CN111088175A - 一种产红没药烯的解脂耶氏酵母及其构建方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了产生红没药烯的解脂耶氏酵母基因工程菌及其用途，属于分子生物学技术领域。所述基因工程菌为解脂耶氏酵母宿主中导入α‑红没药烯合酶基因、β‑红没药烯合酶基因或γ‑红没药烯合酶基因并且过表达甲羟戊二酸单酰辅酶A还原酶基因(HMGR基因)所得。基因工程菌在YPD培养基中摇瓶发酵后，基因工程菌Po1gΔku70α‑HR产α‑红没药烯的产量为100.22mg/L，基因工程菌Po1gΔku70β‑HR产β‑红没药烯的产量为5.66mg/L，基因工程菌Po1gΔku70γ‑HR产γ‑红没药烯的产量为3.55mg/L。经优化培养基后，菌株Po1gΔku70α‑HR产量为162.24mg/L，Po1gΔku70β‑HR产量为20.811mg/L和Po1gΔku70γ‑HR产量为6.25mg/L。

Description

一种产红没药烯的解脂耶氏酵母及其构建方法与用途

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种产生红没药烯的解脂耶氏酵母基因工程 菌及其用途。

背景技术

解脂耶氏酵母是一种具有典型代表性的非常规酵母。该酵母无致病性，最高生长温 度一般在34℃以下，并且已经被认定为(generally regarded as safe,GRAS)安全级微生 物。与酿酒酵母不同，该酵母为严格好氧菌，所能达到的最大生物量值较大。解脂耶氏酵母的另外一个显著优点是它广泛存在于各类食物和各种生存环境中，这是因为该酵母可以利用的碳源类型极为广泛，包括有机酸、烷烃、烯烃、油类、醇类、酯类等各种廉 价碳源。此外，解脂耶氏酵母在其代谢过程中能够产生和(或)分泌多种代谢产物，因 此具有很好的工业用途价值。具体用途包括蛋白酶、脂肪酶、磷酸酶、赖氨酸、γ-癸内 酯、柠檬酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸和单细胞油脂的工业生产和生物修复等。由于解脂 耶氏酵母具有以上这些生理、代谢特征和独特优势(尤其，微生物发酵工业的关键瓶颈 在于生产成本，尤以碳源为主)，因此解脂耶氏酵母在生物燃料、大宗化学品、精细化 学品、工业酶、药物等各种生物制品的工业化生产中都具有巨大的用途潜力(比大肠杆 菌和酿酒酵母更大的用途潜力)。

到目前为止，解脂耶氏酵母的全基因组测序工作已经完成，基因表达载体和遗传转 化方法也相继建立并不断发展完善。这些都为这一新型非模式微生物底盘细胞的开发利 用奠定了良好基础。近年来，利用代谢工程和合成生物学技术对解脂耶氏酵母底盘细胞进行改造来改进自身代谢产物的生产以及合成新的目标产物，已经成为目前的一个研究热点。红没药烯是一种植物来源的天然活性化合物，具有很高的市场价值。

红没药烯(bisabolane)属于单环倍半萜类天然产物，化学式为C₁₅H₂₄，根据双键位置的不同分为三种异构体：α-红没药烯、β-红没药烯、γ-红没药烯(参照附图1)。红没 药烯有类似果香和香脂的悦人香味，可以作为食用香精及日化香精使用，市场价值很大； 红没药烯也是极具潜力的新型生物燃料；红没药烯还具有抗痒、消炎、抗癌的医学价值。 此外，红没药烯也是多种高附加值工业产品合成的前体物质，如生物燃料、生物塑料、 化妆品、保健品及药品等。

目前红没药烯的工业生产主要还是通过植物提取法实现的。但这一方法存在很大弊 端，如植物来源有限、目标物质含量低和分离提取难度大等缺点；利用化学方法也能合成红没药烯，但化学合成法需要采用高温、高压和昂贵的催化剂，而且生产设备复杂， 原料利用率低、环境污染严重。随着人们对健康、能源和环境问题的愈加关注，掀起了 有着广泛用途前景的萜类化合物等植物天然产物的研究热潮。因此利用微生物生产这些 植物来源的天然产物就具有独特优势，也引起了越来越多研究者的关注。

目前关于利用微生物代谢工程技术生产红没药烯的研究并不多见，主要集中在大肠 杆菌和酿酒酵母这两种模式菌株中，但是产量并不高，难以实现工业化。针对红没药烯在大肠杆菌和酿酒酵母中合成产量低的问题，可能存在诸多原因，有待于进行进一步的 探索。而为红没药烯的生物合成寻找新的、更理想的微生物宿主是一个很好的研究方向， 借此可以找到红没药烯合成代谢通路与微生物宿主之间的最大兼容性。

目前在提高α-红没药烯产量的研究中，已知大肠杆菌、酿酒酵母异源生产α-红没药 烯；已知大肠杆菌、酿酒酵母异源生产γ-红没药烯，但尚未有大肠杆菌和酿酒酵母等微生物宿主异源生产β-红没药烯的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题就是针对目前红没药烯异源合成产量低的问题，提供一 株导入α-红没药烯合酶基因或β-红没药烯合酶基因或γ-红没药烯合酶基因的解脂耶氏 酵母基因工程菌以及该菌株在异源合成红没药烯的用途，其能够合成红没药烯以及通过 代谢工程或合成生物学手段构建能够提高红没药烯产量的工程菌株(参照附图2)。

本发明的技术方案之一是：提供一种解脂耶氏酵母基因工程菌，所述基因工程菌以 解脂耶氏酵母为出发菌株，通过导入α-红没药烯合酶基因、β-红没药烯合酶基因或γ-红没药烯合酶基因其中的一种。

优选地，所述基因工程菌以解脂耶氏酵母为出发菌株，通过导入α-红没药烯合酶基 因、β-红没药烯合酶基因或γ-红没药烯合酶基因其中的一种同时过表达甲羟戊二酸单酰 辅酶A还原酶基因(HMGR基因)所得。

所述α-红没药烯合酶基因序列是将GenBank登录号为AF006195.1的核苷酸序列以解脂耶氏酵母密码子使用偏好性分别进行密码子优化并在基因3′端加入His标签获得， 其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；

所述β-红没药烯合酶基因序列是将GenBank登录号为AB511914.1的核苷酸序列以解脂耶氏酵母密码子使用偏好性分别进行密码子优化并在基因3′端加入His标签获得， 其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；

所述γ-红没药烯合酶基因序列是将GenBank登录号为KU674381.1的核苷酸序列以 解脂耶氏酵母密码子使用偏好性分别进行密码子优化并在基因3′端加入His标签获得，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示；

所述HMGR基因是将GenBank登录号为XM_503558，核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：4所示；所述HMGR基因的表达是通过在HMGR基因的前、后端分别连接启 动子和终止子构建HMGR表达盒实现的。

优选地，HMGR基因的表达是通过构建核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：5的 HMGR表达盒实现的。

优选的，所述解脂耶氏酵母出发菌株为解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)Po1gΔku70。

所述解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)Po1gΔku70其构建方法参考文献Genetic engineering of an unconventional yeast for renewable biofuel andbiochemical production. Journal of Visualized Experiments,2016,115,e54371，文章中“Protocol”章节部分。

本发明的技术方案之二是：提供一种重组载体，所述重组载体包含α-红没药烯合酶 基因、β-红没药烯合酶基因或γ-红没药烯合酶基因其中的一种。

优选地，所述重组载体包含α-红没药烯合酶基因、β-红没药烯合酶基因或γ-红没药 烯合酶基因其中的一种以及HMGR基因。

本发明的技术方案之三是：提供一种所述解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，包 括以下步骤：

(I)将α-红没药烯合酶基因、β-红没药烯合酶基因或γ-红没药烯合酶基因其中的一种插入质粒中，得到重组质粒；

(II)将所述重组质粒线性化后导入所述出发菌株中，重组后得到所述基因工程菌。

优选地，所述解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

(A)重组质粒的构建

a)根据Genebank中的α-红没药烯合酶基因、β-红没药烯合酶基因和γ-红没药烯合 酶基因核苷酸序列以解脂耶氏酵母密码子使用偏好性分别进行密码子优化并在基因3′端加入His标签，之后进行基因合成；

b)以带有合成基因的质粒为模板，PCR扩增出α-红没药烯合酶基因、β-红没药烯合酶基因和γ-红没药烯合酶基因；

c)将所述步骤b)中获得的α-红没药烯合酶基因、β-红没药烯合酶基因、γ-红没药烯合酶基因分别插入到质粒pYLEX1的多克隆位点上，分别得到重组质粒pYLEX1-α、pYLEX1-β和pYLEX1-γ；

