CN114874961B

CN114874961B - 一种利用乙醛合成乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN114874961B
Application number: CN202210618205.0A
Authority: CN
Inventors: 马媛媛; 李锋; 宋浩; 户东升
Original assignee: Tianjin University; Frontier Technology Research Institute of Tianjin University Co Ltd
Current assignee: Tianjin University; Frontier Technology Research Institute of Tianjin University Co Ltd
Priority date: 2022-05-24
Filing date: 2022-05-24
Publication date: 2023-08-04
Anticipated expiration: 2042-05-24
Also published as: CN114874961A

Abstract

本发明公开了一种利用乙醛合成乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用，在运动发酵单胞菌中建立乙偶姻生产途径。乙醛在甲醛裂合酶FLS的作用下合成乙偶姻。通过将上述酶构建至运动发酵单胞菌中，能够简洁快速的实现乙偶姻的生物合成。而且运动发酵单胞菌属于安全微生物，对发酵设备无特殊要求，具有广泛应用前景。

Description

一种利用乙醛合成乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程和发酵工程领域，更确切的说，本发明涉及异源生物合成乙偶姻的代谢途径。选择来源于细菌的外源酶，选用改造过的细菌作为宿主细胞，最终实现了乙偶姻的生产。

背景技术

乙偶姻(acetoin)又名甲基乙酰甲醇，是一种重要的香精香料物质，具有强烈的奶油、脂肪、白脱样香气，高度稀释后会有令人愉悦的奶香气。国家标准GB2760-1986规定为可以使用的食品香料，美国食品香料和FEMA安全号为2008，国内外常将其用作各种食品的香味增强剂以及配置奶香型、肉香型、草莓香型的香精^[1]。作为美国能源部30种优先开发利用的平台化合物之一，乙偶姻广泛应用于食品、烟草、化妆品、植物、医药和化工领域^[2]。乙偶姻的制备可以通过从含乙偶姻的植物中提取以及化学合成法和酶转化法^[3]。由于能源和环境的恶化以及化学合成的乙偶姻作为食品添加剂存在健康隐患，因此化学合成法不能满足人们的需求；而酶催化法和植物提取仍然无法克服成本高昂的缺点，因此也不能应用于工业化生产。

运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)是一种天然生产乙醇的兼性厌氧革兰氏阴性菌，由Barker和Hmer从变质的苹果酒中分离出来。具有生长速度快，糖利用率高，高酒精耐受性，适应广泛的pH范围(pH3.5-7.5)。作为GRAS微生物，其优良的菌株特性和代谢途径，以及通过对它遗传元件的研究和遗传操作的开发，使其在生物合成上有着广泛的应用，除了生产乙醇外，还用于生产其他高附加值产品，例如异丁醇、2,3-丁二醇、果聚糖、甘油、乙烯、丁二酸和琥珀酸等。目前还没有文献报道以运动发酵单胞菌为底盘菌株生产目标产物乙偶姻，本发明构建了利用乙醛合成乙偶姻的代谢途径，实现了在运动发酵单胞菌中高产乙偶姻^[4-5]。

参考文献：

[1]Xiao Z,Lu JR.Generation of acetoin and its derivatives in foods.JAgric Food Chem.2014,16；62(28):6487-97.

[2]Gao C,Zhang L J,Xie Y J,etal.Production of(3S)-acetion fromdiacetyl by using stereoselective NADPH-dependent carbonyl reductase andglucose dehydrogenase[J].Bioresour Technol,2013,137:111-115

[3]Ji X J,Xia Z F,Fu N H,et al.Cofactor engineering throughheterologous expression of an NADH oxidase and its impact on metabolic fluxredistribution in Klebsiella pneumonia[J].Biotechnology for biofuels,2013,6(1):7.

[4]Yang S,Mohagheghi A,Franden MA,Chou YC,Chen X,Dowe N,Himmel ME,Zhang M.Metabolic engineering of Zymomonas mobilis for 2,3-butanediolproduction from lignocellulosic biomass sugars[J].Biotechnol Biofuels.2016Sep2；9(1):189.

[5]Liu Y,Ghosh IN,Martien J,Zhang Y,Amador-Noguez D,LandickR.Regulated redirection of central carbon flux enhances anaerobic productionof bioproducts in Zymomonas mobilis[J].Metab Eng.2020Sep；61:261-274.

