CN112553226A - 一种毕赤酵母基因工程菌及其制备d-泛解酸内酯水解酶的方法 - Google Patents

一种毕赤酵母基因工程菌及其制备d-泛解酸内酯水解酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种毕赤酵母基因工程菌及其制备D‑泛解酸内酯水解酶的方法，属于生物工程技术领域。将编码D‑泛解酸内酯水解酶基因插入表达载体pPIC9K构建重组表达载体，并导入GS115中获得表达D‑泛解酸内酯水解酶的毕赤酵母工程菌。本发明构建的毕赤酵母工程菌，在3L发酵罐高密度发酵，发酵产酶活性达到1145U/mL，实现了D‑泛解酸内酯水解酶的高效表达，展现良好的工业应用前景。

Description

一种毕赤酵母基因工程菌及其制备D-泛解酸内酯水解酶的 方法
技术领域
本发明涉及一种毕赤酵母基因工程菌及其制备D-泛解酸内酯水解酶的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
D-泛解酸内酯水解酶是一种能水解泛解酸内酯(尤其是手性D-泛解酸内酯)生成D(+)泛解酸(Pantoic acid)的酶，常见分布在镰孢霉属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)、粘帚霉属(Gliocladium)以及短梗霉属(Aureobasidium)等属丝状真菌中。
而D(+)泛解酸是拆分法合成D-泛酸(Pantothenic acid)的重要手性中间体，D-泛酸则属维生素B族物质，是合成辅酶A的组成部分，参与生命体的糖、脂肪、蛋白质代谢。D-泛酸广泛应用于医药、食品、饲料工业。目前工业化生产D-泛酸主要采用生物拆分方法：即利用微生物的D-泛解酸内酯水解酶选择性拆分DL-泛解酸内酯中的D-泛解酸内酯，生成D-泛解酸和L-泛解酸内酯，再将D-泛解酸内酯化为D-泛解酸内酯，然后进一步合成D-泛酸钙。如中国专利ZL01104070.X公布了串珠镰孢霉SW-902发酵产D-泛解酸内酯水解酶3-6U/L，酶制剂0.5-1.5U/g(干菌体)。为提高微生物产D-泛解酸内酯水解酶的活性，寻找新的产酶微生物菌株或者改进微生物发酵的产酶培养基成为主要手段。如专利申请号CN201811595882.5公布了一种赤霉菌(Gibberella sp.)RD016，发酵过程中生物量干重高达35g/L，酶活最高为41.1U/L，换算为菌体酶活为1.17U/g。专利申请号CN201711208094.1公开了一种黑霉菌突变株BFA010#7发酵产酶107U/L。专利申请号CN201811570594.4公布了一株镰刀菌(Fusarium sp.)CH1701发酵液酶活为640U/L。CN201910897527.1公布了通过诱变方法获得一种新的串珠镰刀菌株CGMCC No.18129，其发酵酶活为82.3I U/g。专利申请号CN201810616526.0公布了一种高密度培养串珠镰刀菌产泛解酸内酯水解酶的方法，生物量达到10g/100mL以上，酶活达到23U/L。中国专利CN201710959526.6公布了一种利用尖镰孢霉菌发酵生产泛解酸内酯水解酶的培养基，通过使用糠醛,发酵生物量大于7.8g/L(干菌丝体),酶活力达到1.29U/g(干菌丝体)。除此之外，中国专利200410041614.0公布了串珠镰孢霉SW-902的D-泛解酸内酯水解酶cDNA基因，并将其分别在大肠杆菌和酿酒酵母中进行表达。获得的重组大肠杆菌和重组酿酒酵母，分别发酵产酶为37-41U/g，和60-64U/g。上述这些产D-泛解酸内酯水解酶的方法，都是基于培养微生物细胞，酶在细胞内，后续需以菌体细胞/固定化细胞直接参与对DL-泛解酸内酯的水解反应，劳动强度大，生产效率低。专利申请号CN201811358233.3公布了一种构建产D-泛解酸内酯水解酶的基因工程菌的方法，将源于串珠镰孢霉SW-902的D-泛解酸内酯水解酶基因在乳酸克鲁维酵母中进行表达，其发酵产酶达到5U/mL，虽然解决了D-泛解酸内酯水解酶表达量低的问题，发酵产酶是上述野生菌的200倍，但基因工程菌发酵成本高于野生菌，工业上用于拆分生产D-泛酸还没有优势。
毕赤酵母细胞是当前应用最广的蛋白表达系统之一，它具有自身的优势：含有特有的强有力的AOX(醇氧化酶基因)启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达；生长速率较快，表达水平高；培养容易，适合高密度发酵，外源基因不易丢失；能进行蛋白翻译后加工与修饰，产物利于提纯，适用于工业化高密度发酵生产重组蛋白。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种能用于高密度发酵的毕赤酵母基因工程菌及其制备D-泛解酸内酯水解酶的方法。