(B)获得基因工程菌

a)将所述步骤(A)-c)中的重组质粒pYLEX1-α、pYLEX1-β和pYLEX1-γ线性化；

b)用醋酸锂转化法将(B)-a)中的线性化载体分别转化入出发菌株中；

c)用亮氨酸缺陷板筛选转化子，挑选长出的菌株即得到重组后的基因工程菌株。

所述重组菌株可通过上述方法构建获得，也可用本领域已知的其他方法来构建。

所述pYLEX1质粒购于Yeastern Biotech Co.,Ltd.，所述质粒并携带有营养缺陷筛选 基因亮氨酸表达盒、标记基因Amp、强启动子hp4d以及终止子XPR2 term。

更优选地，所述解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)将α-红没药烯合酶基因、β-红没药烯合酶基因或γ-红没药烯合酶基因其中的一种和HMGR基因插入质粒中，得到重组质粒；

(2)将所述重组质粒线性化后导入所述出发菌株中，重组后得到所述基因工程菌。

更优选地，所述解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：

(1)重组质粒的构建

1)根据Genebank中的α-红没药烯合酶基因、β-红没药烯合酶基因和γ-红没药烯合 酶基因核苷酸序列以解脂耶氏酵母密码子使用偏好性分别进行密码子优化并在基因3′端加入His标签，之后进行基因合成；

2)以带有合成基因的质粒为模板，PCR扩增出α-红没药烯合酶基因、β-红没药烯合酶基因和γ-红没药烯合酶基因；

3)根据Genebank中的HMGR基因序列设计并合成引物，以解脂耶氏酵母Po1g Δku70的基因组为模板扩增HMGR基因；

4)将2)和3)中获得的α-红没药烯合酶基因、β-红没药烯合酶基因、γ-红没药烯合酶基因和HMGR基因分别插入到质粒pYLEX1的多克隆位点上，分别得到重组质粒 pYLEX1-α、pYLEX1-β、pYLEX1-γ和pYLEX1-HMGR；

所述α-红没药烯合酶基因、β-红没药烯合酶基因、γ-红没药烯合酶基因以及HMGR基因在质粒pYLEX1上的插入位点均为PmlⅠ和KpnⅠ双酶切位点；

5)从所述重组质粒pYLEX1-HMGR上PCR扩增出HMGR表达盒，所述HMGR 表达盒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：5，然后将HMGR表达盒分别克隆到质粒 pYLEX1-α、pYLEX1-β、pYLEX1-γ的Nru I克隆位点上，分别得到重组质粒 pYLEX1-α-HR、pYLEX1-β-HR、pYLEX1-γ-HR。

(2)获得基因工程菌

1)将所述步骤(1)-5)中的重组质粒pYLEX1-α-HR、pYLEX1-β-HR、pYLEX1-γ-HR 线性化。

2)用醋酸锂转化法将(2)-1)中的线性化载体分别转化入出发菌株中。

3)用亮氨酸缺陷板筛选转化子，挑选长出的菌株即得到重组后的基因工程菌株。

所述重组菌株可通过上述方法构建获得，也可用本领域已知的其他方法来构建。

所述pYLEX1质粒购于Yeastern Biotech Co.,Ltd.，所述质粒并携带有营养缺陷筛选 基因亮氨酸表达盒、标记基因Amp、启动子hp4d以及终止子XPR2 term。

本发明的技术方案之四是提供所述解脂耶氏酵母基因工程菌发酵合成红没药烯的 用途。

优选地，所述红没药烯为α-红没药烯、β-红没药烯、γ-红没药烯其中的一种。。

本发明的技术方案之五是：提供一种所述基因工程菌用途于异源合成红没药烯中的 发酵方法，具体如下：

将所述基因工程菌经两次活化后按照接种量0.5-1.5％接种于培养基中，加入10-12％ 的十二烷作为萃取剂，于20-28℃，230-250r/min，摇瓶发酵4.5-5.5天。

优选地，所述基因工程菌的活化步骤为：取所述基因工程菌一环，接种于含20-25mL 种子培养基中，25-30℃，200-230r/min，振荡培养22-25h后(完成一次活化)，以0.5-1.5％ 的接种量接种于含20-25mL种子培养基的中，25-30℃，200-230r/min，继续振荡培养15-17h(完成二次活化)。

所述培养基为YPD培养基，具体组成为：蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，葡萄糖20g/L，余量为水，pH5.7-5.8，115℃，灭菌20min。

优选地，所述培养基组成为：蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，葡萄糖20g/L，硫 酸镁2g/L，余量为水，pH5.7-5.8，115℃，灭菌20min。

优选地，所述培养基组成为：蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，餐厨废油11-12mL/L，硫酸镁2g/L，余量为水，pH5.7-5.8，115℃，灭菌20min；所述餐厨废油中含有C18的 脂肪酸的总量为70-80g/100g餐厨废油。

所述种子培养基为YPD培养基。

有益效果：1、本发明导入了α-红没药烯合酶基因、β-红没药烯合酶基因、γ-红没药 烯合酶基因并且过表达HMGR基因，首次得到能够异源合成红没药烯的解脂耶氏酵母 基因工程菌，并首次以异源合成α-红没药烯、β-红没药烯、γ-红没药烯为目的将该基因 工程菌用于α-红没药烯、β-红没药烯、γ-红没药烯的异源合成。

本发明构建的基因工程菌:产α-红没药烯的工程菌株、产β-红没药烯的工程菌株以 及产γ-红没药烯的工程菌株：区别于常规酿酒酵母菌等其他宿主菌，本发明工程菌通过 利用解脂耶氏酵母，作为一种产油酵母，体内含有含量比较丰富的乙酰辅酶A。其正好是解脂耶氏酵母MVA途径中重要的起始物质，因此解脂耶氏酵母的MVA途径能够 提供含量丰富的FPP(红没药烯合成所需的前体物质)。为菌株异源合成红没药烯提高较 好的发酵生产红没药烯的环境。

同时，本发明构建的基因工程菌可以利用的碳源类型极为广泛，包括有机酸、烷烃、 烯烃、油类、醇类、酯类等碳源，特别是可有效利用廉价碳源。同时实现α-红没药烯、 β-红没药烯、γ-红没药烯高产量的合成。

同时，本发明首次构建出利用微生物发酵生产β-红没药烯的基因工程菌，实现了对 于安全高产β-红没药烯的产业化需求。首次尝试在解脂耶氏酵母中组建红没药烯的代谢 途径，本发明的完成将为利用微生物细胞工厂产业化生产红没药烯开辟崭新的道路。因此本项目的研究成果具有重要的学术价值和应用价值

2、本发明通过对酵母培养基的优化，进一步提高红没药烯产量。

本发明获得的解脂耶氏酵母基因工程菌与出发菌株解脂耶氏酵母相比：在培养基中 摇瓶发酵后，能够异源合成红没药烯，其产量为产α-红没药烯的工程菌株异源合成α-红没药烯的产量为0.4mg/L，产β-红没药烯的工程菌株异源合成β-红没药烯的产量为0.2mg/L，产γ-红没药烯的工程菌株异源合成γ-红没药烯的产量为0.05mg/L。

过表达关键限速酶基因HMGR后Po1gΔku70α-HR中α-红没药烯产量为100.22 mg/L，Po1gΔku70β-HR中β-红没药烯产量为5.66mg/L和Po1gΔku70γ-HR中γ-红没 药烯产量为3.55mg/L。

培养基优化之后产量进一步提高，最终产量Po1gΔku70α-HR中α-红没药烯产量为162.24mg/L，Po1gΔku70β-HR中β-红没药烯产量为20.81mg/L和Po1gΔku70γ-HR中 γ-红没药烯产量为6.25mg/L。

附图说明

图1是红没药烯的结构示意图，其中A为α-红没药烯结构示意图，B为β-红没药 烯结构示意图，C为γ-红没药烯结构示意图；

图2是重组菌株中红没药烯的生物合成途径；

图3是重组质粒pYLEX1-α、pYLEX1-β、pYLEX1-γ和pYLEX1-HMGR的构建示 意图，其中(a)为重组质粒pYLEX1-α的构建过程，(b)为重组质粒pYLEX1-β的构 建过程，(c)为重组质粒pYLEX1-γ-HR的构建过程，(d)为重组质粒pYLEX1-HMGR 的构建过程；

图4是重组质粒pYLEX1-α-HR、pYLEX1-β-HR和pYLEX1-γ-HR的构建示意图， 其中(a)为重组质粒pYLEX1-α-HR的构建过程，(b)为为重组质粒pYLEX1-β-HR的 构建过程，(c)为重组质粒pYLEX1-γ-HR的构建过程。

