CN114806911A - 一种利用解脂耶氏酵母线粒体途径定位合成α-红没药烯的方法 - Google Patents

一种利用解脂耶氏酵母线粒体途径定位合成α-红没药烯的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用解脂耶氏酵母线粒体途径定位合成α‑红没药烯的方法，属于分子生物学技术领域。本发明首次在严格好氧微生物解脂耶氏酵母中将甲羟戊酸合成途径过表达并定位至线粒体合成α‑红没药烯。本发明的工程菌株能够利用含葡萄糖的培养基高效合成α‑红没药烯，产量高达208.23mg/L。通过甲羟戊酸合成途径的线粒体定位并利用含葡萄糖的培养基合成甲羟戊酸及下游萜类化合物，使得解脂耶氏酵母合成甲羟戊酸及下游萜类化合物的产率大幅提高。

Description

一种利用解脂耶氏酵母线粒体途径定位合成α-红没药烯的 方法
技术领域：
本发明涉及一种利用解脂耶氏酵母线粒体途径定位合成α-红没药烯的方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术：
红没药烯(bisabolene)，化学式为C15H24，研究者根据双键所在的位置将其分为三种同分异构体：α-红没药烯、β-红没药烯、γ-红没药烯。红没药烯是一种从植物体内分离出来的次生代谢产物，由异戊二烯骨架结构单位(异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP))组成，按照分子结构中异戊二烯单元的数量和成环的数量被归纳到单环倍半萜一类当中，具有多种生物学功能，在食品、化妆品生产以及医药、化工等方面有着巨大的实际使用价值，市场需求日益增长。
解脂耶氏酵母是一种非常规的产油酵母，与传统的酿酒酵母相比，解脂耶氏酵母含有大量合成红没药烯时所必需的重要前体物质--乙酰辅酶A。在细胞质中，乙酰辅酶A是在丙酮酸氧化酶(PDC)酶系的作用下合成的，而在线粒体中，乙酰辅酶A是由丙酮酸脱氢酶(PDH)酶系催化丙酮酸而来的。从代谢通量角度来看，解脂耶氏酵母中有80％以上的糖酵解代谢流通向了TCA循环，使得线粒体成为合成乙酰辅酶A的主要场所，因此线粒体中的乙酰辅酶A含量远远高于细胞质。在酵母细胞进化过程中，细胞器逐渐地从细胞质中分离出来，成为一个个具有特殊功能的独立空间。其中，线粒体就是典型的代表，线粒体被称为细胞的动力车间，除了含有大量的乙酰辅酶A资源，线粒体中还有丰富的NADPH和ATP资源，这种独特的物理化学环境非常适合合成萜烯类的甲羟戊酸路径。在这种情况下，将α-红没药烯的合成路径定位于线粒体中就可以大大提高其反应速率，增加产物得率。
目前，有关将甲羟戊酸合成途径的合酶过表达并定位至解脂耶氏酵母线粒体，再表达植物来源的α-红没药烯合酶，利用线粒体中的乙酰辅酶A合成α-红没药烯，即利用解脂耶氏酵母途径定位至线粒体合成α-红没药烯的方法目前还未见报道。
发明内容：
针对解脂耶氏酵母利用细胞质中的乙酰辅酶A生产甲羟戊酸及下游萜类化合物过程中存在的产率低的缺陷，本发明提供了一种利用解脂耶氏酵母线粒体途径定位合成α-红没药烯的方法。
本发明提供的技术方案之一，是一株利用解脂耶氏酵母途径定位合成α-红没药烯的工程菌Po1g MαBS，所述Po1g MαBS是在解脂耶氏酵母宿主菌中表达乙酰辅酶A硫解酶(acetoacetyl-CoA thiolase，AACT)、羟甲基戊二酰乙酰辅酶A合酶(hydroxymethylglutaryl-CoA synthase，HMGS)、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(hydroxymethylglutaryl-CoA reductase，HMGR)、甲羟戊酸激酶(mevalonate kinase，MK)，磷酸甲羟戊酸激酶(phosphomevalonate kinase，PMK)、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(diphosphomevalonate decarboxylase，PDO)、异戊烯基二磷酸异构酶(isopentenyl-diphosphate delta-isomerase，IDI)、法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphatesynthase，FPPS)和外源α-红没药烯合酶(α-Bisabolene synthase，αBS)，并将上述酶定位至线粒体(图1)；
进一步地，通过线粒体定位信号(Mitochondrial location signal,MLS)将上述蛋白酶定位至线粒体进行表达，所述MLS是在目的蛋白上添加的具有将蛋白质定位至线粒体内功能的线粒体定位信号，所述线粒体定位信号MLS是连接至蛋白质氨基端的26个氨基酸，氨基酸序列为：MLSLRQSIRFFKPATRTLCSSRYLLQ，其中，前25个氨基酸为细胞色素C氧化酶IV亚基的前导肽序列，第25、26位氨基酸为蛋白酶识别位点LQ，DNA序列：ATGCTTTCACTACGTCAATCTATAAGATTTTTCAAGCCAGCCACAAGAACTTTGTGTAGCTCTAGATATCTGCTTCAG(SEQ IDNO.13)。
所述解脂耶氏酵母宿主菌为解脂耶氏酵母Po1gΔKU70菌株；
获得的解脂耶氏酵母工程菌株Po1g MαBS能够利用YPD培养基在好氧条件下合成α-红没药烯；为进一步开发解脂耶氏酵母作为线粒体亚细胞工厂的潜力，在工程菌株Po1gMαBS的基础上，进一步地对其进行改造。
本发明提供的技术方案之二，是在解脂耶氏酵母工程菌株Po1g MαBS的基础上，表达添加了线粒体定位信号的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(hydroxymethylglutaryl-CoAreductase，HMGR)，增强线粒体内α-红没药烯合成路径代谢流，构建HMGR双拷贝线粒体工程菌株Po1g MαBS-MHMGR(图2)。
本发明提供的技术方案之三，是在解脂耶氏酵母工程菌株Po1g MαBS的基础上，表达线粒体丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase，PDA1)，增强线粒体内前体物乙酰辅酶A的供应，构建线粒体工程菌株Po1g MαBS-PDA1(图3)。
本发明提供的技术方案之四，是在解脂耶氏酵母工程菌株Po1g MαBS的基础上，表达线粒体动态调控蛋白(mitochondrial genome maintenance 1，MGM1)，使线粒体保持稳定的融合状态，构建线粒体工程菌株Po1g MαBS-MGM1(图4)。
本发明提供的技术方案之五，是在解脂耶氏酵母工程菌株Po1g MαBS的基础上，表达ATP依赖型转运蛋白ABC-G1，促进细胞外排α-红没药烯，缓解α-红没药烯对细胞的毒害性，构建线粒体工程菌株Po1g MαBS-ABC-G1(图5)。
进一步地，所述AACT为来源于解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)乙酰乙酰辅酶A硫解酶，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
进一步地，所述HMGS为来源于解脂耶氏酵母的HMG-CoA合成酶，核苷酸序列如SEQID NO.2所示；
进一步地，所述HMGR为来源于解脂耶氏酵母的HMG-CoA还原酶，核苷酸序列如SEQID NO.3所示；
进一步地，所述MK为来源于解脂耶氏酵母的甲羟戊酸激酶，核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；
进一步地，所述PMK为来源于解脂耶氏酵母的磷酸甲羟戊酸激酶，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
进一步地，所述PDO为来源于解脂耶氏酵母的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
进一步地，所述IDI为来源于解脂耶氏酵母的异戊烯基二磷酸异构酶，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
进一步地，所述FPPS为来源于解脂耶氏酵母的法尼基焦磷酸合酶，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
进一步地，所述α-BS为来源于北美冷杉的α-红没药烯合成酶，核苷酸序列如SEQID NO.9所示；
进一步地，所述PDA1为来源于解脂耶氏酵母的丙酮酸脱氢酶，核苷酸序列如SEQID NO.10所示；
进一步地，所述MGM1为来源于解脂耶氏酵母的线粒体动态调控蛋白，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
进一步地，所述ABC-G1(GenBank登录号：XM_014320122.1)为来自罗汉果(Grosmania clavigera)的ATP依赖型转运蛋白，核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
本发明提供的技术方案之六，是上述解脂耶氏酵母工程菌株Po1g MαBS、Po1g MαBS-MHMGR、Po1g MαBS-PDA1、Po1g MαBS-MGM1、Po1gMαBS-ABC-G1的应用，特别是在发酵生产α-红没药烯的中的应用；
进一步地，利用YPD培养基在好氧条件下合α-红没药烯的方法是：
按照发酵初始OD600＝0.1的接种量将解脂耶氏酵母工程菌株Po1g MαBS、Po1g MαBS-MHMGR、Po1g MαBS-PDA1、Po1g MαBS-MGM1或Po1gMαBS-ABC-G1分别接种于YPD培养基中，培养温度为20-30℃，转速220-250rpm，培养时间为120±5h；
所述YPD培养基组成为：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量为水，pH5.7-5.8，115℃，灭菌20min。
发酵120h后取样，检测红没药烯的含量，Po1g MαBS、Po1g MαBS-MHMGR、Po1g MαBS-PDA1、Po1g MαBS-MGM1、Po1g MαBS-ABC-G1菌株发酵液中α-红没药烯含量分别达到122.25mg/L、189.07mg/L、170.49mg/L、208.23mg/L、179.87mg/L。
有益效果：
本发明公开了一种利用解脂耶氏酵母途径定位合成α-红没药烯的方法，首次在严格好氧微生物解脂耶氏酵母中将甲羟戊酸合成途径过表达并定位至线粒体合成α-红没药烯。本发明的工程菌株Po1g MαBS能够利用含葡萄糖的培养基高效合成α-红没药烯。通过甲羟戊酸合成途径的线粒体定位并利用含葡萄糖的培养基合成甲羟戊酸及下游萜类化合物，使得解脂耶氏酵母合成甲羟戊酸及下游萜类化合物的产率大幅提高。
实验证实：工程菌株Po1g MαBS、Po1g MαBS-MHMGR、Po1g MαBS-PDA1、Po1g MαBS-MGM1或Po1g MαBS-ABC-G1利用葡萄糖摇瓶发酵120h合成红没药烯的产量分别可达122.25mg/L、189.07mg/L、170.49mg/L、208.23mg/L、179.87mg/L，而在胞质中合成α-红没药烯的对照工程菌株Po1g KαBS利用葡萄糖生产α-红没药烯的产量仅为0.4mg/L。
为进一步提高α-红没药烯的产量，挖掘解脂耶氏酵母线粒体作为亚细胞工厂合成α-红没药烯的潜能，本申请探究了不同代谢策略对线粒体合成α-红没药烯的影响。如，为提高线粒体中丙酮酸和乙酰辅酶A之间的转化效率，过表达丙酮酸脱氢酶PDA1；为充分利用细胞质和线粒体两个亚细胞区域中存在的代谢物资源，过表达双拷贝线粒体MVA路径限速酶HMGR；从调整线粒体的数量、形态和生理状态入手，过表达线粒体动态调控蛋白MGM1；为促进α-红没药烯外排效率，引入红没药烯转运蛋白ABC-G1。线粒体工程菌株Po1g MαBS-MHMGR、Po1g MαBS-PDA1、Po1g MαBS-MGM1、Po1g MαBS-ABC-G1合成α-红没药烯的产量分别为189.07mg/L、170.49mg/L、208.23mg/L、179.87mg/L。上述结果表明，在表达了丙酮酸脱氢酶蛋白基因、线粒体动态调控基因、红没药烯转运蛋白基因、MVA路径限速酶基因的解脂耶氏酵母工程菌株中均能够不同程度的提高α-红没药烯的产量。
本发明通过甲羟戊酸合成途径的线粒体定位提高了萜类化合物合成的产量，利用微生物合成法来生产甲羟戊酸下游萜类化合物，极大地提高了所述菌株的应用附加值，有利用解决植物提取法和化学合成法所带来的环境污染、效率低下、反应过程繁琐等问题，具有可观的应用前景和经济价值。
附图说明：
图1代谢线路图；
图2代谢线路图-Po1g MαBS-MHMGR；
图3 PDA1作用示意图；
图4 MGM1作用示意图；
图5 ABC-G1作用示意图；
图6 PCR验证图；
其中，泳道1-6分别为Po1g KαBS、Po1g MMVA、Po1g MMVA-MHMGR、Po1g MMVA-PDA1、Po1g MMVA-MGM1、Po1g MMVA-ABC-G1；
图7 PCR验证图；
其中，泳道1-5分别为Po1g MαBS、Po1g MαBS-MHMGR、Po1g MαBS-PDA1、Po1g MαBS-MGM1、Po1g MαBS-ABC-G1；
图8实施例3产量图。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例仅为本发明中的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他实施例，都属于本发明保护范围之内。