本发明的第一个目的是提供一种基因，包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ IDNO.3所示的序列。
本发明第二个目的是提供一种镰孢霉菌来源D-泛解酸内酯水解酶的毕赤酵母基因工程菌，其含有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的编码D-泛解酸内酯水解酶的基因。
在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母基因工程菌的表达载体为pPIC9K；宿主为毕赤酵母GS115。
本发明第三个目的是提供含有所述基因如SEQ ID NO.1所示的毕赤酵母基因工程菌的构建方法。
在本发明的一种实施方式中，所述SEQ ID NO.1所示的基因是串珠镰孢霉(Fusarium moniliforme)SW-902的D-泛解酸内酯水解酶cDNA序列(Genbank：AY728018.1)经密码子优化获得的。
在本发明的一种实施方式中，将SEQ ID NO.1所示基因序列插入到表达载体pPIC9K的酶切位点EcoRⅠ和NotⅠ之间，获得重组表达载体pPIC9K-Lac-1。
在本发明的一种实施方式中，用限制性内切酶SacⅠ线性化重组表达载体pPIC9K-Lac-1，电转到毕赤酵母Pichia pastoris GS115中，并涂布在MD固体培养基上28-30℃培养约24-48h。然后挑取饱满、形态较好的菌落转移至含有0.5-6mg/mLG418的YPD固体培养基上培进行梯度筛选。筛选正确的转化子，经摇瓶发酵筛选获得重组酶活性高的菌株，为Pichiapastoris GS115/pPIC9K-Lac-1。
本发明第四个目的是提供含有所述基因如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.2所示的毕赤酵母基因工程菌的构建方法。
在本发明的一种实施方式中，所述序列SEQ ID NO.2是由序列SEQ ID NO.1编码基因进行两处突变获得的；所述序列SEQ ID NO.3是由序列SEQ ID NO.1编码基因进行三处突变获得的。
在本发明的一种实施方式中，以pPIC9K-Lac-1为模板，进行全质粒PCR，得到pPIC9K-Lac-1/S6P，再以pPIC9K-Lac-1/S6P为模板，进行全质粒PCR，得到pPIC9K-Lac-1/S6P/A134T即pPIC9K-Lac-2。
在本发明的一种实施方式中，以pPIC9K-Lac-1为模板，进行全质粒PCR，得到pPIC9K-Lac-1/E112A/K128Q，再以pPIC9K-Lac-1/E112A/K128Q为模板，进行全质粒PCR，得到pPIC9K-Lac-1/E112A/K128Q/A134T即pPIC9K-Lac-3。
在本发明的一种实施方式中，用限制性内切酶SacⅠ线性化重组表达载体pPIC9K-Lac-2和pPIC9K-Lac-3，分别电转到毕赤酵母Pichia pastoris GS115中，并涂布在MD固体培养基上28-30℃培养约24-48h。
在本发明的一种实施方式中，从MD固体培养基挑取饱满、形态较好的单菌落转移至含有0.5-6mg/mLG418的YPD固体培养基上进行梯度筛选，并获得正确的转化子。
在本发明的一种实施方式中，将所述正确的转化子经摇瓶发酵筛选获得重组酶活性高的菌株，为Pichia pastoris GS115/pPIC9K-Lac-2和Pichia pastoris GS115/pPIC9K-Lac-3。
本发明第五个目的是提供一种毕赤酵母基因工程菌制备D-泛解酸内酯水解酶的方法，所述方法在发酵罐中采用甲醇诱导策略发酵生产D-泛解酸内酯水解酶。
在本发明的一种实施方式中，从培养有毕赤酵母基因工程菌的平板上挑取单菌落接种于YPD培养基中，30℃，220rpm培养24h作为种子液。
在本发明的一种实施方式中，将摇瓶培养获得的种子液以1-20％(v/v)的接种量接种于3L发酵罐中，装液量20-30％(v/v)的发酵培养基中。
在本发明的一种实施方式中，初始搅拌转速400rpm·min-1，通气量为1-3vvm，控制pH5-5.5，溶氧控制在20-40％，生长期培养温度为28-30℃。
在本发明的一种实施方式中，当甘油耗尽溶氧反弹时流加甘油，待甘油耗尽溶氧再次反弹时，饥饿培养1-2h开始流加诱导培养基，并将温度降至28℃，搅拌转速提高至800rpm/min。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基是20-30ml/L 85％磷酸，0.5-1.5g/L CaSO4·2H2O，15-20g/L K2SO4，10-20g/L MgSO4·7H2O，1-6g/L KOH，20-60g/L的甘油，2-8mL/L的微量元素PTM1。
