CN108977422B - 一种具葡糖淀粉酶活性乳酸单体生产菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物、基因工程领域，涉及一种具葡糖淀粉酶活性乳酸单体生产菌种及其构建方法与应用。本发明建立了一种产葡糖淀粉酶乳酸生产菌株的构建方法，并结合该重组菌产葡糖淀粉酶的属性和乳酸单体的合成特征以淀粉液化液为原料建立了发酵生产聚合级D‑乳酸和聚合级L‑乳酸的新工艺，形成了直接利用淀粉液化液发酵生产聚合级乳酸单体的技术，可以实现10m3到300m3及更大规模的聚合级乳酸单体的高效制备过程，具备工艺简单，操作稳定等特点，可以大大降低操作难度，节约经济成本。

Description

一种具葡糖淀粉酶活性乳酸单体生产菌及其应用
技术领域：
本发明构建了一种产葡糖淀粉酶乳酸生产菌株，并结合该重组菌产葡糖淀粉酶的属性和乳酸单体的合成特征以淀粉液化液为原料建立了发酵生产聚合级D-乳酸和聚合级L-乳酸的新工艺，属于微生物、基因工程技术领域。
背景技术：
乳酸生产菌种经历了四代发展过程：第一代乳酸生产菌种以米根霉为代表，主要用于生产L-乳酸，产酸水平约为10％～11％，发酵周期较长(约70h)，且发酵过程L-乳酸光学纯度不稳定，介于55％～95％之间；第二代乳酸生产菌种以国内自主选育的乳酸细菌为主，发酵周期缩短至50h，但产酸水平仅为9％～10％，尽管该类生产菌种具备同时合成L-乳酸和D-乳酸的能力，合理控制仍可发酵生产L-乳酸占总乳酸95％以上的乳酸产品；第三代乳酸生产菌种也是目前在乳酸生产企业中普遍使用的乳酸生产菌种以国外进口的嗜热乳杆菌为主，同样约50h的发酵周期，产酸水平已大幅度调高至16％以上；然而上述三代乳酸生产菌种存在一个共同的问题，即发酵过程中二元羧酸的伴生问题始终未解决。二元羧酸存在的最大影响是现有乳酸产品作为单体用于聚乳酸的加工聚合过程中，二元杂酸改变了聚乳酸分子链条聚合方向的一致性而导致聚合过程终止，因此无法制备高分子量或高品质的聚乳酸材料。这一现状导致了聚乳酸材料加工产业长期面临无米下锅的窘境。更为尴尬的乳酸制造业同时面临食品级乳酸制造产业产能严重过剩的现状。第四代乳酸生产菌种，也称乳酸单体生产菌种，从遗传背景的修饰出发，根本上解决了二元杂酸存在的问题，并形成了高品质聚合级乳酸单体的产业化制造能力，其主要生产菌种以重组大肠杆菌和重组酵母为代表。
经代谢途径改造后的重组菌可以在工业化规模下制备高光学纯度L-乳酸和D-乳酸(Niu et al.Microbial Cell Factories 2014,13:78；ZL201210102731.8)，其光学纯度大于99.9％，化学纯度大于98.4％。上述重组菌可使用结晶葡萄糖或高浓度的葡萄糖糖化液进行高纯度L-乳酸和D-乳酸的发酵生产(ZL201210102731.8)。借鉴食品级乳酸生产体系(嗜热乳杆菌为主)已成功实现以淀粉液化液预糖化的方式同步糖化同步生产乳酸(ZL201410063333.9)，且体现出显著的降低生产成本的特性。
本发明以高产聚合级L-乳酸和聚合级D-乳酸的重组菌为出发菌株，采用基因工程技术，建立了一种新型葡糖淀粉酶的筛选方法和具葡糖淀粉酶活性乳酸单体生产菌株的构建方法，并形成了直接利用淀粉液化液发酵生产聚合级乳酸单体的技术。
发明内容：
本发明以微生物或植物来源的葡糖淀粉酶基因核酸序列为依据，参考聚合级乳酸单体高产菌株的密码子偏好性进行密码子优化，然后再通过引入强启动子和高效率信号肽等元件，借助重构的表达质粒增加葡糖淀粉酶基因拷贝数，以聚合级乳酸单体高产菌株为出发菌株，获得了高效表达葡糖淀粉酶的聚合级乳酸单体高产菌株，建立了10-300m3发酵体系下直接利用淀粉液化液发酵生产聚合级乳酸单体的新工艺；
进一步地，上述葡糖淀粉酶基因来源于产酶丰富的微生物，如烟曲霉，黑曲霉，亮白曲霉，解淀粉芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，地衣芽胞杆菌，谷氨酸棒杆菌，凝结芽胞杆菌，酿酒酵母，毕赤酵母，乳酸克鲁维酵母等；
更进一步地，上述葡糖淀粉酶基因的获得方式既可以是以来源于微生物的染色体DNA为模板PCR扩增获得，也可以是以上述来源微生物染色体DNA上的核酸序列采用全基因合成的方法获得，还可以是以上述来源微生物染色体DNA上的核酸序列为依据结合目标宿主菌的密码子偏好型的重新设计并合成；
优选地，所述葡糖淀粉酶基因为glaFs71，其核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，其编码的葡糖淀粉酶氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示；
所述glaFs71基因编码的葡糖淀粉酶发酵液酶活为3000-4200U/mL，最适作用温度为40℃，最适作用pH为6.5，且在pH5.0-7.0以及20℃-50℃下均有较好的稳定性；
更进一步地，上述葡糖淀粉酶基因克隆表达的目标宿主菌为可高效合成聚合级D-乳酸单体或聚合级L-乳酸单体的菌株，且该目标菌株可以根据需要进行遗传修饰，目标宿主菌可以是米根霉，酿酒酵母，毕赤酵母，地衣芽胞杆菌，枯草芽胞杆菌，解淀粉芽胞杆菌，凝结芽胞杆菌、大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌等；
优选地，所述宿主菌为聚合级D-乳酸单体高产菌株CGMCC No.11059；
优选地，所述宿主菌为聚合级L-乳酸单体高产菌株CGMCC No.11060；
更进一步地，上述葡糖淀粉酶基因可以在目标宿主菌中引入的启动子序列下游进行高效转录，高效启动子可以是来源于目标宿主菌的蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶，纤维素酶，半纤维素酶，果胶酶，糖苷酶等相关基因的操纵子，也可以是闭环质粒自带的诱导型启动子；
更进一步地，上述葡糖淀粉酶基因可以在目标宿主菌优势基因的信号肽序列下游进行高效表达，优势基因的信号肽可以是来源于目标宿主菌的蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶，纤维素酶，半纤维素酶，果胶酶，糖苷酶等相关基因的操纵子，也可以是闭环质粒自带的信号肽序列；表达方式可以是分泌表达，也可以是周质空间高效表达；
优选地，所述启动子为PR-PL启动子，所述信号肽为pelBs。
更进一步地，用于上述葡糖淀粉酶基因高效表达的质粒载体可以是1-4个拷贝的质粒，也可以是400个拷贝左右的质粒，还可以是温度诱导调控型质粒整体。更重要的是该质粒载体同时携带了在目标宿主菌和模式大肠杆菌中高效复制需要的复制子，便于质粒在目标宿主菌中的高拷贝复制；
优选地，葡糖淀粉酶基因高效表达的质粒载体为pMD9-T；
更进一步地，获得的产葡糖淀粉酶重组菌可以高效利用葡萄糖合成聚合级D-乳酸或聚合级L-乳酸，还可以直接利用淀粉液化液或经适度糖化后的糖化液合成聚合级D-乳酸或聚合级L-乳酸，方法如下：
菌种在10-300m3发酵罐中进行乳酸单体发酵试验，2-5％接种量下，在25-36℃进行好氧培养，至OD600值约为15-40，将发酵罐温度设定为37-50℃继续好氧培养0-120min，再将通气量设为0-0.2vvm进行限氧发酵，限氧阶段：
第0-3h发酵温度为33-39℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积20％；
第3-6h发酵温度为37-42℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积15％；
第6-10h发酵温度为38-45℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积10％，
第10-16h发酵温度为40-48℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积5％；
第16-24h发酵温度为45-50℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积5％；
残糖低于1g/L时发酵结束。