本发明所使用的解脂耶氏酵母Po1gΔKU70(基因型MATA,xpr2-332,leu2-270,ku70-,ura3-302::URA3,Axp-2)为现有技术，是在解脂耶氏酵母Po1g菌株中敲除KU70基因获得的，其构建方法参考文献Genetic engineering of an unconventional yeast forrenewable biofuel and biochemical production.Journal of VisualizedExperiments,2016,115,e54371。所述解脂耶氏酵母Po1g菌株购买自中国台湾的YeasternBiotech Co.公司。
本发明涉及携带筛选标记的过表达载体pYLEX1和pYLEX1(hyg)。表达载体pYLEX1(hyg)是基于表达载体pYLEX1的基础上整合潮霉素(hygromycin)表达盒构建出来的。
所述pYLEX1质粒，购自Yeastern Biotech Co.,Ltd.。所述质粒带有营养缺陷筛选基因亮氨酸表达盒、标记基因Amp、强启动子hp4d以及终止子XPR2 term。
本发明涉及的培养基如下：
YPD固体培养基配方：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，余量为水。
YPD培养基组成为：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量为水，pH 5.7-5.8，115℃，灭菌20min。
YNB固体筛选培养基配方：YNB(Yeast Nitrogen Base)6.7g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，余量为水。
YPD-hyg固体培养基配方：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，潮霉素0.5g/L，琼脂粉20g/L，余量为水。
以下通过具体实施例对本发明作进一步地解释说明。
实施例1构建在线粒体中定位表达部分甲羟戊酸合成途径的解脂耶氏酵母工程菌株Po1g MMVA
1.1构建表达载体
(1)来自北美冷杉的α-红没药烯合酶基因(GenBank登录号：AF006195.1)根据解脂耶氏酵母密码子使用偏好性进行密码子优化并在基因3′端加入His标签，之后进行基因合成，以交由金唯智公司合成的基因质粒pYLEX1-α-bisabolene为模板，通过引物PCR的方式在α-红没药烯合成酶的起始密码子前添加线粒体定位信号MLS(蛋白质氨基端的MLSLRQSIRFFKPATRTLCSSRYLLQ26个氨基酸序列)序列，获得MLS-α-bisabolene片段；
同样地，根据Genbank中解脂耶氏酵母的基因组序列，分别在来自解脂耶氏酵母的AACT基因(YALI0B08536g)、HMGS基因(YALI0F30481g)、HMGR基因(YALI0E04807g)、MK基因(YALI0B16038g)、IDI基因(YALI0F04015g)、PMK基因(YALI0E06193g)、PDO基因(YALI0F05632g)、FPPS基因(YALI0E05753g)的起始密码子前添加线粒体定位信号MLS(蛋白质氨基端的MLSLRQSIRFFKPATRTLCSSRYLLQ26个氨基酸序列)序列。以及同时根据表达载体pYLEX1序列分别设计引物：
MLS-α-bisabolene-F:
ACTTTGGTCTACTCCGGTACAATGCTTTCACTACGTCAATCTATAAGATTTTTCAAGCCAGCCACAAGAACTTTGTGTAGCTCTAGATATCTGCTTCAGatggccggtgtctctgcc
MLS-α-bisabolene-R:
gggacaggccatggaggtaccTTAGTGGTGATGGTGGTGGTGG
MLS-AACT-F:
ACAACCACACACATCCACAATGCTTTCACTACGTCAATCTATAAGATTTTTCAAGCCAGCCACAAGAACTTTGTGTAGCTCTAGATATCTGCTTCAGatggagcccgtctacattgttt
MLS-AACT-R:
ttagtttcgggttcccacCTAACACTTCTCAACAATGATAGAGGAA
MLS-HMGS-F:
ACAACCACACACATCCACAATGCTTTCACTACGTCAATCTATAAGATTTTTCAAGCCAGCCACAAGAACTTTGTGTAGCTCTAGATATCTGCTTCAGatggagcccgtctacattgttt
MLS-HMGS-R:
ttagtttcgggttcccacCTACTGCTTGATCTCGTACTTTCGTC
MLS-HMGR-F:
ACAACCACACACATCCACAATGCTTTCACTACGTCAATCTATAAGATTTTTCAAGCCAGCCACAAGAACTTTGTGTAGCTCTAGATATCTGCTTCAGatgctacaagcagctattggaaag
MLS-HMGR-R:
ttagtttcgggttcccacCTAACACTTCTCAACAATGATAGAGGAA
MLS-MK-F:
ACTTTGGTCTACTCCGGTACAATGCTTTCACTACGTCAATCTATAAGATTTTTCAAGCCAGCCACAAGAACTTTGTGTAGCTCTAGATATCTGCTTCAGatggactacatcatttcggcg
MLS-MK-R:
gggacaggccatggagCTAATGGGTCCAGGGACCGA
MLS-IDI-F:
ACTTTGGTCTACTCCGGTACAATGCTTTCACTACGTCAATCTATAAGATTTTTCAAGCCAGCCACAAGAACTTTGTGTAGCTCTAGATATCTGCTTCAGatgctacttgatccaccgccg
MLS-IDI-R:
gggacaggccatggaggtaccCTAATGACGACGTCTTACAGCGA
MLS-PMK-F:
ACTTTGGTCTACTCCGGTACAATGCTTTCACTACGTCAATCTATAAGATTTTTCAAGCCAGCCACAAGAACTTTGTGTAGCTCTAGATATCTGCTTCAGATGctacttgaaccccttctcg
MLS-PMK-R:
gggacaggccatggaggtaccCTAATGACCACCTATTCGGCTCC
MLS-PDO-F:
ACTTTGGTCTACTCCGGTACAATGCTTTCACTACGTCAATCTATAAGATTTTTCAAGCCAGCCACAAGAACTTTGTGTAGCTCTAGATATCTGCTTCAGatgatccaccaggcctcca
MLS-PDO-R:
gggacaggccatggaggtaccCTACTTGCTGTTCTTCAGAGAACCA
MLS-FPPS-F:
CAACCACACACATCCACGTGAATGCTTTCACTACGTCAATCTATAAGATTTTTCAAGCCAGCCACAAGAACTTTGTGTAGCTCTAGATATCTGCTTCAGATGatgtccaaggcgaaattcga
MLS-FPPS-R:
ttagtttcgggttcccacCTACTTCTGTCGCTTGTAAATCTTGG
以来源于解脂耶氏酵母Po1gΔKU70的基因组为模板，使用MLS-AACT-F/R、MLS-HMGS-F/R、MLS-HMGR-F/R、MLS-MK-F/R、MLS-IDI-F/R、MLS-PMK-F/R、MLS-PDO-F/R、MLS-FPPS-F/R引物PCR扩增得到携带相应末端同源序列的MLS-AACT、MLS-HMGS、MLS-HMGR、MLS-MK、MLS-IDI、MLS-PMK、MLS-PDO、MLS-FPPS组装片段。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。
质粒pYLEX1和pYLEX1(hyg)通过PmlⅠ或KpnⅠ内切酶消化后，回收纯化。利用Vazyme组装试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit对pYLEX1线性化片段和MLS-α-bisabolene、MLS-AACT、MLS-HMGS、MLS-HMGR、MLS-MK、MLS-IDI、MLS-PDO、MLS-FPPS组装片段进行组装，构建完成pYLEX1-MLS-α-bisabolene、pYLEX1-MLS-AACT、pYLEX1-MLS-HMGR、pYLEX1-MLS-HMGS、pYLEX1-MLS-MK质粒、pYLEX1-MLS-IDI、pYLEX1-MLS-PDO、pYLEX1-MLS-FPPS质粒；利用Vazyme组装试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit对pYLEX1(hyg)线性化片段和MLS-PMK组装片段进行组装，构建完成pYLEX1-MLS-PMK质粒。
(2)根据Genbank中红没药烯转运蛋白为来自罗汉果的ABC-G1(GenBank登录号：XM_014320122.1)，以解脂耶氏酵母密码子使用偏好性分别进行密码子优化并在基因3′端加入His标签，之后进行基因合成，根据Genbank中解脂耶氏酵母基因组的PDA1、MGM1基因序列、合成的ABC-G1质粒基因序列和表达载体pYLEX1序列分别设计引物：
PDA1-F:
acaaccacacacatccacgtgAATGCTCACTGCCGCTCG
PDA1-R:
ttagtttcgggttcccacTTAGTTCTTAAAGTAGTAGTCCTCGGAAG
MGM1-F:
actttggtctactccggtacATGCTTCGAATCAGACAGGTTCG
MGM1-R:
gggacaggccatggagTCATCGTCTAAAGTTTCGCTGC
ABC-G1-F:
acaaccacacacatccacgtgATGGAGACTGACTCCAAGTCCG
ABC-G1-R:
ttagtttcgggttcccacgtgTTAATGGTGGTGGTGGTGATGA
以来源于解脂耶氏酵母Po1gΔKU70的基因组或合成的ABC-G1质粒为模板，分别使用PDA1-F/R、MGM1-F/R、ABC-G1-F/R引物PCR扩增得到PDA1组装片段、MGM1组装片段、ABC-G1组装片段。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。
质粒pYLEX1通过PmlⅠ内切酶消化后，回收纯化。利用Vazyme组装试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit对pYLEX1线性化片段分别和PDA1组装片段、MGM1组装片段、ABC-G1组装片段进行组装，构建完成pYLEX1-PDA1、pYLEX1-MGM1、pYLEX1-ABC-G1质粒。
(3)质粒pYLEX1-MLS-AACT通过NruⅠ内切酶消化后，回收纯化。根据表达载体pYLEX1-MLS-AACT整合位点NruⅠ的序列设计引物：
NruⅠ-F：
CCATCCAGCCTCGCGTCGCGAgaggccgttgagcaccgc
NruⅠ-R：
acgtcttgctggcgttcgGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTCG
以表达载体pYLEX1-MLS-HMGS为模板，使用NruⅠ-F/NruⅠ-R引物PCR扩增得到携带相应末端同源序列的MLS-HMGS表达盒组装片段。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。利用Vazyme组装试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit对pYLEX1-MLS-AACT酶切片段和MLS-HMGS组装片段进行组装，构建完成pYLEX1-MLS-AACT-HMGS质粒，通过引物设计的形式在整合片段MLS-HMGS表达盒上预留了NruⅠ位点作为下一轮质粒构建的基因整合位点。
(4)质粒pYLEX1-MLS-AACT-HMGS通过NruⅠ内切酶消化后，回收纯化。根据表达载体pYLEX1-MLS-AACT-HMGS整合位点NruⅠ的序列设计引物：
NruⅠ-F：
CCATCCAGCCTCGCGTCGCGAgaggccgttgagcaccgc
NruⅠ-HMGR-R：
gcggtgctcaacggcctcTCGGATAAGCTGTCAAACATGAGAAT
以表达载体pYLEX1-MLS-HMGR为模板，使用NruⅠ-F/NruⅠ-HMGR-R引物PCR扩增得到携带相应末端同源序列的MLS-HMGR表达盒组装片段。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。
利用Vazyme组装试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit对pYLEX1-MLS-AACT-HMGS酶切片段和MLS-HMGR组装片段进行组装，构建完成pYLEX1-MLS-AACT-HMGS-HMGR质粒。
(5)质粒pYLEX1-MLS-AACT-HMGS-HMGR通过Aor13HⅠ内切酶消化后，回收纯化。根据表达载体pYLEX1-MLS-AACT-HMGS-HMGR整合位点Aor13HⅠ的序列设计引物：
Aor13HⅠ-F：
ATCCTGCGATGCAGATCCGgagcccagtagtaggttg
Aor13HⅠ-R：
cgccctgcaccattatgttgCTGTCAAACATGAGAATTCG