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种利用乙醛合成乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用，解决现有技术中乙偶姻生产存在健康隐患，或者成本高昂不能应用于工业化生产的问题。

本发明的技术方案概述如下：

一种利用乙醛合成乙偶姻的重组运动发酵单胞菌，含有编码甲醛裂合酶的基因L482S的表达载体；宿主菌为运动发酵单胞菌。

所述甲醛裂合酶基因L482S的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

所述表达载体为pEZ15Asp、pHW20a或pZA22。

所述的重组运动发酵单胞菌的构建方法，构建分别由启动子P_tet、P_tuf、P_zwf、P_xsea和P_gap调控由甲醛裂合酶基因L482S表达盒，将构建的表达盒转化至运动发酵单胞菌宿主细胞，获得重组运动发酵单胞菌

另一种重组运动发酵单胞菌的构建方法为：将甲醛裂合酶基因L482S连接至表达载体后，转入运动发酵单胞菌宿主细胞，获得重组运动发酵单胞菌；或将甲醛裂合酶基因L482S通过分子生物学技术整合至宿主细胞的基因组，获得重组运动发酵单胞菌。

作为优选，在上述获得的重组运动发酵单胞菌中敲除生产菌株中的竞争代谢途径乙醇脱氢酶基因adhB、乳酸脱氢酶基因ldhA、丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl、葡萄糖-果糖氧化还原酶基因gfo、柠檬酸裂合酶cl和过氧化氢酶cat，获得工程菌株。

所述的重组运动发酵单胞菌在生产乙偶姻中的应用。

一种重组运动发酵单胞菌生产乙偶姻的方法，包括以下步骤：

(1)制备权利要求1所述重组运动发酵单胞菌；

(2)发酵培养所述重组运动发酵单胞菌，发酵液中得到乙偶姻。

所述发酵培养是指按照初始接种密度为OD₆₀₀＝0.05－0.45将工程菌接种于发酵培养基，培养温度为30℃，并在100－200rpm的摇床速度下以及10－100g/L葡萄糖浓度下的条件下发酵。

有益效果：

本发明在运动发酵单胞菌中建立乙偶姻生产途径，乙醛在甲醛裂合酶(FLS)的作用下转化为乙偶姻。通过将上述酶构建至运动发酵单胞菌中，能够简洁快速的实现乙偶姻的生物合成。而且运动发酵单胞菌属于安全微生物，对发酵设备无特殊要求，具有广泛应用前景。本发明选择了催化效率较高的酶在运动发酵单胞菌CP4中表达，将乙醛途径引入运动发酵单胞菌中获得重组菌株，优化发酵条件，实现乙偶姻在重组菌株中的生产，为乙偶姻的生物合成提供了新思路。

附图说明

图1为乙醛途径中乙偶姻合成代谢图；

图2质粒pPtetL的电泳图鉴定；1泳道：Marker III；2泳道：使用引物对pEZ-F/pEZ-R对菌株进行PCR鉴定；

图3pE-Ptet-L482S质粒图谱；

图4重组菌株CP4(pP_tetL),ΔadhB(pP_tetL)和Δ4(pP_tetL)发酵乙偶姻产量；(A)在不同四环素诱导剂浓度下的乙偶姻产量；(B)L482S途径在缺失工程菌株的乙偶姻产量。**代表p<0.01，具有显著统计学差异；

图5组成型启动子调控乙醛合成乙偶姻途径的电泳图鉴定；1，4泳道：Marker III；2泳道：使用引物对pEZ-F/L482S-R鉴定pE-Pgap-L482S(pPgapL)质粒；3泳道：使用引物对pEZ-F/L482S-R鉴定pE-Pxsea-L482S(pPxseaL)质粒；5泳道：使用引物对pEZ-F/L482S-R鉴定pE-Pzwf-L482S(pPzwfL)质粒；6泳道：使用引物对pEZ-F/L482S-R鉴定pE-Pgap-L482S(pPtufL)质粒；

图6组成型启动子调控乙醛合成乙偶姻途径在ΔadhB菌株中发酵生产乙偶姻；

图7质粒pP_tufL在多基因缺失菌株中过表达发酵生产乙偶姻；

图8ΔadhB(pP_tufL)、Δ2(pP_tufL)、Δ3(pP_tufL)补料发酵生产乙偶姻。

具体实施方式

甲醛裂合酶基因：L482S

大肠杆菌DH5α感受态(博迈德公司)