其发酵培养基为(g/L)：磷酸氢二铵11-25，磷酸二氢钾3-5，磷酸氢二钠15-25，氯化钠2-5，MgSO4 0.2-0.5，FeSO4 0.3-1，FeCl3 0.2-1，CoCl2 0.3-1，CuCl2 0.4-1，Na2MoO40.2-1，H3BO3 0.1-1，MnCl2 0.2-1，柠檬酸10-25，硫胺素0.2-1，木糖5-50，甘油5-50，葡萄糖5-50，硫酸1-5，其余为水，pH 6.0-7.5。
本发明形成的发酵工艺可以有效消除葡萄糖对细胞生长及产物合成的不利影响，最大限度实现细胞的高活性和产物合成效率的高水平。发酵结束后，可实现淀粉液化液中99％以上碳源组份转化为细胞组成或乳酸单体。同时由于细胞活性和乳酸单体合成效率均得到了提高，最终乳酸单体底物转化率和合成速率均大幅提高。
本发明的有益效果主要体现在：
本发明中所使用的葡糖淀粉酶其编码基因经过密码子优化等策略改造并通过催化性能筛选获得，具备高催化性能等特点。
本发明中所使用的葡糖淀粉酶的表达方法，特别是筛选获得高强度启动子的表达方法可以保证葡糖淀粉酶转录过程的高水平和后续表达过程的高表达量。
本发明中所使用的葡糖淀粉酶的表达方法，特别是筛选获得分泌性能优良的信号肽的表达方法可以保证葡糖淀粉酶分泌过程的高效性和后续表达过程的高表达量。
本发明中所使用的葡糖淀粉酶的表达方法，特别是高拷贝穿梭型质粒的表达方法既可以保证重组质粒在构建过程中的便捷性也可以保证目标宿主菌中表达过程的高表达量。
本发明中所获得的葡糖淀粉酶的高产菌株具备高效转化淀粉液化液形成葡萄糖的同时高效代谢葡萄糖合成聚合乳酸单体的能力。
本发明中所形成的同步糖化同步发酵生产乳酸单体的工艺，具备工艺简单，操作稳定等特点，可以大大降低操作难度，节约经济成本。
本发明所形成的同步糖化同步发酵生产乳酸单体的工艺，可以实现10m3到300m3及更大规模的聚合级乳酸单体的高效制备过程。
附图说明：
图1新型葡糖淀粉酶最适作用pH测定曲线；
图2新型葡糖淀粉酶最适作用温度测定曲线；
图3新型葡糖淀粉酶pH稳定性；
图4新型葡糖淀粉酶温度稳定性；
图5是获得的葡糖淀粉酶编码基因高效表达质粒的物理图谱；
图6是构建的具葡糖淀粉酶活性乳酸生产菌株的淀粉水解特性。
具体实施方式：
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明涉及的具体方法有：
(1)采用Thermofisher公司的
Figure BDA0001762372330000041
Plus RNA纯化系统将
Figure BDA0001762372330000044
试剂的裂解能力与
Figure BDA0001762372330000042
RNA小量提取试剂盒硅胶离心柱方便的RNA提取技术相结合，快速分离提取黑曲霉总RNA。
(2)在逆转录酶试剂盒
Figure BDA0001762372330000043
Reverse Transcriptase Assay Kit的作用下合成cDNA，以上述cDNA为模板PCR扩增获得葡糖淀粉酶的编码基因gla。
(3)上述获得的葡糖淀粉酶的编码基因克隆入pPIC9K质粒的SnaBI/EcoRI位点中获得重组质粒pPIC-gla
(4)将重组质粒pPIC-gla线性化后电击转化的方式在毕赤酵母GS115中整合表达。并通过组氨酸营养缺陷型筛选和G418抗性筛选获得阳性转化子。
(5)将上述获得的阳性转化子采用Thermofisher(Invitrogen)公司提供的毕赤酵母操作手册阳性转化子发酵验证方法制备酶液。测定酶液中的葡糖淀粉酶酶活并进一步确认其酶学性质。
(6)以上述获得酶学特性最接近葡糖淀粉酶glaF的氨基酸序列为依据，参考大肠杆菌K12的密码子偏好性优化上述基因的核酸序列，密码子优化过程中消除原有基因中已有的SmaI和BamHI位点同时不形成新的上述两个酶切位点，并通过全基因合成的方式获得酶活最优的相关葡糖淀粉酶编码基因。
(7)以上述全合成的基因片段为模板采用通用长引物和低温易错PCR的组合方式获得全新的基因片段。并筛选获得最适作用温度接近40～45℃，最适作用pH接近7.0的新型葡糖淀粉酶编码基因glaFs71。
(8)上述获得的新型葡糖淀粉酶编码基因glaFs71克隆入重组质粒pPL-pelBs(制备方法见中国发明专利申请CN 201510767145.9)的BamHI和SmaI位点，获得重组质粒pT-glaFs71。
(9)上述获得的重组质粒分别转化入聚合级D-乳酸单体生产菌种CGMCC No.11059(中国发明专利ZL 201580000781.7)和聚合级L-乳酸单体生产菌种CGMCC No.11060(中国发明专利ZL 201580000781.7)中，获得对应的具葡糖淀粉酶活性聚合级D-乳酸单体生产菌种和具葡糖淀粉酶活性聚合级D-乳酸单体生产菌种。
(10)针对上述获得的具葡糖淀粉酶活性聚合级乳酸单体生产菌种产酶属性和乳酸合成特征，建立预糖化和同步糖化组合的新型乳酸单体发酵生产工艺，即发酵形成乳酸阶段采用分阶段变温发酵工艺，同时分五个批次添加淀粉液化液同步糖化同步发酵高效制备乳酸单体。
实施例1——待筛选葡糖淀粉酶基因的功能验证
以黑曲霉Aspergillus niger CICIM F0215菌株(江南大学中国高校工业微生物资源与信息中心http://cicim-cu.jiangnan.edu.cn)为出发菌株进行培养，收集菌体。采用TRNzol总RNA提取试剂提取它们的总RNA。以总RNA为模板，参照RT-PCR试剂盒说明书，以oligo(dT)为引物逆转录合成第一链cDNA。
分别以染色体DNA或第一链cDNA为模板，使用引物(SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:14；相邻的两个为一对上下游引物)进行PCR扩增出葡萄糖淀粉酶的编码基因glaA、glaB、glaC、glaD、glaE、glaF和glaG。
PCR反应条件如下：94℃预变性5min；94℃30s，61℃30s，72℃2min，30个循环；72℃延伸10min。
将PCR产物与质粒pPIC9K分别用SnaB I和Avr II(或Not I)进行酶切、纯化，再进行连接，转化Escheriachia coli JM109感受态细胞。用含有氨苄青霉素的LB固体培养基筛选阳性转化子，并提取其重组质粒，用限制性内切酶酶切进行验证。
毕赤酵母的遗传转化及筛选：分别将上述构建成功的7个重组质粒pPIC9K-glaA、pPIC9K-glaB、pPIC9K-glaC、pPIC9K-glaD、pPIC9K-glaE、pPIC9K-glaF和pPIC9K-glaG用SacI或Sal I进行单酶切线性化。酶切产物经纯化回收后电转化转化Pichia pastoris GS115，均匀涂布于MD平板，30℃恒温培养至单菌落形成。挑取多个单克隆重组酵母分别接种于终浓度为0.5、2mg/mL的YPD/G418平板上进行筛选，30℃培养箱培养至长出单菌落，挑取生长情况好的重组酵母菌株保存，并分别对这7株重组菌进行命名GLAa、GLAb、GLAc、GLAd、GLAe、GLAf和GLAg。采用毕赤酵母操作手册给定的培养方法和甲醇诱导发酵方法制备相应的葡糖淀粉酶酶液。葡糖淀粉酶的酶活测定及定义参考国标《GB 1886.174-2016》进行。
7种葡糖淀粉酶的酶学特性汇总于表1。
表1重组毕赤酵母中7种葡糖淀粉酶的酶学特性比较
菌株 酶活(U/mL) 最适作用温度 最适作用pH
GLAa 2005 60 4.0
GLAb 2756 60 4.5
GLAc 4642 40 5.0
GLAd 3195 60 4.0
GLAe 3218 40 6.0
GLAf 3684 45 6.5
GLAg 2356 50 5.5
基于该葡糖淀粉酶后续将应用于乳酸发酵，其阶段温度维持42～45℃，pH维持7.0的控制要求，选择glaF(核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示)作为后续出发酶蛋白进行酶学特性的人工进化的基础。
实施例2—新型葡糖淀粉酶基因的筛选文库的建立
以实施例1中筛选获得的glaF核酸序列为基础序列，参考大肠杆菌K12的密码子偏好性优化上述基因的核酸序列，密码子优化过程中消除原有基因中已有的EcoRV、SmaI、EcoRI和BamHI位点同时不形成新的上述四个酶切位点，并委托上海生工或华大基因等公司通过全基因合成的方式获得葡糖淀粉酶编码基因glaFs(SEQ ID NO.19所示)。