以表达载体pYLEX1-MLS-MK为模板，使用Aor13HⅠ-F/Aor13HⅠ-R引物PCR扩增得到携带相应末端同源序列的MLS-MK表达盒组装片段。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。
利用Vazyme组装试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit对pYLEX1-MLS-AACT-HMGS-HMGR酶切片段和MLS-MK表达盒组装片段进行组装，构建完成pYLEX1-MLS-AACT-HMGS-HMGR-MK质粒，通过引物设计的形式在整合片段MLS-MK表达盒上预留了Aor13HⅠ位点作为下一轮质粒构建的基因整合位点。
(6)质粒pYLEX1-MLS-AACT-HMGS-HMGR-MK通过Aor13HⅠ内切酶消化后，回收纯化。根据表达载体pYLEX1-MLS-AACT-HMGS-HMGR-MK整合位点Aor13HⅠ的序列设计引物：
Aor13HⅠ-F：
ATCCTGCGATGCAGATCCGgagcccagtagtaggttg
Aor13HⅠ-IDI-R：
AACCTACTACTGGGCTGCTGTCAAACATGAGAATTCG
以表达载体pYLEX1-MLS-IDI为模板，使用Aor13HⅠ-F/Aor13HⅠ-IDI-R引物PCR扩增得到携带相应末端同源序列的MLS-IDI表达盒组装片段。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。
利用Vazyme组装试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit对pYLEX1-MLS-AACT-HMGS-HMGR-MK酶切片段和MLS-IDI表达盒组装片段进行组装，构建完成pYLEX1-MLS-AACT-HMGS-HMGR-MK-IDI质粒。通过SpeI内切酶消化后，回收纯化浓缩整合片断。
(7)质粒pYLEX1-MLS-AACT-HMGS-HMGR-MK-IDI通过FspAⅠ内切酶消化后，回收纯化。根据表达载体pYLEX1-MLS-AACT-HMGS-HMGR-MK-IDI整合位点FspAⅠ的序列设计引物：
FspAⅠ-F：
GACAGGAGCACGATCATGCGCACGAGGCCGTTGAGCACCGC
FspAⅠ-R：
GGGTCCTGGCCACGGGTGCGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTCG
分别以表达载体pYLEX1-MLS-HMGR、pYLEX1-PDA1、pYLEX1-MGM1、pYLEX1-ABC-G1为模板，使用FspAⅠ-F/R引物分别PCR扩增得到携带相应末端同源序列的MLS-HMGR、PDA1、MGM1、ABC-G1表达盒组装片段。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。
利用Vazyme组装试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit对pYLEX1-MLS-AACT-HMGS-HMGR-MK-IDI酶切片段分别和MLS-HMGR、PDA1、MGM1、ABC-G1表达盒组装片段进行组装，构建完成pYLEX1-MLS-AACT-HMGS-HMGR-MK-IDI-MLS-HMGR、pYLEX1-MLS-AACT-HMGS-HMGR-MK-IDI-PDA1、pYLEX1-MLS-AACT-HMGS-HMGR-MK-IDI-MGM1、pYLEX1-MLS-AACT-HMGS-HMGR-MK-IDI-ABC-G1质粒。通过SpeⅠ内切酶消化后，回收纯化浓缩整合片断。
1.2使用醋酸锂转化法构建得到工程菌株Po1g MMVA，步骤为：
(1)解脂耶氏酵母Po1gΔKU70感受态细胞的制备
I.将划线保存于YPD培养基固体平板中的解脂耶氏酵母，用接种环挑取单菌落接种于50mL液体YPD培养基中，28℃、225rpm摇床培养至OD600＝15。
II.室温12000rpm离心4min，收集菌体，用10mL无菌水冲洗菌体2次，用5mL0.1mol/L醋酸锂(pH 6.0)悬浮细胞，室温培养10min。
III.向感受态细胞中添加灭菌冷却的甘油至终浓度25％(v/v)，等分100μL到无菌的2mL离心管中，进行酵母转化或并-80℃冰箱保存。
(2)线性化酶切质粒pYLEX1-α-bisabolene、pYLEX1-MLS-AACT-HMGS-HMGR-MK-IDI、pYLEX1-MLS-AACT-HMGS-HMGR-MK-IDI-MLS-HMGR、pYLEX1-MLS-AACT-HMGS-HMGR-MK-IDI-PDA1、pYLEX1-MLS-AACT-HMGS-HMGR-MK-IDI-MGM1、pYLEX1-MLS-AACT-HMGS-HMGR-MK-IDI-ABC-G1获得重组基因片段进行转化，筛选重组子。
I.将100μL的感受态细胞、500ng-1μg线性化重组质粒和10μL鲑鱼精DNA(10mg/mL)轻轻混匀，30℃培养15min。
II.加700μL 40％的PEG 4000，吹吸混匀后于30℃、225rpm培养1h。
III.将离心管放入39℃水浴锅中温浴1h。
IV.添加1mL的YPD培养基，30℃、225rpm恢复培养2h，室温12000rpm离心1min，弃上清并用1mL无菌水重悬菌体。
V.室温12000rpm离心1min，收集菌体，用100μL无菌水重悬菌体并涂到筛选培养基YNB固体平板上，30℃培养2-3d。
VI.随机挑选重组子，利用下列引物进行PCR验证(LEU2-CX-1：ATGATGCTCAAGTTCTCTC；AMP-CX-1：ATAACTACGATACGGGAGG)。得到片段大小为2031bp，如图6，条带大小与理论预期相符，说明目的基因成功整合到解脂耶氏酵母基因组中。
测序进一步验证pYLEX1-α-bisabolene、pYLEX1-MLS-AACT-HMGS-HMGR-MK-IDI、pYLEX1-MLS-AACT-HMGS-HMGR-MK-IDI-MLS-HMGR、pYLEX1-MLS-AACT-HMGS-HMGR-MK-IDI-PDA1、pYLEX1-MLS-AACT-HMGS-HMGR-MK-IDI-MGM1、pYLEX1-MLS-AACT-HMGS-HMGR-MK-IDI-ABC-G1质粒酶切片段是否整合到基因组上。将获得：
①含α-bisabolene基因的解脂耶氏酵母工程菌命名为Po1g KαBS，其基因型为Po1gΔKU70α-bisabolene；
②含MLS-AACT、MLS-HMGS、MLS-HMGR、MLS-MK、MLS-IDI基因的解脂耶氏酵母工程菌命名为Po1g MMVA，其基因型为Po1gΔKU70MLS-AACT-HMGS-HMGR-MK-IDI；
③含MLS-AACT、MLS-HMGS、MLS-HMGR(2个)、MLS-MK、MLS-IDI基因的解脂耶氏酵母工程菌命名为Po1g MMVA-MHMGR，其基因型为Po1gΔKU70 MLS-AACT-HMGS-HMGR-MK-IDI-HMGR；
④含MLS-AACT、MLS-HMGS、MLS-HMGR、MLS-MK、MLS-IDI、PDA1基因的解脂耶氏酵母工程菌命名为Po1g MMVA-PDA1，其基因型为Po1gΔKU70MLS-AACT-HMGS-HMGR-MK-IDI-PDA1；
⑤含MLS-AACT、MLS-HMGS、MLS-HMGR、MLS-MK、MLS-IDI、MGM1基因的解脂耶氏酵母工程菌命名为Po1g MMVA-MGM1，其基因型为Po1gΔKU70 MLS-AACT-HMGS-HMGR-MK-IDI-MGM1；
⑥含MLS-AACT、MLS-HMGS、MLS-HMGR、MLS-MK、MLS-IDI、ABC-G1基因的解脂耶氏酵母工程菌命名为Po1g MMVA-ABC-G1，其基因型为Po1gΔKU70 MLS-AACT-HMGS-HMGR-MK-IDI-ABC-G1。
实施例2构建在线粒体中定位表达红没药烯合成途径的解脂耶氏酵母工程菌株Po1g MαBS、Po1g MαBS-MHMGR、Po1g MαBS-PDA1、Po1g MαBS-MGM1、Po1g MαBS-ABC-G1
2.1构建表达载体
(1)质粒pYLEX1-MLS-PMK通过NarⅠ内切酶消化后，回收纯化。根据表达载体pYLEX1-MLS-PMK整合位点NarⅠ的序列设计引物：
NarⅠ-F：
GACAAGGTATAGGGCGGcgccccgttgagcaccgccgcc
NarⅠ-R：
gttggcatggattgaaggcggataaGCTGTCAAACATGAGAATT
以表达载体pYLEX1-MLS-PDO为模板，使用NarⅠ-F/NarⅠ-R引物PCR扩增得到携带相应末端同源序列的MLS-PDO表达盒组装片段。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。
利用Vazyme组装试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit对pYLEX1-MLS-PMK酶切片段和MLS-PDO表达盒组装片段进行组装，构建完成pYLEX1-MLS-PMK-PDO质粒。
(2)质粒pYLEX1-MLS-PMK-PDO通过SalⅠ内切酶消化后，回收纯化。
根据表达载体pYLEX1-MLS-PMK-PDO整合位点SalⅠ的序列设计引物：
SalⅠ-F：
CTCTCAAGGGCATCGGTCGACccgttgagcaccgccgcc
SalⅠ-R：
cgcataagggagagcgtcgaGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTCG
以表达载体pYLEX1-MLS-FPPS为模板，使用SalⅠ-F/SalⅠ-R引物PCR扩增得到携带相应末端同源序列的MLS-FPPS表达盒组装片段。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。
利用Vazyme组装试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit对pYLEX1-MLS-PMK-PDO酶切片段和MLS-FPPS组装片段进行组装，构建完成pYLEX1-MLS-PMK-PDO-FPPS质粒。
(3)质粒pYLEX1-MLS-PMK-PDO-FPPS通过FspAⅠ内切酶消化后，回收纯化。根据表达载体pYLEX1-MLS-PMK-PDO-FPPS整合位点FspAⅠ的序列设计引物：
FspA Ⅰ-F：
GACAGGAGCACGATCATGcgcacgaggccgttgagcaccgc
FspA Ⅰ-R：
gggtcctggccacgggtgcgATAAGCTGTCAAACATGAGAATTCG
以表达载体pYLEX1-MLS-α-bisabolene为模板，使用FspA Ⅰ-F/FspA Ⅰ-R引物PCR扩增得到携带相应末端同源序列的MLS-α-bisabolene表达盒组装片段。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。
利用Vazyme组装试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit对pYLEX1-MLS-PMK-PDO-FPPS酶切片段和MLS-α-bisabolene组装片段进行组装，构建完成pYLEX1-MLS-PMK-PDO-FPPS-α-bisabolene质粒。通过Bsu36Ⅰ内切酶消化后，回收纯化浓缩整合片断。
2.2使用醋酸锂转化法构建得到工程菌株Po1g MαBS、Po1g MαBS-HMGR、Po1g MαBS-PDA1、Po1g Po1g MαBS-MGM1、Po1g MαBS-ABC-G1，步骤为：
(1)对上步得到的pYLEX1-MLS-PMK-PDO-FPPS-α-bisabolene质粒线性化后进行纯化回收，使用醋酸锂转化法将pYLEX1-MLS-PMK-PDO-FPPS-α-bisabolene质粒酶切片段分别转入菌株Po1gMMVA、Po1g MMVA-HMGR、Po1g MMVA-PDA1、Po1g MMVA-MGM1、Po1gMMVA-ABC-G1中，涂布于YPD-hyg平板中，倒置于30℃培养箱中。
(2)待长出单菌落后，随机挑选重组子，利用下列引物进行PCR验证(hph-CX-1：ccatccagcctcgcgtcgcgaGACATGGAGGCCCAGAATACC；hph-CX-2：acgtcttgctggcgttcgcAGTATAGCGACCAGCATTCACA)。得到片段大小为1615bp，如图7，条带大小与理论预期相符，说明目的基因成功整合到解脂耶氏酵母基因组中。
测序进一步验证pYLEX1-MLS-PMK-PDO-FPPS-α-bisabolene质粒酶切片段是否整合到基因组上，将成功整合至菌株Po1g MMVA、Po1g MMVA-MHMGR、Po1g MMVA-PDA1、Po1gMMVA-MGM1、Po1g MMVA-ABC-G1中获得的菌株分别命名为Po1g MαBS、Po1g MαBS-MHMGR、Po1g MαBS-PDA1、Po1gMαBS-MGM1、Po1g MαBS-ABC-G1。
实施例3在细胞质中产α-红没药烯的工程菌株Po1g KαBS和在线粒体中生产α-红没药烯的Po1g MαBS、Po1g MαBS-MHMGR、Po1g MαBS-PDA1、Po1gMαBS-MGM1、Po1g MαBS-ABC-G1生产α-红没药烯效率的比较。