运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)

表达载体为：pEZ15Asp(pE)

下面通过实施例来详细阐明本发明。但本发明并不限于以下实施例。

实施例1构建诱导型乙醛途径的重组质粒

(1)荧光假单胞菌的L482S基因编码甲醛酶(FLS)，该酶能够催化乙醛转化为乙偶姻。本发明利用该酶的催化性质，构建了P_tet-L482S表达盒，在菌体内通过添加诱导剂，以启动L482S基因的表达，产生的甲醛酶能催化乙醛转化为乙偶姻。L482S基因和P_tet启动子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。由北京擎科新业生物技术有限公司对核酸序列进行密码子优化，并将优化后的合成基因连接至载体pUC57，得到质粒pUC57-L482S。

(2)构建重组质粒pE-P_tet-L482S

用引物L482S-F如序列表中SEQ ID NO.3、L482S-R如序列表中SEQ ID NO.4，以质粒puc57-L482S为模板，使用高保真酶Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase扩增P_tet-L482S表达盒。在200μL的PCR管中配制50μL反应体系，包括：25μL的2×Phanta MaxBuffer(Vazyme)，2μL的上游引物alssD-SLF，2μL的上游引物alssD-SRR，1μL的dNTP Mix，1μL的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，和17μL无菌水。PCR反应热循环程序为95℃预变性3min，95℃变性15s，50℃退火15s，72℃延伸3min，终延伸5min。使用NEB公司的EcoR I-HF和Pst I-HF限制性内切酶双酶切从而获得线性化质粒pE，电泳后用天根公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标载体片段。使用即用型无缝克隆试剂盒(生工生物工程公司)将片段和载体连接，在冰盒上按照表1连接体系添加各组分：

表1

将装有目的片段和线性化质粒的混合物在50℃下反应20min，反应结束后，将离心管置于冰上待转化。取5μl反应后的溶液转化至DH5α感受态细胞，复苏1h后，涂布在含有100μg/mL壮观霉素的LB平板上，在37℃的培养箱中放置12-16h。挑取平板上的转化子进行菌落PCR鉴定，在200μL的PCR管中配制15μL反应体系，包括：7.5μL的2×Rapid Taq Master Mix(Vazyme)，0.5μL的上游引物pEZ-F(SEQ ID NO.5)，0.5μL的上游引物pEZ-R(SEQ ID NO.6)和6.5μL无菌水。PCR反应热循环程序为95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min。配置1％琼脂糖凝胶(1％琼脂，1.5‰EB，TAE缓冲液)。取PCR产物点样，130V电泳25min。PCR能扩增出2692bp的条带(图2)，说明已经成功将P_tet-L482S表达盒整合到pE质粒上，并从转化子中提取3μg(天根公司质粒小提中量试剂盒)的pP_tetL质粒(图3)送测序。

实施例2构建诱导型乙醛途径合成乙偶姻的重组运动发酵单胞菌

取甘油菌CP4、ΔadhB和Δ4活化，当生长至OD₆₀₀＝2.5–2.6按约1/25的体积比转接于40ml RM培养基中，30℃静置培养至OD₆₀₀＝0.3–0.4。将40ml菌液转移至在4℃遇冷的50ml离心管中，冰浴10min，在4℃下1500g(3555rpm/min)离心10min，倒掉上清，并将离心管倒置在灭菌的吸水纸上以使以最后的痕量上清液流尽。细胞沉淀先用20ml冰浴的无菌水洗涤1次，在4℃下1500g(3555rpm/min)离心10min，倒掉上清。然后用20ml冰浴的10％甘油重悬细胞沉淀两次，离心操作同上。用400μl冰冷的10％甘油重悬细胞，然后按100μl/管分装到遇冷的1.5ml EP管中，用于转化。

将5μl pP_tetL质粒(约150ng)分别与50μl运动发酵单胞菌CP4、ΔadhB和Δ4感受态细胞混匀，转移到4℃(也可以是0–4℃中的任意温度)预冷的电极杯中，冰浴5min，电压1800V，用eppendorf公司的电转仪进行电击，电击5ms，电击后立即加入500μL的30℃预热的RM培养基到电极杯中，混匀。将混合物转移到1.5mL离心管中，在30℃下静置复苏10h。在含有100μg/mL的RM平板上涂200μL(也可以是在100μL-200μL中任一数值)培养后的混合液，30℃倒置培养直至转化子出现。使用引物PEZ-F如序列表中SEQ ID NO.5、PEZ-R如序列表中SEQ ID NO.6，按照实施例1中的菌落PCR鉴定方法鉴定转化子，从而获得生产乙偶姻的基因工程菌CP4(pP_tetL),ΔadhB(pP_tetL)和Δ4(pP_tetL)。

