CN113234610B

CN113234610B - 一种合成角鲨烯的酿酒酵母菌株及其应用

Info

Publication number: CN113234610B
Application number: CN202110244286.8A
Authority: CN
Inventors: 曾伟主; 周景文; 夏路; 陈坚; 堵国成
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-03-05
Filing date: 2021-03-05
Publication date: 2023-06-13
Anticipated expiration: 2041-03-05
Also published as: CN113234610A

Abstract

本发明公开了一种合成角鲨烯的酿酒酵母菌株及其应用，属于基因工程技术领域。本发明将tHMG1和IDI1在酿酒酵母多拷贝位点Ty2整合，显著促进了角鲨烯的合成积累，并异源表达NADH依赖的HMG1，平衡酵母细胞中氧化还原水平，进一步替换了对ERG1转录有显著抑制作用的启动子HXT1，阻碍角鲨烯向下游的转化，还异源表达ACL1，ACL2、过表达PEX11和FOX3，利用β氧化强化胞质内角鲨烯合成前体乙酰辅酶A的积累，进一步促进了角鲨烯的积累，可使酿酒酵母发酵96h的角鲨烯产量达1253.4mg/L。

Description

一种合成角鲨烯的酿酒酵母菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种合成角鲨烯的酿酒酵母菌株及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

角鲨烯(squalene)是一种重要的萜类化合物，它是许多生物活性化合物的前体，例如类固醇和藿烯，同时角鲨烯具有很多的价值，例如用在化妆品行业作为保湿成分，由于他的抗氧化性可以作为润肤霜，角鲨烯对人体健康也有益，包括抗肿瘤、抗真菌/真菌，增强机体免疫能力，降低胆固醇的效用如抗炎、抗衰老、抗氧化等作用，角鲨烯还有一种广泛的用途是制作稳定的乳化液，例如疫苗、药物及其他的药用底物。传统方法通过非法手段从鲨鱼肝提取或低效的从植物中提取，但鉴于其来源有限，价格昂贵，利用微生物生产角鲨烯具有可持续性，环境友好等的优点，故与传统角鲨烯生产相比采用微生物发酵法生产角鲨烯具有很好的前景。

角鲨烯的合成从乙酰辅酶A开始，首先通过HMG-CoA合成酶催化生成3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A，HMG-CoA)，接下来HMG-CoA还原酶(HMGR)催化HMG-CoA生成甲羟戊酸(Mevalonate，MVA)，是MVA途径中第一个限速酶，IDI1编码的异戊烯焦磷酸酯异构酶催化异戊烯二磷酸(IPP)形成烯丙基二磷酸(DMAPP)，其与HMG1是细胞质萜类化合物的代谢中的重要调控点。接下来通过一系列Erg 蛋白酶催化，角鲨烯合成酶(Erg9p)将法尼烯基焦磷酸(FPP)催化形成角鲨烯。角鲨烯环氧酶Erg1催化2,3-环氧角鲨烯的形成。天然酿酒酵母MVA途径中角鲨烯几乎不积累。现有技术中有文献记载了对酿酒酵母进行基因工程改造提高角鲨烯产量的方案，但仍存在发酵周期长、产量有限等问题。

发明内容

为提高角鲨烯在酿酒酵母中的产量及生产效率，本发明利用多拷贝位点整合的方式重点强化tHMG1和IDI1这两个基因的表达，并表达了来源于Silicibacter pomeroyi的NADH-HMG1，并通过HXT1启动子显著抑制ERG1的表达，实现了角鲨烯的大量积累。之后还异源表达了Yarrowia lipolytica中的基因ACL并强化β氧化途径，利用β氧化强化胞质内角鲨烯合成前体乙酰辅酶A的积累，进一步促进了角鲨烯的积累，得到高产角鲨烯的酿酒酵母菌株。

本发明提供了一株高效合成角鲨烯的酿酒酵母工程菌，是在酿酒酵母的基础上进行了如下至少一种改进：

(1)在基因组上整合一个或多个基因tHMG1和IDI1；

(2)表达Silicibacter pomeroyi来源的HMG-CoA还原酶；

(3)用启动子P_TDH1、P_ATP3或P_HXT1启动ERG1基因的表达；

(4)表达来源于Yarrowia lipolytica的柠檬酸裂解酶。

在一种实施方式中，所述基因tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，基因IDI1的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

在一种实施方式中，所述基因tHMG1和IDI1整合在位点ARO10，EXG1、SPR1中的至少一处，或多拷贝位点Ty2处。

在一种实施方式中，所述基因tHMG1和IDI1整合在ARO10，EXG1或SPR1处，使构建的酿酒酵母工程菌的基因tHMG1、IDI1的拷贝数为1个。

在一种实施方式中，所述基因tHMG1和IDI1整合在ARO10，EXG1或SPR1中的2处，使构建的酿酒酵母工程菌的基因tHMG1、IDI1的拷贝数为2个。

在一种实施方式中，所述基因tHMG1和IDI1整合在ARO10，EXG1和SPR1处，每处位点上整合一个拷贝的基因，使酿酒酵母工程菌的基因tHMG1、IDI1的拷贝数为3个。

在一种实施方式中，所述基因tHMG1和IDI1在基因组上整合的拷贝数≥1个，可以为 1～3个，或1～5个，或1～8个，或1～10个，或1～20个，或1～25个，或5～10个，或10～20个，或10～25个。

在一种实施方式中，所述Silicibacter pomeroyi来源的HMG-CoA还原酶的氨基酸序列如 SEQ ID NO.2所示。

在一种实施方式中，所述HMG-CoA还原酶的基因NADH-HMG1的序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述ERG1基因的原启动子替换为响应葡萄糖浓度的启动子P_HXT1，该启动子能在培养基中葡萄糖浓度很低或者为零时抑制基因的转录，以减弱角鲨烯环氧酶(由 ERG1编码)的表达。

在一种实施方式中，所述柠檬酸裂解酶由基因ACL1、ACL2编码；基因ACL1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，基因ACL2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在一种实施方式中，用启动子P_GPD2起始ACL1基因的表达，使用P_TEF起始ACL2基因的表达。

在一种实施方式中，所述酿酒酵母工程菌还表达了基因PEX11，基因PEX11的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在一种实施方式中，所述酿酒酵母工程菌还表达了来源于Bacillus pumilus的脂肪酶L5，编码所述脂肪酶L5的基因具有Genebank:JX163855.1所示的核苷酸序列。