在本发明的一种实施方式中，所述诱导培养基是含有2-20mL/L微量元素PTM1的甲醇。
本发明第六个目的是提供所述毕赤酵母基因工程菌在制备D-泛解酸内酯水解酶中的应用或所述毕赤酵母基因工程菌制备的D-泛解酸内酯水解酶在水解DL-泛解酸内酯中的应用。
有益效果：
本发明构建了表达D-泛解酸内酯水解酶的毕赤酵母重组菌，并通过高密度发酵，产酶水平达到1145U/mL，实现了D-泛解酸内酯水解酶的高效表达，并展现良好的工业应用前景。
附图说明
图1为毕赤酵母中构建D-泛解酸内酯水解酶的质粒图谱；图中：从上到下依次为pPIC9K-Lac-1、pPIC9K-Lac-2、pPIC9K-Lac-3。
图2为实施例1中D-泛解酸内酯水解酶重组表达载体酶切验证；图中：泳道M，分子量Maker；泳道1，2，3分别为pPIC9K-Lac-1、pPIC9K-Lac-2、pPIC9K-Lac-3 EcoRⅠ/NotⅠ双酶切验证。
图3为实施例2重组菌表达产物的SDS-PAGE分析；图中：泳道M，分子量Maker；1：GS115/pPIC9K-Lac-1发酵上清；2：GS115/pPIC9K-Lac-2发酵上清；1：GS115/pPIC9K-Lac-3发酵上清。
图4为实施例3重组菌pPIC9K-Lac-1高密度发酵产酶曲线。
图5为实施例5酶水解反应液的HPLC图。
具体实施方式
培养基：
种子培养基YPD：胰蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L、葡萄糖20g/L。
生长培养基BMGY：蛋白胨20g/L,酵母粉10g/L，甘油10mL/L,YNB 13.4g/L，生物素4×10-4g/L,磷酸钾缓冲液100mM/L。
诱导培养基BMMY为：蛋白胨20g/L,酵母粉10g/L，甲醇5mL/L,YNB 13.4g/L，生物素4×10-4g/L,磷酸钾缓冲液100mM/L。
D-泛解酸内酯水解酶酶活测定：
酶活定义：在一定条件下，每分钟水解1umol D-(-)-泛解酸内酯成D-(+)-泛解酸所需要的酶量定义为1个酶活力单位(U)。
酶活反应体系及测定方法：将7mL 20％DL-泛解酸内酯水溶液，7mL pH7.5的Tris-HCl(1Mol/L)和50uL酶液放入25mL摇瓶中，30℃反应20min，然后通过旋光仪和HPLC分析D-泛解酸内酯的减少量来计算酶活。空白对照为将所加的酶液改为煮沸10min灭活的酶液。取700uL反应液+300uL甲醇终止反应，并进行HPLC分析。
D-泛解酸内酯的HPLC测定条件：色谱柱CHIRALPAK IG-3(0.46cm×25cm×3um)，流动相为：0.01％甲酸/甲醇＝40：30(v/v)，流速：0.5mL/min，检测波长：210nm，温度：35℃，进样量：1uL。在此条件下，D-泛解酸的保留时间约15min；L-泛解酸的保留时间约16.5min，D-泛解酸内酯的保留时间约25min，L-泛解酸内酯的保留时间约27.5min。
实施例1重组表达载体pPIC9K-Lac-1、pPIC9K-Lac-2、pPIC9K-Lac-3的构建
(1)构建重组表达载体pPIC9K-Lac-1：根据NCBI公开的串珠镰孢霉菌(Fusariummoniliforme)SW-902中D-泛解酸内酯水解酶的cDNA序列(Genbank：AY728018.1)，按照毕赤酵母的密码子偏好性，送至苏州金唯智GENEWIZ公司进行密码子优化并合成重组表达载体。密码子优化后的序列如SEQ ID NO.1所示，载体为pPIC9K，重组表达载体命名为pPIC9K-Lac-1。质粒图谱如图1所示。
(2)突变点的确认：将镰孢霉菌(Fusarium proliferatum Nirenberg)ECU2002和镰孢霉菌(Fusarium oxysporum)AKU3702的D-泛解酸内酯水解酶的氨基酸序列分别与串珠镰孢霉菌SW-902的D-泛解酸内酯水解酶的氨基酸序列进行比对，发现ECU2002与SW-902有多个氨基酸位点存在差异，选择S6和A134定点突变；AKU3702与SW-902也存在多个氨基酸位点存在差异，选择E112、K128和A134定点突变。
(3)突变质粒的构建
以pPIC9K-Lac-1为模板，根据需要突变的位点设计引物，引物序列如表1所示。
构建突变质粒pPIC9K-Lac-2：以pPIC9K-Lac-1为模板，使用P1、P2进行全质粒PCR，扩增产物用DpnⅠ消化模板，并转化E.coli DH5α感受态，利用卡纳抗性筛选阳性转化子，采用碱裂法提取质粒得到pPIC9K-Lac-1/S6P，再以pPIC9K-Lac-1/S6P为模板，使用引物P3、P4进行全质粒PCR，得到重组表达载体pPIC9K-Lac-1/S6P/A134T，并送至苏州金唯智GENEWIZ公司进行测序，测序突变正确后保存正确的质粒，得到pPIC9K-Lac-1/S6P/A134T即pPIC9K-Lac-2，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。质粒图谱如图1所示。
