KR101743021B1 - 재조합 미생물을 이용한 l형 2,3-부탄디올의 제조방법 - Google Patents

재조합 미생물을 이용한 l형 2,3-부탄디올의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 재조합 미생물을 이용한 L형 2,3-부탄디올 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 meso형 2,3-부탄디올 생성에 관여하는 효소의 유전자가 결실되어 있고, L형 2,3-부탄디올 생성에 관여하는 효소의 유전자가 증폭되어 있는 변이 미생물을 이용하여 L형 2,3-부탄디올을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 변이 미생물을 배양하여 L형 2,3-부탄디올을 고수율로 제조할 수 있다.

Description

재조합 미생물을 이용한 L형 2,3-부탄디올의 제조방법{Method for Preparing L-type 2,3-Butandiol Using Mutant Microorganism}
본 발명은 재조합 미생물을 이용한 L형 2,3-부탄디올 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 meso형 2,3-부탄디올 생성에 관여하는 효소의 유전자가 결실되어 있고, L형 2,3-부탄디올 생성에 관여하는 효소의 유전자가 증폭되어 있는 변이 미생물을 이용하여 L형 2,3-부탄디올을 제조하는 방법에 관한 것이다.
2,3-부탄디올은 일반적으로 발효에 의해 생산된다. 2,3-부탄디올은 1900년대 초에 이미 박테리아인 Klebsiella pneumoniae , Bacillus polymyxa 또는 Enterobacter aerogenes 등의 발효균주를 이용한 pilot scale 규모의 발효공정이 개발되었다(Canadian Journal of Research , 23f(1): 48-71, 1945). 펜토스(Pentoses), 자일로스(Xylose) 및 아라비노스 (Arabinose) 등을 원료로, Klebsiella 등의 박테리아를 이용한 배양조건(온도, pH, 배지조성, 탄소원 등)을 최적화하여, 발효액으로부터는 다단계 감압분별증류, 용매추출 및 미세기공 테프론멤브레인 막분리 등의 방법으로 분리 정제하여 2,3-부탄디올을 제조하는 방법이 알려져 있다(한국 특허 제 1,314,707호, 한국 공개특허 제 10-2013-0061913호, Qin et al., Chinese J Chem Eng 14:132-136, 2006).
2차 세계대전 당시 생고무대신, 합성고무의 수요급등으로 인해, 부타디엔의 원료로 대량생산되기도 하였으나, 석유로부터 부타디엔을 대량으로 저가로 공급하게 됨에 따라서 2,3-부탄디올의 생산은 일부 정밀화학제품 사용으로 제한되면서 크게 줄어들었다. 하지만 최근 고유가 상황과 석유화학 산업의 환경오염 문제의 심각성이 대두되면서 석유 의존도를 줄이기 위해 석유 대체자원인 바이오매스(2,3-부탄디올)로부터 부타디엔, 2-부탄올 및 2,3-디메틸옥시란을 제조 및 미생물에 의한 2,3-부탄디올을 생산하는 다양한 연구개발이 추진되고 있다(Syu MJ , Appl Microbiol Biotechnol 55:10-18, 2001, 한국 공개특허 제 10-2011-0033193호).
2,3-부탄디올은 프린터 잉크, 향수, 보습제, 연화제, 가소제, 식의약소재 등으로 다양하게 이용되는 화학원료로서, 특히 부타디엔으로 화학전환하여 합성고무의 원료로 이용될 수 있기 때문에 석유화학원료를 대체할 수 있는 대표적인 바이오화학원료로 최근 주목을 받고 있다. 또한 작물생장 촉진 등의 생리활성 기능으로 인해 농업분야에서도 2,3-부탄디올의 활용도는 증대할 것으로 예상된다.
2,3-부탄디올의 생성 능력이 우수한 대표적인 미생물은 Klebsiella pneumoniae이다. 통성 혐기성 미생물인 K. pneumoniae는 글리세롤을 비롯한 다양한 탄소원을 활용할 수 있으며, 균체 생장이 우수한 장점을 지니고 있다. 높은 수준의 2,3-부탄디올 생산 수율이 K. pneumoniae에 의해 보고되었으며, 주로 광학비활성형의 meso형과 광학활성형의 L형 2,3-부탄디올 {L(2S,3S)-2,3-Butanediol}을 생성하는 것으로 밝혀졌다. 지금까지 Klebsiella속 미생물 변이체를 이용하여 meso형 2,3-부탄디올과 L형 2,3-부탄디올의 구분 없이 2,3-부탄디올의 생산성을 향상시키기 위한 미생물 변이체에 대한 연구는 이루어졌었으나, L형 2,3-부탄디올만을 생산하는 연구는 이루어지지 않았다.