在一种实施方式中，所述酿酒酵母工程菌还过表达了SEQ ID NO.6～8任一所示的FOX 基因。

在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母的出发菌株为酿酒酵母C800(CEN.PK2-1D； MATα；ura3-52；leu2-3,112；trp1-289；his3Δ1；MAL2-8^C；SUC2；gal80::KanMX)。构建过程参见论文Promoter library based pathway optimization forefficient(2S)-naringenin production from p-coumaric acid in Saccharomycescerevisiae。

本发明还提供了所述酿酒酵母工程菌在生产角鲨烯中的应用。

在一种实施方式中，将所述酿酒酵母工程菌接种于发酵培养基中，于28～35℃发酵至少 48h。

在一种实施方式中，将所述酿酒酵母工程菌接种于YPD培养基中，于28～35℃发酵72～96 h，或72～120h。

本发明还要求保护所述酿酒酵母工程菌在食品、医药、化工领域生产含角鲨烯产品方面的应用。

在一种实施方式中，所述应用是用于制备含角鲨烯的疫苗或药物，或制备含角鲨烯的化妆品。

有益效果：本发明对酿酒酵母出发菌株做了如下改进：

(1)通过利用多拷贝位点整合的方式过量表达MVA途径中关键限速基因tHMG1和IDI1，加强甲羟戊酸(MVA)途径代谢流；

(2)通过引入来源于S.pomeroyi的依赖于NADH的HMG-CoA还原酶(由NADH-HMG1 编码，进一步增加了HMGR的活性，缓解菌株对NADPH的高需求量；

(3)通过对ERG1原启动子的替换，减弱角鲨烯环氧酶(由ERG1编码)的表达，促进角鲨烯的积累；

(4)通过强化β氧化途径，并引入来源于Y.lipolytica的柠檬酸裂解酶(由ACL1、ACL2 编码)，促进过氧化物酶体中β氧化产生的乙酰辅酶A向胞质的转化.

本发明在实施例中，在酿酒酵母基因组的一个位点上整合一个或多个拷贝的tHMG1和 IDI1基因，或在多拷贝位点Ty2上整合tHMG1和IDI1基因，在相同培养条件下可使角鲨烯的产量增加6～35倍不等。在进一步引入NADH-HMG1后，使角鲨烯的产量又提高了15.5％，达828mg/L。再用HXT1启动子替换ERG1原始启动子后，角鲨烯的产量又增产14.6％，达 948.5mg/L，并进一步异源表达ACL1，ACL2，使角鲨烯的产量又增加了32.1％，达1253.4mg/L。

附图说明

图1为tHMG1、IDI1不同拷贝数对角鲨烯产量的影响。

图2为Ty2转座子的结构。

图3多拷贝位点Ty2整合IDI1，tHMG1示意图。

图4为多拷贝位点整合IDI1，tHMG1的菌株在24孔板发酵的角鲨烯的产量。

图5为13种启动子替换P_ERG1摇瓶发酵96h角鲨烯产量及菌体生长。

图6为β氧化强化摇瓶发酵96h角鲨烯产量及菌体生长。

具体实施方式

(一)培养基

YNB培养基：0.72g/L酵母氮源基础培养基、20g/L葡萄糖、50mg/L亮氨酸、50mg/L色氨酸、50mg/L组氨酸。

YPD培养基：10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖。

固体培养基中添加2g/L的琼脂粉。

SD-HIS-TRP筛选固体培养基：0.72g/L酵母氮源基础培养基，5g/L组氨酸，5g/L色氨酸。

(二)酿酒酵母的感受态制备：酿酒酵母感受态制备使用Frozen-EZ YeastTransformation II化转试剂盒，30℃，与10mlYPD培养基培养酿酒酵母菌至中数量级(5×10⁶-2×10⁷个/ml 或OD₆₀₀＝0.8-1.0)。以下步骤室温进行。

1、500g离心细胞4min，吸掉上清液；

2、加入10ml EZ1溶液清洗沉淀，重新离心沉淀细胞，吸掉上清液；

3、加入1ml EZ2溶液重悬沉淀细胞。

(三)酿酒酵母的转化：

1、去50μl感受态细胞与0.2-1μgDNA(体积少于5μl)混合；加入500μlEZ3溶液，完全混合；

2、30℃孵育45min，孵育过程中用手指轻弹或低俗涡旋2-3次让其混匀；

3、从转化混合液中取50-150μl到适当营养缺陷型平板上。

4、30℃平板孵育3天长出转化子。

PCR所用2×Phanta Max Master Mix购自南京诺唯赞公司。

Infusion-Cloning试剂盒购自南京诺唯赞公司。

QuickCut^TMBamH I购自大连Takara公司。

Taq PCR Master Mix(上海生工)。

(4)菌株信息如表1所示。

表1本发明中涉及的菌株

实施例1不同拷贝数tHMG1、IDI1的单拷贝位点整合

选择酿酒酵母C800的位点ARO10，EXG1，SPR1，分别在其中1个位点、2个位点或3 个位点上增加tHMG1(对应的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.9)和IDI1(对应的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.10)，使构建的酿酒酵母工程菌的基因tHMG1、IDI1的拷贝数分别为 1个、2个或3个。将整合不同拷贝数的菌株在YPD培养基中，30℃，220rpm条件下发酵96h，得到角鲨烯产量与拷贝数数量正相关的关系，如图1。增加1个拷贝数tHMG1-IDI1的菌株 CP02的角鲨烯产量为121.2mg/L；增加2个拷贝数tHMG1-IDI1的菌株CP05的角鲨烯产量为252.1mg/L；增加3个拷贝数tHMG1-IDI1的菌株CP12的角鲨烯产量为426.0mg/L。

实施例2 tHMG1、IDI1的多拷贝位点整合

为获得更多的拷贝数，选择多拷贝位点Ty2转座子进行tHMG1、IDI1的整合，SGD中搜寻到的Ty2转座子结构如图2(SGD:S000007168)，上下游同源臂均设计在LTR位点处。添加LEU作为筛选标记，为增加整合拷贝数，增加LEU降解标签，用引物tHMG1-F/tHMG1-R 和IDI1-F/IDI1-R从酿酒酵母800基因组上分别扩增出基因tHMG1和IDI1，用引物 Ty2-armup-F/Ty2-armup-R和Ty2-armdown-F/Ty2-armdown-F分别扩增出Ty2转座子的上下游同源臂，用pY15-F/pY15-R从商业质粒pY15上扩增出质粒骨架pY15-1，利用Gibsome组装上述片段(基因tHMG1和IDI1，Ty2转座子的上下游同源臂)，构建得质粒 pY15-ty2-tHMG1-IDI1。再以质粒pY15-ty2-tHMG1-IDI1为模板，使用引物Ty2-D1-F/Ty2-D1-R, Ty2-D2-F/Ty2-D2-R分两段扩增出整合用片段。PCR产物通过乙醇沉淀法回收。约1μg的整合片段与约500ng的sgRNA利用酵母转化试剂盒Frozen-EZ Yeast Transformation II转化至酿酒酵母C800，涂布于SD-HIS-TRP筛选固体培养基上，30℃培养3天，直至出现菌落，培养过程中记录菌落出现顺序，之后选取20株长势快的菌株进行孔板发酵，将在孔板中培养获得的产量最佳的两株工程菌XSQ10-1、XSQ10-2进行摇瓶水平发酵，经全基因组测序，两个菌株分别整合有8个拷贝和10个拷贝的基因tHMG1和IDI1，其中，菌株XSQ10-1在发酵96h 产量达703.7mg/L(如图4)。