构建突变质粒pPIC9K-Lac-3：以pPIC9K-Lac-1为模板，使用引物P5、P6进行全质粒PCR，得到重组表达载体pPIC9K-Lac-1/E112A/K128Q，再以pPIC9K-Lac-1/E112A/K128Q为模板，使用引物P7、P8进行全质粒PCR，得到重组表达载体pPIC9K-Lac-1/E112A/K128Q/A134T，并送至苏州金唯智GENEWIZ公司进行测序，测序突变正确后保存正确的质粒，得到pPIC9K-Lac-1/E112A/K128Q/A134T即pPIC9K-Lac-3，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。质粒图谱如图1所示。
PCR扩增体系：ddH2O 20uL；模板1uL；PrimeStar Max Premix(2×)25uL；PF 2uL；PR2uL。
PCR扩增条件：预变性95℃3min、变性98℃10s、退火(55-59)℃15s、延伸72℃110s，30个循环、终延伸72℃10min。
表1 PCR引物表
Figure BDA0002867453020000061
(4)重组表达载体pPIC9K-Lac-1、pPIC9K-Lac-2、pPIC9K-Lac-3的鉴定
将表达载体pPIC9K-Lac-1、pPIC9K-Lac-2、pPIC9K-Lac-3用EcoRⅠ/NotⅠ进行双酶切，结果如2所示。由图2可以看出表达载体含有D-泛解酸内酯水解酶基因。
实施例2毕赤酵母基因工程菌GS115/pPIC9K-Lac-1、GS115/pPIC9K-Lac-2、GS115/pPIC9K-Lac-3的构建
(1)酵母感受态细胞的制备：挑取酵母受体菌GS115的单菌落接种于30mL YPD培养基中，28-35℃摇床过夜，1-5％(v/v)的接种量转接100mL YPD液体培养基，28-30℃摇床培养至0D6001.3-1.5，4℃，1000-1500g离心5-10min，弃上清；用100-150mL冰预冷的无菌水将菌体重悬；4℃，1000-1500g离心5-10min，弃上清，再用50-80mL冰预冷的无菌水将菌体重悬；4℃，1000-1500g离心5-10min，弃上清，用4mL 1mol/L的冰预冷山梨醇悬浮细胞；4℃，1000-1500g离心5-10min，弃上清，用100-200uL 1mol/L的冰预冷山梨醇悬浮细胞，分装至无菌EP管中，每管80-100uL。
(2)毕赤酵母基因工程菌构建：用内切酶SacⅠ分别线性化实施例1中的重组表达载体pPIC9K-Lac-1、pPIC9K-Lac-2、pPIC9K-Lac-3，在80uL上述制备的酵母感受态细胞中加入线性化的质粒(5-10ug)，转入冰预冷的0.2cm电转杯中，在冰上放置5-10min。2000V，5ms电击一次，立即加入0.5-2mL 1mol/L的冰预冷山梨醇至电转杯中，混匀得到初步混合液。将初步混合液转移至灭过菌的离心管中，30℃静置1h后，加入0.5-1.5mLYPD培养基，30℃，20-100rpm培养1-2h得到混合液。将混合液10000rpm离心1-5min，去掉部分上清，剩余200-600uL涂布MD平板，30℃培养2-4天。分别挑取饱满、形态较好的菌落转移至含有0.5-6mg/mLG418的YPD固体培养基上培进行梯度筛选。
实施例3毕赤酵母基因工程菌摇瓶发酵生产D-泛解酸内酯水解酶
分别从培养有毕赤酵母基因工程菌GS115/pPIC9K-Lac-1、GS115/pPIC9K-Lac-2、GS115/pPIC9K-Lac-3的平板上挑取单菌落接种于25mL BMGY培养基中进行摇瓶发酵，30℃，220rpm条件下培养至0D6002-6，室温2000g，离心5min，收集细胞，弃上清，用BMMY培养基重悬细胞，在28℃，220rpm条件下进行诱导表达，每24h加甲醇至终浓度1％。经甲醇诱导72h后，对发酵液上清进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图3所示，由图3可以看出，目的基因在宿主中得以表达。由摇瓶产酶结果得知：GS115/pPIC9K-Lac-1摇瓶诱导72h酶活达到17.39U/mL，GS115/pPIC9K-Lac-2摇瓶诱导72h酶活达到16.63U/mL，GS115/pPIC9K-Lac-3摇瓶诱导72h酶活达到20.83U/mL。
实施例4毕赤酵母基因工程菌3L发酵罐发酵生产D-泛解酸内酯水解酶