RM培养基为20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，2g/L磷酸二氢钾，余量为水。

RM固体培养基为20g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，2g/L磷酸二氢钾，18g/L琼脂，余量为水。

实施例3重组菌株CP4(pP_tetL),ΔadhB(pP_tetL)和Δ4(pP_tetL)发酵生产乙偶姻本实施例为锥形瓶发酵法制备乙偶姻。具体方法如下：

①取菌株CP4(pE)、ΔadhB(pE)和实施例2得到的重组菌株ΔadhB(pP_tetL)和Δ4(pP_tetL)甘油菌60μl置于3ml含100μg/mL壮观霉素的RM培养基中活化，然后进行预培养。

②将新鲜的种子液浓缩至OD₆₀₀＝20，取225μl浓缩的菌液接种至含有终浓度为100μg/mL壮观霉素的30ml新鲜RM培养基的250ml锥形瓶中，初始OD₆₀₀控制在0.15。在150rpm转速下，培养温度为30℃。

③测定色谱条件：使用带保护柱的Aminex HPX-87H分离柱，流动相为4mM硫酸，流速为0.6ml/min，柱温40℃，RID光学单元温度40℃，VWD检测波长为280nm，样品处理时间为25min。

菌株CP4(pE)、CP4(pP_tetL)、ΔadhB(pP_tetL)和Δ4(pP_tetL)的乙偶姻产量为2.62g/L至3.4g/L，其中产量最高的菌株为ΔadhB(pP_tetL)，乙偶姻产量为3.4g/L(图4)。

实施例4构建由组成型启动子调控乙醛途径合成乙偶姻的重组质粒

以CP4基因组为模板，按照实施例1中扩增表达盒的PCR反应体系使用高保真酶扩增启动子P_gap、P_tuf、P_zwf和P_xsea，对应的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、和SEQ ID NO.10所示。引物tuf-L482SF(SEQ ID NO.11)和tuf-L482SR(SEQID NO.12)用于扩增P_tuf启动子片段；引物zwf-L482SF(SEQ ID NO.13)和zwf-L482SR(SEQID NO.14)用于扩增P_zwf启动子片段；引物xseA-L482SF(SEQ ID NO.15)和xseA-L482SR(SEQID NO.16)用于扩增P_xseA启动子片段。使用NEB公司的Bas I-HF限制性内切酶酶切pE-P_tet-L482S质粒，电泳后用天根公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标载体片段。获得线性化的质粒pE-P_tet-alssD，使用即用型无缝克隆试剂盒(生工生物工程公司)将上述扩增的启动子片段和载体连接，在冰盒上按照表2连接体系添加各组分：

表2

将启动子片段和pE-P_tet-L482S线性化质粒的混合物在50℃下反应20min，反应结束后，将离心管置于冰上待转化。取5μl反应后的溶液转化至DH5α感受态细胞，复苏1h后，涂布在含有100μg/mL壮观霉素的LB平板上，在37℃的培养箱中放置12-16h。挑取平板上的转化子，按照实施例1中转化子鉴定的PCR反应体系和条件进行菌落PCR鉴定(图5)。获得过表达质粒pE-P_gap-L482S(pP_gapL)、pE-P_tuf-L482S(pP_tufL)、pE-P_zwf-L482S(pP_zwfL)和pE-P_xsea-L482S(pP_xseaL)。

实施例5乙偶姻合成途径重组运动发酵单胞菌的构建

按照实施例2中的方法制备ΔadhB感受态，并使用天根公司质粒小提中量试剂盒提取实施例4中构建的质粒pP_gapL、pP_tufL、pP_zwfL和pP_xseaL。取5μl质粒(150ng)分别加入到50μl运动发酵单胞菌ΔadhB感受态细胞中，轻轻混匀。按照实施例2中的方法进行电穿孔转化，在30℃下静置复苏10h。取200μL菌液涂布到含有壮观霉素(100μg/mL)的平板上，30℃倒置培养直至转化子出现。挑取平板上的转化子，按照实施例1中的鉴定方法进行菌落PCR鉴定。获得含有上述工程质粒的重组菌株ΔadhB(pP_gapL)、ΔadhB(pP_tufL)、ΔadhB(pP_zwfL)和ΔadhB(pP_xseaL)。