所有引物及基因序列均列在表2中。

表2引物序列

实施例3异源表达NADH依赖的HMG1调节细胞内氧化还原平衡

合成来源于S.pomeroyi的基因NADH-HMG1(核苷酸序列如SEQ ID NO.1，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)，并由GENEWIZ合成携带有NADH-HMG1的质粒 pUC57-NADH-HMG1，使用引物NADH-HMG1-F/NADH-HMG1-R扩增出NADH-HMG1片段，使用引物GAL-ARMUP-F/GAL-ARMUP-R和GAL-ARMDOWN-F/GAL-ARMDOWN-R分别扩增出GAL位点上、下游同源臂，将GAL位点上、下游同源臂与NADH-HMG1片段sgRNA 一同利用酵母转化试剂盒Frozen-EZ YeastTransformation II将片段转化至实施例2构建的菌株 XSQ10-1细胞中，涂布于SD-HIS-TRP筛选固体培养基上，30℃培养3天，得到菌株XSQ11，挑取XSQ11单菌落于YPD培养基中，30℃培养96h，角鲨烯的产量相比于XSQ10-1提高了17.7％，达828.1mg/L。

表3引物序列

实施例4 ERG1启动子的替换

从已报道的启动子库(Gao,S.,et al.,Promoter-library-based pathwayoptimization for efficient(2S)-naringenin production from p-coumaric acid inSaccharomyces cerevisiae.J Agric Food Chem,2020.68(25):p.6884-6891.)中选择了13个梯度启动子用于对ERG1表达水平的弱化。启动子分别为P_TDH1、P_CCW12、P_TDH3、P_CIT1、P_PDC1、P_ATP3、P_RPS5、P_ADE6、P_ARO7、P_FAD1、 P_TRP1、P_GPD2、P_HXT1。分别使用XXX-F/XXX-R(表4所示的引物，其中XXX代表启动子名称)从C800基因组上扩增下启动子片段，使用ERG1-armup-F/ERG1-armup-R和 ERG1-armdown-F/ERG1-armdown-R从C800菌株的基因组上扩增ERG1基因的上、下游同源臂，使用pY26-F/pY26-R从质粒pY26上扩增出载体骨架，利用Gibsome组装构建13个 pY26-XXX-HR质粒(其中XXX代表启动子的名称)。使用引物XXX-F/XXX-R(其中XXX 代表启动子名称)，扩增出13个整合用片段，D-P_TDH1、D-P_CCW12、D-P_TDH3、D-P_CIT1、D-P_PDC1、 D-P_ATP3、D-P_RPS5、D-P_ADE6、D-P_ARO7、D-P_FAD1、D-P_TRP1、D-P_GPD2、D-P_HXT1。将PCR产物通过乙醇沉淀法回收。约1μg的整合片段与约500ng的sgRNA利用酵母转化试剂盒Frozen-EZ Yeast TransformationII进行转化于实施例1构建的菌株CP12，涂布于SD-HIS-TRP筛选固体培养基上，30℃培养3，直至出现菌落，将13株工程菌株在250mL含YPD培养基的摇瓶中，于30℃温度，220rpm，发酵96h，发酵结果筛选到启动子P_HXT1对ERG1的转录抑制作用最强，角鲨烯积累量最高达1044.5mg/L，产量较对照菌株CP12提升了145.2％，如图5。

表4引物/启动子序列

实施例5利用β氧化强化供给乙酰辅酶A

为了提高角鲨烯合成的前体物质乙酰辅酶A的积累，引入来源于Y.lipolytica的柠檬酸裂解酶,由SEQ ID NO.3所示的ACL1、SEQ ID NO.4所示的ACL2编码，基因由Genewiz公司合成。用启动子P_GPD2起始ACL1基因的表达，使用P_TEF起始ACL2基因的表达，选择位点TAT1进行ACL1/ACL2基因组的整合。以质粒pY26为模板，使用pY26-F1/pY26-R1和 pY26-F2/pY26-R2扩增出pY26框架pY26-1和pY26-2。使用TAT1-armup-F/TAT1-armup-R， TAT1-armdown-F/TAT1-armdown-R分别扩增出TAT位点上下游同源臂，利用Gibsome组装上述片段构建质粒pY26-TAT-ACL。使用TAT1-armup-F/TAT1-armdown-R扩增出转化用片段 TAT-ACL，PCR产物通过乙醇沉淀法回收。约1μg的整合片段与约500ng的sgRNA利用酵母转化试剂盒Frozen-EZ Yeast Transformation II转化至菌株XSQ13(在XSQ11的基础上，其启动子P_ERG1由启动子P_HXT1替换)，涂布于SD-HIS-TRP筛选固体培养基上，30℃培养3天，得到菌株XSQB1，将菌株XSQB1在YPD培养基中，于30℃，220rpm下摇瓶发酵96h后，产量达1206.4mg/L，产量较对照菌株XSQ13提高了27.2％(图6)。

向筛选获得的单菌落中游离过表达β氧化途径中的SEQ ID NO.5所示的PEX11，异源表达脂肪酶L5(核苷酸序列如Genebank:JX163855.1所示),以强化β氧化。具体步骤为：使用 PEX11-F/PEX11-R从酿酒酵母C800基因组上扩增出PEX11，使用pRS423-F/pRS423-R扩增 pRS423质粒载体，构建pRS423-PEX11-L5质粒。由Genewiz合成来源于Bacillus pumilus的脂肪酶L5基因，并使用启动子P_TEF起始基因L5的表达。将500ng的pRS423-PEX11-L5质粒利用酵母转化试剂盒Frozen-EZ Yeast Transformation II转化于XSQB1，涂布于SD-HIS筛选固体培养基上，30℃培养3天，直至出现菌落，得到XSQB2。将XSQB2在YPD培养基中，于30℃摇瓶发酵96h后，产量达1210.3mg/L(图6)。

