致了高制造成本，且会产生包含环境污染物的废油。
生物方法包括使用兼性厌氧菌株的微生物如柠檬酸细菌、梭状芽胞杆菌、肠杆菌、泥杆菌(ilyobacter)、克雷伯氏杆菌、乳酸杆菌、居泥杆菌(Pelobacter)等由丙三醇来制备1，3-丙二醇的过程（美国专利号5，254，467）。此外，使用这种微生物菌株的遗传工程技术包括这种情况，其中将通过从乳酸杆菌中扩增或剔除丙三醇脱氢酶获得的突变体用于高生产率地制造1，3丙二醇（US2007/0148749）。然而，目前还不存在涉及用于减少副产品的方法的现有技术，该副产品在使用遗传工程变异体制造1，3丙二醇时候大量累积。在使用上述微生物将丙三醇转变成1，3丙二醇的代谢过程中，大量产生各种氧化代谢物。特别地，作为丙三醇的氧化代谢物，2，3-丁二醇的沸点相似于1，3丙二醇的沸点，因此在纯化1，3-丙二醇的过程中作为很大的障碍物。
因此，本发明进行许多努力来研制一种微生物，该微生物通过代谢工程方法在丙三醇新陈代谢中仅产生1，3-丙二醇而不产生包括2，3-丁二醇的氧化代谢副产物。因此，本发明人已经构造了一种突变体，其通过使用基因重组技术仅具有生产1，3-丙二醇的还原代谢途径，来阻隔在丙三醇代谢途径中生产副产物的氧化代谢途径，并且发现，当将该突变体用来制造1，3-丙二醇时，不会产生包括2，3-丁二醇的氧化代谢副产物，从而完成了本发明。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种突变体，其中丙三醇的氧化途径在能够使用丙三醇作为碳源来制造1，3丙二醇的微生物中被阻隔，以便由丙三醇制造1，3-丙二醇而没有副产物。
本发明的另一目的是提供一种制造1，3丙二醇的方法，该方法包括在包含丙三醇的培养基中培养突变体。
为了达成上述目的，本发明提供了一种微生物突变体，其中基因编码的转录活化剂或基因编码的二羟丙酮激酶在能够使用丙三醇作为碳源来制造1，3-丙二醇的微生物中被去除或被失活。
本发明也提供了一种制备1，3-丙二醇的方法，该方法包括通过在包含丙三醇的培养基中培养所述微生物突变体而制造1，3-丙二醇，并回收生产的1，3丙二醇。
本发明也提供了一种能够制造1，3-丙二醇的突变体，其中，包含基因编码1，3-丙二醇氧化还原酶的载体引入到去除了丙三醇脱氢酶基因(DhaD)、转录活化剂基因(DhaR)、1，3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)和丙三醇脱水酶再活化因子II基因(DhaBA2)的克雷白氏杆菌菌株（AK菌株）中，或者将其中基因编码1，3-丙二醇氧化还原酶插入到突变体（AK菌株）的染色体中。
本发明也提供了一种能够制造1，3-丙二醇的突变体，其中，包含基因编码1，3-丙二醇氧化还原酶的载体和基因编码丙三醇脱水酶再活化因子引入到去除了丙三醇脱氢酶基因(DhaD)、转录活化剂基因(DhaR)、1，3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)和丙三醇脱水酶再活化因子II基因(DhaBA2)的克雷白氏杆菌菌株（AK菌株）中，或者将其中基因编码1，3-丙二醇氧化还原酶和基因编码丙三醇脱水酶再活化基因插入到突变体（AK菌株）的染色体中。
本发明也提供了一种能够制造1，3-丙二醇的突变体，其中，包含基因编码1，3-丙二醇氧化还原酶的载体引入到去除了有转录活化剂基因(DhaR)、1，3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)和丙三醇脱水酶再活化因子II基因(DhaBA2)的克雷白氏杆菌菌株（AR菌株）中，或者将其中基因编码1，3-丙二醇氧化还原酶插入到突变体（AR菌株）的染色体中。
