CN108676766A

CN108676766A - 基因修饰的应用及其获得的菌株

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Publication number: CN108676766A
Application number: CN201810557889.1A
Authority: CN
Inventors: 宋浩; 杨绍梅; 曹英秀; 张国银; 蔡志刚
Original assignee: CHIFENG PHARMACEUTICAL Co Ltd; Tianjin University
Current assignee: CHIFENG PHARMACEUTICAL Co Ltd; Tianjin University
Priority date: 2018-06-01
Filing date: 2018-06-01
Publication date: 2018-10-19
Anticipated expiration: 2038-06-01
Also published as: CN108676766B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及基因修饰的应用及其获得的菌株。本发明以实验室已构建的来源于B.subtilis 168的MK3‑MEP123为出发菌株，首先过表达甘油‑3‑磷酸脱氢酶(GlpD)，增加甘油‑3‑磷酸到二羟丙酮磷酸的转化，考察其对MK‑7合成的影响；其次敲除dhbB基因减少异分支酸的消耗，考察其对MK‑7合成的影响；最后通过2L摇瓶发酵，考察氧及碳氮源的供应对MK‑7合成的影响。为将来工业上通过代谢工程方法构建纳豆芽孢杆菌高产MK‑7菌株提供基础研究和理论依据。

Description

基因修饰的应用及其获得的菌株

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及基因修饰的应用及其获得的菌株。

背景技术

甲基萘醌-7是脂溶性维生素K₂的一种，维生素K的天然存在形式包括植物来源的维生素K₁(又称叶绿醌，PK)和细菌来源的维生素K₂(又称甲基萘醌，MK)。根据侧链中异戊二烯单元数量的不同，总共有14种甲基萘醌，记为MK-n，常见的有MK-4和MK-7等。在原核生物中，MK-n参与呼吸链的电子传递。对于人类和其他哺乳动物，由于维生素K是血液和骨骼中特定蛋白的谷氨酸残基翻译转化为γ-羧基谷氨酸(Gla)的重要辅因子，因此用来维持钙稳态、抑制血管壁钙化、支持内皮完整性、促进骨矿化，并参与组织更新和细胞生长控制。常见的维生素K依赖性蛋白包括凝血因子(II、VII、IX、X和凝血酶原)、蛋白C和蛋白S、骨钙蛋白、基质Gla蛋白(MGP)、骨膜素等。有研究表明，尽管食物中的PK含量较高，但与MK-n(尤其是MK-7)相比，生物活性较差；长链MK-n如MK-7对正常凝血的作用比PK和MK-4更持久。因此，由于其半衰期长、生物利用度好，MK-7在食品、制药和保健行业更受欢迎，被广泛用作膳食补充剂或药物，用于治疗骨质疏松症、动脉钙化、心血管疾病、癌症和帕金森精神病等。

传统的MK-7生产方法是通过对纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)进行经典诱变或发酵优化。Toshiro Sato等从日本食物纳豆中分离出菌株B.subtilis，通过传统诱变筛选出甲萘醌抗性菌株，在7L罐中发酵4天可产35mg/L的MK-7；筛选出的二苯胺抗性菌株，上罐发酵37℃1天，45℃5天可产60mg/L的MK-7。Song等人筛选出的1-羟基-2-萘甲酸抗性突变株B.subtilis natto，在500mL瓶中发酵72小时可产3.593±0.107mg/L的MK-7。Miao-miaoLuo等人对分离出的菌株Bacillus natto的发酵培养基及发酵条件和MK-7的萃取方法进行优化，在5L反应器中发酵72小时可产32.2mg/L的MK-7。最近也有研究通过代谢途径工程的方法，来提高解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)中MK-7的产量。Jian-ZhongXu等人从中国豆豉中分离出6株产纤维蛋白原酶的B.amyloliquefaciens菌株，发现菌株B.amyloliquefaciens Y-2能够产生7.1±0.5mg/L的MK-7。序列分析表明以下六个酶经历了错义突变：MenA，MenC，MenD，MenE，MenH，HepS。通过在枯草芽孢杆菌168中过表达菌株Y-2的这六个酶，发现MenA的过表达使得MK-7的含量增加1.6倍，优于其它酶；在解淀粉芽孢杆菌Y-2中过表达自身的这六个酶，发现HepS的过表达导致MK-7的产量最高，达到273±5.4克/干细胞重量(DCW)。