分别游离过表达β氧化途径中的SEQ ID NO.6所示的FOX1(Genebank:CP033477.1)和 SEQ ID NO.7所示的FOX2(Genebank:CP046091.1)和SEQ ID NO.8所示的FOX3。分别使用FOX1-F/FOX1-R、FOX2-F/FOX2-R和FOX3-F/FOX3-R从酿酒酵母C800基因组上扩增出FOX1、FOX2和FOX3，使用prs424-F2/pRS424-R2扩增pRS424质粒载体，分别构建 pRS424-FOX1、pRS424-FOX2和pY26-FOX3质粒。分别将500ng的pRS424-FOX1、 pRS424-FOX2和pY26-FOX3质粒利用酵母转化试剂盒Frozen-EZ Yeast Transformation II分别转化于XSQB1，涂布于SD-HIS筛选固体培养基上，30℃培养3天，直至出现菌落，得到菌株XSQB3、XSQB4和XSQB5。经摇瓶发酵96h后，XSQB3、XSQB4和XSQB5的产量分别达1229.6mg/L、1241.1mg/L和1253.4mg/L，见图6。引物和基因序列见表5。

另外，将pRS423-PEX11-L5质粒利用酵母转化试剂盒Frozen-EZ YeastTransformation II 分别转化至XSQB2中，分别获得菌株XSQB6、XSQB7和XSQB8，其发酵96h的角鲨烯产量分别达1178.6、1177.8、1226.8mg/L。

表5所用引物序列

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种合成角鲨烯的酿酒酵母菌株及其应用

<130> BAA210263A

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1302

<212> DNA

<213> Silicibacter pomeroyi

<400> 1

atgacaggca agacgggtca catcgatggt ttgaactcgc gcattgaaaa gatgcgagat 60

ctcgaccccg cacaacggct ggtgcgcgtt gccgaggcgg cgggcctcga gcccgaggcg 120

atcagcgcgc tggcgggtaa cggcgccctg cccctctcgc tggccaacgg gatgatcgag 180

aacgtcatcg gcaaattcga actgccgctg ggcgtggcca cgaatttcac tgtgaacggc 240

cgcgactatc tgatcccgat ggcggtcgaa gagccctcgg tggtggcggc cgcgtcctat 300

atggcgcgta tcgcgcgcga gaatggcgga ttcaccgcgc atggcaccgc gcccttgatg 360

cgcgcccaga tccaggtggt cgggttgggt gatcccgagg gcgcccggca gcgtctcctc 420

gcccacaagg ccgcgttcat ggaggcggcg gacgctgtcg atccggtgct tgtcgggctg 480

ggtggcggct gccgcgatat cgaggttcac gtgttccggg atacgccggt gggcgcgatg 540

gtcgtcctgc acctgatcgt cgatgtgcgc gacgcgatgg gggccaatac ggtcaacacg 600

atggccgaac ggctggcccc cgaggtcgag cggattgccg gtggcaccgt gcggctgcgc 660

atcctgtcga acctcgccga cctgcgattg gtccgggcgc gggtggaact ggccccggaa 720

acactgacaa cgcagggcta tgacggcgcc gacgtggcgc ggggcatggt cgaggcctgc 780

gcgcttgcca tcgtcgaccc ctatcgcgcg gcgacccata acaaggggat catgaacggc 840

atcgacccgg tcgtcgtcgc caccggcaat gactggcgcg cgatcgaggc gggtgcccat 900

gcctatgccg cccgcacggg tcattatacc tcgctgaccc gctgggaact ggcgaatgac 960

gggcggcttg tgggcacgat cgaactgccc ctggcgcttg gccttgtcgg cggcgcgacc 1020

aagacgcacc cgaccgcacg ggcggcgctg gccctgatgc aggtagagac tgcaaccgaa 1080

ctggcccagg tcaccgccgc cgtgggtctg gcgcagaaca tggccgccat ccgcgcgctg 1140

gcgaccgaag gcatccagcg cggtcacatg acccttcatg cgcgcaacat cgcgatcatg 1200

gccggcgcaa caggcgccga tatcgaccgc gtcacccggg tcattgtcga agcgggcgac 1260

gtcagcgtgg cccgtgcaaa acaggtgctg gaaaacacct ga 1302

<210> 2

<211> 433

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Thr Gly Lys Thr Gly His Ile Asp Gly Leu Asn Ser Arg Ile Glu