本发明也提供了一种能够制造1，3-丙二醇的突变体，其中，包含基因编码1，3-丙二醇氧化还原酶的载体和基因编码丙三醇脱水酶再活化因子引入到去除了转录活化剂基因(DhaR)、1，3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)和丙三醇脱水酶再活化因子II基因(DhaBA2)的克雷白氏杆菌菌株（AR菌株）中，或者将其中基因编码1，3-丙二醇氧化还原酶和基因编码丙三醇脱水酶再活化基因插入到突变体（AR菌株）的染色体中。
本发明也提供了一种制备1，3-丙二醇的方法，该方法包括通过在包含丙三醇的培养基中培养所述突变体而制造1，3-丙二醇，并回收生产的1，3丙二醇。
本发明的其他特征和方面将通过以下详述和附加的权利要求而更加明显。
附图说明
图1是显示丙三醇代谢过程中制造1，3-丙二醇的还原途径和制造副产物的氧化途径的示意图。
图2显示了根据本发明制造突变体的方法，使用dha调节子的结构进行显示。
图3显示了根据本发明的用于制备突变体的质粒DNAs的方法。图3a显示了用于构造质粒DNA的方法，该质粒DNA用于制造AK菌株并包括DhaB基因氨基端(dhaB’)-LacZ启动子（PlacZ）-抗阿普拉霉素基因-DhaK基因氨基端（dhaK’）的连锁，图3b显示了用于构造质粒DNA的方法，该质粒DNA用于制备AR菌株并包括DhaB基因氨基端(dhaB’)-LacZ启动子（PlacZ）-抗阿普拉霉素基因-DhaR基因氨基端（dhaR’）的连锁。
图4是显示克雷白氏杆菌AK和AR菌株的丙三醇代谢物的分析结果的图示。
图5显示了用于构造包含lacZ启动子下游的克雷白氏杆菌的DhaT基因和DhaB再活化酶基因的质粒DNA的方法或者用于构造仅包含lacZ启动子下游的DhaT基因的质粒DNA的方法。
图6是说明用于构造包含lacZ启动子下游的1，3-丙二醇氧化还原酶活性YqhD(E)基因（源自大肠杆菌）和DhaB再活化酶基因的质粒DNA或者用于构造仅包含lacZ启动子下游的YqhD(E)基因的质粒DNA的过程示意图。
图7显示了用于构造包含lacZ启动子下游的1，3-丙二醇氧化还原酶活性YqhD(K)基因（源自克雷白氏杆菌）和DhaB再活化酶基因的质粒DNA或者用于构造仅包含lacZ启动子下游的YqhD(K)基因的质粒DNA的方法。
图8是显示根据本发明的源自克雷白氏杆菌Cu，AK和AR的重组菌株的丙三醇代谢物的分析结果的图示。
具体实施方式
一种情况下，本发明涉及一种微生物突变体，其中基因编码的转录活化剂或基因编码的二羟丙酮激酶在能够使用丙三醇作为碳源来制造1，3-丙二醇的微生物中被去除或被失活。
在根据本发明的突变体中，优选地，基因编码的丙三醇脱氢酶额外被去除或失活。
丙三醇代谢途径由两个代谢途径组成，也就是氧化代谢途径和还原代谢途径（图1）。在氧化代谢过程中，丙三醇被NAD+依赖的丙三醇脱氢酶氧化成二羟基丙酮（DHA）同时生成NADH，然后通过DHA激酶转变成二羟基丙酮磷酸酯（DHAP）。上述二羟基丙酮磷酸酯（DHAP）通过各种途径进行新陈代谢，同时被用作生长需要的碳源和能量源。在氧化代谢过程中，产生包括2，3-丁二醇、乙酸(acetic acid)、乙醇(ethanol)、乳酸（lactic acid）和琥珀酸（succinic acid）的副产物。
同时，在还原代谢过程中，丙三醇在脱水酶的作用下转变为3-羟基丙醛，然后在NADH依赖的氧化还原酶的作用下还原为1，3-丙二醇，同时形成NAD+。
丙三醇的氧化途径和还原途径彼此紧密联系以在细胞中保持NAD+-NADH的平衡，基因编码的四个酶，也就是丙三醇脱水酶（dhaB），1，3-丙二醇还原酶（dhaT），丙三醇脱氢酶（dhaD）和二羟基丙酮激酶（dhaK）在染色体上成簇排列并通过共存的转录因子DhaR以相同的调节子加以调节。
本发明的突变体是微生物菌株，其中参与丙三醇代谢过程的氧化途径中的基因编码蛋白质被去除或失活，且其通过还原途径仅产生1，3丙二醇而不产生包含2，3-丁二醇、乙醇、乳酸和琥珀酸的副产物。
在本发明中，包含在突变体的丙三醇氧化途径中的蛋白质优选是丙三醇脱氢酶，转录活化剂和二羟丙酮激酶。
在本发明中，所述微生物优选选由自柠檬细菌、梭状芽胞杆菌、肠杆菌、泥杆菌(ilyobacter)、克雷伯氏杆菌、乳酸杆菌和居泥杆菌(Pelobacter)所组成的组。