以上述glaFs基因中相对保守序列中的部分碱基串联组成长引物(SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；上游引物引入EcoRV和BamHI位点，下游引物引入EcoRI位点)，短时PCR条件下[95℃10min；30×(94℃30s；56℃1min；72℃0.1～2s)；68℃10min]扩增获得目的条带。将获得的条带经BamHI和EcoRI酶切后克隆入pET-20b表达载体的BamHI和EcoRI位点，获得重组质粒pET-glaFsX(“X”代表转化子的编号)。获得重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中保存。作为葡糖淀粉酶基因文库用于分泌表达型新型葡糖淀粉酶编码基因的筛选。
上述携带有重组质粒pET-glaFsX的大肠杆菌BL21(pET-glaFsX)点种含有2％淀粉和溴酚蓝的LB平板，40℃培养条件下，测定不同转化子的透明圈直径与菌落直径比值。获得了近400个透明圈直径与菌落直径比值显著增加的转化子，其中71号转化子透明圈直径与菌落直径比值最高，达到2.37，命名为BL21(pET-glaFs71)，提取质粒，并测定其中葡糖淀粉酶基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.20所示，并将该基因命名为glaFs71，其氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示，用于后续具葡糖淀粉酶乳酸单体生产菌种的构建。
实施例3-新型葡糖淀粉酶酶学性质测定
(1)进行发酵测定酶活的实验，酶活测定方法参考国标《GB 1886.174-2016》；
菌株BL21(pET-glaFs71)在LB培养基中采用1mM的IPTG诱导12h，发酵液酶活测定数据见下表：其中在温度为45℃，pH为6.5作用条件下E.coli BL21(pET-glaFs71)发酵液的酶活力最高水平达到3570U/mL,突变后获得的新基因表达的葡萄淀粉酶较相同条件下原始基因经密码子优化后表达的葡萄淀粉酶活性提高了141％。
表2：
酶活测定条件 E.coli BL21(pET-glaFs71) E.coli BL21(pET-glaFs)
温度为45℃，pH为6.5 3570U/mL 1480U/mL
(2)酶学性质：温度、pH、稳定性等测定。
不同温度(pH)下测定突变后获得的新基因表达的葡糖淀粉酶酶活(如图1，图2)，新型葡糖淀粉酶的最适作用温度为40℃，最适作用pH为6.5。
通过稳定性测定发现(将本发明所述的新型葡糖淀粉酶分别在不同pH及温度下保存后，在45℃，pH为6.5下测定酶活)，本发明提供的新型葡糖淀粉酶在pH5.0-7.0以及20℃-50℃下均有较好的稳定性(图3，图4所示)。
实施例4—具葡糖淀粉酶乳酸单体生产菌种的获得
采用质粒快速提取试剂盒，将上述筛选获得质粒pET-glaFs71提取纯化，用EcoRV和EcoRI双酶切，胶分离glaFs71片段，大小1.42kb。pMD9-T(大连宝生物公司采购)经EcoRV和EcoRI双酶切后与胶回收的glaFs71片段连接转化大肠杆菌获得质粒pMD-glaFs71；重组质粒pPL-pelBs(见中国发明专利申请CN 201510767145.9)经SmaI和BamHI双酶切，胶分离PL-pelBs片段，克隆入重组质粒pMD-glaFs71的EcoRV和BamHI位点，获得重组质粒pPL-pelBs-glaFs71(物理图谱见图5)，电转化或化转该重组质粒进入聚合级D-乳酸单体生产菌种CGMCC No.11059(见中国发明专利ZL 201580000781.7)和聚合级L-乳酸单体生产菌种CGMCC No.11060(见中国发明专利ZL 201580000781.7)中，获得对应的具葡糖淀粉酶活性聚合级D-乳酸单体生产菌种CGMCC No.11059(pPL-pelBs-glaFs71)和具葡糖淀粉酶活性聚合级L-乳酸单体生产菌种CGMCC No.11060(pPL-pelBs-glaFs71)。乳酸单体生产菌种葡糖淀粉酶活性鉴定结果显示，两种乳酸单体生产菌株均形成典型透明圈，呈现显著的葡糖淀粉酶活性(见图6)。
实施例5—CGMCC No.11059(pPL-pelBs-glaFs71)菌株生产聚合级D-乳酸单体
实施例4获得的CGMCC No.11059(pPL-pelBs-glaFs71)菌种在200m3发酵罐中进行乳酸单体发酵试验。发酵过程中定时取样，分析细胞密度、糖耗、乳酸产率、代谢主要中间产物及其它有机酸产物等。
菌株经种子培养后，在2％接种量下，在25℃进行好氧培养至OD600值约为15，将发酵罐温度设定为37℃继续好氧培养0min，再将通气量设为0-0.2vvm进行限氧发酵，限氧阶段：
0-3h发酵温度为33-39℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积20％；
3-6h发酵温度为37-42℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积15％；
6-10h发酵温度为38-45℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积10％，
10-16h发酵温度为40-48℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积5％；
16-24h发酵温度为45-50℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积5％；
残糖低于1g/L发酵结束。
其发酵培养基为(g/L)：磷酸氢二铵11，磷酸二氢钾3，磷酸氢二钠15，氯化钠2，MgSO4 0.2，FeSO4 0.3，FeCl3 0.2，CoCl2 0.3，CuCl2 0.4，Na2MoO4 0.2，H3BO3 0.1，MnCl20.2，柠檬酸10，硫胺素0.2，木糖18，甘油16，葡萄糖15，硫酸1，其余为水，pH 6.0-7.5；
重复发酵过程3个批次，详细发酵结果见表3。
表3：三批次200m3罐发酵生产聚合级D-乳酸单体
Figure BDA0001762372330000081
实施例5’—CGMCC No.11059(pPL-pelBs-glaFs71)菌株生产聚合级D-乳酸单体
实施例4获得的CGMCC No.11059(pPL-pelBs-glaFs71)菌种在300m3发酵罐中进行乳酸单体发酵试验。
菌株经种子培养后，在3.5％接种量下，在31℃进行好氧培养至OD600值约为30，将发酵罐温度设定为40℃继续好氧培养60min，再将通气量设为0-0.2vvm进行限氧发酵，限氧阶段：
0-3h发酵温度为33-39℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积20％；
3-6h发酵温度为37-42℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积15％；
6-10h发酵温度为38-45℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积10％，
10-16h发酵温度为40-48℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积5％；
16-24h发酵温度为45-50℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积5％；
残糖低于1g/L发酵结束。
其发酵培养基为(g/L)：磷酸氢二铵18，磷酸二氢钾4，磷酸氢二钠20，氯化钠3.5，MgSO4 0.35，FeSO4 0.7，FeCl3 0.6，CoCl2 0.7，CuCl2 0.7，Na2MoO4 0.6，H3BO3 0.5，MnCl20.6，柠檬酸12，硫胺素0.7，木糖36，甘油34，葡萄糖32，硫酸3，其余为水，pH 6.0-7.5；