工程菌株：解脂耶氏酵母工程菌Po1g KαBS、Po1g MαBS、Po1gMαBS-MHMGR、Po1g MαBS-PDA1、Po1g MαBS-MGM1、Po1g MαBS-ABC-G1。
冷冻甘油管保存的解脂耶氏酵母Po1g KαBS、Po1g MαBS、Po1gMαBS-MHMGR、Po1g MαBS-PDA1、Po1g MαBS-MGM1、Po1g MαBS-ABC-G1分别划线接种于YPD固体平板，30℃培养30h。
将YPD固体平板上长出的Po1g KαBS、Po1g MαBS、Po1g MαBS-MHMGR、Po1g MαBS-PDA1、Po1g MαBS-MGM1、Po1g MαBS-ABC-G1菌落分别接入装有50ml的YPD液体培养基(蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L)的250mL三角瓶中，30℃，250rpm转速振荡培养活化。
种子培养：分别取1mL活化的培养液转接到装有50mL种子培养基(蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L)的250mL三角瓶中，30℃，220rpm好氧培养24h。
发酵培养：将种子培养液接种到装有50mL发酵YPD培养基(蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L)的250mL三角瓶中使得初始OD600＝0.1，进行摇瓶发酵，20℃，250rpm好氧培养120h，发酵前添加5ml萃取剂十二烷以捕获发酵过程中产生的α-红没药烯。
发酵120h取样，然后再600nm波长下检测菌液的光吸收值。即取1mL菌液12,000rpm转速离心2min。弃去上清，用等体积的H2O重悬，稀释至合适倍数后使用分光光度计检测其光吸收值。
测定α-红没药烯含量的方法：在刚进行摇瓶发酵的时候添加十二烷，发酵结束后，将发酵液全部倒入50mL离心管中，7500rpm，4℃，离心5min，取有机相过膜，气相色谱-质谱联用检测α-红没药烯的含量，使用(-)-trans-Caryophyllene(购自sigma-aldrich公司)标准品制作标准曲线。
其中，上述气相色谱-质谱联用检测条件为：
色谱柱HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm，美国瓦里安)，载气：高纯氦气，流速为1mL/min，进样口温度280℃，升温程序：60℃，20℃/min升到170℃，2℃/min升到210℃，280℃保持3min，溶剂延迟3min，离子扫描模式为选扫(67、93、136m/z)，进样量为1μL。
结果如图8所示，经过120h的发酵，Po1g MαBS、Po1g MαBS-MHMGR、Po1g MαBS-PDA1、Po1g MαBS-MGM1、Po1g MαBS-ABC-G1菌株发酵液中α-红没药烯含量分别达到122.25mg/L、189.07mg/L、170.49mg/L、208.23mg/L、179.87mg/L。而在胞质中合成α-红没药烯的对照工程菌株Po1g KαBS利用葡萄糖生产α-红没药烯的产量仅为0.4mg/L。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津科技大学
<120> 一种利用解脂耶氏酵母线粒体途径定位合成α-红没药烯的方法
<130> 1
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1179
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 1
atggagcccg tctacattgt ttctactgct cgaaccccca ttggttcttt tctgagctcg 60
ctgagcggcc agacctacgt ggatctggga gcccatgccg tgaaggccgc actcgccaag 120
accgacatca agcccgacca ggtcgacgag atcatcttcg gtaacgttct ctccgccggc 180
gtcggacagg cccctgctcg acaggttgcc ctcaaggctg gtctccctga caccattgtc 240
gctaccaccg tcaacaaggt ctgtgcctcc ggtatgaagg ccatcatcca gggtgcccag 300
gccatcatga ccggatctgc cgacattgtc attgctggcg gtgccgagtc catgtccaac 360
gtgccccact acgtgcaggc ccgtgtcgct aacaagtacg gcaacggctc tctggtcgac 420
ggtatccagc gagacggtct gtttgacgcc tacgatggcc aggccatggg tgtggccgct 480
gaggtctgtg ctgacaccca ctccatctcc cgagaggagc aggacgagtt tgccattggc 540
tcttacaaga agacccaggc tgcctatgcc gccggcaagt ttaaggacga gattgccccc 600
attgagctgc ccggcttccg aggcaagcct ggtgtcgttg tctccgagga cgaggagtac 660
aagaacctca acgaggacaa gctcaagtct gcccgaactg tttttaagaa ggacggtacc 720
gtgactgccc ccaacgcctc ccctatcaac gacggtggag ctgccgtcat tctggcctct 780
gctgccaagg tcaaggagct tggtcttaag cccctgctca agattgtctc ttggggcgag 840
gctgccaacg agcccgtcaa gttcaccact gctcccgctc tggccgtccc cgttgccctc 900
aagcgagctg gtctcgaggc caaggacatt gacttttacg agttcaacga ggccttctct 960
gttgttggta tcgccaacac caagctgctt ggtctggact ccagcaaggt caacgtctac 1020
ggaggtgctg ttgccattgg tcaccctctg ggctgctctg gtgcccgagt cattgtcact 1080
ctcaactctg ttctgcacca ggaaggcggc aagtacggat gtgctgccat ctgcaacggt 1140
ggtggtggcg cttcctctat cattgttgag aagtgttag 1179
<210> 2
<211> 1341
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 2
atgtcgcaac cccagaacgt tggaatcaaa gccctcgaga tctacgtgcc ttctcgaatt 60
gtcaaccagg ctgagctcga gaagcacgac ggtgtcgctg ctggcaagta caccattggt 120
cttggtcaga ccaacatggc ctttgtcgac gacagagagg acatctattc ctttgccctg 180
accgccgtct ctcgactgct caagaacaac aacatcgacc ctgcatctat tggtcgaatc 240
gaggttggta ctgaaaccct tctggacaag tccaagtccg tcaagtctgt gctcatgcag 300
ctctttggcg agaacagcaa cattgagggt gtggacaacg tcaacgcctg ctacggagga 360
accaacgccc tgttcaacgc tatcaactgg gttgagggtc gatcttggga cggccgaaac 420
gccatcgtcg ttgccggtga cattgccctc tacgcaaagg gcgctgcccg acccaccgga 480
ggtgccggct gtgttgccat gctcattggc cccgacgctc ccctggttct tgacaacgtc 540
cacggatctt acttcgagca tgcctacgat ttctacaagc ctgatctgac ctccgagtac 600
ccctatgttg atggccacta ctccctgacc tgttacacaa aggccctcga caaggcctac 660
gctgcctaca acgcccgagc cgagaaggtc ggtctgttca aggactccga caagaagggt 720
gctgaccgat ttgactactc tgccttccac gtgcccacct gcaagcttgt caccaagtct 780
tacgctcgac ttctctacaa cgactacctc aacgacaaga gcctgtacga gggccaggtc 840
cccgaggagg ttgctgccgt ctcctacgat gcctctctca ccgacaagac cgtcgagaag 900
accttccttg gtattgccaa ggctcagtcc gccgagcgaa tggctccttc tctccaggga 960
cccaccaaca ccggtaacat gtacaccgcc tctgtgtacg cttctctcat ctctctgctg 1020
acttttgtcc ccgctgagca gctgcagggc aagcgaatct ctctcttctc ttacggatct 1080
ggtcttgctt ccactctttt ctctctgacc gtcaagggag acatttctcc catcgtcaag 1140
gcctgcgact tcaaggctaa gctcgatgac cgatccaccg agactcccgt cgactacgag 1200
gctgccaccg atctccgaga gaaggcccac ctcaagaaga actttgagcc ccagggagac 1260
atcaagcaca tcaagtctgg cgtctactac ctcaccaaca tcgatgacat gttccgacga 1320
aagtacgaga tcaagcagta g 1341
<210> 3
<211> 3000
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 3
atgctacaag cagctattgg aaagattgtg ggatttgcgg tcaaccgacc catccacaca 60
gttgtcctga cgtccatcgt ggcgtcaacc gcatacctcg ccatcctcga cattgccatc 120
ccgggtttcg agggcacaca acccatctca tactaccacc ctgcagcaaa atcttacgac 180
aaccctgctg attggaccca cattgcagag gccgacatcc cttcagacgc ctaccgactt 240
gcatttgccc agatccgtgt cagtgatgtt cagggcggag aggcccccac catccctggc 300
gccgtggccg tgtctgatct cgaccacaga atcgtcatgg actacaaaca gtgggccccc 360
tggaccgcca gcaacgagca gatcgcctcg gagaaccaca tctggaagca ctccttcaag 420
gaccacgtgg ccttcagctg gatcaagtgg ttccgatggg cctacctgcg tttgtccact 480
ctcatccagg gggcagacaa cttcgacatt gccgtggtcg cccttggcta tcttgccatg 540
cactacacct tcttcagtct cttccgatcc atgcgaaagg ttggctcgca cttttggctt 600
gcctccatgg ctctggtctc ttccaccttc gctttcctgc ttgcggtggt ggcttcctct 660
agcctgggtt accgacctag catgatcacc atgtccgagg gcctgccctt cctcgtggtc 720
gccattggct ttgaccgaaa ggtcaacctg gctagcgagg tgctcacatc caagagcagc 780
cagctcgctc ccatggtgca ggtgatcaca aagatcgcct ccaaggcgct gtttgagtac 840
agccttgagg tggccgccct gtttgctggc gcctataccg gagttcctcg actgtcccag 900
ttttgcttct tatctgcttg gatcctcatc ttcgactaca tgtttttgct gaccttctac 960
tctgctgtcc ttgctatcaa gtttgagatc aatcacatta agcgaaaccg aatgatccag 1020
gatgctctca aggaggatgg tgtatctgct gctgttgccg agaaggtagc cgactcttct 1080