在本发明中，所述微生物优选是克雷白氏杆菌，并且参与丙三醇的氧化途径中的基因编码酶是丙三醇脱氢酶基因（DhaD），转录活化剂基因（dhaR）和二羟丙酮激酶基因（DhaK，DhaL，DhaM和DhaK'）。
在本发明的一实施方式中，克雷白氏杆菌突变体（AK菌株）通过从克雷白氏杆菌菌株的染色体中去除丙三醇脱氢酶基因（DhaD）、转录活化剂基因（DhaR），1，3-丙二醇氧化还原酶基因（DhaT）和丙三醇脱水酶再活化因子II基因（DhaBA2）加以构成。所述突变体用包含1，3-丙二醇氧化还原酶基因（DhaT）和丙三醇脱水酶再活化因子II基因（DhaBA2）的重组载体加以转换，这些基因是参与丙三醇的还原途径的基因，因而修复所述还原途径。因此，构造了仅去除丙三醇脱氢酶基因（DhaD）和转录活化剂基因（DhaR）的突变体（图2）。
因此，本发明的突变体的特征在于，所述丙三醇脱氢酶基因（DhaD）和转录活化剂基因（DhaR）被去除或被失活。
在该过程中，lacZ启动子（PlacZ）插入到参与还原途径中的基因的上游，使得基因不再受DhaR调节剂的调节，由此基因的表达可以使用诱导剂进行人工控制。
在本发明的另一实施方式中，克雷白氏杆菌突变体（AR菌株）通过从克雷白氏杆菌菌株的染色体中去除转录活化剂基因（DhaR），1，3-丙二醇氧化还原酶基因（DhaT）和丙三醇脱水酶再活化因子II基因（DhaBA2）加以构成。所述突变体用包含1，3-丙二醇氧化还原酶基因（DhaT）和丙三醇脱水酶再活化因子II基因（DhaBA2）的重组载体加以转换，这些基因是参与丙三醇的还原途径的基因，因而修复了还原途径。因此，构造了仅去除转录活化剂基因（DhaR）的突变体（图2）。
因此，本发明的突变体的特征在于，转录活化剂基因（DhaR）被去除或被失活。
另一种情况下，本发明涉及一种用于生产1，3-丙二醇的方法，该方法包括在包含丙三醇的培养基中培养微生物突变体，其中基因编码的转录活化剂或基因编码的二羟丙酮激酶在能够使用丙三醇作为碳源来制造1，3-丙二醇的微生物中被去除或被失活。
在本发明的一实施方式中，可以证实，去除了丙三醇脱氢酶基因（DhaD）和转录活化剂基因（DhaR）的克雷白氏杆菌菌株和去除了转录活化剂基因（DhaR）的克雷白氏杆菌菌株在包含丙三醇的培养基中产生了1，3-丙二醇，而不产生除少量乙酸外的氧化途径的副产物。
又一种情况下，本发明涉及一种能够生成1，3丙二醇的突变体，其中包含基因编码1，3-丙二醇氧化还原酶的载体引入到去除了丙三醇脱氢酶基因（DhaD）、转录活化剂基因（DhaR）、1，3-丙二醇氧化还原酶基因（DhaT）和丙三醇脱水酶再活化因子II基因（DhaBA2）的克雷白氏杆菌菌株（AK菌株）中，或者将该基因编码1，3-丙二醇氧化还原酶插入到突变体（AK菌株）的染色体中。
为了制备上述突变体，dha调节子的DhaB酶再活化因子，DhaT基因，DhaR调节剂和DhaD基因，通过使用质粒DNA处理的克雷白氏杆菌MGH78578菌株（下简称为“Cu”）为亲株的同源重组方法被替换为抗阿普拉霉素基因，从而制备出去除了氧化途径和还原途径的重组菌株（下面简称为“AK”菌株）。
为了制备上述突变体，DhaB酶再活化因子、DhaT基因以及dha调节子的DhaR调节剂，通过使用质粒DNA处理的克雷白氏杆菌MGH78578菌株（下简称为“Cu”）为亲株的同源重组方法被替换为抗阿普拉霉素基因，从而制造出去除了氧化途径和还原途径的重组菌株（下面简称为“AR”菌株）。
此外，分析了去除丙三醇的厌氧代谢途径中的克雷白氏杆菌重组菌株（AK和AR菌株）的增殖和丙三醇代谢特性。为此目的，将AK和AR菌株培养在补充有丙三醇的培养基中，并考察了微生物细胞的增殖度。此外，培养液中存在的丙三醇含量以及包含1，3-丙二醇的代谢物的产生通过色谱法进行分析。因此，显示出的是，除了乙酸外没有产生包括2，3-丁二醇在内的氧化代谢物，并且该结果与遗传背景相一致，其中AK和AR菌株中的丙三醇的厌氧代谢途径被阻隔了。