将实施例3中获得的毕赤酵母基因工程菌GS115/pPIC9K-Lac-1活化并涂布于YPD固体培养基平板上，30℃培养2-4天。挑取单菌落接种于YPD培养基中(500mL三角瓶装液量100mL)30℃，220rpm培养24h作为种子液，然后将种子液以10％(v/v)接种量接种于包含900mL分批发酵培养基(26.7ml/L 85％磷酸，0.93g/L CaSO4·2H2O，18.2g/L K2SO4，14.9g/L MgSO4·7H2O，4.13g/L KOH，40g/L的甘油，4.35mL/L的微量元素PTM1)的3L全自动发酵罐(Eppendorf)中，初始搅拌转速400rpm/min，通气量为1-3vvm，使用氨水控制pH5-5.5，生长期培养温度为30℃，当甘油耗尽溶氧反弹时流加50％(w/v含12mL PTM1)甘油，待甘油耗尽溶氧再次反弹时，不再添加甘油饥饿培养1-2h后，开始流加诱导培养基(100％甲醇含12mLPTM1)，同时将温度降至28℃，搅拌转速提高至800rpm/min，所述诱导培养基是含有12mL/L微量元素PTM1的甲醇。诱导培养基采用分阶段流加方式，0-1h流速2mL/h，1-2h流速4mL/h，＞2h流速6mL/h。每隔12h取样一次，测定生物量，蛋白含量，酶活等参数。(重组菌GS115/pPIC9K-Lac-1分批补料发酵性能见图4)。在发酵156h，GS115/pPIC9K-Lac-1最高酶活为1145U/mL。同样的实施方式发酵并测定GS115/pPIC9K-Lac-2酶活为850-1050U/mL，GS115/pPIC9K-Lac-3酶活为950U/mL。
实施例5：游离酶GS115/pPIC9K-Lac-1水解DL-泛解酸内酯的应用
根据实施例4的实施方式，获得发酵液离心后取上清得到D-泛解酸内酯水解酶粗酶液。使用一定量的粗酶液对浓度为40％的DL-泛解酸内酯进行水解反应，并用碳酸氢钠或氨水调节pH 7-7.5，控制温度30℃，反应9h，对DL-泛解酸内酯的水解率为36％，产物D-泛解酸光学纯度＞97e.e.，产物D-泛解酸时空效率为17.8g·L-1·h-1。D-泛解酸内酯的HPLC测定结果如图5所示。D-泛解酸内酯的HPLC测定结果如图5所示。
实施例6游离酶GS115/pPIC9K-Lac-2水解DL-泛解酸内酯的应用
根据实施例5的实施方式，使用粗酶液对浓度为40％的DL-泛解酸内酯进行水解反应，并用碳酸氢钠或氨水调节pH 7-7.5，控制温度30℃，反应8h，对DL-泛解酸内酯的水解率为32％，产物D-泛解酸光学纯度＞98e.e.，产物D-泛解酸时空效率为15.1g·L-1·h-1。
实施例7游离酶GS115/pPIC9K-Lac-3水解DL-泛解酸内酯的应用
根据实施例5的实施方式，使用粗酶液对浓度为40％的DL-泛解酸内酯进行水解反应，并用碳酸氢钠或氨水调节pH 7-7.5，控制温度30℃，反应8h，对DL-泛解酸内酯的水解率为42％，产物D-泛解酸光学纯度＞97e.e.，产物D-泛解酸时空效率为23.9g·L-1·h-1。
对比例：
根据实施例1的实施方式，将SEQ ID NO.4所示基因序列插入到载体pPIC9K得到重组表达载体GS115/pPIC9K-Lac-4，SEQ ID NO.4所示的基因序列是串珠镰孢霉(Fusariummoniliforme)SW-902的D-泛解酸内酯水解酶cDNA序列(Genbank：AY728018.1)，即未经密码子优化的原始序列。根据实施例3的实施方式进行摇瓶发酵，结果显示GS115/pPIC9K-Lac-4发酵产量低，摇瓶发酵诱导72h酶活为0.15-2U/mL，较GS115/pPIC9K-Lac-1、GS115/pPIC9K-Lac-2和GS115/pPIC9K-Lac-3低了约8-10倍。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种毕赤酵母基因工程菌及其制备D-泛解酸内酯水解酶的方法
<130> BAA201645A
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1146
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggccaagc ttccttctac cgcccaaatc atcgaccaga agtctttcaa tgttcttaaa 60
gacgtcccac caccagccgt tgctaacgac agtttggtct tcacttggcc cggagttacc 120
gaggaaagtt tggtcgagaa gccattccac gtctacgacg aggagttcta cgacgtcatc 180
ggtaaggacc catctcttac cttgatcgcc acctctgaca ccgatccaat cttccacgag 240