总发酵周期36h后，D-乳酸浓度达到18.7％(w/v)，底物-产物转化率89.0％(w/w)，光学纯度99.95％(w/w)，化学纯度98.6％(w/w)。
实施例5”—CGMCC No.11059(pPL-pelBs-glaFs71)菌株生产聚合级D-乳酸单体
实施例4获得的CGMCC No.11059(pPL-pelBs-glaFs71)菌种在300m3发酵罐中进行乳酸单体发酵试验。
菌株经种子培养后，在5％接种量下，在36℃进行好氧培养至OD600值约为40，将发酵罐温度设定为50℃继续好氧培养120min，再将通气量设为0-0.2vvm进行限氧发酵，限氧阶段：
0-3h发酵温度为33-39℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积20％；
3-6h发酵温度为37-42℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积15％；
6-10h发酵温度为38-45℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积10％，
10-16h发酵温度为40-48℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积5％；
16-24h发酵温度为45-50℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积5％；
残糖低于1g/L发酵结束。
其发酵培养基为(g/L)：磷酸氢二铵25，磷酸二氢钾5，磷酸氢二钠25，氯化钠5，MgSO4 0.5，FeSO4 1，FeCl3 1，CoCl2 1，CuCl2 1，Na2MoO4 1，H3BO3 1，MnCl2 1，柠檬酸25，硫胺素1，木糖50，甘油50，葡萄糖50，硫酸5，其余为水，pH 6.0-7.5；
总发酵周期35h后，D-乳酸浓度达到17.9％(w/v)，底物-产物转化率88.7％(w/w)，光学纯度99.97％(w/w)，化学纯度99.2％(w/w)。
实施例6—CGMCC No.11060(pPL-pelBs-glaFs71)菌株生产聚合级L-乳酸单体
实施例4获得的CGMCC No.11060(pPL-pelBs-glaFs71)菌种在200m3发酵罐中进行乳酸单体发酵试验。发酵过程中定时取样，分析细胞密度、糖耗、乳酸产率、代谢主要中间产物及其它有机酸产物等。
菌株经种子培养后，在2％接种量下，在25℃进行好氧培养至OD600值约为15，将发酵罐温度设定为37℃继续好氧培养0min，再将通气量设为0-0.2vvm进行限氧发酵，限氧阶段：
0-3h发酵温度为33-39℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积20％；
3-6h发酵温度为37-42℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积15％；
6-10h发酵温度为38-45℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积10％，
10-16h发酵温度为40-48℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积5％；
16-24h发酵温度为45-50℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积5％；
残糖低于1g/L发酵结束。
其发酵培养基为(g/L)：磷酸氢二铵11，磷酸二氢钾3，磷酸氢二钠15，氯化钠2，MgSO4 0.2，FeSO4 0.3，FeCl3 0.2，CoCl2 0.3，CuCl2 0.4，Na2MoO4 0.2，H3BO3 0.1，MnCl20.2，柠檬酸10，硫胺素0.2，木糖18，甘油17，葡萄糖15，硫酸1，其余为水，pH 6.0-7.5；
重复发酵过程3个批次，详细发酵结果见表4。
表4：三批次200m3罐发酵生产聚合级L-乳酸单体
Figure BDA0001762372330000101
实施例6’—CGMCC No.11060(pPL-pelBs-glaFs71)菌株生产聚合级L-乳酸单体
实施例4获得的CGMCC No.11060(pPL-pelBs-glaFs71)菌种在300m3发酵罐中进行乳酸单体发酵试验。发酵过程中定时取样，分析细胞密度、糖耗、乳酸产率、代谢主要中间产物及其它有机酸产物等。
菌株经种子培养后，在3.5％接种量下，在33℃进行好氧培养至OD600值约为30，将发酵罐温度设定为40℃继续好氧培养60min，再将通气量设为0-0.2vvm进行限氧发酵，限氧阶段：
0-3h发酵温度为33-39℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积20％；
3-6h发酵温度为37-42℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积15％；
6-10h发酵温度为38-45℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积10％，
10-16h发酵温度为40-48℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积5％；
16-24h发酵温度为45-50℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积5％；
残糖低于1g/L发酵结束。
其发酵培养基为(g/L)：磷酸氢二铵17，磷酸二氢钾4，磷酸氢二钠20，氯化钠3.5，MgSO4 0.35，FeSO4 0.7，FeCl3 0.6，CoCl2 0.7，CuCl2 0.7，Na2MoO4 0.6，H3BO3 0.5，MnCl20.6，柠檬酸18，硫胺素0.6，木糖34，甘油32，葡萄糖30，硫酸3，其余为水，pH 6.0-7.5；
总发酵周期38h后，L-乳酸浓度达到18.9％(w/v)，底物-产物转化率88.0％(w/w)，光学纯度99.98％(w/w)，化学纯度98.3％(w/w)。
实施例6”—CGMCC No.11060(pPL-pelBs-glaFs71)菌株生产聚合级L-乳酸单体
实施例4获得的CGMCC No.11060(pPL-pelBs-glaFs71)菌种在300m3发酵罐中进行乳酸单体发酵试验。发酵过程中定时取样，分析细胞密度、糖耗、乳酸产率、代谢主要中间产物及其它有机酸产物等。
菌株经种子培养后，在5％接种量下，在36℃进行好氧培养至OD600值约为40，将发酵罐温度设定为50℃继续好氧培养120min，再将通气量设为0-0.2vvm进行限氧发酵，限氧阶段：
0-3h发酵温度为33-39℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积20％；
3-6h发酵温度为37-42℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积15％；
6-10h发酵温度为38-45℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积10％，
10-16h发酵温度为40-48℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积5％；
16-24h发酵温度为45-50℃，流加固含量35％的淀粉液化液至发酵体积5％；
残糖低于1g/L发酵结束。
其发酵培养基为(g/L)：磷酸氢二铵25，磷酸二氢钾5，磷酸氢二钠25，氯化钠5，MgSO4 0.5，FeSO4 1，FeCl3 1，CoCl2 1，CuCl2 1，Na2MoO4 1，H3BO3 1，MnCl2 1，柠檬酸25，硫胺素1，木糖50，甘油50，葡萄糖50，硫酸5，其余为水，pH 6.0-7.5；
总发酵周期37h后，L-乳酸浓度达到17.4％(w/v)，底物-产物转化率87.7％(w/w)，光学纯度99.96％(w/w)，化学纯度98.9％(w/w)。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种具葡糖淀粉酶活性乳酸单体生产菌及其应用