为了修复其中氧化途径和还原途径已阻隔的AK和AR菌株中每一个的丙三醇还原途径，制备了用于修复丙三醇还原途径的质粒。该质粒的制备包括扩增具有1，3-丙二醇氧化还原酶活性的DhaB再活化酶基因（orfw）-orfx DNA片断，dhaT，yqhD（源自大肠杆菌）或yqhD同源基因（源自克雷白氏杆菌）并将扩增产物插入到pGEM TEasy载体的LacZ启动子下游。
为了分析用修复丙三醇还原途径的质粒DNA转换的AK和AR菌株的特性，将每种重组菌株培养在补充有丙三醇、四环素和IPTG的培养基中，同时分析培养液中的代谢物。源自克雷白氏杆菌Cu的重组菌株，在特定时间的培养后，完全消耗了添加的丙三醇，而源自AK或AR的重组菌株显示出比源自Cu的重组菌株那些稍微慢的丙三醇消耗率。但是它们产生1，3丙二醇的性能被发现为修复（图8）。显示了源自大肠杆菌或克雷白氏杆菌的两个yqhD基因与dhaT基因相同的方式修复丙三醇的还原途径，同时经发现，其中丙三醇的氧化途径已被阻隔的源自AK或源自AR的重组菌株除了少量乙酸外不会产生氧化途径的代谢物（图8）。
又一种情况下，本发明涉及一种能够制备1，3-丙二醇的突变体，其中包含基因编码1，3-丙二醇氧化还原酶的载体和基因编码丙三醇脱水酶再活化因子引入到去除丙三醇脱氢酶基因(DhaD)、转录活化剂基因(DhaR)、1，3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)和丙三醇脱水酶再活化因子II基因(DhaBA2)的克雷白氏杆菌菌株（AK菌株）中，或者将其中基因编码1，3-丙二醇氧化还原酶和基因编码丙三醇脱水酶再活化基因插入到突变体（AK菌株）的染色体中。
又一种情况下，本发明涉及一种能够制备1，3-丙二醇的突变体，其中包含基因编码1，3-丙二醇氧化还原酶的载体引入到去除转录活化剂基因(DhaR)、1，3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)和丙三醇脱水酶再活化因子II基因(DhaBA2)的克雷白氏杆菌菌株（AK菌株）中，或者将其中基因编码1，3-丙二醇氧化还原酶插入到突变体（AR菌株）的染色体中。
又一种情况下，本发明涉及一种能够制备1，3-丙二醇的突变体，其中包含基因编码1，3-丙二醇氧化还原酶的载体和基因编码丙三醇脱水酶再活化因子引入到去除转录活化剂基因(DhaR)、1，3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)和丙三醇脱水酶再活化因子II基因(DhaBA2)的克雷白氏杆菌菌株（AR菌株）中，或者将其中基因编码1，3-丙二醇氧化还原酶和基因编码丙三醇脱水酶再活化基因插入到突变体（AR菌株）的染色体中。
本文使用的术语基因的“去除”指代基因从染色体或质粒中去除的状态，以便不能制备出基因编码的蛋白质。术语基因的“失活”指代以下状态，其中基因被插入、移位或部分去除，以便不能制备出基因编码的蛋白质。
根据本发明的突变体可根据普遍已知的方法进行培养，并可适当控制包括培养温度和时间，培养基的pH等条件。从突变体的培养液中收集1，3-丙二醇可使用常规的分离技术，例如蒸馏、电渗析、蒸发、色谱法、溶剂萃取和反应萃取，并且通常使用这些技术的组合以便分离极纯的物质。
实施例
以下参照实施例对本发明进行进一步说明。然而，可以理解的是，这些实施例仅为示例的目的，并不能解释为对本发明的保护范围的限制。
在下面的实施例中，克雷白氏杆菌菌株中丙三醇的氧化途径和还原途径全都阻隔的突变体，并且重新修复丙三醇的还原途径，从而制备出能够制备1，3-丙二醇的突变株，而不产生副产物。然而，本领域的技术人员显而易见的是，能够制备1，3-丙二醇而不产生副产物的突变体，可通过在能由丙三醇制备1，3-丙二醇的微生物中仅阻隔丙三醇的氧化途径来制备。
实施例1：制备丙三醇的氧化-还原代谢途径被阻隔的重组菌株