또한 K. pneumoniae에서 meso형 2,3-부탄디올 생성에 관여하는 효소에 대해서는 잘 알려져 있으나, L형 2,3-부탄디올 생성에 관여하는 효소에 대해서는 알려져 있지 않은 상황이다.
이에, 본 발명자들은 L형 2,3-부탄디올의 생산효율을 높이고자 예의 노력한 결과, K. pneumoniae에서 L형 2,3-부탄디올 생성에 관여하는 효소를 분리하고, 이를 이용할 경우 L형 2,3-부탄디올 생성이 증진되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 향상된 L형 2,3-부탄디올 생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 L형 2,3-부탄디올 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 글루코스로부터 2,3-부탄디올 생성능을 가지는 미생물에서, 락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자와 meso형 2,3-부탄디올 생성에 관여하는 효소의 유전자가 결실되어 있고, L형 2,3-부탄디올 생성에 관여하는 효소의 유전자가 증폭되어 있는 변이 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 변이 미생물을 글루코스 함유 배지에서 배양하여 L형 2,3-부탄디올을 생산 및 수득하는 단계를 포함하는 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 변이 미생물을 배양하여 L형 2,3-부탄디올을 고수율로 제조할 수 있다.
도 1은 Meso형 2,3-부탄디올 생성 효소가 결손된 Klebsiella속 변이균주의 제작 과정을 나타낸 것이다.
도 2은 L형 2,3-부탄디올 생성 효소의 아미노산 서열 상동성 분석을 실시한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 대장균을 이용한 신규 L형 2,3-부탄디올 생성 효소의 발현 및 정제 과정을 나타낸 것이다.
도 4는 L형 2,3-부탄디올 생성 효소의 활성에 대한 반응 pH와 온도의 영향을 조사한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 L형 2,3-부탄디올 생성 효소를 과발현한 Klebsiella속 변이균주의 유가식 배양 결과를 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
미생물 발효에 의하여 생성되는 2,3-부탄디올은 주로 광학비활성형의 meso형과 광학활성형의 L형 2,3-부탄디올이 혼합하여 생성되고 있으나, 본 발명에서는 향상된 L형 2,3-부탄디올 생성능을 가지는 변이 미생물을 이용하여 L형 2,3-부탄디올 생성이 증진되는 것을 하였다.
본 발명은 일 관점에서, 글루코스로부터 2,3-부탄디올 생성능을 가지는 미생물에서, 락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자와 meso형 2,3-부탄디올 생성에 관여하는 효소의 유전자가 결실되어 있고, L형 2,3-부탄디올 생성에 관여하는 효소의 유전자가 증폭되어 있는 변이 미생물에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 변이 미생물을 글루코스 함유 배지에서 배양하여 L형 2,3-부탄디올을 생산 및 수득하는 단계를 포함하는 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 유전자의 ‘결실’이란 상기 유전자가 염색체상 또는 플라스미드 상에서 삭제되어 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 생산 할 수 없게 된 상태를 의미한다.
본 발명에 있어서 글루코스로부터 2,3-부탄디올 생성능을 가진 미생물은 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태에서, 염색체상의 meso-2,3-부탄디올 생산에 관여하는 acetoin reductase (Ard)유전자를 항생제 apramycin 내성 유전자로 치환하여 염색체상에서 제거하여 ard 유전자가 결실되어 L형 2,3-부탄디올 생성능이 향상된 변이균주 Δ(ldhA ard)변이균주를 제작하였다 (도 1 및 표 1).
본 발명의 다른 양태에서, K. pneumoniae에서 존재하는 dehydrogenase중에서 meso형 2,3-부탄디올 생성에 관여하는 유전자 (ard)와 L형 2,3-부탄디올 생성에 관여하는 유전자 (ABR76070)를 분리하여 과발현하는 플라스미드를 제작하였다. 제작된 플라스미드들을 Δ(ldhA ard) 균주에 전기충격법으로 도입하여 Δ(ldhA ard)/ABR76070 변이균주를 제작하였다 (표 2).