cccgacgcca agctcgaccg aaagtccgac gtttctcttt ttggagcctc tggcgccatt 1140
gcggtgttca agatcttcat ggtccttggg ttccttggtc tcaacctcat caacctgact 1200
gccatccctc accttggcaa ggcggccgcc gctgcccagt ctgtgactcc catcaccctc 1260
tcccccgagc ttctccatgc catccccgcc tctgtgcccg ttgttgtcac ctttgtgccc 1320
agcgttgtgt acgagcactc ccagctcatt ctgcagctgg aggacgccct cactaccttc 1380
ctggctgcct gctccaaaac tattggtgac cccgtcatct ccaagtacat cttcctgtgc 1440
ctgatggtct ccaccgccct gaacgtctac ctgtttggag ccacccgaga agttgtgcga 1500
acccagtctg tgaaggtggt tgagaagcac gttcctatcg tcattgagaa gcccagcgag 1560
aaggaggagg acacctcttc tgaagactcc attgagctga ctgtcggaaa gcagcccaag 1620
cccgtgaccg agacccgttc tctggacgac ctagaggcta tcatgaaggc aggtaagacc 1680
aagcttctgg aggaccacga ggttgtcaag ctctctctcg agggcaagct tcctttgtat 1740
gctcttgaga agcagcttgg tgacaacacc cgagctgttg gcatccgacg atctatcatc 1800
tcccagcagt ctaataccaa gactttagag acctcaaagc ttccttacct gcactacgac 1860
tacgaccgtg tttttggagc ctgttgcgag aacgttattg gttacatgcc tctccccgtt 1920
ggtgttgctg gccccatgaa cattgatggc aagaactacc acattcctat ggccaccact 1980
gagggttgtc ttgttgcctc aaccatgcga ggttgcaagg ccatcaacgc cggtggcggt 2040
gttaccactg tgcttactca ggacggtatg acacgaggtc cttgtgtttc cttcccctct 2100
ctcaagcggg ctggagccgc taagatctgg cttgattccg aggagggtct caagtccatg 2160
cgaaaggcct tcaactccac ctctcgattt gctcgtctcc agtctcttca ctctaccctt 2220
gctggtaacc tgctgtttat tcgattccga accaccactg gtgatgccat gggcatgaac 2280
atgatctcca agggcgtcga acactctctg gccgtcatgg tcaaggagta cggcttccct 2340
gatatggaca ttgtgtctgt ctcgggtaac tactgcactg acaagaagcc cgcagcgatc 2400
aactggatcg aaggccgagg caagagtgtt gttgccgaag ccaccatccc tgctcacatt 2460
gtcaagtctg ttctcaaaag tgaggttgac gctcttgttg agctcaacat cagcaagaat 2520
ctgatcggta gtgccatggc tggctctgtg ggaggtttca atgcacacgc cgcaaacctg 2580
gtgaccgcca tctaccttgc cactggccag gatcctgctc agaatgtcga gtcttccaac 2640
tgcatcacgc tgatgagcaa cgtcgacggt aacctgctca tctccgtttc catgccttct 2700
atcgaggtcg gtaccattgg tggaggtact attttggagc cccagggggc tatgctggag 2760
atgcttggcg tgcgaggtcc tcacatcgag acccccggtg ccaacgccca acagcttgct 2820
cgcatcattg cttctggagt tcttgcagcg gagctttcgc tgtgttctgc tcttgctgcc 2880
ggccatcttg tgcaaagtca tatgacccac aaccggtccc aggctcctac tccggccaag 2940
cagtctcagg ccgatctgca gcgtctacaa aacggttcga atatttgcat acggtcatag 3000
<210> 4
<211> 1350
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 4
atggactaca tcatttcggc gccaggcaaa gtgattctat ttggtgaaca tgccgctgtg 60
tttggtaagc ctgcgattgc agcagccatc gacttgcgaa catacctgct tgtcgaaacc 120
acaacatccg acaccccgac agtcacgttg gagtttccag acatccactt gaacttcaag 180
gtccaggtgg acaagctggc atctctcaca gcccagacca aggccgacca tctcaattgg 240
tcgactccca aaactctgga taagcacatt ttcgacagct tgtctagctt ggcgcttctg 300
gaagaacctg ggctcactaa ggtccagcag gccgctgttg tgtcgttctt gtacctctac 360
atccacctat gtcccccttc tgtgtgcgaa gattcatcaa actgggtagt tcgatcaacg 420
ctgcctatcg gcgcgggcct gggctcttcc gcatccattt gtgtctgttt ggctgcaggt 480
cttctggttc tcaacggcca gctgagcatt gaccaggcaa gagatttcaa gtccctgacc 540
gagaagcagc tgtctctggt ggacgactgg tccttcgtcg gtgaaatgtg cattcacggc 600
aacccgtcgg gcatcgacaa tgctgtggct actcagggag gtgctctgtt gttccagcga 660
cctaacaacc gagtccctct tgttgacatt cccgagatga agctgctgct taccaatacg 720
aagcatcctc gatctaccgc agacctggtt ggtggagtcg gagttctcac taaagagttt 780
ggctccatca tggatcccat catgacttca gtaggcgaga tttccaacca ggccatggag 840
atcatttcta gaggcaagaa gatggtggac cagtctaacc ttgagattga gcagggtatc 900
ttgcctcaac ccacctctga ggatgcctgc aacgtgatgg aagatggagc tactcttcaa 960
aagttgagag atatcggttc ggaaatgcag catctagtga gaatcaatca cggcctgctt 1020
atcgctatgg gtgtttccca cccgaagctc gaaatcattc gaactgcctc cattgtccac 1080
aacctgggtg agaccaagct cactggtgct ggaggaggag gttgcgccat cactctagtc 1140
acttctaaag acaagactgc gacccagctg gaggaaaatg tcattgcttt cacagaggag 1200
atggctaccc atggcttcga ggtgcacgag actactattg gtgccagagg agttggtatg 1260
tgcattgacc atccctctct caagactgtt gaagccttca agaaggtgga gcgggcggat 1320
ctcaaaaaca tcggtccctg gacccattag 1350
<210> 5
<211> 1260
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 5
ctacttgaac cccttctcga gccgcagacc ctcgttctcc tccttgagct ccatccattg 60
gactccctgg ctctctcgct tgacattgtt caccgtagag ctgatcacca gaagagaaat 120
agcatcgtag cctcctgctc caggcacaac acctccaatg actccactat aagtgttgca 180
cttgttgagc aatgcagact gctcatccgg ctcaatagca gcaccagtct cccgtgtcat 240
cttcttgaga tgctttcgaa tagtgataat gcatcgtgct agttctccga gagggttctg 300
caacattatc atctttagag cgttgagagg agcagcctcg gccaaaagtt gttcgtaggc 360
ctcgttgtta gtgagagaga gcttgcgcag gtcgttgaac aacttgacca tgagcatgtt 420
ggcagcgttg agatctctcc acaccatctc ggcttctcgg ggctttgctt ttcgccatgc 480
catcaccttg gccaccatac ctggagtctc agatcctccc tggacgtctc ccataagcag 540
gctgattccc ggcggcaaga aggatggttc cagagtcacc ttccactttt gattaacggt 600
agttctcaac agagccccgt attcggaggt cccttcagct gcaatgacca tgttcacgga 660
ctccgccggg aaacgtctat agactagaga gccacaaacg gccgaagcca cgtcaaatcc 720
agacccaatc ttcttctgtg ccgagcagtg tgcaacctgg gacaggttgt gaacgaggtg 780
ggtgttatgc aagggatcaa tgccgtatga cttgagcaaa gctgccacaa gaacggtggt 840
aagagcagcg gagctaccga ggcccgtttt aggcacctcg tggatcgcct ttttgtggta 900
tgcaaactgg cctctctgcg tgctgtcaat ttgcgagtgg tacgcgttgt cacttttgat 960
gctgatgttg atgtggaggt ttcgaggagg aacgtaatgc agaacggtgt tgacggccgc 1020
gtgagcaaat gggttgtgtc cgatggccgt cagctggccg ttcgtgtagt tgtaggtcca 1080
ttcacccttg tcaaactgcg gagagacgac atggacagag gtggtggagg cctcggaagc 1140
cgaaactgtc gcgtaaatac gcgccgagag gcccacgacg tatgctgaat acgccggatc 1200
aataaccaaa taaccgccgc aaaggagggc ctttcccgga gccgaatagg tggtcattag 1260
<210> 6
<211> 1164
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 6
atgatccacc aggcctccac caccgctccg gtgaacattg cgacactcaa gtactggggc 60
aagcgagacc ctgctctcaa tctgcccact aacaactcca tctccgtgac tttgtcgcag 120
gatgatctgc ggaccctcac cacagcctcg tgttcccctg atttcaccca ggacgagctg 180
tggctcaatg gcaagcagga ggacgtgagc ggcaaacgtc tggttgcgtg tttccgagag 240
ctgcgggctc tgcgacacaa aatggaggac tccgactctt ctctgcctaa gctggccgat 300
cagaagctca agatcgtgtc cgagaacaac ttccccaccg ccgctggtct cgcctcatcg 360