<130> 1
<141> 2018-08-13
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
gtaactagtt tcgttggcaa tatggctga 29
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
tgctctagat cagatacgca cgagactaaa gatcaaag 38
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
gtatccttga gtttctcctc agatgtggc 29
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
tgctctagat tacgaaggca ccccctcata ttc 33
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
gtaatgcagg caattgagca ggcag 25
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
tgctctagat caaaatgcta gaccgacagc ggaat 35
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
gtatataccg aggaatacaa tggctgttac tcc 33
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
tgctctagac tagcgtcgat cggggttggt c 31
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
gtaaatgtga tttccaagcg cg 22
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
tgctctagac taccgccagg tgtcagtcac 30
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
gtagatccgg caaacgaata ttgcg 25
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
tgctctagat tatctgtcgc cccctccg 28
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
gtaagcagtt atgaacttgt ggaaacctgg 30
<210> 14
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
tgctctagat taagccaaca aagcaaaagc aaga 34
<210> 15
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
agcgatatcc gcggatccat gcaggctatc atcgttgttg cttctcctgg acgtgttaat 60
cgctgcacct cttctgctga tcccgccgtt tct 93
<210> 16
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
ccggaattct tagaaagcca gaccaacaaa gagatgtcag cagattcagc gatcgggagc 60
agccagggtg cacagataga cggcag 86
<210> 17
<211> 1530
<212> DNA
<213> 黑曲霉Aspergillus niger CICIM F0215菌株()
<400> 17
atgttctgcc cgctgtctct gtctccggac gttccggttg ttaccgtttc ttctatctct 60
ccggcttctt ctaccaccac caccgctacc accaccgtta ccgctgttgc tcgttcttct 120
ggttctgttc tgtacgaact gggtccgtac cgttgctctc tggacttcga cctgtctgac 180
ctgatcaacg ttttccgtgg tttcttccag gcttactctt ctgaactgac cgttttcacc 240
cgttacatct ctctgaacct gcacgctgct ggttctgcta cctctccgga cgaaccggct 300
tctaccgtta ccggttctca gctgccgacc tcttctgaat ttgtttctta ccagttcgac 360
gaacacctgt cttcttacat ctacaccccg tcttctctgg cttctgaacg tgctaacctg 420
aaccagtctt ggtaccaggt tgaagacggt tacaaaccga tcaccgaata cttcaccatc 480
cacgaagaac cgaacggtga ccagtctacc ccggacggtt ggccgtgcgt taaatacctg 540
cagctggctc aggaaaaacg tctgctgatc gactacggta ccatcgactc tcagctgcag 600
gactacaact tctcttacat gtctgacgtt atcttcccgc cgaactacct gacctctacc 660
gtttctgttt ctctggactc tgacggttct gttgacaccg gttgcttcta cgactctggt 720
gctaccaccg tttctcaggc taacaactct tgggctatct ctgactacat cccgatcccg 780
gaaggtctgt ctgaaaactc taccatcgct gctatgtctc tggttgcttc taacctgacc 840
gcttgcggtc tgaccccggc tctgaacaac accctgttca accagaccgc tgacacccac 900
ccgcagccgt acaccgacat ctctctgtct tcttcttggg cttggtctat cggtcagccg 960
gctaacgctg actcttcttc tgcttctttc tctgctaccg accgttgcgc tgttatcgac 1020
ctgaccaact ctggtcactg gcgtgctatc aactgctctc aggttcgtta cgctgcttgc 1080
cgtgttggta acaacccgtt cacctggcag ctgtctccga ccccgtacac cttccgtgac 1140
gcttacgacc acggttgccc ggaaaacacc tctatggctg ttccgcgtac cggtctggaa 1200
aacacctacc tgtaccagta cctgctgacc cgtaccgacg ttctggaccc gacctctgct 1260
atcccgaaca aaaccaaagt ttggctgaac atgaactgca tcgacgttga atcttgctgg 1320
gttaccggtg gtccggacca ggaatgcccg tacgcttctg acccgcagca gctggaacgt 1380
cgtaccgttc tggttgctgc tatcgctggt atcgttatct gcatcatcgc tgctctgacc 1440
ctgttcgtta aatgcaacgc taaccgtcgt aactctcgtc gtaacaaacg tgttatcaaa 1500