图5为重组质粒pYLEX1-α-HR、pYLEX1-β-HR和pYLEX1-γ-HR的酶切验证图； 其中：1泳道是用限制性内切酶ClaⅠ和SpeⅠ双酶切重组质粒pYLEX1-α-HR得到的片 段大小分别为9031bp和4626bp的条带；2泳道是用限制性内切酶ClaⅠ和SpeⅠ双酶 切重组质粒pYLEX1-β-HR，得到的片段大小分别为8230bp和4626bp的条带；3泳道 是用限制性内切酶ClaⅠ和SpeⅠ双酶切重组质粒pYLEX1-γ-HR，得到的片段大小分别 为8275bp和4626bp的条带；M为DNAMarker；

图6为重组菌株Po1gΔku70α-HR和Po1gΔku70β-HR和Po1gΔku70γ-HR的的PCR验证图，其中，泳道1是重组菌株Po1gΔku70α-HR基因组为模板，用引物DJY-F和 DJY-R进行菌落PCR扩增出的片段，泳道2是重组菌株Po1gΔku70β-HR基因组为模板， 用引物DJY-F和DJY-R进行菌落PCR扩增出的片段，泳道3是重组菌株Po1gΔku70γ-HR 基因组为模板，用引物DJY-F和DJY-R进行菌落PCR扩增出的片段；M为DNA Marker。

具体实施方式

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利， 并不用于限定本发明。

下面通过具体的实施方案叙述本发明能产红没药烯的解脂耶氏酵母及其构建方法 与用途。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：产红没药烯的解脂耶氏酵母菌株的构建

根据Genebank中的α-红没药烯合酶基因核苷酸序列和β-红没药烯烯合酶基因核苷 酸序列和γ-红没药烯合酶基因核苷酸序列以解脂耶氏酵母密码子使用偏好性分别进行 密码子优化并在基因3′端加入His标签，之后由基因合成公司合成，合成的α-红没药 烯合酶基因核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；合成的β-红没药烯合酶基因核 苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；合成的γ-红没药烯合酶基因核苷酸序列如序 列表中SEQID NO：3所示。根据合成后的基因序列、Genebank中HMGR参考序列和 整合质粒序列，设计了下述实施例中各引物(表1所示)。

表1.本实例中所用到的引物

本发明所述基因工程菌的构造过程如下：

(1)以含有合成红没药烯合酶基因的质粒为模板，用引物α-F和α-R PCR扩增出 α-红没药烯合酶基因，引物β-F和β-R PCR扩增出β-红没药烯合酶基因，用引物γ-F和 γ-RPCR扩增出γ-红没药烯合酶基因，以解脂耶氏酵母Po1gΔku70的基因组为模板，用 引物BDH-2-F和BDH-2-R，通过PCR扩增出HMGR基因；所述解脂耶氏酵母Po1gΔku70 是在解脂耶氏酵母Po1g菌株中敲除KU70基因获得的，其构建方法参考下述文献： Geneticengineering of an unconventional yeast for renewable biofuel and biochemicalproduction.Journal of Visualized Experiments,2016,115,e54371。

PCR反应条件：95℃5min；95℃30s；54℃30s；72℃4min，30个循环；72℃10min， 1％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物；

PCR反应体系(20μL)详见表2：

表2 PCR反应体系

(2)将纯化的α-红没药烯合酶基因，β-红没药烯合酶基因和γ-红没药烯合酶基因片 段用KpnⅠ进行单酶切，用PmlⅠ和KpnⅠ进行双酶切pYLEX1质粒(购自Yeastern BiotechCo.公司，中国台湾)，将酶切后的α-红没药烯合酶基因，β-红没药烯合酶基因 和γ-红没药烯合酶基因和HMGR基因片段分别与酶切后的pYLEX1质粒连接，得到含 有α-红没药烯合酶基因的重组质粒pYLEX1-α，含有β-红没药烯合酶基因的重组质粒 pYLEX1-β和含有γ-红没药烯合酶基因的重组质粒pYLEX1-γ，含有HMGR基因的重组 质粒pYLEX1-HMGR，具体构建示意图参照附图3。

(3)用引物BDH-2-F和BDH-2-R从重组质粒pYLEX1-HMGR上PCR扩增出HMGR 表达盒，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5，然后将HMGR表达盒分别克隆到质 粒pYLEX1-α和pYLEX1-β和pYLEX1-γ的Nru I克隆位点上，分别得到重组质粒 pYLEX1-α-HR和pYLEX1-β-HR和pYLEX1-γ-HR，具体构建示意图参照附图4。

用限制性内切酶ClaⅠ和SpeⅠ对重组质粒pYLEX1-α-HR、pYLEX1-β-HR和 pYLEX1-γ-HR进行酶切验证(参照附图5)。每个质粒酶切后包括两个条带，其中1泳 道是用限制性内切酶ClaⅠ和SpeⅠ双酶切重组质粒pYLEX1-α-HR得到的片段大小分别 为9031bp和4626bp的条带；2泳道是用限制性内切酶ClaⅠ和SpeⅠ双酶切重组质粒 pYLEX1-β-HR，得到的片段大小分别为8230bp和4626bp的条带；3泳道是用限制性 内切酶ClaⅠ和SpeⅠ双酶切重组质粒pYLEX1-γ-HR，得到的片段大小分别为8275bp 和4626bp的条带；M为DNA Marker。

(4)将(3)中重组质粒pYLEX1-α-HR和pYLEX1-β-HR和pYLEX1-γ-HR分别用 SpeI酶切线性化后，用醋酸锂转化法将线性化片段分别转化入Po1gΔku70中，在亮氨 酸缺陷板YNB上筛选得到重组后的解脂耶氏酵母菌株Po1gΔku70α-HR和Po1gΔku70 β-HR和Po1gΔku70γ-HR。提取转化子菌株Po1gΔku70α-HR和Po1gΔku70β-HR和Po1g Δku70γ-HR的基因组DNA，并以此为模板，进行PCR验证(图6)。以实验设计的上、 下游引物DJY-F和DJY-R进行菌落PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测目的基因片段，转 化子Po1gΔku70α-HR和Po1gΔku70β-HR和Po1gΔku70γ-HR的基因组扩增出了检测 序列4366bp(SEQ ID NO:6)大小条带。其中1、2、3道分别为菌落DH5α-pYLα-HR、DH5α-pYLβ-HR、DH5α-pYLγ-HR，均存在大小为4366bp的条带。从电泳结果(参照 图6)可以看出，PCR产物大小与预期一致。此结果说明线性化重组质粒已经成功整合 到出发菌株的染色体基因组上，即得基因工程菌株Po1gΔku70α-HR和Po1gΔku70β-HR 和Po1gΔku70γ-HR。

实施例2：基因工程菌发酵生产红没药烯的比较

(1)实验方法

将工程菌和出发菌株解脂耶氏Po1gΔku70取一环，接种于含25mL YPD培养基的250mL三角瓶中，30℃，225r/min，振荡培养24h后，以1％的接种量接种于含25mL YPD 培养基的250mL三角瓶中，30℃，225r/min，继续振荡培养16h后按1％的接种量接种 到含50mLYPD培养基的250mL三角瓶中，并加入培养基质量百分比10％的十二烷， 28℃，225r/min，摇瓶发酵5天。

YPD培养基组成：蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，葡萄糖20g/L，余量为水， pH5.7-5.8，115℃，灭菌20min。

发酵结束后，将发酵液全部倒入50mL离心管中，7500rpm，4℃，离心5min，取 有机相过膜，气相色谱-质谱联用测定发酵液中的红没药烯含量。

其中，上述气相色谱-质谱联用检测条件为：

色谱柱HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm，美国瓦里安)，载气：高纯氦气，流速为1mL/min，进样口温度280℃，升温程序：60℃，20℃/min升到170℃，2℃/min升到210℃， 280℃3min，溶剂延迟3min，离子扫描模式为选扫(67、93、136m/z)，进样量为1μL。

所述实施例2步骤(1)中，所述工程菌分别为：

(a)实施例1中构建的基因工程菌：Po1gΔku70α-HR和Po1gΔku70β-HR和Po1g Δku70γ-HR；

(b)基因工程菌Po1gΔku70α、Po1gΔku70β以及Po1gΔku70γ，其中该基因工程菌的构建方法具体为：

根据Genebank中的α-红没药烯合酶基因、β-红没药烯合酶基因和γ-红没药烯合酶 基因核苷酸序列以解脂耶氏酵母密码子使用偏好性分别进行密码子优化并在基因3′端加入His标签，之后进行基因合成，合成的α-红没药烯合酶基因核苷酸序列如序列表中 SEQID NO：1所示；合成的β-红没药烯合酶基因核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO： 2所示；合成的γ-红没药烯合酶基因核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。根据 合成后的基因序列、Genebank中HMGR参考序列和整合质粒序列，设计了下述实施例 中各引物(表1所示)。