实施例6重组菌株ΔadhB(pP_gapL)、ΔadhB(pP_tufL)、ΔadhB(pP_zwfL)和ΔadhB(pP_xseaL)发酵生产乙偶姻

本实施例为锥形瓶发酵法制备乙偶姻。具体方法如下：

①取菌株CP4(pE)、ΔadhB(pE)和实施例5得到的重组菌株ΔadhB(pP_tetL)和Δ4(pP_tetL)甘油菌60μl置于3ml含100μg/mL壮观霉素的RM培养基中活化，然后进行预培养。

③实施例3所述的色谱条件测定发酵产物。

菌株ΔadhB(pP_xseaL)、ΔadhB(pP_zwfL)、ΔadhB(pP_tufL)、ΔadhB(pP_gapL)的乙偶姻产量为5.28g/L–6.52g/L，比对照分别提高了2–2.5倍，其中由P_tuf启动子调控的菌株ΔadhB(pP_tufL)产量最高为6.52g/L(图6)。

实施例7构建pP_tufL质粒至多种副产物生成基因的缺失菌株

运动发酵单胞菌通过途径2合成乙偶姻时以乙醛作为前体，而在生长代谢过程中乙醛的前提物主要是丙酮酸，它也作为其它化合物(乙酰辅酶A、乳酸、苹果酸、甲酸等)的前体被利用，并且乙醛作为乙醇的前体物也被消耗。实验室前期利用IF-CRISPR基因编辑技术敲除了编码乳酸脱氢酶基因ldhA以抑制乳酸的合成，敲除编码葡萄糖-果糖氧化还原酶基因gfo以抑制山梨醇的合成，敲除编码丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl以抑制甲酸的合成，敲除编码柠檬酸裂合酶基因cl以抑制乙酸的合成，编码乙醇脱氢酶的基因adhB。获得副产物基因缺失菌株ΔadhBΔldhA(简称Δ2)、CP4ΔadhBΔldhAΔgfo(简称Δ3)、CP4ΔadhBΔldhAΔgfoΔcl(简称Δ4)、CP4ΔadhBΔldhAΔgfoΔclΔpfl(简称Δ5)、CP4ΔadhBΔldhAΔgfoΔclΔpflΔcat(简称Δ6)。

按照实施例2中的方法制备Δ2、Δ3、Δ4、Δ5、Δ6感受态细胞，取5μ(150ng)pP_tetL质粒分别与50μl多基因缺失菌株Δ2、Δ3、Δ4、Δ5和Δ6感受态细胞混匀，按照实施例2中的方法进行电穿孔转化，在30℃下静置复苏10h。取200μL菌液涂布到含有壮观霉素(100μg/mL)的平板上，30℃倒置培养直至转化子出现。挑取平板上的转化子，按照实施例1中的鉴定方法进行菌落PCR鉴定。从而获得生产乙偶姻的基因工程菌Δ2(pP_tufL)、Δ3(pP_tufL)、Δ4(pP_tufL)、Δ5(pP_tufL)和6(pP_tufL)。

实施例8最优途径在多基因缺失菌株中发酵生产乙偶姻

本实施例为锥形瓶发酵法制备乙偶姻。具体方法如下：

①取ΔadhB(pE)、ΔadhB(pP_tufL)、Δ2(pP_tufL)、Δ3(pP_tufL)、Δ4(pP_tufL)、Δ5(pP_tufL)和Δ6(pP_tufL)甘油菌60μl置于3ml含有100μg/mL壮观霉素的RM培养基中活化，然后进行预培养。

③实施例3所述的色谱条件测定发酵产物。

菌株ΔadhB(pP_tufL)、Δ2(pP_tufL)、Δ3(pP_tufL)、Δ4(pP_tufL)、Δ5(pP_tufL)和Δ6(pP_tufL)乙偶姻产量为5.01g/L至6.52g/L。其中产量较高的三个菌株为ΔadhB(pP_tufL)、Δ2(pP_tufL)、Δ3(pP_tufL)，乙偶姻产量分别为6.52g/L、6.25g/L和5.92g/L(图7),从中选择了产量较高的ΔadhB(pP_tufL)菌株用于后续的发酵研究。