ggttgggaat acgaaggtgt tccgtcttaa 1530
<210> 18
<211> 509
<212> PRT
<213> 黑曲霉Aspergillus niger CICIM F0215菌株()
<400> 18
Met Phe Cys Pro Leu Ser Leu Ser Pro Asp Val Pro Val Val Thr Val
1 5 10 15
Ser Ser Ile Ser Pro Ala Ser Ser Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr
20 25 30
Val Thr Ala Val Ala Arg Ser Ser Gly Ser Val Leu Tyr Glu Leu Gly
35 40 45
Pro Tyr Arg Cys Ser Leu Asp Phe Asp Leu Ser Asp Leu Ile Asn Val
50 55 60
Phe Arg Gly Phe Phe Gln Ala Tyr Ser Ser Glu Leu Thr Val Phe Thr
65 70 75 80
Arg Tyr Ile Ser Leu Asn Leu His Ala Ala Gly Ser Ala Thr Ser Pro
85 90 95
Asp Glu Pro Ala Ser Thr Val Thr Gly Ser Gln Leu Pro Thr Ser Ser
100 105 110
Glu Phe Val Ser Tyr Gln Phe Asp Glu His Leu Ser Ser Tyr Ile Tyr
115 120 125
Thr Pro Ser Ser Leu Ala Ser Glu Arg Ala Asn Leu Asn Gln Ser Trp
130 135 140
Tyr Gln Val Glu Asp Gly Tyr Lys Pro Ile Thr Glu Tyr Phe Thr Ile
145 150 155 160
His Glu Glu Pro Asn Gly Asp Gln Ser Thr Pro Asp Gly Trp Pro Cys
165 170 175
Val Lys Tyr Leu Gln Leu Ala Gln Glu Lys Arg Leu Leu Ile Asp Tyr
180 185 190
Gly Thr Ile Asp Ser Gln Leu Gln Asp Tyr Asn Phe Ser Tyr Met Ser
195 200 205
Asp Val Ile Phe Pro Pro Asn Tyr Leu Thr Ser Thr Val Ser Val Ser
210 215 220
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Val Asp Thr Gly Cys Phe Tyr Asp Ser Gly
225 230 235 240
Ala Thr Thr Val Ser Gln Ala Asn Asn Ser Trp Ala Ile Ser Asp Tyr
245 250 255
Ile Pro Ile Pro Glu Gly Leu Ser Glu Asn Ser Thr Ile Ala Ala Met
260 265 270
Ser Leu Val Ala Ser Asn Leu Thr Ala Cys Gly Leu Thr Pro Ala Leu
275 280 285
Asn Asn Thr Leu Phe Asn Gln Thr Ala Asp Thr His Pro Gln Pro Tyr
290 295 300
Thr Asp Ile Ser Leu Ser Ser Ser Trp Ala Trp Ser Ile Gly Gln Pro
305 310 315 320
Ala Asn Ala Asp Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser Ala Thr Asp Arg Cys
325 330 335
Ala Val Ile Asp Leu Thr Asn Ser Gly His Trp Arg Ala Ile Asn Cys
340 345 350
Ser Gln Val Arg Tyr Ala Ala Cys Arg Val Gly Asn Asn Pro Phe Thr
355 360 365
Trp Gln Leu Ser Pro Thr Pro Tyr Thr Phe Arg Asp Ala Tyr Asp His
370 375 380
Gly Cys Pro Glu Asn Thr Ser Met Ala Val Pro Arg Thr Gly Leu Glu
385 390 395 400
Asn Thr Tyr Leu Tyr Gln Tyr Leu Leu Thr Arg Thr Asp Val Leu Asp
405 410 415
Pro Thr Ser Ala Ile Pro Asn Lys Thr Lys Val Trp Leu Asn Met Asn
420 425 430
Cys Ile Asp Val Glu Ser Cys Trp Val Thr Gly Gly Pro Asp Gln Glu
435 440 445
Cys Pro Tyr Ala Ser Asp Pro Gln Gln Leu Glu Arg Arg Thr Val Leu
450 455 460
Val Ala Ala Ile Ala Gly Ile Val Ile Cys Ile Ile Ala Ala Leu Thr
465 470 475 480
Leu Phe Val Lys Cys Asn Ala Asn Arg Arg Asn Ser Arg Arg Asn Lys
485 490 495
Arg Val Ile Lys Gly Trp Glu Tyr Glu Gly Val Pro Ser
500 505
<210> 19
<211> 1782
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 19
gtttctctgt ctttctcttc tgacgttgct ctgaacgcta ccgaagctgc tgttttcctg 60
tctgaacgtg acgttgctgg tcagatcccg atcaacttcg ttaccacctc tgctgtttct 120
ctgcgtgctg cttgcttcgg tgacaacatc tacgaccgtg acgctgctgg tcgttgcatc 180
tctaacctgc tggttgttgg ttaccgtcgt ttcctggttg acctgtactg gtcttctgac 240
cagcgtgact ggatgttctg cccgctgtct ctgtctccgg acgttccggt tgttaccgtt 300
tcttctatct ctccggcttc ttctaccacc accaccgcta ccaccaccgt taccgctgtt 360
gctcgttctt ctggttctgt tctgtacgaa ctgggtccgt accgttgctc tctggacttc 420
gacctgtctg acctgatcaa cgttttccgt ggtttcttcc aggcttactc ttctgaactg 480
accgttttca cccgttacat ctctctgaac ctgcacgctg ctggttctgc tacctctccg 540
gacgaaccgg cttctaccgt taccggttct cagctgccga cctcttctga atttgtttct 600
taccagttcg acgaacacct gtcttcttac atctacaccc cgtcttctct ggcttctgaa 660
cgtgctaacc tgaaccagtc ttggtaccag gttgaagacg gttacaaacc gatcaccgaa 720