以带有合成基因的质粒为模板，PCR扩增出α-红没药烯合酶基因、β-红没药烯合酶基因和γ-红没药烯合酶基因分别插入到质粒pYLEX1的多克隆位点上，分别得到重组质 粒pYLEX1-α、pYLEX1-β、pYLEX1-γ(重组质粒的构建方法同实施例1步骤(2))。

重组质粒pYLEX1-α、pYLEX1-β、pYLEX1-γ分别用SpeI酶切线性化后，用醋酸 锂转化法分别转化入出发菌株Po1gΔku70中。用亮氨酸缺陷板YNB上筛选转化子，挑 选长出的菌株即得到重组后的基因工程菌株。

(2)实验结果

经测定，基因工程菌的红没药烯产量详见表3

表3基因工程菌的红没药烯产量

经测定，基因工程菌Po1gΔku70α、Po1gΔku70β以及Po1gΔku70γ和出发菌株解脂耶氏Po1gΔku70相比，发酵初始OD值≈1，发酵结束后，原始菌株Po1gΔku70 OD 值在18-20，Po1gΔku70αOD值在40-50，Po1gΔku70βOD值在50-58，Po1gΔku70γOD 值在50-60。可得到基因工程菌Po1gΔku70α、Po1gΔku70β以及Po1gΔku70γ与原始 菌株相比，对菌株生长性能有正面影响，需要说明的是，上述基因工程菌相较于出发菌 株在其他菌种的正常功能上未受较大影响。

基因工程菌Po1gΔku70α-HR、Po1gΔku70β-HR以及Po1gΔku70γ-HR和出发菌株解脂耶氏Po1gΔku70相比，发酵初始OD值≈1，发酵结束后OD值原始菌株Po1gΔku70 OD值在18-20，Po1gΔku70α-HR的OD值在40-50，Po1gΔku70β–HR的OD值在45-55， Po1gΔku70γ–HR的OD值在45-50，和基因工程菌Po1gΔku70α、Po1gΔku70β以及 Po1gΔku70γ相比，在菌株生长性能上相比没有太大区别，与原始菌株相比，对菌株生 长性能有正面影响。需要说明的是，上述基因工程菌相较于出发菌株在其他菌种的正常 功能上未受较大影响。

(3)优化培养基的发酵生产

将实施例1中所得的工程菌Po1gΔku70α-HR和Po1gΔku70β-HR和Po1gΔku70 γ-HR和出发菌株解脂耶氏Po1gΔku70取一环，接种于含25mL的YPD培养基中，按 照上述实施例2(1)的发酵方法进行发酵培养，30℃，225r/min，振荡培养24h后，以 1％的接种量接种于含25mL YPD培养基的250mL三角瓶中，30℃，225r/min，继续振 荡培养16h后按1％的接种量接种到含50mL优化培养基的250mL三角瓶中，并加入 培养基总量质量百分比10％的十二烷，28℃，225r/min，摇瓶发酵5天。所述优化培养 基组成为(g/L)：蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，葡萄糖20g/L，硫酸镁2g/L，余量为 水，pH5.7-5.8，115℃，灭菌20min。

YPD培养基组成同实施例2步骤(1)。

发酵结束后，将发酵液全部倒入50mL离心管中，7500rpm，4℃，离心5min，取 有机相过膜，气相色谱-质谱联用备用待测，发酵液中的红没药烯含量的测定方法同上 (实施例2步骤(1))。

经测定，菌株Po1gΔku70α-HR产量为162.24mg/L，Po1gΔku70β-HR产量为20.811mg/L和Po1gΔku70γ-HR产量为6.25mg/L。基因工程菌Po1gΔku70α-HR、Po1gΔku70 β-HR以及Po1gΔku70γ-HR和出发菌株解脂耶氏Po1gΔku70相比，发酵初始OD值≈1， 发酵结束后OD值原始菌株Po1gΔku70 OD值在18-20，Po1gΔku70α-HR的OD值在 45-50，Po1gΔku70β–HR的OD值在50-55，Po1gΔku70γ–HR的OD值在45-50，和 基因工程菌Po1gΔku70α、Po1gΔku70β以及Po1gΔku70γ相比，在菌株生长性能上相 比没有太大区别，与原始菌株相比，对菌株生长性能有正面影响。需要说明的是，上述 基因工程菌相较于出发菌株在其他菌种的正常功能上未受较大影响。

实施例3：基因工程菌利用优化的廉价碳源发酵生产红没药烯

将实施例1中所得的工程菌Po1gΔku70α-HR、Po1gΔku70β-HR和Po1gΔku70γ-HR和出发菌株解脂耶氏Po1gΔku70取一环，接种于含25mL的YPD培养基中，按照上述 实施例2(1)的发酵方法进行发酵培养，30℃，225r/min，振荡培养24h后，以1％的 接种量接种于含25mL YPD培养基的250mL三角瓶中，30℃，225r/min，继续振荡培 养16h后按1％的接种量接种到含50mL优化的廉价培养基的250mL三角瓶中，并加 入10％的十二烷，28℃，225r/min，摇瓶发酵5天。

所述廉价优化培养基组成为：蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，餐厨废油11.8mL/L，硫酸镁2g/L，余量为水，pH5.7-5.8，115℃，灭菌20min；其中餐厨废油中含有C18的 脂肪酸的总量为77g/100g餐厨废油。

所述廉价优化培养基中，厨房废油的主要成分为脂肪酸，作为主要碳源替代原始优 化培养基中的碳源成分(即葡萄糖)。

YPD培养基组成同实施例2步骤(1)。

发酵结束后，将发酵液全部倒入50mL离心管中，7500rpm，4℃，离心5min，取 有机相过膜，气相色谱-质谱联用备用待测，发酵液中的红没药烯含量的测定方法同上 (实施例2步骤(1))。

经测定，菌株Po1gΔku70α-HR产量为202mg/L，Po1gΔku70β-HR产量为25.8mg/L和Po1gΔku70γ-HR产量为8.85mg/L。基因工程菌Po1gΔku70α-HR、Po1gΔku70β-HR 以及Po1gΔku70γ-HR和出发菌株解脂耶氏Po1gΔku70相比，发酵初始OD值≈1，发酵 结束后OD值原始菌株Po1gΔku70 OD值在18-20，Po1gΔku70α-HR的OD值在45-50， Po1gΔku70β–HR的OD值在50-55，Po1gΔku70γ–HR的OD值在45-50，和基因工程 菌Po1gΔku70α、Po1gΔku70β以及Po1gΔku70γ相比，在菌株生长性能上相比没有太 大区别，与原始菌株相比，对菌株生长性能有正面影响。需要说明的是，上述基因工程 菌相较于出发菌株在其他菌种的正常功能上未受较大影响。

通过实施例3和实施例2中基因工程菌利用优化培养基的发酵生产红没药烯的产量 上看，本发明的基因工程菌有效利用廉价碳源生产红没药烯的特性即为显著，菌株在利用廉价碳源即廉价餐厨废油生产红没药烯较利用常规碳源更具有显著性。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不 能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这 些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种产红没药烯的解脂耶氏酵母及其构建方法与用途