gctgtcgtct ggtacccacc taccgaagag gtcttcttcg ttcagaacgc cggagctcca 300
gctgctggta ccggattgaa caagtcttct attatccaga agatctcttt gaaagaggcc 360
gacgaggtta gaaagggaaa gaaggacgag gttaaggtcg ccgttgtcga ctctaaccca 420
caagttatca acccaaacgg tggaacctac tacaagggaa acatcatctt cgccggtgag 480
ggacaaggtg acgacgtccc aagtgccctt tacttgatga accctcttcc accttacaac 540
accaccactt tgttgaataa ttatttcggt agacaattta actctttgaa tgacgtcggt 600
atcaacccta ggaacggaga cttgtacttc accgatactt tgtacggtta cttgcaagat 660
ttcagaccag tccccggact taggaaccaa gtttacagat ataacttcga caccggagcc 720
gtcactgttg ttgccgacga cttcaccctt ccaaacggta tcggattcgg tccagacggt 780
aagaaggtct acgtcaccga caccggtatc gccttgggat tttacggtag gaacttgtct 840
tctccagcct ctgtctactc tttcgacgtc aaccaagatg gtaccttgca gaatagaaag 900
accttcgcct acgtcgcctc tttcattcca gatggtgtcc acaccgacag taagggaaga 960
gtctatgccg gttgcggtga cggtgtccat gtctggaatc cttctggaaa attgattggt 1020
aaaatctata ccggaaccgt tgccgccaac ttccagtttg ccggtaaggg taggatgatc 1080
atcaccggtc aaaccaagct tttctacgtc accttgggag ccagtggacc taagttgtat 1140
gattaa 1146
<210> 2
<211> 1146
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggccaagc ttcctcctac cgcccaaatc atcgaccaga agtctttcaa tgttcttaaa 60
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ggtaaggacc catctcttac cttgatcgcc acctctgaca ccgatccaat cttccacgag 240
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ttcagaccag tccccggact taggaaccaa gtttacagat ataacttcga caccggagcc 720
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tctccagcct ctgtctactc tttcgacgtc aaccaagatg gtaccttgca gaatagaaag 900
accttcgcct acgtcgcctc tttcattcca gatggtgtcc acaccgacag taagggaaga 960
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aaaatctata ccggaaccgt tgccgccaac ttccagtttg ccggtaaggg taggatgatc 1080
atcaccggtc aaaccaagct tttctacgtc accttgggag ccagtggacc taagttgtat 1140
gattaa 1146
<210> 3
<211> 1146
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atggccaagc ttccttctac cgcccaaatc atcgaccaga agtctttcaa tgttcttaaa 60
gacgtcccac caccagccgt tgctaacgac agtttggtct tcacttggcc cggagttacc 120