到目前为止，还未发现有对MK-7的从头生物合成途径进行全面系统的研究。由于对枯草芽孢杆菌的生物化学、遗传学和分子生物学的研究有很多，且其生长速度快，并'通常被认为安全'(GRAS)的，所以枯草芽孢杆菌是最佳表征的模式微生物之一。而且枯草芽孢杆菌168的完整基因组序列已被测序完成，这有利于通过基因工程的手段构建工业生产菌株。因此，我们选择枯草芽孢杆菌168作为底盘细胞，对从甘油合成MK-7的整体合成路径进行全面系统的研究。

Miao-miao Luo等人和Aydin Berenjian等人比较了四种碳源：可溶性淀粉，蔗糖，葡萄糖和甘油，对B.subtilis natto合成MK-7以及生长的影响，发现甘油作为碳源时MK-7产量最高。在枯草芽孢杆菌内，仅存在一条甘油异化途径，主要包括将甘油磷酸化为甘油-3-磷酸(Gly-3P)的甘油激酶(GlpK)和将Gly-3P氧化为磷酸二羟丙酮(DHAP)的Gly-3P脱氢酶(GlpD)。甘油在膜通道蛋白(GlpF)的帮助下通过促进扩散的方式进入细胞内，依次经甘油激酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶催化合成甘油醛-3-磷酸(G3P)，随后进入糖酵解过程。本实验室之前的研究表明，甲基赤藓糖醇-4-磷酸路径(MEP路径)对MK-7的合成非常重要，尤其是脱氧木酮糖合成酶(Dxs)催化的MEP路径的第一步反应：G3P和丙酮酸(Pyr)的缩合成脱氧木酮糖(DXP)。因此，增强甘油向G3P的转化将有望进一步促进MK-7的合成。在枯草芽孢杆菌内，将Gly-3P氧化为DHAP的Gly-3P脱氢酶(GlpD)，是甘油代谢途径中的关键酶。

此外，枯草芽孢杆菌可利用合成肠菌素的前体物：2,3-二羟基苯甲酸(DHB)及其甘氨酸衍生物(DHBG)作为铁载体，即一种低分子量的铁离子螯合剂，来响应铁的剥夺。dhbACEBF操纵子负责合成DHB，且异分支酸裂合酶(DhbB)催化第一步反应，即催化异分支酸裂解成2,3-二羟基-2,3-二羟基苯甲酸(DHDHB)。而异分支酸是合成MK-7的重要中间代谢物，因此切断异分支酸的消耗，理论上可促进MK-7的合成。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种基因修饰的应用及其获得的菌株。该枯草芽孢杆菌高产MK-7菌株，具有精确修饰目标基因、次级突变概率低、遗传育种周期短的优势。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了过表达基因和/或敲除基因在提高微生物次级代谢产物的代谢通量中的应用；

所述基因具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

I、具有基因glpD和/或dhbB的核苷酸序列；

II、具有如I所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

III、与如I所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或翻译后所得蛋白与基因glpD和/或dhbB表达的蛋白功能相同或相近的核苷酸序列；

IV、如IV、Ⅴ或Ⅵ所示序列的互补序列。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供了过表达基因glpD在提高微生物次级代谢产物的代谢通量中的应用。

本发明还提供了过表达基因menA、dxs、dxr、yacM-yacN、glpD和/或dhbB在提高微生物次级代谢产物的代谢通量中的应用；

所述基因具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

V、具有基因menA、dxs、dxr、yacM-yacN、glpD和/或dhbB的核苷酸序列；

VI、具有如V所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的

核苷酸序列；

VII、与如V所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或翻译后所得蛋白与基因menA、dxs、dxr、yacM-yacN、glpD和/或dhbB表达的蛋白功能相同或相近的核苷酸序列；

VIII、如V、VI或VII所示序列的互补序列。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明还提供了过表达基因menA、dxs、dxr、yacM-yacN、glpD和/或dhbB在提高微生物次级代谢产物的代谢通量中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述次级代谢产物为甘油代谢路径的产物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述微生物为原核生物；所述次级代谢产物醌类物质。

在本发明的一些具体实施方案中，所述原核生物为枯草芽孢杆菌；所述醌类物质为甲基萘醌-7。

本发明还提供了菌株，其基因过表达或被敲除；

所述基因具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

IX、具有基因glpD和/或dhbB的核苷酸序列；

X、具有如IX所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

XI、与如IX所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或翻译后所得蛋白与基因glpD和/或dhbB表达的蛋白功能相同或相近的核苷酸序列；

XII、如IX、X或XI所示序列的互补序列。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明还提供了一种菌株，其基因glpD过表达。

本发明还提供了菌株，其基因过表达；

所述基因具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

XIII、具有基因menA、dxs、dxr、yacM-yacN、glpD和/或dhbB的核苷酸序列；

XIV、具有如XIII所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

XV、与如XIII所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或翻译后所得蛋白与基因menA、dxs、dxr、yacM-yacN、glpD和/或dhbB表达的蛋白功能相同或相近的核苷酸序列；