또한 Δ(ldhA ard)균주에 Ard 유전자를 발현한 균주 배양을 통하여 meso형 2,3-부탄디올의 생성량이 약 5배 증가한 반면, L형 2,3-BD의 생산량은 거의 변화가 없는 것으로 나타났으며, Δ(ldhA ard)/ABR76070 변이균주를 배양한 경우, meso형 2,3-부탄디올의 생성량이 약 2.6배 증가하기는 하였으나, L형 2,3-부탄디올의 생성량이 7.5배 증가한 것으로 나타났다 (표 2).
본 발명의 또 다른 양태에서, L형 2,3-부탄디올 생성 효소, ABR76070 발현 플라미스드를 E. coli BL21 (DE3) 균주에 형질전환 한 후, IPTG로 발현을 유도하였으며, Ni-NTA 아가로스 beads를 이용하여 가용성 효소를 정제하였다 (도 3).
또한 정제된 L형 2,3-부탄디올 생성 효소의 기질 특이성을 조사한 결과, 표 3에 나타난 바와 같이, ABR76070 효소는 L형 2,3-부탄디올 기질에 대해 가장 높은 산화반응 활성을 보였으며, meso형과 D형의 2,3-부탄디올에 대해서는 상대적으로 낮거나 활성이 보이지 않는 것으로 나타났다. ABR76070 효소의 활성에 대한 pH와 온도의 영향을 조사한 결과, pH 7과 40℃에서 가장 높은 활성을 보이는 것으로 나타났다 (도 4).
본 발명의 또 다른 실시예에서, Δ(ldhA ard)/ABR76070 변이체를 유가식 배양한 결과, ABR76070 유전자가 과발현된 변이균주에서 L형 2,3-부탄디올의 생성량이 모균주에 비해 3.5배 증가하는 것으로 나타났다 (표 5).
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. Meso 형 2,3- 부탄디올 생성 효소가 결손된 Klebsiella 변이균주의 제작 및 특성 분석
락테이트 디하이드로게나제 유전자가 결실된 Klebsiella 균주의 염색체상의 2,3-부탄디올 생산에 관여하는 acetoin reductase (Ard)유전자를 항생제 apramycin 내성 유전자로 치환한 변이균주를 제작하였다. acetoin reductase (Ard) 유전자를 Apramycin 내성 유전자로 치환하기 위해 ard up region과 down region, 약 300 bp을 PCR한 후, DNA 단편의 중간 부위에 apramycin 내성유전자를 삽입하였다. 제작된 DNA 카세트를 Klebsiella pneumoniae (ATCC200721)에서 ΔldhA가 결손된 변이균주를 도입한 후, apramycin이 첨가된 배지에서 얻어진 콜로니를 southern hybridization 실험을 통해 homologous recombination이 정확하게 일어났음을 확인하여 최종적으로 ard 유전자가 결손된 Klebsiella pneumoniae Δ(ldhA ard)를 제작하였다 (도1).
Ard 유전자 변이균주의 제작에 사용된 올리고 뉴클레오타이드 서열
Primer Sequence
ard
up		 서열번호 2 F:ATCACAATAAGGAAAGGAAA
서열번호 3 R:CGGTCATATAATCAGAATCCGGTTAACCCTTTAACGTTGATGTTG
ard
down		 서열번호 4 F:CAACATCAACGTTAAAGGGTTAACCGGATTCTGATTATATGACCG
서열번호 5 R:ATTTGGTTCCTCAATTTTATAG
Ard 유전자가 결손된 Klebsiella pneumoniae Δ(ldhA ard) 변이 균주를 glucose를 유일 탄소원으로 포함하는 배지(0.1 M photassium phosphate buffer (pH7.0) 1 L에 60 g/L glucose를 첨가한 후, 2 g/L (NH4)2SO4, 0.2 g/L MgSO4, 0.002 g/L CaCl2 ·2H2O, 1 g/L yeast extract, 5 g/L FeSO4 ·7H2O in 4 ml (37%, v/v), 1 ml trace metal solution (70 mg/L ZnCl2, 100 mg/L MnCl2 ·4H2O, 60 mg/L H3BO3, 200 mg/L CoCl2 ·4H2O, 20 mg/L CuCl2 ·2H2O, 25 mg/L NiCl2 ·6H2O, 35 mg/L Na2MoO4 ·2H2O, 4 mL HCl (37%, v/v), 0.5 mM IPTG)에서 37℃, 200 rpm 조건에서 배양하였다.