gaggaaagtt tggtcgagaa gccattccac gtctacgacg aggagttcta cgacgtcatc 180
ggtaaggacc catctcttac cttgatcgcc acctctgaca ccgatccaat cttccacgag 240
gctgtcgtct ggtacccacc taccgaagag gtcttcttcg ttcagaacgc cggagctcca 300
gctgctggta ccggattgaa caagtcttct attatccaga agatctcttt gaaagaggcc 360
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<210> 4
<211> 1146
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<213> 人工序列
<400> 4
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atcaacccca ggaacggtga cttgtacttc accgataccc tctatggata cctccaggac 660
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gtcactgtcg tcgctgatga ctttaccctc cctaacggta ttggctttgg ccccgacggc 780
aagaaggtct atgtcaccga cactggtatc gctcttggct tttacggccg caacctctct 840
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acctttgctt acgtcgcgtc tttcatcccc gatggtgttc ataccgactc caagggccgt 960
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aagatctaca ccggtactgt tgctgctaac ttccagtttg ccggcaaggg aaggatgatt 1080
attactggac agaccaagtt gttctatgtt actttagggg cttcgggtcc caagctctat 1140
gattag 1146

Claims (10)

1.一种编码D-泛解酸内酯水解酶基因，其特征在于，包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的序列。
2.一种毕赤酵母基因工程菌，其特征在于，在毕赤酵母中表达权利要求1所述的基因。
3.一种毕赤酵母基因工程菌，其特征在于，表达载体为pPIC9K；宿主为毕赤酵母GS115。
4.构建权利要求2或3所述的毕赤酵母基因工程菌的方法，包括以下步骤：
(1)在表达载体pPIC9K上插入SEQ ID NO.1所示基因，构建重组表达载体；(2)将所述重组表达载体导入毕赤酵母GS115中获得表达D-泛解酸内酯水解酶的毕赤酵母工程菌。
5.构建权利要求2或3所述的毕赤酵母基因工程菌的方法，包括以下步骤：
(1)以表达SEQ ID NO.1序列的重组表达载体为模板，进行全质粒PCR，获得表达SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.3基因序列的重组表达载体；(2)将所述重组表达载体导入毕赤酵母GS115中获得表达D-泛解酸内酯水解酶的毕赤酵母工程菌。
6.一种制备D-泛解酸内酯水解酶的方法，其特征在于，将权利要求2或3所述毕赤酵母基因工程菌进行高密度发酵。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，初始搅拌转速400rpm·min-1，通气量为1-3vvm，控制pH5-5.5，溶氧控制在20-40％，生长期培养温度为28-30℃。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，溶氧反弹时流加甘油，待溶氧再次反弹时，饥饿培养1-2h开始流加诱导培养基。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，流加诱导培养基并将温度降至28℃，搅拌转速提高至800rpm/min。
10.权利要求2或3所述毕赤酵母基因工程菌在制备D-泛解酸内酯水解酶中的应用或权利要求2或3所述毕赤酵母基因工程菌制备得到的D-泛解酸内酯水解酶在水解DL-泛解酸内酯的应用。
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