1 5 10 15

Lys Met Arg Asp Leu Asp Pro Ala Gln Arg Leu Val Arg Val Ala Glu

20 25 30

Ala Ala Gly Leu Glu Pro Glu Ala Ile Ser Ala Leu Ala Gly Asn Gly

35 40 45

Ala Leu Pro Leu Ser Leu Ala Asn Gly Met Ile Glu Asn Val Ile Gly

50 55 60

Lys Phe Glu Leu Pro Leu Gly Val Ala Thr Asn Phe Thr Val Asn Gly

65 70 75 80

Arg Asp Tyr Leu Ile Pro Met Ala Val Glu Glu Pro Ser Val Val Ala

85 90 95

Ala Ala Ser Tyr Met Ala Arg Ile Ala Arg Glu Asn Gly Gly Phe Thr

100 105 110

Ala His Gly Thr Ala Pro Leu Met Arg Ala Gln Ile Gln Val Val Gly

115 120 125

Leu Gly Asp Pro Glu Gly Ala Arg Gln Arg Leu Leu Ala His Lys Ala

130 135 140

Ala Phe Met Glu Ala Ala Asp Ala Val Asp Pro Val Leu Val Gly Leu

145 150 155 160

Gly Gly Gly Cys Arg Asp Ile Glu Val His Val Phe Arg Asp Thr Pro

165 170 175

Val Gly Ala Met Val Val Leu His Leu Ile Val Asp Val Arg Asp Ala

180 185 190

Met Gly Ala Asn Thr Val Asn Thr Met Ala Glu Arg Leu Ala Pro Glu

195 200 205

Val Glu Arg Ile Ala Gly Gly Thr Val Arg Leu Arg Ile Leu Ser Asn

210 215 220

Leu Ala Asp Leu Arg Leu Val Arg Ala Arg Val Glu Leu Ala Pro Glu

225 230 235 240

Thr Leu Thr Thr Gln Gly Tyr Asp Gly Ala Asp Val Ala Arg Gly Met

245 250 255

Val Glu Ala Cys Ala Leu Ala Ile Val Asp Pro Tyr Arg Ala Ala Thr

260 265 270

His Asn Lys Gly Ile Met Asn Gly Ile Asp Pro Val Val Val Ala Thr

275 280 285

Gly Asn Asp Trp Arg Ala Ile Glu Ala Gly Ala His Ala Tyr Ala Ala

290 295 300

Arg Thr Gly His Tyr Thr Ser Leu Thr Arg Trp Glu Leu Ala Asn Asp

305 310 315 320

Gly Arg Leu Val Gly Thr Ile Glu Leu Pro Leu Ala Leu Gly Leu Val

325 330 335

Gly Gly Ala Thr Lys Thr His Pro Thr Ala Arg Ala Ala Leu Ala Leu

340 345 350

Met Gln Val Glu Thr Ala Thr Glu Leu Ala Gln Val Thr Ala Ala Val

355 360 365

Gly Leu Ala Gln Asn Met Ala Ala Ile Arg Ala Leu Ala Thr Glu Gly

370 375 380

Ile Gln Arg Gly His Met Thr Leu His Ala Arg Asn Ile Ala Ile Met

385 390 395 400

Ala Gly Ala Thr Gly Ala Asp Ile Asp Arg Val Thr Arg Val Ile Val

405 410 415

Glu Ala Gly Asp Val Ser Val Ala Arg Ala Lys Gln Val Leu Glu Asn

420 425 430

Thr

<210> 3

<211> 1953

<212> DNA

<213> Yarrowia lipolytica

<400> 3

atgtctgcca acgagaacat ctcccgattc gacgcccctg tgggcaagga gcaccccgcc 60

tacgagctct tccataacca cacacgatct ttcgtctatg gtctccagcc tcgagcctgc 120

cagggtatgc tggacttcga cttcatctgt aagcgagaga acccctccgt ggccggtgtc 180

atctatccct tcggcggcca gttcgtcacc aagatgtact ggggcaccaa ggagactctt 240

ctccctgtct accagcaggt cgagaaggcc gctgccaagc accccgaggt cgatgtcgtg 300

gtcaactttg cctcctctcg atccgtctac tcctctacca tggagctgct cgagtacccc 360

cagttccgaa ccatcgccat tattgccgag ggtgtccccg agcgacgagc ccgagagatc 420

ctccacaagg cccagaagaa gggtgtgacc atcattggtc ccgctaccgt cggaggtatc 480

aagcccggtt gcttcaaggt tggaaacacc ggaggtatga tggacaacat tgtcgcctcc 540

aagctctacc gacccggctc cgttgcctac gtctccaagt ccggaggaat gtccaacgag 600

ctgaacaaca ttatctctca caccaccgac ggtgtctacg agggtattgc tattggtggt 660

gaccgatacc ctggtactac cttcattgac catatcctgc gatacgaggc cgaccccaag 720

tgtaagatca tcgtcctcct tggtgaggtt ggtggtgttg aggagtaccg agtcatcgag 780

gctgttaaga acggccagat caagaagccc atcgtcgctt gggccattgg tacttgtgcc 840

tccatgttca agactgaggt tcaattcggc cacgccggct ccatggccaa ctccgacctg 900

gagactgcca aggctaagaa cgccgccatg aagtctgctg gcttctacgt ccccgatacc 960

ttcgaggaca tgcccgaggt ccttgccgag ctctacgaga agatggtcgc caagggcgag 1020

ctgtctcgaa tctctgagcc tgaggtcccc aagatcccca ttgactactc ttgggcccag 1080

gagcttggtc ttatccgaaa gcccgctgct ttcatctcca ctatttccga tgaccgaggc 1140

caggagcttc tgtacgctgg catgcccatt tccgaggttt tcaaggagga cattggtatc 1200

ggcggtgtca tgtctctgct gtggttccga cgacgactcc ccgactacgc ctccaagttt 1260

cttgagatgg ttctcatgct tactgctgac cacggtcccg ccgtatccgg tgccatgaac 1320

accattatca ccacccgagc tggtaaggat ctcatttctt ccctggttgc tggtctcctg 1380

accattggta cccgattcgg aggtgctctt gacggtgctg ccaccgagtt caccactgcc 1440

tacgacaagg gtctgtcccc ccgacagttc gttgatacca tgcgaaagca gaacaagctg 1500

attcctggta ttggccatcg agtcaagtct cgaaacaacc ccgatttccg agtcgagctt 1560

gtcaaggact ttgttaagaa gaacttcccc tccacccagc tgctcgacta cgcccttgct 1620

gtcgaggagg tcaccacctc caagaaggac aacctgattc tgaacgttga cggtgctatt 1680

gctgtttctt ttgtcgatct catgcgatct tgcggtgcct ttactgtgga ggagactgag 1740

gactacctca agaacggtgt tctcaacggt ctgttcgttc tcggtcgatc cattggtctc 1800

attgcccacc atctcgatca gaagcgactc aagaccggtc tgtaccgaca tccttgggac 1860

gatatcacct acctggttgg ccaggaggct atccagaaga agcgagtcga gatcagcgcc 1920

ggcgacgttt ccaaggccaa gactcgatca tag 1953

<210> 4

<211> 1494

<212> DNA

<213> Yarrowia lipolytica

<400> 4

atgtcagcga aatccattca cgaggccgac ggcaaggccc tgctcgcaca ctttctgtcc 60

aaggcgcccg tgtgggccga gcagcagccc atcaacacgt ttgaaatggg cacacccaag 120

ctggcgtctc tgacgttcga ggacggcgtg gcccccgagc agatcttcgc cgccgctgaa 180

aagacctacc cctggctgct ggagtccggc gccaagtttg tggccaagcc cgaccagctc 240

atcaagcgac gaggcaaggc cggcctgctg gcactcaaca agtcgtggga ggagtgcaag 300

ccctggatcg ccgagcgggc cgccaagccc atcaacgtgg agggcattga cggagtgctg 360

cgaacgttcc tggtcgagcc ctttgtgccc cacgaccaga agcacgagta ctacatcaac 420

atccactccg tgcgagaggg cgactggatc ctcttctacc acgagggagg agtcgacgtc 480