实施例9菌株ΔadhB(pP_tufL)批次发酵生产乙偶姻

本实施例为锥形瓶发酵法制备乙偶姻。具体方法如下：

①取ΔadhB(pP_tufL)甘油菌60μl置于3ml含有100μg/mL壮观霉素的RM培养基中活化，然后进行预培养。

②将新鲜的种子液浓缩至OD₆₀₀＝20，取225μl浓缩的菌液接种至含有终浓度为100μg/ml壮观霉素的30ml新鲜RM培养基的250ml锥形瓶中，初始OD₆₀₀控制在0.15。在150rpm转速下，分别在30℃、33℃和37℃的温度条件下和在5.7、6、7和8的pH条件下发酵。

③实施例3所述的色谱条件测定发酵产物。

当为自然pH为5.5时，在30℃、33℃和37℃的发酵条件下，乙偶姻产量为5.58g/L-6.54g/L。其中菌株ΔadhB(pP_tufL)在30℃的培养条件下产量最高为6.54g/L。在温度为30℃，pH为5、5.5(自然pH)、6、7和8的条件下发酵，乙偶姻产量为4.38g/L-6.54g/L。其中菌株ΔadhB(pP_tufL)在pH＝5.5-6的培养条件下产量最高为6.54g/L。菌株ΔadhB(pP_tufL)在温度30℃，pH为5.5–6的情况下，乙偶姻发酵的产量最高，为6.54g/L。

实施例10菌株ΔadhB(pP_tufL)补料发酵

本实施例为锥形瓶发酵法制备乙偶姻。具体方法如下：

①取甘油菌ΔadhB(pP_tufL)和Δ2(pP_tufL)60μl置于3ml含有100μg/mL壮观霉素的RM培养基中活化，然后进行预培养。

②将新鲜的种子液浓缩至OD₆₀₀＝20，取225μl浓缩的菌液接种至含有终浓度为100μg/mL壮观霉素的30ml新鲜RM培养基的250ml锥形瓶中，初始OD₆₀₀控制在0.15。在150rpm转速下，培养温度为30℃。在发酵30–45h时，补加1.5ml浓度为200g/l的酵母粉溶液，300μl浓度为200g/l的KH₂PO₄和1ml浓度为600g/L的葡萄糖溶液，补加后发酵液中总的葡萄糖浓度为40g/L。发酵80–95h时进行第二次补料，补加1.5ml浓度为200g/l的酵母粉溶液，300μl浓度为200g/l的KH₂PO₄和1ml浓度为600g/l的葡萄糖溶液，补加后发酵液中总的葡萄糖浓度为60g/l。当发酵130–145h时进行第三次补料，补加1.5ml浓度为200g/l的酵母粉溶液，300μl浓度为200g/l的KH₂PO₄和1ml浓度为600g/l的葡萄糖溶液，补加后发酵液中总的葡萄糖浓度为80g/l。当发酵180–195h时进行第四次补料，补加1.5ml浓度为200g/l的酵母粉溶液，300μl浓度为200g/l的KH₂PO₄和1ml浓度为600g/L的葡萄糖溶液，补加后发酵液中总的葡萄糖浓度为100g/L。分别向锥形瓶中补加1、2、3和4次葡萄糖后，对应发酵液中的葡萄糖总浓度分别为40g/l、60g/l、80g/l和100g/l，分析比较葡萄糖对乙偶姻生产的影响。

③实施例3所述的色谱条件测定发酵产物。

菌株ΔadhB(pP_tufL)在30–45h进行第一次补料后葡萄糖总浓度为40g/l，发酵至96h–120h时产量为10.22–11.78g/l。在80–95h进行第二次补料，发酵至144-168h时产量为19.58–21.22g/l；在130–145h进行第三次补料，发酵至192–116h时产量为27–28.4g/l；在180–195h进行第四次补，发酵至230–254h产量为35–36.4g/l(图8)。

从以上结果可见，构建的重组菌株ΔadhB(pP_tufL)在优化后的发酵条件下进行四次连续补料发酵时乙偶姻产量最高，此结果说明了将乙醛合成乙偶姻途径引入运动发酵单胞菌后，利用代谢工程对宿主细胞和乙偶姻合成途径进行优化有利于乙偶姻的生产。