<130> 1

<141> 2019-11-26

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2472

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

atggccggtg tctctgccgt gtccaaggtg tcctctctgg tctgtgattt atcctctacc 60

tccggcctca tcagacgaac cgccaatccc caccccaacg tgtggggcta tgatttagtc 120

cactccctca agtctcccta cattgattct tcctaccgag aacgagctga ggtgctggtc 180

tctgagatta aggccatgct gaaccccgcc attactggcg acggcgagtc catgattact 240

ccctccgcct atgacactgc ttgggtggct agagtgcccg ctatcgacgg ttccgctaga 300

ccccagttcc cccagaccgt ggactggatt ttaaagaacc agctgaaaga cggctcttgg 360

ggcattcaat cccacttctt attatccgat cgactcctcg ccaccctctc ttgtgtcctc 420

gtgctgctga agtggaatgt gggtgacctc caagtcgagc aaggtattga gttcatcaag 480

tctaatttag agctggtcaa ggatgagacc gaccaagatt ctttagtgac cgatttcgag 540

atcatcttcc cctctttact gagagaagcc cagtctctcc gactcggtct gccctatgat 600

ttaccctaca tccacctcct ccaaaccaaa cgacaagaaa gactggccaa gctctcccga 660

gaggaaattt atgccgtccc ttccccttta ctctattctt tagaaggcat ccaagatatt 720

gtggagtggg agcgaattat ggaggtgcag tcccaagatg gctcctttct ctcctctccc 780

gcttccactg cttgtgtgtt tatgcacacc ggcgatgcca agtgcctcga atttctcaac 840

tccgtgatga tcaaattcgg taactttgtg ccttgtttat accccgttga tttattagaa 900

agactgctca tcgtggacaa tatcgtgcga ctcggcattt atcgacactt cgagaaggag 960

attaaggagg ccctcgacta cgtctacaga cactggaatg agagaggcat cggttggggc 1020

cgactgaacc ccatcgctga tttagaaacc accgctctgg gctttcgact gctgagactc 1080

cacagataca acgtgtcccc cgctatcttc gacaatttca aggatgccaa cggtaagttc 1140

atctgttcta ctggccagtt taacaaggat gtcgcctcca tgctcaacct ctaccgagcc 1200

tcccaactcg ctttccccgg cgaaaatatc ctcgacgagg ccaagtcctt cgctactaag 1260

tatttacgag aggccttaga aaagtctgag acctcctccg cttggaataa caaacagaac 1320

ctctctcaag aaatcaagta cgctttaaag acttcttggc acgcttctgt cccccgagtc 1380

gaggccaagc gatattgtca agtttaccga cccgattacg ccagaattgc caagtgcgtc 1440

tacaagctcc cttacgtgaa caatgagaaa tttttagaac tcggcaagct ggacttcaac 1500

atcatccagt ccatccacca agaggagatg aagaacgtga cctcttggtt cagagattct 1560

ggtctgcctt tattcacctt tgcccgtgaa cgacccttag agttttattt tctcgtcgcc 1620

gccggtactt atgagcctca gtacgccaaa tgccgatttc tctttaccaa ggtcgcttgt 1680

ctgcagaccg tgctggatga catgtacgac acctacggta ctctggatga gctgaagctg 1740

ttcactgagg ctgtgcgacg atgggatctg tccttcaccg agaatctccc cgattacatg 1800

aagctgtgtt atcaaattta ttacgacatt gtgcatgaag tggcttggga ggctgaaaag 1860

gagcaaggcc gagagctcgt ctccttcttc cgaaagggct gggaagacta tttattaggc 1920

tactacgagg aggccgagtg gctggccgcc gagtatgtcc ctactctgga cgagtacatt 1980

aagaatggta tcacctccat cggtcagcgt attttattac tgtccggcgt gctgattatg 2040

gacggtcaac tgctctctca agaggcttta gagaaagtgg actaccccgg tagacgagtg 2100

ctgaccgagc tgaactcttt aatctcccgt ctcgccgacg ataccaagac ctacaaggct 2160

gagaaggccc gtggtgagct ggcctcctct atcgagtgct atatgaagga ccaccccgag 2220

tgcaccgaag aggaggcttt agaccacatc tactccattc tggagcccgc cgtcaaggaa 2280

ctcacccgag agtttttaaa gcccgacgac gtcccttttg cttgtaagaa gatgctcttc 2340

gaggagaccc gtgttaccat ggtcatcttc aaagacggcg atggcttcgg cgtgtccaag 2400

ctggaggtca aagaccatat taaggagtgt ctcattgagc ctctccctct ccaccaccac 2460

catcaccact aa 2472

<210> 2

<211> 1671

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

atggaacttg ttgatactcc atcactcgag gttttcgaag acgtggttgt tgatcgtcag 60

gttgcaggct tcgatcctag cttttggggt gactacttta ttacaaatca gaaatcacag 120

tctgaggcat ggatgaatga aagagctgaa gagctcaaga atgaagtaag gagcatgttc 180

caaaacgtga ctggcatcct acaaaccatg aatctaattg atacaattca acttcttgga 240

cttgattacc atttcatgga ggaaatagcc aaagctttag accatctcaa ggatgttgac 300

atgagcaaat acgggctcta tgaggttgct cttcattttc gactgcttag acaaaaagga 360

ttcaacattt cttcagatgt atttaaaaag tacaaggata aggagggaaa atttatggaa 420

gaactaaaag atgatgctaa gggtctcctg agcttatata acgcggctta ctttggaact 480

aaagaagaga ctatactcga cgaagctatt tcttttacta aagataatct tacatctttg 540

ttaaaagatt taaatcctcc atttgcaaag ctagtgtctc tcactctcaa gacacctatt 600

caacgaagca tgaaacgaat tttcacaaga agctacatct ctatttacca agatgaacca 660

acactaaatg aaacaatact tgagcttgca aagttggact tcaacatgtt acaatgtctc 720

caccagaagg agctcaagaa aatatgcgcg tggtggaata atttgaattt agacattatg 780

catctaaatt ttattcgaga ccgagtggtg gaatgttatt gttggtcgat ggtgatacgt 840

catgaaccta gttgttctcg tgctcgacta atatcaacta agctacttat gttaattact 900

gtcttggacg acacctatga cagctacagc acactagaag agagtcgact acttacagac 960

gcaatccaaa ggtggaaccc taatgaagta gatcaactac cagaatactt gagggatttc 1020

tttctcaaaa tgttgaacat ttttcaagaa tttgaaaatg aacttgcacc ggaggagaaa 1080

tttcgaatat tgtacctcaa agaagaatgg aaaattcaat ctcaaagtta cttcaaggaa 1140

tgccaatgga gggatgacaa ttatgtgccc aagttagaag agcacatgcg tctttcaatc 1200

ataagtgtgg gatttgtctt gttttattgc ggatttttga gtggcatgga ggaggcagtg 1260

gccacaaagg atgcatttga atggttcgca agctttccta agatcataga agcttgtgca 1320

acaattattc gtatcactaa tgacataact tcaatggagc gagaacaaaa gagggcacat 1380

gttgcctcaa cggtagattg ctatatgaag gaatatggaa catcaaaaga tgttgcatgc 1440

gagaagctcc taggctttgt tgaagatgca tggaagacta tcaacgagga actccttact 1500

gaaactggat tgtccaggga agtaattgaa ctatcattcc actctgcgca aactacagaa 1560

tttgtataca agcatgtcga cgcatttaca gaacctaata ccacgatgaa ggaaaatata 1620

ttttctctac ttgttcatcc tatccctatt catcatcacc atcaccactg a 1671

<210> 3

<211> 1716

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

atgtctattt cttcatctcc ttcagctctt taccataaca aaagtttgaa gaaggaagca 60

attcgcaaca tgttgacctt caaacctagc ttatggggag atcaatttct catatataat 120

gagagaaagg atcttgcttg tgaggagcaa cgggctaggg aactaaaaga gaatgtaagg 180

aaagtgctag tgatcaaagg atcaatagaa cctacacatc atatgaaatt attggaactt 240

attgattcgg tccaacgcct tggtgtggca tatcattttg aagatgaaat tgaggaatgc 300

ttaaagcata tttatcttac gtatggggat gagtggatca acgggaataa cctccaaggc 360

acttcacttt ggttcagact tctgcgacaa caagggttca atgtttcaag tggaatattc 420

tacaagtaca agaatgaaaa tggtaatttt ctggagtcct tgagagacga tattcacggt 480

atgctttctt tgtacgaagc aacatacatg agggtggaag gtgaagaagt tctagacgaa 540

gccctcgagt ttacaaaata ccatcttgga aatataatca agaaacacat ttgtagtgac 600

gacacttctc tagaaactca aatatctcaa gcactacaac aacctcttcg aaaaaaattg 660

ccacggctag aagcattgcg ttacatacca atctaccaac aacaagattc tcgtaatgac 720

gacttactaa cacttgctaa gttagatttc aatttgctcc aagaattgca ccgaaaagag 780

cttagccaag tttgcaaatg gtggaaggat tttgacgtgt tgaataaact accttatgct 840

cgggatagaa cagtcgaagg ttacttttgg atattggcgg tctacttcga gcctcaacat 900

tccgaatcaa gggtttttct gattaaaata tgcaatctaa taaacctttt ggatgacacg 960

tacgatagtt atggtactta tgaagaactc gagatattta ctaaagctat tcaaaaatgg 1020

tcgataagtt gcatggatat gcttccagaa tacatgaaac tcatatatca agaaattctc 1080

aatgtttaca aagaagcaga agatttgcta gagaagaagg gaaatacata tcgtttatct 1140

tatacaaaag agatggttaa agagtacact cgaaatgtct tacttgaagc taaatgggta 1200

aacgagaggt atattccaac ctttgaagaa catatgtcgg ttgccatagt atctgttggc 1260

taccccttga tcatcatgtt gtcttatgtt caccgggata atttggttac cgaagatata 1320

tttaaatggt tgtctaacta tcctcctata gtcaaagctt catctttgat tttgagatac 1380

atgaatgatc tttccacacg aaaggatgaa caagaaagaa accatgtagc ttcaagtgtg 1440

aagtgctata tgaagcaata cgaggtctca gaggagcaca cacgtgagtt attctcaaag 1500

ctaattgaag ataattggaa agttataaat aaggagtctc taaggcctac agacataccc 1560

ggacctttac ttatgcctcc tatcaatttt gcacgtgttt gtggtatact ttatacaggt 1620

ggtgacaatt atactcatgc cgggaaagaa atgattggct acattgaatc acttcttgtt 1680

actcccataa gtgttcatca tcaccatcac cactaa 1716

<210> 4

<211> 3000

<212> DNA

<213> 解脂耶氏酵母 Po1g Δku70()