ggcgacgtgg acgccaaggc cgccaagatc ctcatccccg ttgacattga gaacgagtac 540

ccctccaacg ccacgctcac caaggagctg ctggcacacg tgcccgagga ccagcaccag 600

accctgctcg acttcatcaa ccggctctac gccgtctacg tcgatctgca gtttacgtat 660

ctggagatca accccctggt cgtgatcccc accgcccagg gcgtcgaggt ccactacctg 720

gatcttgccg gcaaactcga ccagaccgca gagtttgagt gcggccccaa gtgggctgct 780

gcgcggtccc ccgccgctct gggccaggtc gtcaccattg acgccggctc caccaaggtg 840

tccatcgacg ccggccccgc catggtcttc cccgctcctt tcggtcgaga gctgtccaag 900

gaggaggcgt acattgcgga gctcgattcc aagaccggag cttctctgaa gctgactgtt 960

ctcaacgcca agggccgaat ctggaccctt gtggctggtg gaggagcctc cgtcgtctac 1020

gccgacgcca ttgcgtctgc cggctttgct gacgagctcg ccaactacgg cgagtactct 1080

ggcgctccca acgagaccca gacctacgag tacgccaaaa ccgtactgga tctcatgacc 1140

cggggcgacg ctcaccccga gggcaaggta ctgttcattg gcggaggtat cgccaacttc 1200

acccaggttg gatccacctt caagggcatc atccgggcct tccgggacta ccagtcttct 1260

ctgcacaacc acaaggtgaa gatttacgtg cgacgaggcg gtcccaactg gcaggagggt 1320

ctgcggttga tcaagtcggc tggcgacgag ctgaatctgc ccatggagat ttacggcccc 1380

gacatgcacg tgtcgggtat tgttcctttg gctctgcttg gaaagcggcc caagaatgtc 1440

aagccttttg gcaccggacc ttctactgag gcttccactc ctctcggagt ttaa 1494

<210> 5

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctatgtagct ttccacatgt cttgcatacc aaggatagat gtgacaacac cggatagcgc 60

aacatactct tcgttgctag acaagtaccc taggttgttg aggacgatga acgaatctgc 120

agcatcccag aatagtcttc ttaacgcggt gtacctgtct tggtatgcct tccctagtac 180

cttcttgtga tcctcatgct catcgccttg gctttgtgat tttgccttga caaacgcagc 240

aatctgggca tgagatgttt ggatcttacg aagatccata gccagaccac ttaggaggcc 300

gaacagccaa caccaattgg accagcgagg tattttctta ccggtaagaa cggttacagg 360

aatcactttc aaaattctca aaagattgac ttgatctaac gacaaatatg cagcaaagaa 420

gatgtttttc aaaacattgc agactctaac gacgttgtcg ctggccaact tgttatcgta 480

gaatttagca gctgcctgca agtggtttaa aggcttcaga aacctcagaa attttctgac 540

tgtggtaaat tgagcttgta attgcctggc caagagagat gagttctgta ctgctaaaaa 600

tcttgctaaa tactgcagta atctgagaac cttttctctg ccagctgagc catctagaaa 660

tttgacgaat ctcgtcacgg agggatgata taccagtgta tcacagacca t 711

<210> 6

<211> 2247

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgacgagac gtactactat taatcccgat tcggtggttc tgaatcctca aaaatttatc 60

cagaaagaaa gggcggattc gaaaatcaaa gttgaccaag ttaacacatt tttagagtca 120

tccccggaga ggagaactct gacgcacgcc ttaatagacc aaatagtgaa tgatcctata 180

ttgaaaactg atacggacta ttacgatgct aaaaaaatgc aagagagaga aattactgcc 240

aaaaaaatag ctaggcttgc tagttatatg gagcacgata tcaaaacagt gcgcaaacac 300

tttcgcgaca ctgacctgat gaaagagttg caagcaaatg atccagacaa agcttcgcct 360

ttaacaaaca aagacctttt tatattcgat aagagattgt cacttgtagc aaatattgat 420

cctcaattgg gtacgcgcgt gggtgtacac ttggggctat ttggtaattg tatcaagggc 480

aatggtactg atgagcaaat ccggtattgg ttgcaggaga gaggtgccac tttgatgaaa 540

ggtatatatg gctgttttgc aatgactgag ttaggacatg gttccaatgt tgcccagctg 600

cagactaggg ctgtgtacga taagcaaaat gatacttttg taattgatac acctgatcta 660

actgccacca aatggtggat tggtggggct gcccattctg ccacgcacgc tgccgtgtac 720

gccagattga tcgttgaagg taaagactac ggtgtaaaaa cattcgttgt tcctctgaga 780

gacccttcga ctttccaact gttagctggt gtttccatag gggatattgg agcgaagatg 840

ggtcgtgacg gtattgataa tggctggatc cagttcagaa acgtagttat ccctagagaa 900

tttatgctaa gtagatttac caaagttgtc cgttctccag atggttcagt caccgtcaaa 960

actgagccac aattggatca aatttctggt tatagtgcat tgttaagtgg tagagttaac 1020

atggtcatgg attcatttag gtttggctcc aaatttgcta ctattgctgt acgttacgcg 1080

gttggtcgtc agcaattcgc acctagaaag ggattgtctg aaacacaatt aatcgactat 1140

ccccttcacc aatatcgtgt tttaccacaa ttgtgtgttc catatttggt gtcacctgta 1200

gcttttaagt taatggacaa ctattattcc actttggacg agttatacaa cgcttcctca 1260

tctgcataca aagctgctct ggttaccgtg agtaaaaagt tgaagaattt atttattgat 1320

agcgccagct tgaaagccac caatacttgg ttaattgcta cactgattga tgagttgaga 1380

cagacttgcg gaggacatgg gtattcacag tataacggat ttggtaaagg ctatgacgac 1440

tgggtggttc agtgcacatg ggagggtgat aataatgttt tatctttaac ttcagcaaaa 1500

tcaatattga aaaaatttat cgattcagcc acaaagggta gatttgacaa cacactggat 1560

gtggactcat tctcttactt aaaacctcag tacataggat ctgtggtttc tggagaaata 1620

aagagtggtt taaaggagtt gggtgattat actgaaattt ggtctatcac cttaatcaaa 1680

ttactggcac atattggtac tttagttgaa aaatcaagaa gtattgatag cgtttctaag 1740

cttttagtct tagtatccaa atttcatgcc ttgcgctgca tgttgaaaac ctattacgac 1800

aagttaaact ctcgtgattc acatatttcc gatgaaatta caaaggaatc tatgtggaat 1860

gtttataagt tattttcctt gtattttatt gacaagcatt ccggagaatt ccaacaattc 1920

aagatcttca ctcctgatca gatctctaaa gttgtgcagc cacaactatt ggctcttttg 1980

ccaattgtga ggaaagactg tataggtctg acagactcct ttgaattacc tgacgcgatg 2040

ttaaattctc ctataggtta ctttgatggc gatatctatc acaattactt caatgaagtt 2100

tgccgcaata atccagtgga ggcagatggg gcagggaagc cttcttatca tgcgctgttg 2160

agcagcatgc tcggtagagg tttcgaattt gaccaaaagt taggtggtgc agctaatgcg 2220

gaaattttat cgaaaataaa caagtga 2247

<210> 7

<211> 2703

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgcctggaa atttatcctt caaagataga gttgttgtaa tcacgggcgc tggagggggc 60