XVI、如XIII、XIV或XV所示序列的互补序列。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明还提供了一种菌株，其基因menA、dxs、dxr、yacM-yacN、glpD和/或dhbB过表达。

在本发明的一些具体实施方案中，所述菌株为原核生物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述原核生物为枯草芽孢杆菌。

本发明还提供了所述的菌株在提高微生物次级代谢产物的代谢通量中的应用。在本发明的一些具体实施方案中，所述次级代谢产物为甘油代谢路径的产物。

本发明还提供了所述菌株的发酵方法，包括补料发酵的步骤。

在本发明的一些具体实施方案中，所述补料发酵为在发酵过程中补加2～6％(v/v)的甘油和/或5～18.9％(w/v)的大豆蛋白胨。

在本发明的一些具体实施方案中，所述补料发酵为在发酵48h和96h均补加1％(v/v)的甘油和/或2％(w/v)的大豆蛋白胨。

本实验的发酵培养基配方为：3％甘油，6％大豆蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.3％K₂HPO₄，0.05％MgSO₄·7H₂O，pH 7.3。利用250mL摇瓶进行发酵，菌株的生长一般在发酵的120小时达到最大，最后生长下降。然而在2L挡板三角瓶中，同样的发酵培养基及发酵条件，菌株在发酵的48小时达到最大，随后菌株生长下降，所以为了延长菌株生长的稳定期，选择在发酵的48小时和96小时分别同时补加1％的甘油(v/v)和2％(v/v)大豆蛋白胨，发酵培养基中的甘油及大豆蛋白胨的终浓度分别达到5％和10％。

迄今为止，一般是通过对纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)进行传统诱变或发酵优化来生产MK-7。由于纳豆芽孢杆菌的基因组信息不完整且分子操作技术不成熟，故本发明选择与其生理生化特征相似的、革兰氏阳性模式菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)进行基础研究。本发明以实验室已构建的来源于B.subtilis 168的MK3-MEP123为出发菌株，首先过表达甘油-3-磷酸脱氢酶(GlpD)，增加甘油-3-磷酸到二羟丙酮磷酸的转化，考察其对MK-7合成的影响；其次敲除dhbB基因，切断铁载体的合成，减少异分支酸的消耗，考察其对MK-7合成的影响；最后通过2L摇瓶发酵，考察氧及碳氮源的供应对MK-7合成的影响。为将来工业上通过代谢工程方法构建纳豆芽孢杆菌高产MK-7菌株提供基础研究和理论依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示枯草芽孢杆菌内MK-7的生物合成路径；物质简写：Gly，甘油；Gly-3P，甘油-3-磷酸；DHAP，二羟丙酮磷酸；G3P，甘油醛-3-磷酸；E4P，赤藓糖-4-磷酸；DAHP，3-脱氧-阿拉伯糖-庚酮酸7-磷酸；CHA，分支酸；ICHA，异分支酸；SEPHCHC，2-琥珀酰基-5-烯醇丙酮酰-6-羟基-3-环己烯-1-羧酸酯；MK-7，甲基萘醌-7；PEP，磷酸烯醇式丙酮酸；Pyr，丙酮酸；DXP，1-脱氧木酮糖-5-磷酸；Hepta-PP，庚异戊二烯基焦磷酸；酶：GlpF，甘油吸收蛋白；GlpK，甘油激酶；GlpD，甘油-3-磷酸脱氢酶；DhbB，异分支酸裂合酶；

图2示出发菌MK3-MEP123及重组菌MK3-MEP123-glpD的菌体生长情况(图2A)和MK-7产量图(图2B)；

图3示示重组菌MK3-MEP123-glpD及敲除菌MK3-MEP123-glpD-ΔdhbB的菌体生长情况(图3A)和MK-7产量图(图3B)；

图4示示在2L挡板三角瓶中对菌株MK3-MEP123-glpD-ΔdhbB进行发酵时的菌体生长情况(图4A，□)和MK-7产量图(图4B，■)；当在发酵的48小时和96小时，分别同时补加1％的甘油和2％大豆蛋白胨，此时的菌体生长情况(图4C，△)和MK-7产量图(图4D，▲)。

具体实施方式

本发明公开了一种基因修饰的应用及其获得的菌株，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是重要的工业菌株，基因组信息完整、分子操作技术及发酵技术成熟。本发明以MK3-MEP123为出发菌株，促进甘油利用率，减少异分支酸消耗，并通过在2L摇瓶中进行发酵，考察氧及碳氮源对MK-7合成的影响，为将来遗传改造纳豆芽孢杆菌构建MK-7高产菌株提供基础研究和理论依据。本发明通过基因修饰方法和发酵优化促进枯草芽孢杆菌合成MK-7。