<400> 4

atgctacaag cagctattgg aaagattgtg ggatttgcgg tcaaccgacc catccacaca 60

gttgtcctga cgtccatcgt ggcgtcaacc gcatacctcg ccatcctcga cattgccatc 120

ccgggtttcg agggcacaca acccatctca tactaccacc ctgcagcaaa atcttacgac 180

aaccctgctg attggaccca cattgcagag gccgacatcc cttcagacgc ctaccgactt 240

gcatttgccc agatccgtgt cagtgatgtt cagggcggag aggcccccac catccctggc 300

gccgtggccg tgtctgatct cgaccacaga atcgtcatgg actacaaaca gtgggccccc 360

tggaccgcca gcaacgagca gatcgcctcg gagaaccaca tctggaagca ctccttcaag 420

gaccacgtgg ccttcagctg gatcaagtgg ttccgatggg cctacctgcg tttgtccact 480

ctcatccagg gggcagacaa cttcgacatt gccgtggtcg cccttggcta tcttgccatg 540

cactacacct tcttcagtct cttccgatcc atgcgaaagg ttggctcgca cttttggctt 600

gcctccatgg ctctggtctc ttccaccttc gctttcctgc ttgcggtggt ggcttcctct 660

agcctgggtt accgacctag catgatcacc atgtccgagg gcctgccctt cctcgtggtc 720

gccattggct ttgaccgaaa ggtcaacctg gctagcgagg tgctcacatc caagagcagc 780

cagctcgctc ccatggtgca ggtgatcaca aagatcgcct ccaaggcgct gtttgagtac 840

agccttgagg tggccgccct gtttgctggc gcctataccg gagttcctcg actgtcccag 900

ttttgcttct tatctgcttg gatcctcatc ttcgactaca tgtttttgct gaccttctac 960

tctgctgtcc ttgctatcaa gtttgagatc aatcacatta agcgaaaccg aatgatccag 1020

gatgctctca aggaggatgg tgtatctgct gctgttgccg agaaggtagc cgactcttct 1080

cccgacgcca agctcgaccg aaagtccgac gtttctcttt ttggagcctc tggcgccatt 1140

gcggtgttca agatcttcat ggtccttggg ttccttggtc tcaacctcat caacctgact 1200

gccatccctc accttggcaa ggcggccgcc gctgcccagt ctgtgactcc catcaccctc 1260

tcccccgagc ttctccatgc catccccgcc tctgtgcccg ttgttgtcac ctttgtgccc 1320

agcgttgtgt acgagcactc ccagctcatt ctgcagctgg aggacgccct cactaccttc 1380

ctggctgcct gctccaaaac tattggtgac cccgtcatct ccaagtacat cttcctgtgc 1440

ctgatggtct ccaccgccct gaacgtctac ctgtttggag ccacccgaga agttgtgcga 1500

acccagtctg tgaaggtggt tgagaagcac gttcctatcg tcattgagaa gcccagcgag 1560

aaggaggagg acacctcttc tgaagactcc attgagctga ctgtcggaaa gcagcccaag 1620

cccgtgaccg agacccgttc tctggacgac ctagaggcta tcatgaaggc aggtaagacc 1680

aagcttctgg aggaccacga ggttgtcaag ctctctctcg agggcaagct tcctttgtat 1740

gctcttgaga agcagcttgg tgacaacacc cgagctgttg gcatccgacg atctatcatc 1800

tcccagcagt ctaataccaa gactttagag acctcaaagc ttccttacct gcactacgac 1860

tacgaccgtg tttttggagc ctgttgcgag aacgttattg gttacatgcc tctccccgtt 1920

ggtgttgctg gccccatgaa cattgatggc aagaactacc acattcctat ggccaccact 1980

gagggttgtc ttgttgcctc aaccatgcga ggttgcaagg ccatcaacgc cggtggcggt 2040

gttaccactg tgcttactca ggacggtatg acacgaggtc cttgtgtttc cttcccctct 2100

ctcaagcggg ctggagccgc taagatctgg cttgattccg aggagggtct caagtccatg 2160

cgaaaggcct tcaactccac ctctcgattt gctcgtctcc agtctcttca ctctaccctt 2220

gctggtaacc tgctgtttat tcgattccga accaccactg gtgatgccat gggcatgaac 2280

atgatctcca agggcgtcga acactctctg gccgtcatgg tcaaggagta cggcttccct 2340

gatatggaca ttgtgtctgt ctcgggtaac tactgcactg acaagaagcc cgcagcgatc 2400

aactggatcg aaggccgagg caagagtgtt gttgccgaag ccaccatccc tgctcacatt 2460

gtcaagtctg ttctcaaaag tgaggttgac gctcttgttg agctcaacat cagcaagaat 2520

ctgatcggta gtgccatggc tggctctgtg ggaggtttca atgcacacgc cgcaaacctg 2580

gtgaccgcca tctaccttgc cactggccag gatcctgctc agaatgtcga gtcttccaac 2640

tgcatcacgc tgatgagcaa cgtcgacggt aacctgctca tctccgtttc catgccttct 2700

atcgaggtcg gtaccattgg tggaggtact attttggagc cccagggggc tatgctggag 2760

atgcttggcg tgcgaggtcc tcacatcgag acccccggtg ccaacgccca acagcttgct 2820

cgcatcattg cttctggagt tcttgcagcg gagctttcgc tgtgttctgc tcttgctgcc 2880

ggccatcttg tgcaaagtca tatgacccac aaccggtccc aggctcctac tccggccaag 2940

cagtctcagg ccgatctgca gcgtctacaa aacggttcga atatttgcat acggtcatag 3000

<210> 5

<211> 4024

<212> DNA

<213> 解脂耶氏酵母 Po1g Δku70()