对于丙三醇代谢途径的重新设计，其中制备克雷白氏杆菌MGH78578(ATCC 700721)中的丙三醇代谢途径被完全阻隔的重组菌株作为基本菌株。为了固定可用于基因重组过程中使用的筛选标记，分析了克雷白氏杆菌MGH 78578菌株的抗生素抗性特征。因此，经发现，阿普拉霉素（50/ml）可作为抗生素标记用于重组菌株的筛选。此外，菌株中起始存在的质粒通过处理方法去除，并且添加四环素为可用的筛选标记。使用质粒DNA处理的克雷白氏杆菌MGH 78578菌株（命名为“Cu”）作为亲株，DhaB酶再活化因子、DhaT基因、DhaR调节剂和dha调节子的DhaD基因（图2）通过同源重组方法用抗阿普拉霉素的基因取代，从而制备出去除了氧化途径和还原途径的重组菌株AK。同时，重组菌株AR通过用抗阿普拉霉素的基因取代DhaB酶再活化因子、DhaT基因和DhaR调节剂来制备。本文中，DhaB基因上游的DhaR依赖性启动子用可人工控制的LacZ启动子替代。
(1) 从克雷白氏杆菌中处理质粒DNA
克雷白氏杆菌MGH78578培养在包含1%的胰蛋白胨、0.5%酵母提取物和0.5% NaCl的液态培养基（LB）中，并在37℃以180rpm培养12小时。然后将培养的菌株亚接种（subinoculate）到包含1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl、2mM Tris-Cl缓冲液和0.1% EtBr的液态培养基中，并在37℃以180rpm培养12小时。以与上述相同的方式重复培养三次。然后将培养液覆盖到不包含抗生素的固态LB培养基上，并在37℃培养12小时，从培养液中分离出单个的菌落。分离的菌落接种到补充或不补充四环素的培养基中，并且选择在补充有四环素的培养基中不再增殖的菌落。从选定的菌落中分离质粒DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳分析，最终选择了缺少质粒DNA的菌株。该选定的菌株称为“克雷白氏杆菌MGH78578 Cu”，并用作制备重组菌株的亲株，之后证实，其细胞增殖和丙三醇代谢特征不会与MGH78578菌株有显著的不同。
(2) 制备丙三醇代谢途径被阻隔的重组菌株
为了分离克雷白氏杆菌MGH78578菌株的染色体DNA，培养该菌株在LB液态培养基（50ml）中12小时，然后在10℃，以14,000×g通过离心分离收集细胞10分钟。用50mM的Tris-Cl（pH 8.0）清洗收集的细胞，重新悬浮在包含3的25%蔗糖，175的TES缓冲液，20% SDS和100的0.5mM EDTA的溶液中，然后在37℃静置30分钟。40的核糖核酸酶(10㎎/的TE缓冲液)加入到该细胞中，然后使其在37℃保持20分钟。为了去除蛋白质，250的蛋白酶K(10㎎/的TE缓冲液)加入到该细胞中，然后将其在50℃培养1小时。900的5M NaCl加入到该细胞中，然后以14,000×g对其离心分离10分钟收集上清液。双倍体积的无水酒精加入到收集的该上清液中，以诱导染色体DNA的沉淀。然后，在4℃，以14,000×g离心分离细胞溶液15分钟以沉淀染色体DNA，用70%的乙醇清洗沉淀的DNA，然后干燥。通过在0.7%（W/V）琼脂糖凝胶上的电泳分析分离的染色体DNA。
用于同源重组的质粒制备用的DNA片断通过使用萃取的染色体DNA作为模板和以下的引子组（primer sets）（图2）的聚合酶链反应（PCR）进行扩增。对于一个变性周期，聚合酶链反应在94℃下使用了50最后的反应溶液进行了30秒，该反应溶液包含有2模板DNA，2的每种引物（primer）DNA，0.2mM dNTP混合液，2mM的MgCl2，5的10×缓冲液(无Mg2+)，0.05U/的Taq聚合酶和30.5三重蒸馏水，并在52℃下退火处理30秒，并在72℃延伸1分钟。
用于扩增dhaBI基因片断的引物
序列号1: 5'-TCTAGAATGAAAAGATCAAAACGATTT-3'(dhaBI XbaI-480bpF)