gctgctggct ttgccgccct gatccgagcc gttgcaaatc tctacgagct ccaggagacc 420
cccgagcagc tgtccattgt ggctcgacag ggctctggat ccgcctgtcg atctctctac 480
ggaggctacg tggcatggga aatgggcacc gagtctgacg gaagcgactc gcgagcggtc 540
cagatcgcca ccgccgacca ctggcccgag atgcgagccg ccatcctcgt tgtctctgcc 600
gacaagaagg acacgtcgtc cactaccggt atgcaggtga ctgtgcacac ttctcccctc 660
ttcaaggagc gagtcaccac tgtggttccc gagcggtttg cccagatgaa gaagtcgatt 720
ctggaccgag acttccccac ctttgccgag ctcaccatgc gagactcaaa ccagttccac 780
gccacctgtc tggactcgta tcctcccatt ttctacctca acgacgtgtc gcgagcctcc 840
attcgggtag ttgaggccat caacaaggct gccggagcca ccattgccgc ctacaccttt 900
gatgctggac ccaactgtgt catctactac gaggacaaga acgaggagct ggttctgggt 960
gctctcaagg ccattctggg ccgtgtggag ggatgggaga agcaccagtc tgtggacgcc 1020
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ggttctctga agaacagcaa gtag 1164
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<212> DNA
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gtcgtggcca tcaaatagct tggccgacga gtccgacgac tccgtgctgg gccggctagc 720
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<211> 1035
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母（yarrowia lipolytica）
<400> 8
atgtccaagg cgaaattcga aagcgtgttc ccccgaatct ccgaggagct ggtgcagctg 60
ctgcgagacg agggtctgcc ccaggatgcc gtgcagtggt tttccgactc acttcagtac 120
aactgtgtgg gtggaaagct caaccgaggc ctgtctgtgg tcgacaccta ccagctactg 180
accggcaaga aggagctcga tgacgaggag tactaccgac tcgcgctgct cggctggctg 240
attgagctgc tgcaggcgtt tttcctcgtg tcggacgaca ttatggatga gtccaagacc 300
cgacgaggcc agccctgctg gtacctcaag cccaaggtcg gcatgattgc catcaacgat 360
gctttcatgc tagagagtgg catctacatt ctgcttaaga agcatttccg acaggagaag 420
tactacattg accttgtcga gctgttccac gacatttcgt tcaagaccga gctgggccag 480
ctggtggatc ttctgactgc ccccgaggat gaggttgatc tcaaccggtt ctctctggac 540
aagcactcct ttattgtgcg atacaagact gcttactact ccttctacct gcccgttgtt 600
ctagccatgt acgtggccgg cattaccaac cccaaggacc tgcagcaggc catggatgtg 660
ctgatccctc tcggagagta cttccaggtc caggacgact accttgacaa ctttggagac 720
cccgagttca ttggtaagat cggcaccgac atccaggaca acaagtgctc ctggctcgtt 780
aacaaagccc ttcagaaggc cacccccgag cagcgacaga tcctcgagga caactacggc 840
gtcaaggaca agtccaagga gctcgtcatc aagaaactgt atgatgacat gaagattgag 900
caggactacc ttgactacga ggaggaggtt gttggcgaca tcaagaagaa gatcgagcag 960
gttgacgaga gccgaggctt caagaaggag gtgctcaacg ctttcctcgc caagatttac 1020
aagcgacaga agtag 1035
<210> 9
<211> 2472
<212> DNA
<213> 北美冷杉（abies grandis）
<400> 9
atggccggtg tctctgccgt gtccaaggtg tcctctctgg tctgtgattt atcctctacc 60
tccggcctca tcagacgaac cgccaatccc caccccaacg tgtggggcta tgatttagtc 120
cactccctca agtctcccta cattgattct tcctaccgag aacgagctga ggtgctggtc 180
tctgagatta aggccatgct gaaccccgcc attactggcg acggcgagtc catgattact 240
ccctccgcct atgacactgc ttgggtggct agagtgcccg ctatcgacgg ttccgctaga 300
ccccagttcc cccagaccgt ggactggatt ttaaagaacc agctgaaaga cggctcttgg 360
ggcattcaat cccacttctt attatccgat cgactcctcg ccaccctctc ttgtgtcctc 420
gtgctgctga agtggaatgt gggtgacctc caagtcgagc aaggtattga gttcatcaag 480
tctaatttag agctggtcaa ggatgagacc gaccaagatt ctttagtgac cgatttcgag 540
atcatcttcc cctctttact gagagaagcc cagtctctcc gactcggtct gccctatgat 600
ttaccctaca tccacctcct ccaaaccaaa cgacaagaaa gactggccaa gctctcccga 660
gaggaaattt atgccgtccc ttccccttta ctctattctt tagaaggcat ccaagatatt 720
gtggagtggg agcgaattat ggaggtgcag tcccaagatg gctcctttct ctcctctccc 780
gcttccactg cttgtgtgtt tatgcacacc ggcgatgcca agtgcctcga atttctcaac 840
tccgtgatga tcaaattcgg taactttgtg ccttgtttat accccgttga tttattagaa 900
agactgctca tcgtggacaa tatcgtgcga ctcggcattt atcgacactt cgagaaggag 960
attaaggagg ccctcgacta cgtctacaga cactggaatg agagaggcat cggttggggc 1020
cgactgaacc ccatcgctga tttagaaacc accgctctgg gctttcgact gctgagactc 1080
cacagataca acgtgtcccc cgctatcttc gacaatttca aggatgccaa cggtaagttc 1140
atctgttcta ctggccagtt taacaaggat gtcgcctcca tgctcaacct ctaccgagcc 1200
tcccaactcg ctttccccgg cgaaaatatc ctcgacgagg ccaagtcctt cgctactaag 1260
tatttacgag aggccttaga aaagtctgag acctcctccg cttggaataa caaacagaac 1320
ctctctcaag aaatcaagta cgctttaaag acttcttggc acgcttctgt cccccgagtc 1380
gaggccaagc gatattgtca agtttaccga cccgattacg ccagaattgc caagtgcgtc 1440
tacaagctcc cttacgtgaa caatgagaaa tttttagaac tcggcaagct ggacttcaac 1500
atcatccagt ccatccacca agaggagatg aagaacgtga cctcttggtt cagagattct 1560
ggtctgcctt tattcacctt tgcccgtgaa cgacccttag agttttattt tctcgtcgcc 1620
gccggtactt atgagcctca gtacgccaaa tgccgatttc tctttaccaa ggtcgcttgt 1680
ctgcagaccg tgctggatga catgtacgac acctacggta ctctggatga gctgaagctg 1740
ttcactgagg ctgtgcgacg atgggatctg tccttcaccg agaatctccc cgattacatg 1800
aagctgtgtt atcaaattta ttacgacatt gtgcatgaag tggcttggga ggctgaaaag 1860
gagcaaggcc gagagctcgt ctccttcttc cgaaagggct gggaagacta tttattaggc 1920
tactacgagg aggccgagtg gctggccgcc gagtatgtcc ctactctgga cgagtacatt 1980
aagaatggta tcacctccat cggtcagcgt attttattac tgtccggcgt gctgattatg 2040
gacggtcaac tgctctctca agaggcttta gagaaagtgg actaccccgg tagacgagtg 2100
ctgaccgagc tgaactcttt aatctcccgt ctcgccgacg ataccaagac ctacaaggct 2160
gagaaggccc gtggtgagct ggcctcctct atcgagtgct atatgaagga ccaccccgag 2220
tgcaccgaag aggaggcttt agaccacatc tactccattc tggagcccgc cgtcaaggaa 2280
ctcacccgag agtttttaaa gcccgacgac gtcccttttg cttgtaagaa gatgctcttc 2340
gaggagaccc gtgttaccat ggtcatcttc aaagacggcg atggcttcgg cgtgtccaag 2400
ctggaggtca aagaccatat taaggagtgt ctcattgagc ctctccctct ccaccaccac 2460
catcaccact aa 2472
<210> 10
<211> 1510
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 10
atgctcactg ccgctcgacg atctacacgg ctcaccagcc gactcggcca ccaggtccga 60
gcatactcca tcgctgacga tgccgacaag gtgagtattt ttttcgccca ttgcgttggg 120
gtgtcgtgga tttgggttac agggagtttt tccgaaacat acgcctcacg aaacacgacg 180
aaacggacga cacagacatg ccatcgacgc gggacccctc ggaattgatt ctacggatgc 240
cattacccct ggcggtggcg tctcgttgac gctgctgaga ttgttaatga gaaacgggcc 300
tagagaaaat cgaacctcta ggaacgcatg cacccggaaa aattattcct cacccaccag 360
caatccatca caaaacgtgg caaaacagct tcaatcgacc gtatactaac cccagaaatg 420