1、对枯草芽孢杆菌的甘油代谢路径的甘油-3-磷酸脱氢酶的编码基因glpD进行过表达，表明glpD的过表达有利于MK-7的合成。

2、敲除枯草芽孢杆菌的异分支酸裂合酶编码基因dhbB，考察其对MK-7合成的影响，发酵结果表明，dhbB的敲除，减少了前体物异分支酸的消耗，促进了MK-7的合成。

3、在2L挡板三角瓶中进行发酵，MK-7的产量增加，但细菌生长的稳定期很短；补料发酵时，细菌生长的稳定期延长，且MK-7的产量大幅增加，说明氧及碳氮源的及时供应对MK-7的合成很重要。

与传统诱变相比，通过代谢工程构建枯草芽孢杆菌高产MK-7菌株，具有精确修饰目标基因、次级突变概率低、遗传育种周期短的优势。

根据本发明的实验方法及结论，可将该模块化设计同样应用于纳豆芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，但由于二者的分子信息不完整，首先需要测序确定其基因序列，再进行后续实验设计及基因改造；分子技术缺乏即只能用整合质粒。在本发明的基础上结合分子生物学的技术获得的相应技术方案均在本发明的保护范围之内。

材料:

菌株、质粒和培养基:

本发明涉及的所有质粒和菌株信息详见表1。

LB培养基(蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L)用于B.subtilis的一般培养，固体培养基添加15g/L琼脂粉，需要时新霉素16μg/mL，或氯霉素8μg/mL。发酵培养基：甘油30mL/L，大豆蛋白胨60g/L，酵母提取物5g/L，K₂HPO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，pH7.3。

表1实验中涉及的菌株

试剂及仪器:

FastTaq酶、Hifi DNA聚合酶、dNTP均购自北京全式金生物技术有限公司；RNAprepPure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒、FastQuant cDNA第一链合成试剂盒、SuperReal荧光定量预混试剂盒均购自天根公司；标准品MK-7购自ChromaDex公司；其余生化试剂为进口或国产分析纯试剂。所用仪器：漩涡混合器、真空离心浓缩仪、高效液相色谱仪(Waters)、LightCycler 480(Roche)。

引物用于PCR的引物见表2。

表2 PCR引物序列

方法:

DNA操作:所有DNA片段都来自PCR扩增；用于转化的DNA片段均采用重叠PCR方法拼接形成。B.subtilis感受态细胞的制备及转化采用Spizizen方法。在染色体上的基因过表达和基因敲除均采用无标记修饰方法，即利用反选择盒(P_ara-neo)和选择盒(cat-araR)来完成。引物合成及DNA测序均由金唯智生物科技有限公司(苏州，中国)负责。

出发菌株MK3-MEP123的构建：

选择B.subtilis染色体的yxlA位点过表达menA基因。首先以B.subtilis 168的染色体为模板，分别用引物yxlA-menA-U1/yxlA-menA-U2q，yxlA-menA-1q/yxlA-menA-2，yxlA-menA-D1q/yxlA-menA-D2，yxlA-menA-G1q/yxlA-menA-G2扩增片段U(1115bp)、A(1057bp)、D(1053bp)、G(806bp)；以质粒pUC57-1.8k-P1为模板，用引物yxlA-menA-P1/yxlA-menA-P2扩增含有启动子P_lapS的片段P(442bp)；以实验室保存的BS168NUm的染色体为模板，用引物yxlA-menA-CR1q/CR2扩增片段CR(2069bp)。然后通过重叠PCR方法，利用引物yxlA-menA-U1/yxlA-menA-2，将片段U、P和A拼接成片段UPA(2614bp)；再利用引物yxlA-menA-U1/yxlA-menA-D2将片段UPA和片段D拼接成片段UPAD(3667bp)；最后利用引物yxlA-menA-U1/yxlA-menA-G2将片段UPAD、片段CR和片段G拼接成片段UPADCRG(6542bp)。将UPADCRG片段转化受体菌BS168NU的感受态细胞，经过两步筛选，最终获得P_lapS-menA基因在yxlA位点整合的重组菌株MK3。