序列号2: 5'-GGATCCGTCAGCGGCAATCTGCAC-3'(dhaBI BamHI-480bpR)
用于扩增dhaK基因片断的引物
序列号3: 5'-AAGCTTCATGCTCTCCGGCGCCTGTC-3'(dhaK HindIII-200-700 bpF)
序列号4: 5'-AGATCTATTTGGTCCAGCGAGCTGAAGC-3'(dhaK BglII-200-700bpR)
用于扩增dhaR基因片断的引物
序列号5: 5'-AGATCTCCTGGGATTTCGCGACGGCA-3'(dhaR bglII-200-700bpF)
序列号6: 5'-AAGCTTTCGACAATCGGTTTTAAGGTG-3'(dhaR HindIII-200-700bpR)
用于扩增Apr基因片断的引物
序列号7: 5'-GTTAACCTGACGCCGTTGGATACACC-3' Apr HpaI F
序列号8: 5'-AGATCTAAAAGCTTATGAGCTCAGCCAATCGA-3' Apr HindIII-BglIIR
使用pGEM TEasy载体对扩增的DNA片断进行克隆，并且分析了其基本序列。然后如图3中所示，构造了质粒DNAs。
在图3a中所示的方法中，构造了用于制备AK菌株的质粒DNA，其包括
DhaB基因氨基端(dhaB')-LacZ启动子(PlacZ)-抗阿普拉酶素基因-DhaK基因氨基端(dhaK')的连锁(linkage)。在图3b中所示的方法中，构造了用于制备AR菌株的质粒DNA，其包括DhaB基因氨基端(dhaB')-LacZ启动子(PlacZ)-抗阿普拉酶素基因-DhaR基因氨基端(dhaR') 的连锁。
每种质粒用BamHI-BglII进行处理，并且收集的DNA片断通过电穿孔引入到克雷白氏杆菌Cu菌株中。然后分离在补充有阿普拉霉素的培养基中形成菌落的重组菌株。可以推定的是，在获得的菌落中，包含抗阿普拉霉素基因的BamHI-BglII DNA片断插入到染色体中。最终通过南印迹法可以证实，在dha调节子中发生了同源重组。结果，获得了去除DhaB酶再活化因子、DhaT基因、DhaR调节剂和dha调节子的DhaD基因与插入lacZ启动子和抗阿普拉霉素基因的重组菌株AK，以及获得了去除DhaB酶再活化因子、DhaT基因、DhaR调节剂与插入lacZ启动子和抗阿普拉霉素基因的重组菌株AR。
实施例2：分析克雷白氏杆菌菌株AK和AR的特性
分析了克雷白氏杆菌重组菌株AK和AR的增殖和丙三醇代谢特性，其中去除了丙三醇的厌氧性代谢途径。AK和AR每种菌株培养到补充有丙三醇的培养基中，并在37℃以180rpm培养12小时。然后，研究了细胞的增殖度，并通过色谱法分析了培养上清液中存在的丙三醇含量和产生的包括1，3-丙二醇的代谢物（使用的装置：Agilent 1200（折光率检测器，RID）；使用的柱：Aminex HPX-87H(Bio-Rad)300mm×78mm；使用的溶剂：65:35去离子水-乙腈（0.005M H2SO4）；和流速：0.5ml/分钟。AK和AR菌株示出了细胞增殖率，其约比用作对照的亲株Cu慢两倍，并且其丙三醇消耗率和1，3-丙二醇的产生率分别显示为约40%和20%(图5)。可以看出，并没有产生除乙酸外的包括2，3丁二醇的氧化代谢物，该结果与遗传背景相一致，其中在每个AK和AR重组菌株中的丙三醇厌氧性代谢途径被阻隔。
实施例3：制备丙三醇的还原途径被修复的菌株
(1) 制备用于修复丙三醇的还原途径的质粒DNA
DhaB再活化酶基因(orfW)-orfX DNA片断和具有1，3-丙二醇氧化还原酶活性的dhaT，yqhD（源自大肠杆菌)或yqhD同源基因(源自克雷白氏杆菌)使用以下的引物序列扩增。扩增的基因克隆到pGEM TEasy载体，并分析了其基本序列。然后，如图5中所示，制备了质粒DNAs。
序列号9:5'-AGATCTATGAGCTATCGTATGTTTGA-3'(dhaT-BglII F)
序列号10:5'-CTCGAGAAGCTTCAGAATGCCTGGCGGAAAAT-3'