cacaatcacg ctcaaggagg attcttacac cacctacatg cttgattctc cccctcctct 480
cgagttcgag atgaccaagg gtgagcttct gcaaatgtac aaggacatgg tgaccgtccg 540
acgactcgag atggctgctg atgccctcta caaggccaag aagatccgag gtttctgcca 600
tctgtctact ggtcaggagg ctgttgccgt cggtatcgag aaggccatcg accacgacga 660
ttctgtcatc accgcctacc gatgccacgg tttcgcctac atgcgaggtg cctctgtccg 720
agcaatcatc gccgagctgc tcggaaagcg aaccggtgtc tcctacggta agggtggatc 780
catgcacatg ttcaccgagg gtttctacgg aggaaacggt attgtcggag cccaggtccc 840
cgtcggagct ggtctcgcct tcgcccacaa gtacctcgag cagaccggaa aggccacctt 900
tgccctgtac ggtgacggtg cttccaacca gggtcagatc ttcgaggcct acaacatggc 960
caagctctgg gacctcccct gcatctttgc atgcgagaac aacaagtacg gaatgggtac 1020
cgctgctgct cgatcctctg ccctgacgca gtactacaag cgaggtcagt acattcccgg 1080
tctcaaggtt aacggaatgg acattctgtc cgtctaccag ggagccaagt tcgccaagga 1140
gtggaccaca cacggcaagg gtcccctcgt catggagttc gagacctacc gatacggtgg 1200
tcactccatg tccgatcccg gaaccaccta ccgaacccga gaggagatcc agtacatgcg 1260
atcccacaac gatcctattt ctggtctcaa ggcccacatc ctggagctta atttcgccac 1320
tgaggacgag cttaagtctg tggacaaggc tgctcgagct atggttgaca aggaggttgc 1380
ccttgctgag tccgaccctg ctcctgaggc tactgccaag gttctgtttg aggatatcta 1440
cgttcccggc accgagcctc ctgtgatccg aggccgaatc ccttccgagg actactactt 1500
taagaactaa 1510
<210> 11
<211> 2700
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）
<400> 11
atgcttcgaa tcagacaggt tcgcggccga tggcccgcgc ccggttcgcc gcctcttttg 60
cgggctcaga cgctgcccac acgaaaactg cacctcacac acctgccccg tcatgtgcac 120
catcttccca cgactctggg agacaacaag cgccacgtgt ccttctttgc gatcctcggc 180
aaggccgtgc gggttcccgc ggctctggga ggcgtcatgg tcggcggagc agcctacgtc 240
aaccacaagg tgaacgaagc gaccgggttt gcgtccgaca agctgaatgg cgtgaccgac 300
tgggccaagg gcgccgtgga cggcatttcc gggtttggag aaaacaccgt caacagtatg 360
aaggacttca tgaaggaatt cagccaggcc agaagcgaaa gtgctgctga aggagcagac 420
gcgaacgcag cgggaggaga gggcgctact gggggagaag gaggctccgg aggctctgga 480
ggcagtccca atggcggagg caccacagat gctgctgctc tggctgccgc ggtaggagct 540
gccacatacg acaactccga ggaggagatt gttgctccca gaaccaacga cgaggccatc 600
atgcttctga ccaagaagat gattgagatt cgggccattt tgtcgcgggt gcaggagtcg 660
gaggctctcc agctgccttc catcgttgtc attggctccc aatcgtccgg aaagtcgtct 720
gtgttggaag ccattgtggg tcacgagttc ttgcccaagg gttccaacat ggtgacccga 780
cggcctattg agctgacgct catcaacaca cccgattcgg cgtctgagta cggagagttc 840
cctgctctca acatgggcaa gatcacggac tttagcatga ttcagagaac tcttactgag 900
ctgaatttag ctgtccctga gaaggaatgc atctccgacg accccattca gctgcatatt 960
tactcaccca atgtacccga tctgaatctg actgatctgc ccggttacat tcaggtgtct 1020
tctcacgacc agcctattgc tctgaagacc aagatccaga aactgtgtga aaagtacatt 1080
cagcctccca acatcattct ggccatttct gccgccgatg tcgatcttgc caactcttcg 1140
gctctccgag cttctcgaag agttgatcct cagggcgaac gaactattgg tgtcatcaca 1200
aagatggatc tcgtcgaccc tattagagga tacaacgtcc tcaacaacaa ggagtaccct 1260
ctgagcatgg gttatgtcgg agttatcacc cgagctccct ctggaggtct gttccgacga 1320
tcttctcgag tcggagagct tgtttcagct aacgaatctg ccttcttctc ccaggcgccc 1380
gagtacaacg gctgcgaggt cggcaccaat ctgctcaagg aaaagctcat gtacaccctt 1440
gagaagacgc ttgctaagtc gctgatcccc acttttgacg ctgtgcagca ggagctcgag 1500
gaggccactt atatgttcaa ggtggaatac aacgatcggt cgctgactcc ctctacctac 1560
cttgcatctt cgctggacgc gttcaagcag gcgttcaagg acttttctaa atcgtttgac 1620
cgagatgagg tcaagaacct gcttcgatgc gagctggacc agcgggttct ggatctgctg 1680
gcccagcggt actggaacaa gcccattgtg gagctgcaaa atatgactgt gggcgacttt 1740
gcccaggacg ttcctctttc caagctctcc acggcctcca acgacgatcc ccactggcaa 1800
cgaaagctgg acgcctctac cagcaccctc accaagcttg gtatcggccg tctgagcacc 1860
aacctcgtca tcaactctct ggtgagcgac atggagcgtc tgacttcgaa cacgtcgttt 1920
gccggccatc cttttgcata ccaaaccatc cacgacgcgg cttcttctct gctcaacatg 1980
cgatactaca gcaccgccga gcaggttgag aactgtatca agccattcaa gtacgagatt 2040
gatatggatg accgggagtg ggctcatgct cgagatcact cctacgtgct gcttaaggag 2100
gagcttcggc agtgcgagca ggctctgtct tcgctcaagt ctaacattgg cagcagaaag 2160
ttgtcgcaag tgatgacttt tgtggacaag actcgggagc agcgaatgaa cggcaactct 2220
gtcgttactc cagccgaggg caccgaagca tacggcttct ctgctgctct gttgcaaaag 2280
ggacgggagg gtctctttct gaaagaccga actgaggtgc tcaagatgcg aatggccgcc 2340
atcaagtcgc gccagtgcaa gaacaaggac aacaagtaca attgtcccga gattttcctt 2400
aacgtggtgg ccgataagat gacgcagact gccgtgttgt tcctcaacgt ggagttgctc 2460
aatgactttt accacaactt tcctcgggag ctagacatgc ggtttggcca gaacttgacc 2520
aaggaccaga ttgacaagtt tgccaaggag gatcccaaaa tcaagcggca cattgagctt 2580
caggagcgaa aggagctact tgacgaggct ctgcataaga tcaaggacgt gattgcactg 2640
cagggcgcgc gggaacgagg agagcttggc cagctccagc agcgaaactt tagacgatga 2700
<210> 12
<211> 4398
<212> DNA
<213> 罗汉果(Grosmania clavigera)
<400> 12
atggagactg actccaagtc cgtcgaatcc ggtgagaccg ctgccatgcc cggccaacag 60
cagatttcct ctaacgccca aggtctgatc catgcctatt ccatggagct ggtcagatcc 120
tcctcccgag ctaccggtgg tggtggtgcc cccggtagaa atccctttac cggcacctcc 180
aacgaccccg ctctcgatcc tcattctaag gccttcgacg ctcgaagatg ggctcaagcc 240
gtgctccact ctaccggtga gggtcccgat cattgcccca gacctactgc cggcgtggct 300
tacagaaatc tccgagtgca cggttacggc tctcctaccg actaccagaa ggacgtcttt 360
aacgtcctcc tccaagcccc tctggaggct gcccaatact ttatgtcctc tcgacgaggt 420
agagaggtgc ctattctgag agacggtttt gacggtctcg tccgatccgg tgagatgctg 480
ctcgtgctgg gccgacccgg ttctggcgtg accactctgc tcaagactgt cgctggtgaa 540
accaacggtc tgcaagtgga cgctgaggcc tttatctcct atcaaggcat ccctatgcaa 600
gccatccaaa agagattcag aggcgaggtg gtgtatcaag ccgaaaccga cgtgcatttt 660
ccccagctga ccgtcggtca gaccctcctc tttgctgcca aggctcgaac cccccaaatg 720
agacccgacg gtgtcactag agcccagtac gccaagcaca ttcgagacgt ggtgatggcc 780
gtgttcggta tctcccacac cgtcaatacc agagtgggct ccgatctggt gcgaggtgtc 840
tctggcggcg agagaaagcg agtgtccatt gctgaggtcg ctctgtccgg ttccgctctg 900
cagtgctggg ataactccac cagaggtctc gactccgcct ccgccctctc ctttgctaac 960
actctgcgac tctccaccga actggccggc accactgctc tggtcgctat gtaccaagcc 1020
tccgaagctg cttacgagac ctttggcaag gtctgtctgc tgtacgaagg cagacaaatc 1080
ttcttcggtc ccgccaacga ggccaaggcc ttcttcgtgg acatgggcta tgaatgtccc 1140
gaccgacaga ccactgccga ctttctgact tctctcacca accccggcga gcgagtcgtg 1200