选择B.subtilis染色体的yjoB位点过表达dxs基因。首先以B.subtilis 168的染色体为模板，分别用引物yjoB-dxs-U1/yjoB-dxs-U2q，yjoB-dxs-1q/yjoB-dxs-2，yjoB-dxs-D1q/yjoB-dxs-D2，yjoB-dxs-G1q/yjoB-dxs-G2扩增片段U(1236bp)、s(1947bp)、D(808bp)、G(697bp)；以质粒pUC57-1.8k-P2为模板，用引物P₄₃1/P₄₃2扩增含有启动子P₄₃的片段P(232bp)；以实验室保存的BS168NUm的染色体为模板，用引物yjoB-dxs-CR1q/CR2扩增片段CR(2069bp)。然后通过重叠PCR方法，利用引物yjoB-dxs-U1/yjoB-dxs-2，将片段U、P和s拼接成片段UPs(3415bp)；再利用引物yjoB-dxs-U1/yjoB-dxs-D2将片段UPs和片段D拼接成片段UPsD(4223bp)；最后利用引物yjoB-dxs-U1/yjoB-dxs-G2将片段UPsD、片段CR和片段G拼接成片段UPsDCRG(6989bp)。将UPsDCRG片段转化受体菌MK3的感受态细胞，经过两步筛选，最终获得P₄₃-dxs基因在yjoB位点整合的重组菌株MK3-MEP1。

在菌株MK3-MEP1的基础上，依次过表达dxr和yacM-yacN，得到重组菌株MK3-MEP123。

本发明提供的基因修饰的应用及其获得的菌株中所用菌株、原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1过表达甘油-3-磷酸脱氢酶基因glpD

选择B.subtilis染色体的pksJ位点过表达glpD基因，该位点与MK-7合成路径没有关系且经枯草芽孢杆菌最小基因组研究表明，其的敲除不影响细胞正常生长特性。首先以本实验室保存的中间菌YqiD-CR的染色体为模板，分别用引物pksJ-glpD-U1/pksJ-glpD-U2q和pksJ-glpD-D1q/pksJ-glpD-G2扩增片段UP(如SEQ ID No.15所示，1806bp)和DCRG(如SEQ ID No.17所示，3917bp)；以出发菌B.subtilis MK3-MEP123的染色体为模板，用引物pksJ-glpD-1/pksJ-glpD-2扩增glpD基因的片段D(如SEQ ID No.16所示，1749bp)；然后通过重叠PCR方法，拼接成UPDDCRG(7472bp)。用UPDDCRG片段转化受体菌MK3-MEP123的感受态细胞，最终筛选获得P₄₃-glpD基因在pksJ位点整合的重组菌株MK3-MEP123-glpD。

UPDDCRG片段序列(如SEQ ID No.22所示)：

本发明通过调控glpD基因，考察其对MK-7合成的影响。在枯草芽孢杆菌内，甘油-3-磷酸脱氢酶GlpD催化甘油-3-磷酸脱氢生成二羟丙酮磷酸，后者经磷酸丙糖异构酶催化合成甘油醛-3-磷酸(G3P)，随后进入糖酵解过程。本实验室已获得一株MK-7生产菌株B.subtilis MK3-MEP123，且之前的研究表明，甲基赤藓糖醇-4-磷酸路径(MEP路径)对MK-7的合成非常重要，尤其是脱氧木酮糖合成酶(Dxs)催化的MEP路径的第一步反应：G3P和丙酮酸(Pyr)的缩合成脱氧木酮糖(DXP)。因此为了进一步提高MK-7的产量，本发明以MK3-MEP123为出发菌，利用启动子P₄₃在染色体的pksJ位点过表达glpD基因，得到重组菌MK3-MEP123-glpD。通过摇瓶发酵，得到该菌株的菌体生长情况和在发酵96h和120h的MK-7产量。

摇瓶发酵培养及菌体生长的测定

表3发酵培养基及发酵条件

参数	范围
		甘油	20～80mL/L
大豆蛋白胨	60～180g/L
		酵母提取物	0～20g/L
K₂HPO₄	1～5g/L
		MgSO₄·7H₂O	0.1～0.8g/L
pH	6.5～7.5
		接种量	1％～6％
温度	35～45℃
		转速	100～250r/min
发酵时间	72-144h

250mL摇瓶发酵：挑取新活化的平板单菌落接入装有5mL LB培养基的试管中，200r/min、37℃振荡培养14h；按1％接种量转接装有30mL发酵培养基的250mL锥形瓶中(三个平行)，37℃、黑暗条件下、200r/min振荡培养144h。

2L摇瓶发酵：挑取新活化的平板单菌落接入装有5mL LB培养基的试管中，200r/min、37℃振荡培养14h；然后取100μL菌液转接装有100mL发酵培养基的500mL锥形瓶中；200r/min、37℃振荡培养12h；最后取25mL发酵液加入装有225mL发酵培养基的2L挡板三角瓶(三个平行)，在37℃、黑暗条件下、200r/min振荡培养72h。补料发酵时：在发酵的48h，补加1％(v/v)的甘油和2％(w/v)的大豆蛋白胨；在发酵的96h，再补加1％(v/v)的甘油和2％(w/v)的大豆蛋白胨，来维持细菌的生长发酵到144h。