ttaggtaagg tgtatgcact agcttacgca agcagaggtg caaaagtggt cgtcaatgat 120

ctaggtggca ctttgggtgg ttcaggacat aactccaaag ctgcagactt agtggtggat 180

gagataaaaa aagccggagg tatagctgtg gcaaattacg actctgttaa tgaaaatgga 240

gagaaaataa ttgaaacggc tataaaagaa ttcggcaggg ttgatgtact aattaacaac 300

gctggaatat taagggatgt ttcatttgca aagatgacag aacgtgagtt tgcatctgtg 360

gtagatgttc atttgacagg tggctataag ctatcgcgtg ctgcttggcc ttatatgcgc 420

tctcagaaat ttggtagaat cattaacacc gcttcccctg ccggtctatt tggaaatttt 480

ggtcaagcta attattcagc agctaaaatg ggcttagttg gtttggcgga aaccctcgcg 540

aaggagggtg ccaaatacaa cattaatgtt aattcaattg cgccattggc tagatcacgt 600

atgacagaaa acgtgttacc accacatatc ttgaaacagt taggaccgga aaaaattgtt 660

cccttagtac tctatttgac acacgaaagt acgaaagtgt caaactccat ttttgaactc 720

gctgctggat tctttggaca gctcagatgg gagaggtctt ctggacaaat tttcaatcca 780

gaccccaaga catatactcc tgaagcaatt ttaaataagt ggaaggaaat cacagactat 840

agggacaagc catttaacaa aactcagcat ccatatcaac tctcggatta taatgattta 900

atcaccaaag caaaaaaatt acctcccaat gaacaaggct cagtgaaaat caagtcgctt 960

tgcaacaaag tcgtagtagt tacgggtgca ggaggtggtc ttgggaagtc tcatgcaatc 1020

tggtttgcac ggtacggtgc gaaggtagtt gtaaatgaca tcaaggatcc tttttcagtt 1080

gttgaagaaa taaataaact atatggtgaa ggcacagcca ttccagattc ccatgatgtg 1140

gtcaccgaag ctcctctcat tatccaaact gcaataagta agtttcagag agtagacatc 1200

ttggtcaata acgctggtat tttgcgtgac aaatcttttt taaaaatgaa agatgaggaa 1260

tggtttgctg tcctgaaagt ccaccttttt tccacatttt cattgtcaaa agcagtatgg 1320

ccaatattta ccaaacaaaa gtctggattt attatcaata ctacttctac ctcaggaatt 1380

tatggtaatt ttggacaggc caattatgcc gctgcaaaag ccgccatttt aggattcagt 1440

aaaactattg cactggaagg tgccaagaga ggaattattg ttaatgttat cgctcctcat 1500

gcagaaacgg ctatgacaaa gactatattc tcggagaagg aattatcaaa ccactttgat 1560

gcatctcaag tctccccact tgttgttttg ttggcatctg aagaactaca aaagtattct 1620

ggaagaaggg ttattggcca attattcgaa gttggcggtg gttggtgtgg gcaaaccaga 1680

tggcaaagaa gttccggtta tgtttctatt aaagagacta ttgaaccgga agaaattaaa 1740

gaaaattgga accacatcac tgatttcagt cgcaacacta tcaacccgag ctccacagag 1800

gagtcttcta tggcaacctt gcaagccgtg caaaaagcgc actcttcaaa ggagttggat 1860

gatggattat tcaagtacac taccaaggat tgtatcttgt acaatttagg acttggatgc 1920

acaagcaaag agcttaagta cacctacgag aatgatccag acttccaagt tttgcccacg 1980

ttcgccgtca ttccatttat gcaagctact gccacactag ctatggacaa tttagtcgat 2040

aacttcaatt atgcaatgtt actgcatgga gaacaatatt ttaagctctg cacgccgaca 2100

atgccaagta atggaactct aaagacactt gctaaacctt tacaagtact tgacaagaat 2160

ggtaaagccg ctttagttgt tggtggcttc gaaacttatg acattaaaac taagaaactc 2220

atagcttata acgaaggatc gttcttcatc aggggcgcac atgtacctcc agaaaaggaa 2280

gtgagggatg ggaaaagagc caagtttgct gtccaaaatt ttgaagtgcc acatggaaag 2340

gtaccagatt ttgaggcgga gatttctacg aataaagatc aagccgcatt gtacaggtta 2400

tctggcgatt tcaatccttt acatatcgat cccacgctag ccaaagcagt taaatttcct 2460

acgccaattc tgcatgggct ttgtacatta ggtattagtg cgaaagcatt gtttgaacat 2520

tatggtccat atgaggagtt gaaagtgaga tttaccaatg ttgttttccc aggtgatact 2580

ctaaaggtta aagcttggaa gcaaggctcg gttgtcgttt ttcaaacaat tgatacgacc 2640

agaaacgtca ttgtattgga taacgccgct gtaaaactat cgcaggcaaa atctaaacta 2700

taa 2703

<210> 8

<211> 1254

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgtctcaaa gactacaaag tatcaaggat catttggtgg agagcgccat gggtaagggt 60

gaatcgaaga ggaagaactc gttgctggag aaaagacccg aagatgtagt tattgtggct 120

gctaacaggt ctgccatcgg taaaggtttt aaaggtgcct tcaaagatgt aaacacagac 180

tacttattat acaactttct caatgagttc atcgggaggt ttccggaacc tttgagggct 240

gatttgaact taatcgaaga agttgcctgt ggaaatgttc tcaatgttgg agccggtgct 300

acagaacaca gggctgcatg cttggcaagt gggattccct actcgacgcc atttgtcgct 360

ttaaacagac aatgttcttc aggtttaacg gcggtgaacg atattgccaa caagattaag 420

gttgggcaaa ttgatattgg tttggcgctg ggagtggaat caatgaccaa taactacaaa 480

aacgtcaatc ccttgggcat gatctcctct gaagagctgc aaaaaaaccg agaagcgaag 540

aaatgtctaa taccaatggg cattactaat gagaatgttg ccgctaattt caagatcagt 600

agaaaggatc aagacgagtt cgctgcgaat tcatatcaaa aagcttacaa ggcgaaaaat 660

gaggggcttt tcgaagatga aattttacct ataaaattac cagatggctc aatttgccag 720

tcggacgaag ggccacgccc taacgtcact gcggagtcgc tttcaagcat caggcctgcc 780

tttatcaaag acagaggaac cacaactgcg ggcaatgcat cccaggtctc cgatggtgtg 840

gcaggtgtct tgttagcccg caggtccgta gccaaccagt taaatctgcc tgtgctaggt 900

cgctacatcg attttcaaac agtgggggtt ccccctgaaa tcatgggtgt gggccctgca 960

tacgccatac caaaagtcct ggaagctact ggcttgcaag tccaagatat cgatattttt 1020

gaaataaatg aagcattcgc ggcccaagca ttatactgca tccataaact gggcatcgat 1080

ttgaataaag taaatccaag aggtggtgca atcgcgttag gccatccctt gggttgtact 1140

ggcgcaaggc aagtagctac catactaaga gaactgaaaa aggatcaaat cggggttgtt 1200

agtatgtgta tcggtactgg tatgggtgcc gccgccatct ttattaaaga atag 1254

<210> 9

<211> 1575

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gaccaattgg tgaaaactga agtcaccaag aagtctttta ctgctcctgt acaaaaggct 60