本发明的实施方式并不局限于上述的具体实施例。如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护范围的情况下，做出其他变化或变型，均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 天津大学

<120> 一种利用乙醛合成乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1692

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

atggcgatga ttacaggcgg cgaactggtt gttcgcaccc taataaaggc tggggtcgaa 60

catctgttcg gcctgcacgg cattcatatc gatacgattt ttcaagcctg tctcgatcat 120

gatgtgccga tcatcgacac ccgccatgag gccgccgcag ggcatgcggc cgagggctat 180

gcccgcgctg gcgccaagct gggcgtggcg ctggtcacgg cgggcggggg atttaccaat 240

gcggtcacgc ccattgccaa cgctcgtacc gatcgcacgc cggtgctctt cctcaccgga 300

tcgggcgcgc tgcgtgatga tgaaaccaac acgttgcagg cggggattga tcaggtcgcc 360

atggcggcgc ccattaccaa atgggcgcat cgggtgatgg caaccgagca tatcccacgg 420

ctggtgatgc aggcgatccg cgccgcgttg agcgcgccac gcgggccggt gttgctggat 480

ctgccgtggg atattctgat gaaccagatt gatgaggata gcgtcattat ccccgatctg 540

gtcttgtccg cgcatggggc ccatcccgac cctgccgatc tggatcaggc tctcgcgctt 600

ttgcgcaagg cggagcggcc ggtcatcgtg ctcggctcag aagcctcgcg gacagcgcgc 660

aagacggcgc ttagcgcctt cgtggcggcg actggcgtgc cggtgtttgc cgattatgaa 720

gggctaagca tgctctcggg gctgcccgat gctatgcggg gcgggctggt gcaaaacctc 780

tattcttttg ccaaagccga tgccgcgcca gatctcgtgc tgatgctggg ggcgcgcttt 840

ggccttaaca ccgggcatgg atctgggcag ttgatccccc atagcgcgca ggtcattcag 900

gtcgaccctg atgcctgcga gctgggacgc ctgcagggca tcgctctggg cattgtggcc 960

gatgtgggtg ggaccatcga ggctttggcg caggccaccg cgcaagatgc ggcttggccg 1020

gatcgcggcg actggtgcgc caaagtgacg gatctggcgc aagagcgcta tgccagcatc 1080

gctgcgaaat cgagcagcga gcatgcgctc cacccctttc acgcctcgca ggtcattgcc 1140

aaacacgtcg atgcaggggt gacggtggta gcggatggtg gcctgaccta tctctggctg 1200

tccgaagtga tgagccgcgt gaaacccggc ggttttctct gccacggcta tctaaactcg 1260

atgggcgtgg gcttcggcac ggcgctgggc gcgcaagtgg ccgatcttga agcaggccgc 1320

cgcacgatcc ttgtgaccgg cgatggctcg gtgggctata gcatcggtga atttgatacg 1380

ctggtgcgca aacaattgcc gctgatcgtc atcatcatga acaaccaaag ctgggggtgg 1440

acaagtcatt tccagcaatt ggccgtcggc cccaatcgcg tgacgggcac ccgtttggaa 1500

aatggctcct atcacggggt ggccgccgcc tttggcgcgg atggctatca tgtcgacagt 1560

gtggagagct tttctgcggc tctggcccaa gcgctcgccc ataatcgccc cgcctgcatc 1620

aatgtcgcgg tcgcgctcga tccgatcccg cccgaagaac tcattctgat cggcatggac 1680

cccttcgcat ga 1692

<210> 2

<211> 736

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

ttaagaccca ctttcacatt taagttgttt ttctaatccg catatgatca attcaaggcc 60

gaataagaag gctggctctg caccttggtg atcaaataat tcgatagctt gtcgtaataa 120

tggcggcata ctatcagtag taggtgtttc cctttcttct ttagcgactt gatgctcttg 180

atcttccaat acgcaaccta aagtaaaatg ccccacagcg ctgagtgcat ataatgcatt 240

ctctagtgaa aaaccttgtt ggcataaaaa ggctaattga ttttcgagag tttcatactg 300

tttttctgta ggccgtgtac ctaaatgtac ttttgctcca tcgcgatgac ttagtaaagc 360

acatctaaaa cttttagcgt tattacgtaa aaaatcttgc cagctttccc cttctaaagg 420

gcaaaagtga gtatggtgcc tatctaacat ctcaatggct aaggcgtcga gcaaagcccg 480

cttatttttt acatgccaat acaatgtagg ctgctctaca cctagcttct gggcgagttt 540