生物量的测定：首先间隔6h，中间间隔12h，后面间隔24h取适量发酵液，13000r/min离心1min沉淀细胞，洗涤后重悬、稀释适当倍数，测定菌悬液的OD₆₀₀值。

实时定量反转录PCR分析：

取菌体生长稳定期初期(48h)的发酵液1mL，12000r/min离心1min收集菌体，利用RNAprep Pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒提取RNA，然后根据FastQuant cDNA第一链合成试剂盒说明加入反应体系进行反转录得到cDNA，最后根据SuperReal荧光定量预混试剂盒说明加入反应体系进行荧光定量PCR，得到C_t值，根据公式根据2^-△△Ct法计算待测基因的相对表达量。(其中，△△C_t＝[(C_{t(target,test)}-C_t(ref,test)-(C_{t(target,calibrator)}-C_{t(ref,calibrator)})]；target：目标基因；ref：内参基因，该实验选择ccpA为内参基因；test：待测样本；calibrator：参照样本)。

MK-7的提取及HPLC检测：

取96h和120h发酵液750mL，向其加入1mL的异丙醇和2mL的正己烷，漩涡震荡2min，3000r/min离心10min，取上清750μL进行真空离心浓缩，最后加入500μL甲醇进行溶解。经0.25μm滤膜过滤，取滤液进行HPLC检测。所有过程应尽量避光。

色谱条件：色谱柱，C18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)；检测器，Waters2998PDA；流动相，纯甲醇；柱温，50℃；检测波长为270nm；流速1.0mL/min。定量方法：使用相同的色谱条件测定标准品MK-7的标准溶液，绘制浓度-峰面积标准曲线，对MK-7定量。

由表4可知，与出发菌相比，重组菌的生长趋势基本不变，但生长情况降低。由表5可知，利用P₄₃启动子过表达glpD后，glpD的mRNA表达水平是出发菌的3.72倍，说明该启动子是有效的。由表6可知，发酵96h后，出发菌的MK-7产量为9.456mg/L，重组菌的MK-7产量为9.500mg/L，较出发菌基本没有提高；发酵120h后，出发菌的MK-7产量为12.044mg/L，重组菌的MK-7产量为13.648mg/L，较出发菌提高13.3％，即两株菌在120h的MK-7产量差异较96h的差异显著，说明随着发酵时间的延长，MK-7合成量增加，过表达glpD的效果更能得到凸显。研究结果表明过表达甘油-3-磷酸脱氢酶(GlpD)的确可促进MK-7的合成，并且随着发酵时间的延长，MK-7产量越高。具体如图2所示。

表4菌体生长情况

发酵时间(h)	OD₆₀₀(MK3-MEP123)	OD₆₀₀(MK3-MEP123-glpD)
			6	1.513±0.173	4.696^#±0.211
12	8.203±0.013	8.004±0.129
			24	7.954±0.078	4.458^#±0.079
48	9.131±0.158	5.412^#±0.446
			72	7.648±0.616	10.217^#±0.364
96	10.505±0.481	10.536±0.127
			120	16.541±0.737	12.866^#±0.583
144	12.326±0.189	9.559^#±0.501

注：^*示与出发菌MK3-MEP123相比具有显著差异(P＜0.05)；^#示与出发菌MK3-MEP123相比具有极显著差异(P＜0.01)。

表5 glpD的相对转录水平

菌株	glpD的相对转录水平
		MK3-MEP123	1.00
MK3-MEP123-glpD	3.72^#±0.16

表6 MK-7产量

发酵时间(h)	C(MK3-MEP123)(mg/L)	C(MK3-MEP123-glpD)(mg/L)
			96	9.456±0.024	9.500±0.028
120	12.044±0.008	13.648^#±0.196

实施例2敲除乳酸脱氢酶编码基因dhbB

以出发菌B.subtilis MK3-MEP123的染色体为模板，分别用引物dhbB-U1/dhbB-U2、dhbB-D1q/dhbB-D2和dhbB-G1q/dhbB-G2扩增片段U(如SEQ ID No.18所示，1003bp)、D(如SEQ ID No.19所示，815bp)和G(如SEQ ID No.21所示，605bp)；以本实验室保存的中间菌YqiD-CR的染色体为模板，用引物dhbB-CR1q/CR2扩增带有选择盒(cat-araR)的片段CR(如SEQ ID No.20所示，2069bp)。首先通过重叠PCR，利用引物dhbB-U1/dhbB-D2，将片段U和D拼接成UD(1818bp)；然后利用引物dhbB-U1/dhbB-G2，通过重叠PCR方法，将上述三个片段UD、GR和G拼接成UDCRG(4492bp)。将UDCRG片段转化受体菌MK3-MEP123-glpD的感受态细胞，最终筛选获得基因dhbB被敲除的重组菌株MK3-MEP123-glpD-Δldh。