<400> 5

aggccgttga gcaccgccgc cgcaaggaat ggtgcatgct gaggtgtctc acaagtgccg 60

tgcagtcccg cccccacttg cttctctttg tgtgtagtgt acgtacatta tcgagaccgt 120

tgttcccgcc cacctcgatc cggcatgctg aggtgtctca caagtgccgt gcagtcccgc 180

ccccacttgc ttctctttgt gtgtagtgta cgtacattat cgagaccgtt gttcccgccc 240

acctcgatcc ggcatgctga ggtgtctcac aagtgccgtg cagtcccgcc cccacttgct 300

tctctttgtg tgtagtgtac gtacattatc gagaccgttg ttcccgccca cctcgatccg 360

gcatgctgag gtgtctcaca agtgccgtgc agtcccgccc ccacttgctt ctctttgtgt 420

gtagtgtacg tacattatcg agaccgttgt tcccgcccac ctcgatccgg catgcactga 480

tcacgggcaa aagtgcgtat atatacaaga gcgtttgcca gccacagatt ttcactccac 540

acaccacatc acacatacaa ccacacacat ccacaatgct acaagcagct attggaaaga 600

ttgtgggatt tgcggtcaac cgacccatcc acacagttgt cctgacgtcc atcgtggcgt 660

caaccgcata cctcgccatc ctcgacattg ccatcccggg tttcgagggc acacaaccca 720

tctcatacta ccaccctgca gcaaaatctt acgacaaccc tgctgattgg acccacattg 780

cagaggccga catcccttca gacgcctacc gacttgcatt tgcccagatc cgtgtcagtg 840

atgttcaggg cggagaggcc cccaccatcc ctggcgccgt ggccgtgtct gatctcgacc 900

acagaatcgt catggactac aaacagtggg ccccctggac cgccagcaac gagcagatcg 960

cctcggagaa ccacatctgg aagcactcct tcaaggacca cgtggccttc agctggatca 1020

agtggttccg atgggcctac ctgcgtttgt ccactctcat ccagggggca gacaacttcg 1080

acattgccgt ggtcgccctt ggctatcttg ccatgcacta caccttcttc agtctcttcc 1140

gatccatgcg aaaggttggc tcgcactttt ggcttgcctc catggctctg gtctcttcca 1200

ccttcgcttt cctgcttgcg gtggtggctt cctctagcct gggttaccga cctagcatga 1260

tcaccatgtc cgagggcctg cccttcctcg tggtcgccat tggctttgac cgaaaggtca 1320

acctggctag cgaggtgctc acatccaaga gcagccagct cgctcccatg gtgcaggtga 1380

tcacaaagat cgcctccaag gcgctgtttg agtacagcct tgaggtggcc gccctgtttg 1440

ctggcgccta taccggagtt cctcgactgt cccagttttg cttcttatct gcttggatcc 1500

tcatcttcga ctacatgttt ttgctgacct tctactctgc tgtccttgct atcaagtttg 1560

agatcaatca cattaagcga aaccgaatga tccaggatgc tctcaaggag gatggtgtat 1620

ctgctgctgt tgccgagaag gtagccgact cttctcccga cgccaagctc gaccgaaagt 1680

ccgacgtttc tctttttgga gcctctggcg ccattgcggt gttcaagatc ttcatggtcc 1740

ttgggttcct tggtctcaac ctcatcaacc tgactgccat ccctcacctt ggcaaggcgg 1800

ccgccgctgc ccagtctgtg actcccatca ccctctcccc cgagcttctc catgccatcc 1860

ccgcctctgt gcccgttgtt gtcacctttg tgcccagcgt tgtgtacgag cactcccagc 1920

tcattctgca gctggaggac gccctcacta ccttcctggc tgcctgctcc aaaactattg 1980

gtgaccccgt catctccaag tacatcttcc tgtgcctgat ggtctccacc gccctgaacg 2040

tctacctgtt tggagccacc cgagaagttg tgcgaaccca gtctgtgaag gtggttgaga 2100

agcacgttcc tatcgtcatt gagaagccca gcgagaagga ggaggacacc tcttctgaag 2160

actccattga gctgactgtc ggaaagcagc ccaagcccgt gaccgagacc cgttctctgg 2220

acgacctaga ggctatcatg aaggcaggta agaccaagct tctggaggac cacgaggttg 2280

tcaagctctc tctcgagggc aagcttcctt tgtatgctct tgagaagcag cttggtgaca 2340

acacccgagc tgttggcatc cgacgatcta tcatctccca gcagtctaat accaagactt 2400

tagagacctc aaagcttcct tacctgcact acgactacga ccgtgttttt ggagcctgtt 2460

gcgagaacgt tattggttac atgcctctcc ccgttggtgt tgctggcccc atgaacattg 2520

atggcaagaa ctaccacatt cctatggcca ccactgaggg ttgtcttgtt gcctcaacca 2580

tgcgaggttg caaggccatc aacgccggtg gcggtgttac cactgtgctt actcaggacg 2640

gtatgacacg aggtccttgt gtttccttcc cctctctcaa gcgggctgga gccgctaaga 2700

tctggcttga ttccgaggag ggtctcaagt ccatgcgaaa ggccttcaac tccacctctc 2760

gatttgctcg tctccagtct cttcactcta cccttgctgg taacctgctg tttattcgat 2820

tccgaaccac cactggtgat gccatgggca tgaacatgat ctccaagggc gtcgaacact 2880

ctctggccgt catggtcaag gagtacggct tccctgatat ggacattgtg tctgtctcgg 2940

gtaactactg cactgacaag aagcccgcag cgatcaactg gatcgaaggc cgaggcaaga 3000

gtgttgttgc cgaagccacc atccctgctc acattgtcaa gtctgttctc aaaagtgagg 3060

ttgacgctct tgttgagctc aacatcagca agaatctgat cggtagtgcc atggctggct 3120

ctgtgggagg tttcaatgca cacgccgcaa acctggtgac cgccatctac cttgccactg 3180

gccaggatcc tgctcagaat gtcgagtctt ccaactgcat cacgctgatg agcaacgtcg 3240

acggtaacct gctcatctcc gtttccatgc cttctatcga ggtcggtacc attggtggag 3300

gtactatttt ggagccccag ggggctatgc tggagatgct tggcgtgcga ggtcctcaca 3360

tcgagacccc cggtgccaac gcccaacagc ttgctcgcat cattgcttct ggagttcttg 3420

cagcggagct ttcgctgtgt tctgctcttg ctgccggcca tcttgtgcaa agtcatatga 3480

cccacaaccg gtcccaggct cctactccgg ccaagcagtc tcaggccgat ctgcagcgtc 3540

tacaaaacgg ttcgaatatt tgcatacggt catagggtac ctccatggcc tgtccccacg 3600

ttgccggtct tgcctcctac tacctgtcca tcaatgacga ggttctcacc cctgcccagg 3660

tcgaggctct tattactgag tccaacaccg gtgttcttcc caccaccaac ctcaagggct 3720

ctcccaacgc tgttgcctac aacggtgttg gcatttaggc aattaacaga tagtttgccg 3780

gtgataattc tcttaacctc ccacactcct ttgacataac gatttatgta acgaaactga 3840

aatttgacca gatattgttg taaatagaaa atctggcttg taggtggcaa aatgcggcgt 3900

ctttgttcat caattccctc tgtgactact cgtcatccct ttatgttcga ctgtcgtatt 3960

tcttattttc catacatatg caagtgagat gcccgtgtcc gaattctcat gtttgacagc 4020

ttat 4024

<210> 6

<211> 4366

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

aatcgccgtg acgatcagcg gtccagtgat cgaagttagg ctggtaagag ccgcgagcga 60

tccttgaagc tgtccctgat ggtcgtcatc tacctgcctg gacagcatgg cctgcaacgc 120

gggcatcccg atgccgccgg aagcgagaag aatcataatg gggaaggcca tccagcctcg 180

cgtcggttaa ctatcctagg aggccgttga gcaccgccgc cgcaaggaat ggtgcatgct 240

gaggtgtctc acaagtgccg tgcagtcccg cccccacttg cttctctttg tgtgtagtgt 300

acgtacatta tcgagaccgt tgttcccgcc cacctcgatc cggcatgctg aggtgtctca 360

caagtgccgt gcagtcccgc ccccacttgc ttctctttgt gtgtagtgta cgtacattat 420

cgagaccgtt gttcccgccc acctcgatcc ggcatgctga ggtgtctcac aagtgccgtg 480

cagtcccgcc cccacttgct tctctttgtg tgtagtgtac gtacattatc gagaccgttg 540

ttcccgccca cctcgatccg gcatgctgag gtgtctcaca agtgccgtgc agtcccgccc 600

ccacttgctt ctctttgtgt gtagtgtacg tacattatcg agaccgttgt tcccgcccac 660

ctcgatccgg catgcactga tcacgggcaa aagtgcgtat atatacaaga gcgtttgcca 720

gccacagatt ttcactccac acaccacatc acacatacaa ccacacacat ccacaatgct 780

acaagcagct attggaaaga ttgtgggatt tgcggtcaac cgacccatcc acacagttgt 840

cctgacgtcc atcgtggcgt caaccgcata cctcgccatc ctcgacattg ccatcccggg 900

tttcgagggc acacaaccca tctcatacta ccaccctgca gcaaaatctt acgacaaccc 960

tgctgattgg acccacattg cagaggccga catcccttca gacgcctacc gacttgcatt 1020

tgcccagatc cgtgtcagtg atgttcaggg cggagaggcc cccaccatcc ctggcgccgt 1080

ggccgtgtct gatctcgacc acagaatcgt catggactac aaacagtggg ccccctggac 1140

cgccagcaac gagcagatcg cctcggagaa ccacatctgg aagcactcct tcaaggacca 1200

cgtggccttc agctggatca agtggttccg atgggcctac ctgcgtttgt ccactctcat 1260

ccagggggca gacaacttcg acattgccgt ggtcgccctt ggctatcttg ccatgcacta 1320

caccttcttc agtctcttcc gatccatgcg aaaggttggc tcgcactttt ggcttgcctc 1380

catggctctg gtctcttcca ccttcgcttt cctgcttgcg gtggtggctt cctctagcct 1440

gggttaccga cctagcatga tcaccatgtc cgagggcctg cccttcctcg tggtcgccat 1500