배양액 내 acetoin, meso형 2,3-부탄디올, L형 2,3-부탄디올을 HPLC로 분석한 결과, 대조군인 ΔldhA 균주에 비해 Δ(ldhA ard) 변이 균주의 경우 acetoin의 생성량이 0.8 g/L에서 10.3 g/L 크게 증가하였다. 또한 대조군인 ΔldhA 균주에 비해 Δ(ldhA ard) 변이 균주의 경우 meso형 2,3-부탄디올의 생성량이 13.9 g/L에서 0.6 g/L으로 확연히 감소하는 것으로 나타난 반면, L형 2,3-부탄디올의 생성량은 1.2 g/L에서 0.9 g/L로 약간 감소하는 것으로 나타났다 (표 2).
Klebsiella pneumoniae 변이균주의 플라스크 배양 결과
Metabolite (g/L) ΔldhA Δ(ldhA ard) Δ(ldhA ard)/ Ard Δ(ldhA ard)/ ABR76070
Acetoin 0.8 10.3 10.7 8.3
Meso-2,3-BD 13.9 0.6 2.9 1.6
L(2S,3S)-2,3-BD 1.2 0.9 1.0 6.8
실시예 2. L형 2,3- 부탄디올 생성 효소의 분리
K. pneumoniae에 존재하는 dehydrogenase중에서 meso형 2,3-부탄디올 생성에 관여하는 유전자 (ard)와 L형 2,3-부탄디올 생성에 관여하는 유전자 (ABR76070 유전자, 염기서열 1)를 분리하여 과발현하는 플라스미드를 제작하였다. PCR 증폭법으로 2,3-부탄디올 생성에 관여하는 dehydrogenase Ard와 ABR76070 유전자를 증폭하여 각각 pGEM-T 벡터에 클로닝한 후 염기서열을 분석, 확인하였다 (도 2). 증폭된 유전자를 XbaI-BamHI으로 절단하여 pGEM-PlacZ 플라스미드의 lacZ 프로모터 하류에 삽입한 후, 제한효소 SpeI으로 절단, Klenow를 처리하여 평활말단을 만든 후 테트라사이클린 항생제 마커 유전자와 연결하였다. 제작된 플라스미드를 실시예 1에서 제작한 Δ(ldhA ard) 균주에 전기충격법으로 도입하여 재조합 균주를 제조하였다.
Δ(ldhA ard)균주에 Ard 유전자를 발현한 변이 균주를 glucose를 유일한 탄소원으로 포함하는 배지에서 배양한 결과, meso형 2,3-부탄디올의 생성량이 0.6 g/L에서 2.9 g/L로 증가한 반면, L형 2,3-부탄디올의 생산량은 거의 변화가 없는 것으로 나타났다(표 2).
한편, Δ(ldhA ard)균주에 ABR76070 유전자를 발현한 균주를 glucose를 유일한 탄소원으로 포함하는 배지에서 배양한 결과, meso형 2,3-부탄디올의 생성량이 0.6 g/L에서 1.6 g/L로 증가하였으며, 특이적으로 L형 2,3-부탄디올의 생성량이 0.9 g/L에서 6.8 g/L로 두드러지게 증가하는 것으로 나타났다(표 2).
사용된 프라이머 서열
서열번호 6 : F: 5’-gctagcatgcagatcgatttaacaggta-3’
서열번호 7 : R: 5’-ctcgagtcaggcgttcaatccgcc-3
실시예 3. L형 2,3- 부탄디올 생성 효소의 발현, 정제 및 생화학적 특성 분석
(1) ABR76070 효소의 과발현 및 정제
ABR76070 유전자를 대장균에 발현시키기 위한 프라이머를 제작하고, PCR 증폭법으로 유전자를 확보하여 pGEM-T-Easy 벡터에 클로닝한 후 염기서열을 분석하여 서열번호 1에 나타내었다. 상기 재조합 벡터를 NheI-XhoI로 절단한 후 DNA 단편을 대장균 발현 벡터인 pET-28a에 클로닝하였다.