(dhaT-HindIII/XhoI R)
序列号11:5'-AGATCTATGAACAACTTTAATCTGCAC-3'(yqhD-BglII F)
序列号12:5'-AGATCTATGAATAATTTCGACCTGCA-3'(yqhD-HindIII/
XhoI R)
序列号13:5'-AGATCTATGAATAATTTCGACCTGCA-3'(yqhD Kle BglII F)
序列号14:5'-CTCGAGAAGCTTAGCGTGCAGCCTCGTAAAT-3'(yqhD Kle HindIII， XhoI R)
图5显示了用于构造在lacZ启动子下游包含有克雷白氏杆菌的DhaT基因和DhaB再活化酶基因的质粒DNA和用于构造在lacZ启动子下游仅包含有DhaT基因的质粒DNA的过程，图6显示了用于构造在lacZ启动子下游包含有1，3-丙二醇氧化还原酶活性YqhD(E)基因（源自大肠杆菌）和DhaB再活化酶基因的质粒DNA和用于构造在lacZ启动子下游仅包含有YqhD(E)基因的质粒DNA的过程。图7显示了用于构造在lacZ启动子下游包含有1，3-丙二醇氧化还原酶活性YqhD(E)基因（源自克雷白氏杆菌）和DhaB再活化酶基因的质粒DNA和用于构造在lacZ启动子下游仅包含有YqhD(K)基因的质粒DNA的过程。
(2) 制备其中丙三醇的还原途径被修复的重组菌株
上述构造的六种质粒DNAs包含基因编码1，3-丙二醇的氧化还原酶活性酶的每一种，以及包含pBR322和DhaB再活化酶基因的对照质粒DNAs，通过电穿孔引入到丙三醇的厌氧性代谢途径被阻隔的AK和AR每个菌株中，从而制备出丙三醇的还原途径被修复的重组菌株（表1）。将每个质粒引入到亲株Cu中的重组菌株用作对照。该实施例中构造的表2中克雷白氏杆菌AK(Klebsiella pneumoniae AK)的保藏号为KCTC11419BP(该菌株于2008年11月12日保藏在韩国生命工学研究院的韩国典型菌种保藏中心(KCTC, Korean Collection for Type Cultures)) 、克雷白氏杆菌AR(Klebsiella pneumoniae AR)的保藏号为KCTC11420BP（该菌株于2008年11月12日保藏在韩国生命工学研究院的韩国典型菌种保藏中心）、克雷白氏杆菌AK-VOT（Klebsiella pneumoniae AK-VOT）的保藏号为KCTC11421BP（该菌株于2008年11月12日保藏在韩国生命工学研究院的韩国典型菌种保藏中心）、克雷白氏杆菌AK-VOK（Klebsiella pneumoniae AK-VOK）的保藏号为KCTC11422BP（该菌株于2008年11月12日保藏在韩国生命工学研究院的韩国典型菌种保藏中心）、克雷白氏杆菌AR-VOT（Klebsiella pneumoniae AR-VOT）的保藏号为KCTC11423BP（该菌株于2008年11月12日保藏在韩国生命工学研究院的韩国典型菌种保藏中心）以及克雷白氏杆菌AR-VOK（Klebsiella pneumoniae AR-VOK）的保藏号为KCTC11424BP（该菌株于2008年11月12日保藏在韩国生命工学研究院的韩国典型菌种保藏中心）。
表1：本发明中使用或构造的重组菌株和质粒DNAs
。
表2: 根据本发明的重组菌株的保藏号
| 菌株 | 保藏号 |
| 克雷白氏杆菌AK | KCTC11419BP |
| 克雷白氏杆菌 AR | KCTC11420BP |
| 克雷白氏杆菌AK-VOT | KCTC11421BP |
| 克雷白氏杆菌 AK-VOK | KCTC11422BP |
| 克雷白氏杆菌 AR-VOT | KCTC11423BP |
| 克雷白氏杆菌 AR-VOK | KCTC11424BP |
实施例4：丙三醇的还原途径被修复的重组菌株的特性分析