UDCRG片段序列(如SEQ ID No.23所示)：

从图1可知，异分支酸除参与MK-7的合成，还可经异分支酸裂合酶催化生成2,3-二羟基-2,3-二羟基苯甲酸(DHDHB)，用于铁载体杆菌素的合成。故本发明以MK3-MEP123-glpD为出发菌，减少异分支酸的消耗，考察其对MK-7合成的影响。基因敲除菌株的生长情况见表7，菌体的生长略有提高。敲除异分支酸裂合酶的编码基因dhbB，阻断铁载体杆菌素的合成，导致96h，MK-7产量增加20.8％，为11.474mg/L；120h时，MK-7产量增加12.7％，为15.375mg/L(见表8)，说明减少异分支酸的消耗，增加其供应有利于MK-7的合成。如图3所示。

表7菌体生长情况

注：^*示与MK3-MEP123-glpD相比具有显著差异(P＜0.05)；^#示与MK3-MEP123-glpD相比具有极显著差异(P＜0.01)。

表8 MK-7产量

发酵时间(h)	C(MK3-MEP123-glpD)(mg/L)	C(MK3-MEP123-glpD-ΔdhbB)(mg/L)
			96	9.500±0.028	11.474^#±0.052
120	13.648±0.196	15.375^#±0.601

实施例3发酵培养

为了考察发酵条件的扩大对重组菌MK3-MEP123-glpD-ΔdhbB生长及MK-7合成能力的影响，本发明将250mL锥形瓶中的发酵条件放大到2L挡板三角瓶中。由表7可知，同样的培养基及发酵条件，在250mL锥形瓶中发酵时，在120h时OD₆₀₀达到最大，随后生长下降；但在2L摇瓶中发酵时，在48h时OD₆₀₀就达到最大，随后迅速下降，即细菌生长稳定期很短，说明此时碳源或氮源不足，导致生长下降(见表9)。由表10可知，虽然细菌生长在发酵72h时迅速下降，但此时MK-7却大量合成，为38.877mg/L。取48h的发酵液，13000rpm、4℃离心8min，分别取上清及细胞沉淀提取并测定其中的MK-7含量，由表11可知，分泌到胞外的MK-7约占总合成量的24.8％。

稳定期越长，代谢物积累越多。为了延长细菌生长的稳定期，本发明采取补料发酵，即分别在发酵的48h和96h均补加1％(v/v)的甘油和2％(w/v)的大豆蛋白胨。由表9可知，补料条件下，细菌生长的稳定期得到延长，且在120h时OD₆₀₀达到最大，随后生长下降，验证了就是碳源或氮源的不足导致细菌生长的下降。由表10可知，在发酵的72h，虽然生长较未补料发酵时好，但产量却低于未补料发酵时72h的产量，可能是由于碳氮源的增加存在一定的阻遏作用或者碳氮源的配比不合适，不利于MK-7的合成，因此随时监测碳氮源消耗并流加更利于MK-7的合成；在发酵144h后，MK-7产量为69.528mg/L。取96h、120h及144h的发酵液，分别检测上清及细胞沉淀中的MK-7含量，由表11可知，这三个时间点，分泌到胞外的MK-7占总合成量的比例差别不大，约为23-25％。如图4所示。

表9菌体生长情况

注：^*示与正常发酵相比具有显著差异(P＜0.05)；^#示与正常发酵相比具有极显著差异(P＜0.01)。

表10 MK-7产量

发酵时间(h)	C(正常发酵)(mg/L)	C(补料发酵)(mg/L)
			6	1.693±0.128	1.693±0.128
12	5.269±0.004	5.269±0.004
			24	13.071±0.185	13.071±0.185
48	21.560±0.614	21.560±0.614
			72	38.877±2.035	29.692^#±0.159
96	－－	46.865^#±1.102
			120	－－	56.723^#±1.536
144	－－	69.528^#±2.819

表11发酵液上清及细胞沉淀中的MK-7产量

发酵时间(h)	C(发酵上清)(mg/L)	C(细胞沉淀)(mg/L)
			48	5.343±0.050	16.218^#±0.564
96	11.551±0.601	35.314^#±0.500+
			120	13.363±0.509	43.360^#±1.027
144	16.215±0.902	53.313^#±1.917