acgggttgtt aaaccttcga ttccgacctc attaagcagc tctaatgcgc tgttaatcac 600

tttactttta tctaatctgg acatcattaa ttcctaattt ttgttgacac tctatcgttg 660

atagagttat tttaccactc cctatcagtg atagagaaaa gtattcaaat gatctaaaga 720

ggagaaagga tctccc 736

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

accagctcac cgtctgaatt ctgtcgatgc cgagttgg 38

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

gtgagccagt gtgacctgca gtcatgcgaa ggggtccat 39

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

aattcgttga atcctgcctc 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

tcagtgccaa catagtaagc c 21

<210> 7

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

tgtcgatgcc gagttggact ttgttcgatc aacaacccga atcctatcgt aatgatgttt 60

tgcccgatca gcctcaatcg acaattttac gcgtttcgat cgaagcaggg acgacaattg 120

gctgggaacg gtatactgga ataaatggtc ttcgttatgg tattgatgtt tttggtgcat 180

cggccccggc gaatgatcta tatgctcatt tcggcttgac cgcagtcggc atcacgaaca 240

aggtgttggc cgcgatcgcc ggtaagtcgg cacgttaaaa aatagctatg gaatataata 300

gctacttaat aagttaggag aataaac 327

<210> 8

<211> 103

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

ttaaatactg gcataaaccg aaaaatgtcg ttatgagcgc gccggagaag cgcggcgcgc 60

tcaatacaat agtgataaaa gcggtaacaa aaagaggtaa cta 103

<210> 9

<211> 145

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

ttaaacttgc tttggctgaa tccttttgtc ttttttagat aagtcttaac caattatact 60

ttttgtttac aacgatggta taaagcgggc ggacaggcta aaaacaggct aaaaggattc 120

ggcctctgtt ttaaggacga gaata 145

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

ggcatgttcg cggccgccgg ttccgataag caggacgttc 40

<210> 11

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

taaggcaggt caccagctca ccgtctgaat tcttaaatac tggcataaac cga 53

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

cctgtaatca tcgccattag ttacctcttt ttgttaccg 39

<210> 13

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

taaggcaggt caccagctca ccgtctgaat tcttaaactt gctttggctg a 51

<210> 14

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

cctgtaatca tcgccattat tctcgtcctt aaaacagag 39

<210> 15

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

taaggcaggt caccagctca ccgtctgaat tcggcatgtt cgcggccgcc ggttccgat 59

<210> 16

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

ccagttcgcc gcctgtaatc atcgccatga acgtcctgct tatcggaacc ggcggccgc 59

Claims

1.一种利用乙醛合成乙偶姻的重组运动发酵单胞菌，其特征在于，含有编码甲醛裂合酶的基因L482S的表达载体；宿主菌为敲除生产菌株中的竞争代谢途径乙醇脱氢酶基因adhB的运动发酵单胞菌；

2.根据权利要求1所述的重组运动发酵单胞菌，其特征在于，所述表达载体为pEZ15Asp、pHW20a或pZA22。

3.根据权利要求1所述的重组运动发酵单胞菌的构建方法，其特征在于，构建分别由启动子P_tet、P_tuf、P_zwf、P_xsea和P_gap调控的甲醛裂合酶基因L482S表达盒，将构建的表达盒转化至运动发酵单胞菌宿主细胞，获得重组运动发酵单胞菌。

4.根据权利要求1所述的重组运动发酵单胞菌的构建方法，其特征在于，将甲醛裂合酶基因L482S连接至表达载体后，转入运动发酵单胞菌宿主细胞，获得重组运动发酵单胞菌；或将甲醛裂合酶基因L482S通过分子生物学技术整合至宿主细胞的基因组，获得重组运动发酵单胞菌。

5.根据权利要求1-2任意一项所述的重组运动发酵单胞菌在生产乙偶姻中的应用。

6.一种重组运动发酵单胞菌生产乙偶姻的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备权利要求1所述重组运动发酵单胞菌；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养是指按照初始接种密度为OD₆₀₀＝0.05–0.45将工程菌接种于发酵培养基，培养温度为30℃，并在100－200rpm的摇床速度下以及10–100g/L葡萄糖浓度下的条件下发酵。