将实施例3中制备的每种重组菌株培养到补充有丙三醇(2%)、四环素(10μg/ml)和IPTG(0.5mM)的培养基（50ml）中，并在37℃以120rpm培养，同时分析培养液中的代谢物。在培养14小时后，源自克雷白氏杆菌Cu的重组菌株完全消耗了加入的丙三醇，而源自AK或AR的重组菌株显示了比源自Cu的重组菌株轻微慢一点的丙三醇消耗率，但经发现它们制备1，3-丙二醇的能力被修复（图8）。可以看出，源自大肠杆菌和克雷白氏杆菌的两YqhD基因以与DhaT基因相同的方式修复了丙三醇的还原途径。同时，可以发现，其中丙三醇的氧化途径被阻隔的源自AK或AR的重组菌株除少量乙酸外并不产生其它的氧化途径代谢物（图8）。
工业实用性
如上所详细说明的，当使用本发明的突变体时，能够最小化使用现有菌株由丙三醇制备1，3丙二醇时不可避免获得的副产物的产生，从而能够降低纯化1，3丙二醇的费用。
尽管参照具体特征已经对本发明进行了详细说明，但本领域的技术人员明白的是，这些说明仅用于优选的实施方式，并不限制本发明的保护范围，因此，本发明的主要范围由附加的权利要求和其等同变化加以确定。
氨基酸序列表
<110> 韩国生命工学研究院
<120> 用于制造1，3-丙二醇的丙三醇氧化途径中阻隔的突变体
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Claims (5)
1.一种能够制造1,3-丙二醇的选自AK-VOT和AK-VOK的突变体，其中，包含编码1,3-丙二醇氧化还原酶的基因的载体被重组到去除丙三醇脱氢酶基因(DhaD)、转录活化子基因(DhaR)、1,3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)和丙三醇脱水酶再活化因子II基因(DhaBA2)的保藏号为KCTC11419BP的克雷白氏杆菌菌株AK中，或者其中编码1,3-丙二醇氧化还原酶的基因被插入到该克雷白氏杆菌菌株AK的染色体中。
2.一种能够制造1,3-丙二醇的选自AK-VOT和AK-VOK的突变体，其中，包含编码1,3-丙二醇氧化还原酶的基因和编码丙三醇脱水酶再活化因子II的基因的载体被重组到去除丙三醇脱氢酶基因(DhaD)、转录活化子基因(DhaR)、1,3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)和丙三醇脱水酶再活化因子II基因(DhaBA2)的保藏号为KCTC11419BP的克雷白氏杆菌菌株AK中，或者其中编码1,3-丙二醇氧化还原酶的基因和编码丙三醇脱水酶再活化因子II的基因被插入到该克雷白氏杆菌菌株AK的染色体中。
3.一种能够制造1,3-丙二醇的选自AR-VOT和AR-VOK的突变体，其中，包含编码1,3-丙二醇氧化还原酶的基因的载体被重组到去除转录活化子基因(DhaR)、1,3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)和丙三醇脱水酶再活化因子II基因(DhaBA2)的保藏号为KCTC11420BP的克雷白氏杆菌菌株AR中，或者其中编码1,3-丙二醇氧化还原酶的基因被插入到该克雷白氏杆菌菌株AR的染色体中。
4.一种能够制造1,3-丙二醇的选自AR-VOT和AR-VOK的突变体，其中，包含编码1,3-丙二醇氧化还原酶的基因的和编码丙三醇脱水酶再活化因子II的基因的载体被重组到去除转录活化子基因(DhaR)、1,3-丙二醇氧化还原酶基因(DhaT)和丙三醇脱水酶再活化因子II基因(DhaBA2)的保藏号为KCTC11420BP的克雷白氏杆菌菌株AR菌株中，或者其中编码1,3-丙二醇氧化还原酶的基因和编码丙三醇脱水酶再活化因子II的基因被插入到该克雷白氏杆菌菌株AR的染色体中。
5.一种制备1,3-丙二醇的方法，所述方法包括通过在包含丙三醇的培养基中培养上述权利要求1至4中任一项所述的突变体来制造1,3-丙二醇，并回收制造的所述1,3-丙二醇。
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