tacttcacca tccacgaaga accgaacggt gaccagtcta ccccggacgg ttggccgtgc 780
gttaaatacc tgcagctggc tcaggaaaaa cgtctgctga tcgactacgg taccatcgac 840
tctcagctgc aggactacaa cttctcttac atgtctgacg ttatcttccc gccgaactac 900
ctgacctcta ccgtttctgt ttctctggac tctgacggtt ctgttgacac cggttgcttc 960
tacgactctg gtgctaccac cgtttctcag gctaacaact cttgggctat ctctgactac 1020
atcccgatcc cggaaggtct gtctgaaaac tctaccatcg ctgctatgtc tctggttgct 1080
tctaacctga ccgcttgcgg tctgaccccg gctctgaaca acaccctgtt caaccagacc 1140
gctgacaccc acccgcagcc gtacaccgac atctctctgt cttcttcttg ggcttggtct 1200
atcggtcagc cggctaacgc tgactcttct tctgcttctt tctctgctac cgaccgttgc 1260
gctgttatcg acctgaccaa ctctggtcac tggcgtgcta tcaactgctc tcaggttcgt 1320
tacgctgctt gccgtgttgg taacaacccg ttcacctggc agctgtctcc gaccccgtac 1380
accttccgtg acgcttacga ccacggttgc ccggaaaaca cctctatggc tgttccgcgt 1440
accggtctgg aaaacaccta cctgtaccag tacctgctga cccgtaccga cgttctggac 1500
ccgacctctg ctatcccgaa caaaaccaaa gtttggctga acatgaactg catcgacgtt 1560
gaatcttgct gggttaccgg tggtccggac caggaatgcc cgtacgcttc tgacccgcag 1620
cagctggaac gtcgtaccgt tctggttgct gctatcgctg gtatcgttat ctgcatcatc 1680
gctgctctga ccctgttcgt taaatgcaac gctaaccgtc gtaactctcg tcgtaacaaa 1740
cgtgttatca aaggttggga atacgaaggt gttccgtctt aa 1782
<210> 20
<211> 1416
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 20
atgcaggcta tcgaacaggc tggttctatc ttcaccggtt ggatctcttc ttgcctgttc 60
tgcctgtctg gtcgtggtga cgacgaatct ttccaccacc agcaggctat gaaacagggt 120
atcgttgttg cttctccgtc taccgacaac ccggactact tctacacctg gacccgtgac 180
tctggtctgg ttctgaaaac cctggttgac ctgttccacc gtccgtacac caacatgctg 240
gaaacccgtt ggatacacga agaaggtgtt atgaacatcc tggactactt cccgatcgct 300
aaaccgactt tctggtctac cggtaaaaac tggccgaccg acggtgaaat cgacatcatc 360
gaaggtgtta acaaaaacga agctaacgaa atcgttctgc acacctctgg tacctgccag 420
gtttcttccg ctgctatcgc tgctggtgtt gttgttggtg ttgttggtgc ttgcgctctg 480
gctggtgctg gtttcttcct gtggcgtttc aaaaaccctg gttctgctac ctctccggac 540
gaaccggctt ctaccgttac cggttctcag ctgccgacct cttctgaatt tgtttcttac 600
cagttcggtt cttctctgcc gacccaggaa cagctgcagc tgctggaaaa aaacaccccg 660
atcacctctc cgctgatccc gcacttctct cagcgttctt ctgctgttac cggtctgacc 720
gctaacgctg ttccgtctac caccccgcgt ctggaccgac cggttctcag accgtttctg 780
aaatcaccgg ttctaccgaa aaccacacca tcaccaccga aatcaacgct tctgctgtta 840
cctctacaac cgtctctgca ggaccgtccg ctgccgtcta tcccgaccga agaagactct 900
ccgtcttctg aagctgttgc tgttggtcgt tacccggaag acacctacta caacggtaac 960
ccgtggttcc tgtgcaccct ggctgctgct gaacagctgt acgacgctct gtaccagtgg 1020
gacaaacagg gttctctgga agttaccgac gtttctctgg acttcttcaa agctctgtac 1080
tctgacgctg ctaccggtac ctactcttct tcttcttcta cctactcttc tatcgttgac 1140
gctgttatta ccatgaccac caccatctgc ccgatcgctg aatcttcttc tgctgctgct 1200
gctctggctg gtggttcttc tgaagctacc gaagcttcta actctgaagg ttctccggct 1260
gctgctaaca acaaacacgc tgctgacatc tcttacgacc agtggcgtgc tatccgtcgt 1320
atgatcgact tcgttatcca gatccgtcac cagccggacg acatgctgac ccagtactac 1380
gaataccgtc actctgctgt tggtctggct ttctaa 1416
<210> 21
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 21
Met Gln Ala Ile Glu Gln Ala Gly Ser Ile Phe Thr Gly Trp Ile Ser
1 5 10 15
Ser Cys Leu Phe Cys Leu Ser Gly Arg Gly Asp Asp Glu Ser Phe His
20 25 30
His Gln Gln Ala Met Lys Gln Gly Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Thr
35 40 45
Asp Asn Pro Asp Tyr Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Gly Leu Val
50 55 60
Leu Lys Thr Leu Val Asp Leu Phe His Arg Pro Tyr Thr Asn Met Leu
65 70 75 80
Glu Thr Arg Trp Ile His Glu Glu Gly Val Met Asn Ile Leu Asp Tyr
85 90 95
Phe Pro Ile Ala Lys Pro Thr Phe Trp Ser Thr Gly Lys Asn Trp Pro