cgacccggct ttgaaaatcg agtccctcga acccccgacg atttcgtggc ctattggaag 1260
gcctctgcta ctagagcctc cctcctccaa gacattgccg agttcgacca agagcacccc 1320
atggatggta ctcctatcga ggccatggct accgtgcgaa aagctcatca agcccctctc 1380
acccccaaca agtctccctt taccctctcc ttccctcagc aagtcgccct ctgtatgacc 1440
agaggctacg agcgaaccat gggcgacaag accttcttta ttgtcaccgt gggcggcaat 1500
ctggtcattt ctctggtcct cggctctgtg ttctaccaac tctcccccga cgcttcttcc 1560
atcacctcca gatgtatcct cctcttcttc gccattctct tcaacgctct gtcctcttct 1620
ctggagattc tgtctctcta cgcccagcga cccatcgtcg agaagcacgc ccgatatgct 1680
ctctataccc cctctgccga agctgtgtcc tccgctttct gcgaactgcc ctccaagatt 1740
ttctccgcca tcgccttcaa cattcctctg tacttcatgg ctgatctgcg acatggtgcc 1800
ggtcattttt tcttcttcct cctcttcgcc tttacttgca ctctgaccat gtcctttatc 1860
ctccgaacta tcggccaagc ctcccgaacc gtccaagaag ccctcacccc cgctgccgtc 1920
ttcattatct ctctcgtcat ttataccggc tttgtcatcc ccgtcaagtc catgcaaggc 1980
tggatgagat ggattaacta tctcaatccc attgcttacg cctatgagtc tctgctggtg 2040
aacgaactct ccggccgaaa tttcccttgt gcctctttcg tccccgccta tcctaacctc 2100
tcctcctccg agcacacttg ttccaccgct ggtgccgctc ccggtgccga ctttgtggtc 2160
ggtgacacca ttctcaactc ctcctacgag tactaccacg ctcacaaatg gagaaacctc 2220
ggtatcctca ttggcttcct cattgccttc ttcttcgcct atctcgtcgc ctctgaatac 2280
atcaccgctg agcagtctaa gggcgaggtg ctcgtgttcc gaagaggcca taaggagtcc 2340
gctgtcgtcg aaagaaagac tgctacctcc gatgactctg acggcgagaa gggccaccaa 2400
accgagcaga aggacatctg ccattggcga aatgtgtgct acgacattac cattaagggc 2460
caaggccgaa gactgctgga tcatgtggac ggttgggtga agcccggcac tctcacttgt 2520
ctcatgggtg tgtctggtgc tggtaaaacc actctgctgg acgtgctggc caatcgagtg 2580
accatgggcg tcgtgaccgg cgacatgctg gtgaatggct cccccagaga ttcttccttc 2640
cagcgaaaga ctggctacgt gcagcagcaa gatgtccacc tcgaaacttc tactgtgcga 2700
gaagctctcc gattctccgc ccagctccga cagcccacta ccgtctctac tcaagacaaa 2760
tatatcttcg tggaggaagt catcgaactg ctggagatgg acgagtatgc tgatgccatt 2820
gtgggtgtcc ccggcaccgg tctgaatgtc gagcagagaa agcgactgac cattggcgtg 2880
gagctggccg ctaaacccga tctgctcctc ttcctcgacg agcccacttc tggcctcgat 2940
tctcagaccg cttggtccgt cgctgctctg atccgaaaac tctctgcccg aggccaagcc 3000
gtcctctgca ccatccacca gccctccgct ctcctctatc agcagtttga ccggattctg 3060
ctgctggccg ctggcggtcg aactgtgtac ttcggcgata ttggccctaa cgccgagacc 3120
attatctcct acttcgagcg aaatggcgct gagccttgcg gccaagacga aaaccccgcc 3180
gagtggatgc tctctgtcat tggtgccggt cccggcggcg tcgccaagca agactgggtg 3240
tccatttggc gaaactctga cgagtactcc gctgtgcaag ccgaactcga caatctggcc 3300
aagcgaaagg acaccatggc ttcttctggc gccactgatg ctgccgctgt gaccacttat 3360
gccacccctt tcttcttcca gctgtacatg tgctccaaga gagtctttga gcagtactgg 3420
agaaccccct cctatatcta tgctaagatg attctgtgtt tcgccgtgtc cctctttatt 3480
ggcctctcct tccgaaaggc ccctctctcc gagcaaggtc tgcaaaacca gatgttttct 3540
atctttatgc tgctggtcat cttcgccttt ctggcctatc agaccatgcc ccacttcatc 3600
agacaacgag agctctacga gatccgagaa cgagcttccc gaacctactc ttggtacgtg 3660
ttcatgctgg ccaacatcat tgtcgaactg ccttggaata ctatcgcttc tctgctcgtc 3720
ttcctccctt tttactacat tgtcggcatg aaccacaacg ccgaggccac ccattctgtc 3780
tctgaacgag gcggcctcat gtttctgctg gtctgggtgt ttctggtgtt tgaatctacc 3840
ttcactgaca tggtcgtggc tggttcccct actgccgaac tgggtgccac tatggctctg 3900
ctgctcttcg ctttcaccct catcttttgc ggtgtcatgg tgggtaagga ccaactcccc 3960
ggcttttgga ttttcatgta ccgagtgtct cccctcacct atctggtggg cggtctgctc 4020
gccactggcg tgggtcacca cgaggtcact tgtaccgcca gagaactgct gtctttccaa 4080
cccgtgggca accagacttg tctggagtat atgaccccct acatgaagct ggccggcggt 4140
aaagtcatca accccaatgc tgtcgctccc gcttcttgcg agttttgtac cctcgctaac 4200
accgacgcct ttctcgcctc tattaacgtg tcctacgacc aacgatggag agatttcggt 4260
ctgatgtggg cctacgtcgt cttcaatgtc ttcggcgctc tgttcatgta ctggctcgtc 4320
cgagctccca aaggcgatct gaaagcccga ctcttcaaac tcgtcggcaa gaccgctcat 4380
caccaccacc accattaa 4398
<210> 13
<211> 78
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 13
atgctttcac tacgtcaatc tataagattt ttcaagccag ccacaagaac tttgtgtagc 60
tctagatatc tgcttcag 78

Claims (10)

1.一株生产α-红没药烯的工程菌，其特征在于，所述工程菌是在解脂耶氏酵母宿主菌中表达乙酰辅酶A硫解酶AACT、羟甲基戊二酰乙酰辅酶A合酶HMGS、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR、甲羟戊酸激酶MK，磷酸甲羟戊酸激酶PMK、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶PDO、异戊烯基二磷酸异构酶IDI、法尼基焦磷酸合酶FPPS和外源α-红没药烯合酶α-BS，并将上述酶定位至线粒体。
2.如权利要求1所述的一株生产α-红没药烯的工程菌，其特征在于，还在宿主细胞中表达添加了线粒体定位信号的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR。
3.如权利要求1所述的一株生产α-红没药烯的工程菌，其特征在于，还在宿主细胞中表达线粒体丙酮酸脱氢酶PDA1。
4.如权利要求1所述的一株生产α-红没药烯的工程菌，其特征在于，还在宿主细胞中表达线粒体动态调控蛋白MGM1。
5.如权利要求1所述的一株生产α-红没药烯的工程菌，其特征在于，还在宿主细胞中表达ATP依赖型转运蛋白ABC-G1。
6.如权利要求1所述的一株生产α-红没药烯的工程菌，其特征在于，通过线粒体定位信号MLS将上述蛋白酶定位至线粒体进行表达，所述线粒体定位信号MLS的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.13所示。
7.如权利要求1所述的一株生产α-红没药烯的工程菌，其特征在于，所述解脂耶氏酵母宿主菌为解脂耶氏酵母Po1gΔKU70菌株。
8.如权利要求1所述的一株生产α-红没药烯的工程菌，其特征在于，
所述AACT，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述HMGS，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述HMGR，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述MK，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述PMK，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述PDO，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示
所述IDI，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述FPPS，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示
所述α-BS，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
所述PDA1，核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
所述MGM1，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
所述ABC-G1，核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
9.权利要求1-8任意一项所述工程菌在生产α-红没药烯中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，发酵生产α-红没药烯中的方法如下：
将所述工程菌接种于YPD培养基中，培养温度为20-30℃，转速220-250rpm，培养时间为120±5h；
所述YPD培养基组成为：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量为水，pH5.7-5.8，115℃，灭菌20min。
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WO2018069418A2 (en) * 2016-10-11 2018-04-19 Evolva Sa Production of citronellal and citronellol in recombinant hosts
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