tctacaccag ttttaaccaa taaaacagtc atttctggat cgaaagtcaa aagtttatca 120

tctgcgcaat cgagctcatc aggaccttca tcatctagtg aggaagatga ttcccgcgat 180

attgaaagct tggataagaa aatacgtcct ttagaagaat tagaagcatt attaagtagt 240

ggaaatacaa aacaattgaa gaacaaagag gtcgctgcct tggttattca cggtaagtta 300

cctttgtacg ctttggagaa aaaattaggt gatactacga gagcggttgc ggtacgtagg 360

aaggctcttt caattttggc agaagctcct gtattagcat ctgatcgttt accatataaa 420

aattatgact acgaccgcgt atttggcgct tgttgtgaaa atgttatagg ttacatgcct 480

ttgcccgttg gtgttatagg ccccttggtt atcgatggta catcttatca tataccaatg 540

gcaactacag agggttgttt ggtagcttct gccatgcgtg gctgtaaggc aatcaatgct 600

ggcggtggtg caacaactgt tttaactaag gatggtatga caagaggccc agtagtccgt 660

ttcccaactt tgaaaagatc tggtgcctgt aagatatggt tagactcaga agagggacaa 720

aacgcaatta aaaaagcttt taactctaca tcaagatttg cacgtctgca acatattcaa 780

acttgtctag caggagattt actcttcatg agatttagaa caactactgg tgacgcaatg 840

ggtatgaata tgatttctaa aggtgtcgaa tactcattaa agcaaatggt agaagagtat 900

ggctgggaag atatggaggt tgtctccgtt tctggtaact actgtaccga caaaaaacca 960

gctgccatca actggatcga aggtcgtggt aagagtgtcg tcgcagaagc tactattcct 1020

ggtgatgttg tcagaaaagt gttaaaaagt gatgtttccg cattggttga gttgaacatt 1080

gctaagaatt tggttggatc tgcaatggct gggtctgttg gtggatttaa cgcacatgca 1140

gctaatttag tgacagctgt tttcttggca ttaggacaag atcctgcaca aaatgttgaa 1200

agttccaact gtataacatt gatgaaagaa gtggacggtg atttgagaat ttccgtatcc 1260

atgccatcca tcgaagtagg taccatcggt ggtggtactg ttctagaacc acaaggtgcc 1320

atgttggact tattaggtgt aagaggcccg catgctaccg ctcctggtac caacgcacgt 1380

caattagcaa gaatagttgc ctgtgccgtc ttggcaggtg aattatcctt atgtgctgcc 1440

ctagcagccg gccatttggt tcaaagtcat atgacccaca acaggaaacc tgctgaacca 1500

acaaaaccta acaatttgga cgccactgat ataaatcgtt tgaaagatgg gtccgtcacc 1560

tgcattaaat cctaa 1575

<210> 10

<211> 867

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atgactgccg acaacaatag tatgccccat ggtgcagtat ctagttacgc caaattagtg 60

caaaaccaaa cacctgaaga cattttggaa gagtttcctg aaattattcc attacaacaa 120

agacctaata cccgatctag tgagacgtca aatgacgaaa gcggagaaac atgtttttct 180

ggtcatgatg aggagcaaat taagttaatg aatgaaaatt gtattgtttt ggattgggac 240

gataatgcta ttggtgccgg taccaagaaa gtttgtcatt taatggaaaa tattgaaaag 300

ggtttactac atcgtgcatt ctccgtcttt attttcaatg aacaaggtga attactttta 360

caacaaagag ccactgaaaa aataactttc cctgatcttt ggactaacac atgctgctct 420

catccactat gtattgatga cgaattaggt ttgaagggta agctagacga taagattaag 480

ggcgctatta ctgcggcggt gagaaaacta gatcatgaat taggtattcc agaagatgaa 540

actaagacaa ggggtaagtt tcacttttta aacagaatcc attacatggc accaagcaat 600

gaaccatggg gtgaacatga aattgattac atcctatttt ataagatcaa cgctaaagaa 660

aacttgactg tcaacccaaa cgtcaatgaa gttagagact tcaaatgggt ttcaccaaat 720

gatttgaaaa ctatgtttgc tgacccaagt tacaagttta cgccttggtt taagattatt 780

tgcgagaatt acttattcaa ctggtgggag caattagatg acctttctga agtggaaaat 840

gacaggcaaa ttcatagaat gctataa 867

Claims

1.可合成角鲨烯的酿酒酵母工程菌，其特征在于，对酿酒酵母做了如下改进：

（1）在基因组上多拷贝位点Ty2处整合8个拷贝或10个拷贝的串联基因tHMG1和IDI1；基因tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，基因IDI1的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

（2）表达氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的HMG-CoA还原酶；

（3）用启动子P_TDH1、P_ATP3或P_HXT1启动酿酒酵母来源的ERG1基因的表达；

（4）表达来源于Yarrowia lipolytica的柠檬酸裂解酶；所述柠檬酸裂解酶由基因ACL1、ACL2编码；基因ACL1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，基因ACL2的核苷酸序列如SEQID NO.4所示；用启动子P_GPD2起始ACL1基因的表达，使用P_TEF起始ACL2基因的表达。

2.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，还表达了SEQ ID NO.5所示的基因PEX11。

3.根据权利要求1或2所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，还表达了来源于Bacillus pumilus的脂肪酶L5；编码所述脂肪酶L5的基因的核苷酸序列如Genbank登录号:JX163855.1所示。

4.根据权利要求1或2所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，还过表达了FOX基因，所述FOX基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6~8任一所示。

5.根据权利要求3所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，还过表达了FOX基因，所述FOX基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6~8任一所示。

6.权利要求1~5任一所述的酿酒酵母工程菌在生产角鲨烯中的应用。

7.一种生产角鲨烯的方法，其特征在于，将权利要求1~5任一所述酿酒酵母工程菌接种于YPD培养基中，于28~35℃发酵至少48 h。

8.权利要求1~5任一所述酿酒酵母工程菌在食品、医药、化工领域生产含角鲨烯产品方面的应用。