100 105 110
Thr Asp Gly Glu Ile Asp Ile Ile Glu Gly Val Asn Lys Asn Glu Ala
115 120 125
Asn Glu Ile Val Leu His Thr Ser Gly Thr Cys Gln Val Ser Ser Ala
130 135 140
Ala Ile Ala Ala Gly Val Val Val Gly Val Val Gly Ala Cys Ala Leu
145 150 155 160
Ala Gly Ala Gly Phe Phe Leu Trp Arg Phe Lys Asn Pro Gly Ser Ala
165 170 175
Thr Ser Pro Asp Glu Pro Ala Ser Thr Val Thr Gly Ser Gln Leu Pro
180 185 190
Thr Ser Ser Glu Phe Val Ser Tyr Gln Phe Gly Ser Ser Leu Pro Thr
195 200 205
Gln Glu Gln Leu Gln Leu Leu Glu Lys Asn Thr Pro Ile Thr Ser Pro
210 215 220
Leu Ile Pro His Phe Ser Gln Arg Ser Ser Ala Val Thr Gly Leu Thr
225 230 235 240
Ala Asn Ala Val Pro Ser Thr Thr Pro Arg Leu Asp Arg Pro Val Leu
245 250 255
Arg Pro Phe Leu Lys Ser Pro Val Leu Pro Lys Thr Thr Pro Ser Pro
260 265 270
Pro Lys Ser Thr Leu Leu Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Leu Gln Asp
275 280 285
Arg Pro Leu Pro Ser Ile Pro Thr Glu Glu Asp Ser Pro Ser Ser Glu
290 295 300
Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr Asn Gly Asn
305 310 315 320
Pro Trp Phe Leu Cys Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala
325 330 335
Leu Tyr Gln Trp Asp Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr Asp Val Ser
340 345 350
Leu Asp Phe Phe Lys Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr Gly Thr Tyr
355 360 365
Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Ser Ile Val Asp Ala Val Ile Thr
370 375 380
Met Thr Thr Thr Ile Cys Pro Ile Ala Glu Ser Ser Ser Ala Ala Ala
385 390 395 400
Ala Leu Ala Gly Gly Ser Ser Glu Ala Thr Glu Ala Ser Asn Ser Glu
405 410 415
Gly Ser Pro Ala Ala Ala Asn Asn Lys His Ala Ala Asp Ile Ser Tyr
420 425 430
Asp Gln Trp Arg Ala Ile Arg Arg Met Ile Asp Phe Val Ile Gln Ile
435 440 445
Arg His Gln Pro Asp Asp Met Leu Thr Gln Tyr Tyr Glu Tyr Arg His
450 455 460
Ser Ala Val Gly Leu Ala Phe
465 470

Claims (10)

1.一种葡糖淀粉酶，其特征在于，所述葡糖淀粉酶其氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.21所示。
2.权利要求1所述葡糖淀粉酶的编码基因，其特征在于，所述葡糖淀粉酶的编码基因为glaFs71，其核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
3.权利要求1所述葡糖淀粉酶或权利要求2所述葡糖淀粉酶的编码基因在转化淀粉液化液生成葡萄糖中的应用。
4.表达权利要求1所述葡糖淀粉酶的重组菌株。
5.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，宿主菌为聚合级D-乳酸单体高产菌株CGMCC No.11059或聚合级L-乳酸单体高产菌株CGMCC No.11060。
6.如权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，葡糖淀粉酶表达的质粒载体为pMD9-T，启动子为PR-PL启动子，信号肽为pelBs。
7.权利要求4-6任意一项所述重组菌株在生产权利要求1所述葡糖淀粉酶中的应用。
8.权利要求5或6所述重组菌株在生产聚合乳酸单体中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述菌株直接利用淀粉液化液或经适度糖化后的糖化液合成聚合级D-乳酸或聚合级L-乳酸，方法如下：
菌种在10-300 m3发酵罐中进行乳酸单体发酵试验，2-5%接种量下，在25-36℃进行好氧培养，至OD600值为15-40，将发酵罐温度设定为37-50℃继续好氧培养0-120 min，再将通气量设为0-0.2 vvm进行限氧发酵，限氧阶段：
0-3 h发酵温度为33-39℃，流加固含量35%的淀粉液化液至发酵体积20%；
3-6 h发酵温度为37-42℃，流加固含量35%的淀粉液化液至发酵体积15%；
6-10 h发酵温度为38-45℃，流加固含量35%的淀粉液化液至发酵体积10%，
10-16 h发酵温度为40-48℃，流加固含量35%的淀粉液化液至发酵体积5%；
16-24 h发酵温度为45-50℃，流加固含量35%的淀粉液化液至发酵体积5%；
残糖低于1 g/L 发酵结束。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，其发酵培养基以g/L计组成为：磷酸氢二铵11-25，磷酸二氢钾3-5，磷酸氢二钠，15-25，氯化钠2-5，MgSO4 0.2-0. 5，FeSO4 0.3-1，FeCl3 0.2-1，CoCl2 0.3-1，CuCl2 0.4-1， Na2MoO4 0.2-1，H3BO3 0.1-1，MnCl2 0.2-1，柠檬酸10-25，硫胺素 0.2-1，木糖 5-50，甘油 5-50，葡萄糖5-50，硫酸1-5，其余为水，pH 6.0-7.5。
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Assignee: Zhenye (Shenzhen) Holding Group Co.,Ltd.

Assignor: TIANJIN University OF SCIENCE AND TECHNOLOGY

Contract record no.: X2022990000415

Denomination of invention: A lactic acid monomer producing bacterium with glucoamylase activity and its application

Granted publication date: 20220222

License type: Common License

Record date: 20220720