ABR76070 발현 플라미스드를 E. coli BL21 (DE3) 균주에 형질전환 한 후, 1 mM IPTG로 ABR76070 효소의 발현을 유도하였다 (28℃, 24시간). 생성된 ABR76070 단백질을 SDS-PAGE로 분석하였으며, Ni-NTA 아가로스 beads를 이용하여 가용성 효소를 정제하였다 (도 3).
사용된 프라이머 서열
서열번호 8 : F: 5’-gctagcatgcagatcgatttaacaggta-3’
서열번호 9 : R: 5’-ctcgagtcaggcgttcaatccgcc-3‘
(2) 기질 특이성 조사
정제된 L형 2,3-부탄디올 생성 효소(ABR76070)의 기질 특이성을 조사하였다. 50 mM potassium phosphate buffer (pH7.0)에서 조효소 NAD (5 mM) 첨가해 산화반응의 활성을 측정했으며, 환원반응에 대한 활성은 조효소 NADH를 사용하여 측정하였다.
표 3에 나타난 바와 같이, ABR76070 효소는 L형 2,3-부탄디올을 기질로 사용한 경우에서 가장 높은 산화반응 활성을 보였으며, meso형과 D형의 2,3-부탄디올에 대해서는 상대적으로 효소의 활성이 낮거나 없는 것으로 나타나, 상기의 배양 실험 결과와 일치하는 것으로 확인되었다. 한편, ABR76070 효소는 Acetoin 기질에서 높은 환원반응 활성을 보이는 것으로 확인되었다.
신규 2,3-부탄디올 생성 효소의 기질특이성 분석
Substrate Activity (%)
Oxidation
L(2S,3S)-2,3-Butanediol 100
Meso-2,3-Butanediol 14.3±1.1
D(2R,3R)-2,3-Butanediol ND
1,4-Butanediol 20.4±1.3
1,3-Propanediol 10.2 ±0.7
Glycerol 2.1 ±0.1
Reduction
Acetoin 100
Diacetyl 48.6±1.4
3-Hydroxy-3-methly-2-butanone 16.7±0.3
(3) pH, 온도 영향
ABR76070 효소의 활성에 대한 pH와 온도의 영향을 조사한 결과, L형 2,3-부탄디올을 기질로 사용한 산화반응의 활성은 pH 7과 40℃에서 가장 높은 것으로 나타났으며, acetoin을 기질로 사용한 환원반응의 최적의 pH와 온도는 각각 5.0과 40℃인 것으로 확인되었다 (도 4).
(4) Km, Vmax
ABR76070 효소의 Km과 Vmax (μm/min)값을 조사한 결과, 기질로 L형 2,3-부탄디올을 사용한 경우의 Km과 Vmax값은 각각 5.51±0.31과 6.73±0.55이었으며, acetoin의 경우 각각 0.58±0.11과 36.36±0.34으로 확인되었다. 또한 Specific activity (U/mg)은 L형 2,3-부탄디올과 acetoin에 대해 각각 2.99±0.23와 16.16±0.13인 것으로 확인되었다(표 4). 이는 ABR76070 효소의 환원반응 활성이 산화반응 활성에 비해 높음을 의미한다.
2,3-부탄디올 생성 효소의 kinetics
Substrate Km (mM) Vmax (μm/min) Specific activity (U/mg)
L형 2,3-부탄디올 5.51±0.31 6.73±0.55 2.99±0.23
Acetoin 0.58±0.11 36.36±0.34 16.16±0.13
실시예 4. Klebsiella 변이균주의 유가식 배양에 의한 L형 2,3- 부탄디올 생산
실시예 1 및 2에서 제작한 Klebsiella pneumoniae 변이균주를 배양하여 L형 2,3-부탄디올의 생산을 확인하였다. 유가식 배양에 사용한 배지 조성은 다음과 같다. 3.4 g/L K2HPO4, 1.3 g/L KH2PO4에 50 g/L crude glycerol, 2 g/L (NH4)2SO4, 0.2 g/L MgSO4, 0.002 g/L CaCl2ㆍ2H2O, 1 g/L yeast extract, 1 mL 철 용액 (5 g/l FeSO4ㆍ7H2O, 4 mL HCl (37%,w/v), 1 mL 미량원소용액 (70 mg/L ZnCl2, 100 mg/L MnCl2ㆍ4H2O, 60 mg/L H3BO3, 200 mg/L CoCl2ㆍ4H2O, 20 mg/L CuCl2ㆍ2H2O, 25 mg/L NiCl2ㆍ6H2O, 35 mg/L Na2MoO4ㆍ2 H2O, 4 mL HCl (37%,w/v))
상기의 배지 2 L를 첨가한 5L 발효조에서 배양온도 37°C, 교반속도 200 rpm, pH 6.0, 공기 공급속도는 2.0 vvm의 조건으로 변이체 Δ(ldhA ard)/ABR76070의 유가식 배양을 실시하였다 (도 5).