tggctttgac cgaaaggtca acctggctag cgaggtgctc acatccaaga gcagccagct 1560

cgctcccatg gtgcaggtga tcacaaagat cgcctccaag gcgctgtttg agtacagcct 1620

tgaggtggcc gccctgtttg ctggcgccta taccggagtt cctcgactgt cccagttttg 1680

cttcttatct gcttggatcc tcatcttcga ctacatgttt ttgctgacct tctactctgc 1740

tgtccttgct atcaagtttg agatcaatca cattaagcga aaccgaatga tccaggatgc 1800

tctcaaggag gatggtgtat ctgctgctgt tgccgagaag gtagccgact cttctcccga 1860

cgccaagctc gaccgaaagt ccgacgtttc tctttttgga gcctctggcg ccattgcggt 1920

gttcaagatc ttcatggtcc ttgggttcct tggtctcaac ctcatcaacc tgactgccat 1980

ccctcacctt ggcaaggcgg ccgccgctgc ccagtctgtg actcccatca ccctctcccc 2040

cgagcttctc catgccatcc ccgcctctgt gcccgttgtt gtcacctttg tgcccagcgt 2100

tgtgtacgag cactcccagc tcattctgca gctggaggac gccctcacta ccttcctggc 2160

tgcctgctcc aaaactattg gtgaccccgt catctccaag tacatcttcc tgtgcctgat 2220

ggtctccacc gccctgaacg tctacctgtt tggagccacc cgagaagttg tgcgaaccca 2280

gtctgtgaag gtggttgaga agcacgttcc tatcgtcatt gagaagccca gcgagaagga 2340

ggaggacacc tcttctgaag actccattga gctgactgtc ggaaagcagc ccaagcccgt 2400

gaccgagacc cgttctctgg acgacctaga ggctatcatg aaggcaggta agaccaagct 2460

tctggaggac cacgaggttg tcaagctctc tctcgagggc aagcttcctt tgtatgctct 2520

tgagaagcag cttggtgaca acacccgagc tgttggcatc cgacgatcta tcatctccca 2580

gcagtctaat accaagactt tagagacctc aaagcttcct tacctgcact acgactacga 2640

ccgtgttttt ggagcctgtt gcgagaacgt tattggttac atgcctctcc ccgttggtgt 2700

tgctggcccc atgaacattg atggcaagaa ctaccacatt cctatggcca ccactgaggg 2760

ttgtcttgtt gcctcaacca tgcgaggttg caaggccatc aacgccggtg gcggtgttac 2820

cactgtgctt actcaggacg gtatgacacg aggtccttgt gtttccttcc cctctctcaa 2880

gcgggctgga gccgctaaga tctggcttga ttccgaggag ggtctcaagt ccatgcgaaa 2940

ggccttcaac tccacctctc gatttgctcg tctccagtct cttcactcta cccttgctgg 3000

taacctgctg tttattcgat tccgaaccac cactggtgat gccatgggca tgaacatgat 3060

ctccaagggc gtcgaacact ctctggccgt catggtcaag gagtacggct tccctgatat 3120

ggacattgtg tctgtctcgg gtaactactg cactgacaag aagcccgcag cgatcaactg 3180

gatcgaaggc cgaggcaaga gtgttgttgc cgaagccacc atccctgctc acattgtcaa 3240

gtctgttctc aaaagtgagg ttgacgctct tgttgagctc aacatcagca agaatctgat 3300

cggtagtgcc atggctggct ctgtgggagg tttcaatgca cacgccgcaa acctggtgac 3360

cgccatctac cttgccactg gccaggatcc tgctcagaat gtcgagtctt ccaactgcat 3420

cacgctgatg agcaacgtcg acggtaacct gctcatctcc gtttccatgc cttctatcga 3480

ggtcggtacc attggtggag gtactatttt ggagccccag ggggctatgc tggagatgct 3540

tggcgtgcga ggtcctcaca tcgagacccc cggtgccaac gcccaacagc ttgctcgcat 3600

cattgcttct ggagttcttg cagcggagct ttcgctgtgt tctgctcttg ctgccggcca 3660

tcttgtgcaa agtcatatga cccacaaccg gtcccaggct cctactccgg ccaagcagtc 3720

tcaggccgat ctgcagcgtc tacaaaacgg ttcgaatatt tgcatacggt catagggtac 3780

ctccatggcc tgtccccacg ttgccggtct tgcctcctac tacctgtcca tcaatgacga 3840

ggttctcacc cctgcccagg tcgaggctct tattactgag tccaacaccg gtgttcttcc 3900

caccaccaac ctcaagggct ctcccaacgc tgttgcctac aacggtgttg gcatttaggc 3960

aattaacaga tagtttgccg gtgataattc tcttaacctc ccacactcct ttgacataac 4020

gatttatgta acgaaactga aatttgacca gatattgttg taaatagaaa atctggcttg 4080

taggtggcaa aatgcggcgt ctttgttcat caattccctc tgtgactact cgtcatccct 4140

ttatgttcga ctgtcgtatt tcttattttc catacatatg caagtgagat gcccgtgtcc 4200

gaattctcat gtttgacagc ttatcgaacg ccagcaagac gtagcccagc gcgtcggccg 4260

ccatgccggc gataatggcc tgcttctcgc cgaaacgttt ggtggcggga ccagtgacga 4320

aggcttgagc gagggcgtgc aagattccga ataccgcaag cgacag 4366

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

cctcgatccg gcatgcactg atcacg 26

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

taggcaacag cgttgggaga gcccttgagg 30

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

acaaccacac acatccacaa tggccggtgt ctctgcc 37

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

gggacaggcc atggaggtac cttagtggtg atggtggtgg tgg 43

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

acaaccacac acatccacaa tggaactcgt tgatactccc tc 42

<210> 12

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

gggacaggcc atggaggtac cttagtgatg atgatggtgg tgg 43

<210> 13

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

acaaccacac acatccacaa tgtctatctc ctcttccccc tc 42

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

gggacaggcc atggaggtac cttagtggtg atggtggtgg tgc 43

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

aatcgccgtg acgatcagc 19

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

ctgtcgcttg cggtattcgg 20

<210> 17

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

ccatccagcc tcgcgtcggt taactatcct aggaggccgt tgagcac 47

<210> 18

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

acgtcttgct ggcgttcgat aagctgtcaa acatgagaat tcg 43

Claims (10)

1.一种解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌以解脂耶氏酵母为出发菌株，通过导入红没药烯合酶基因并且过表达甲羟戊二酸单酰辅酶A还原酶基因HMGR所得；所述红没药烯合酶基因为α-红没药烯合酶基因、β-红没药烯合酶基因或γ-红没药烯合酶基因其中的一种。

2.如权利要求1所述一种解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于：所述α-红没药烯合酶基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；所述β-红没药烯合酶基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；所述γ-红没药烯合酶基因的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：3所示；所述HMGR基因的表达是通过构建核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：5的HMGR表达盒实现。

3.如权利要求1所述一种解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于：所述解脂耶氏酵母出发菌株为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Po1gΔku70。

4.一种重组载体，其特征在于：所述重组载体包含α-红没药烯合酶基因、β-红没药烯合酶基因或γ-红没药烯合酶基因其中的一种以及HMGR基因。

5.权利要求1-3任一所述解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)将HMGR基因和红没药烯合酶基因插入质粒中，得到重组质粒；

(2)将所述重组质粒线性化后导入所述出发菌株中，重组后得到所述基因工程菌。

6.如权利要求5所述解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

1)将α-红没药烯合酶基因、β-红没药烯合酶基因和γ-红没药烯合酶基因基因分别插入到质粒pYLEX1的多克隆位点上，分别得到重组质粒pYLEX1-α、pYLEX1-β和pYLEX1-γ；

2)构建核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：5的HMGR表达盒，将所述HMGR表达盒分别克隆到质粒pYLEX1-α、pYLEX1-β、pYLEX1-γ上，分别得到重组质粒pYLEX1-α-HR、pYLEX1-β-HR、pYLEX1-γ-HR；

3)将所述重组质粒pYLEX1-α-HR、pYLEX1-β-HR、pYLEX1-γ-HR线性化，并分别转化入出发菌株中，经过筛选得到阳性转化子。

7.权利要求1-3任一所述解脂耶氏酵母基因工程菌在发酵制备红没药烯中的用途。

8.如权利要求7所述解脂耶氏酵母基因工程菌在发酵合成红没药烯中的用途，其特征在于：所述红没药烯为α-红没药烯、β-红没药烯或γ-红没药烯其中的一种。

9.如权利要求7所述解脂耶氏酵母基因工程菌在发酵合成红没药烯中的用途，其特征在于：

将所述基因工程菌经两次活化后按照接种量0.5-1.5％接种于培养基中，加入10-12％的十二烷作为萃取剂，于20-28℃，230-250r/min，摇瓶发酵4.5-5.5天。

10.如权利要求9所述解脂耶氏酵母基因工程菌在发酵合成红没药烯中的用途，其特征在于：

所述培养基组成为：蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，葡萄糖20g/L，余量为水，pH5.7-5.8，115℃，灭菌20min；

或者所述培养基组成为：蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，葡萄糖20g/L，硫酸镁2g/L，余量为水，pH5.7-5.8，115℃，灭菌20min；

或者所述培养基组成为：蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，餐厨废油11-12mL/L，硫酸镁2g/L，余量为水，pH5.7-5.8，115℃，灭菌20min；所述餐厨废油中含有C18的脂肪酸的总量为70-80g/100g。

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