표 5에서 보인바와 같이, ABR76070 유전자가 과발현된 변이균주에서 L형 2,3-부탄디올의 생성량이 대조군(ΔldhA)과 비교해 3배 이상 증가하는 것으로 나타났다.
2,3-부탄디올 생성 효소 발현 변이균주의 유가식 배양 결과
Metabolites (g/L) ΔldhA Δ(ldhA ard)
pGEM-T pGEM-T ABR76070
Glucose consumed 182.4 108.1 220.7
Acetoin 3.7 33.3 8.8
Meso-2,3-BD 87.0 8.7 19.9
L(2S,3S)-2,3-BD 21.9 23.3 77.6
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시의 일예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for Preparing L-type 2,3-Butandiol Using Mutant Microorganism <130> P14-B036 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 744 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae <400> 1 atgcagatcg atttaacagg taaaaaggcg ctggttaccg gcgccagccg tgggctgggt 60 cgcgcaatcg cgctgtcgct ggcacgcgcc ggtgccgatg tggttattac gtatgaaaaa 120 tcggccgata aagcccaggc agtcgccgat gaaataaagg ccctgggtcg gcacggcgag 180 gcggtgcagg ccgacagcgc cagcgcgcag gctattcagg aggcggtaac ccatgcggcc 240 cggtccctcg gcgggctgga tattttggtc aacaacgccg ggatcgcccg cggcggtcca 300 ctggaatcca tgacgctggc ggacattgac gcccttatca acgtcaatat tcgtggggtg 360 gtcatcgcca cccaggaagc gctggtgcat atggccgatg gcggacggat catcaacatc 420 ggcagctgtc tggctaatcg cgtggccatg ccgggcatcg cggtttacgc catgaccaag 480 tccgccctca acgccctgac ccgtggcctg gcgcgtgatt taggccctcg cgggatcacc 540 gttaaccttg tccatccagg gccgaccaac agcgatatga acccggaaga cggagaacag 600 gcggaagccc agcgccagat gattgcggtc ggtcactacg gccagccgga agacatcgcc 660 gcggcggtca ccttcctcgc cagcccggca gccgggcaga tctccggtac ggggctggac 720 gtggatggcg gattgaacgc ctga 744 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 atcacaataa ggaaaggaaa 20 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cggtcatata atcagaatcc ggttaaccct ttaacgttga tgttg 45 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 caacatcaac gttaaagggt taaccggatt ctgattatat gaccg 45 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 atttggttcc tcaattttat ag 22 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gctagcatgc agatcgattt aacaggta 28 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ctcgagtcag gcgttcaatc cgcc 24 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gctagcatgc agatcgattt aacaggta 28 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ctcgagtcag gcgttcaatc cgcc 24

Claims (6)

  1. 글루코스로부터 2,3-부탄디올 생성능을 가지는 미생물에서, 락테이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자와 meso형 2,3-부탄디올 생성에 관여하는 효소의 유전자가 결실되어 있고, 서열번호 1의 염기서열을 가지는 L형 2,3-부탄디올 생성에 관여하는 효소의 유전자가 증폭되어 있는 변이 미생물.
  2. 제1항에 있어서, meso형 2,3-부탄디올 생성에 관여하는 효소는 아세토인 리덕타제인 것을 특징으로 하는 변이 미생물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)인 것을 특징으로 하는 변이 미생물.
  6. 다음 단계를 포함하는 L형 2,3-부탄디올의 제조방법:
    (a) 제1항, 제2항, 제5항 중 어느 한 항의 변이 미생물을 글루코스 함유 배지에서 배양하여 L형 2,3-부탄디올을 생성하는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 L형 2,3-부탄디올을 수득하는 단계.
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