注：^*示与发酵上清相比具有显著差异(P＜0.05)；^#示与发酵上清相比具有极显著差异(P＜0.01)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 天津大学;赤峰制药股份有限公司

<120> 基因修饰的应用及其获得的菌株

<130> MP1805617

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

attgatggtg tcgcagag 18

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catttgtata atcctccctt tcc 23

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggaaagggag gattatacaa atgatgaacc accaattctc aagt 44

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcgtctgtca cctgataac 19

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtaagggag gattatacaa atgatgaatc accaattttc tagtctt 47

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggctcccagt ttgtttga 18

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tggaggaaga gtggtattat c 21

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

taacaagtca gcccgattc 19

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaatcgggct gacttgttaa tcgtggaatt ggctgaa 37

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cagacggagg aagatatgc 19

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcatatcttc ctccgtctgt cttcaactaa agcacccat 39

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttattcattc agttttcgtg 20

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcacgaaaac tgaatgaata acctgaagaa tcaatatgtt c 41

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccgaatcaag accacgat 18

<210> 15

<211> 1806

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

attgatggtg tcgcagagtt tgatccgttg ttttttggta tttcgccgcg agaagctgat 60

tatgtagacc ctcagcagcg cttgttaatg acatacgtgt ggaaggcatt ggaagatgcg 120

ggttgctcgc cgcaaagcct ttcgggtaca gggaccggta tctttatcgg tacgggaaac 180

accggttata aagatctatt ccatagagcg aatcttccaa ttgaaggcca tgctgctaca 240

ggtcatatga ttccttcggt aggcccgaat agaatgagtt attttttaaa tattcatggt 300

ccgagcgagc cagtagagac ggcttgttcc agttctcttg tagccattca ccgtgctgtg 360

actgcgatgc aaaacggtga ttgtgagatg gcgatcgctg gaggcgtgaa tacgatctta 420

accgaggagg cgcatattag ctacagcaag gcggggatgc tcagcacaga cggcaggtgt 480

aaaaccttct ccgccgatgc gaatggctat gtcagaggcg aaggggtcgg aatggtcatg 540

ttgaaaaagc tggaagatgc cgagcgcgac ggaaatcata tttacggcgt tattcggggc 600

acggcggaaa atcacggcgg aagagccaat accctgacat cgcctaatcc gaaagcacaa 660

gctgatttgt tggtgcgtgc atatcgccaa gcagacatag atccaagcac tgtcacatat 720

atcgaagcac atggaacagg gacggaattg ggcgatccga ttgaaataaa tgggctgaaa 780

gccgcgttta aggaactatc caatatgaga ggcgagagcc agccggatgt tccggatcac 840

cgttgcggca tcggctcagt taaaagcaat atcggtcatt tagagctagc agccggtatt 900

tccggtttga tcaaggtgct tttgcaaatg aagcataaaa cgttagtgaa aagcctgcat 960

tgcgagacgc ttaatcctta tcttcagctg actgacagtc cgttttacat cgttcaggaa 1020

aaacaggaat ggaagtctgt cacagatcgt gacggaaacg agcttccgcg ccgtgccgga 1080

atcagttcgt ttgggattgg cggagtaaac gcgcatattg tgattgaaga atatatgcca 1140

aaagccaatt cagaacacac ggctacagaa cagccaaacg taattgtgct gtcggctaaa 1200

aataaaagca ggctgataga tcgtgcttcg caattgcttg aggtgattcg caataaaaaa 1260

tatactgatc aggatttgca ccgcatcgct tacaccctgc aggtcgggcg cgaagaaatg 1320

gatgagcgtc tggcgtgtgt tgcggggaca atgcaggagc ttgaagagaa actgcaggcg 1380

tttgttgacg gtaaggaaga aacagacgaa tttttccggg gacagtctca tcgaaataaa 1440

gagacccaga ctatttttac agcagatgaa gatatggcgt tggcacttga tgcttggatc 1500

agaaaaagaa aatacgccaa acttgctgat ttatgggtca aaggggtctc aatccagtgg 1560

aacacattat acggacagaa catcacgctc ttgctaaagc ggccaaggac gctgccgccg 1620

gggctgtttg cgtttttgcc gtgatttcgt gtatcattgg tttacttatt tttttgccaa 1680

agctgtaatg gctgaaaatt cttacattta ttttacatat ttagaaatgg gcttgaaaaa 1740

aagcgcgcga ttatgtaaaa tataaagtga tagcggtacc attataggta agggaggatt 1800

atacaa 1806

<210> 16

<211> 1749

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atgatgaatc accaattttc tagtcttgaa agagatcgca tgctgacaga catgacgaaa 60

aaaacatatg acctatttat tatcggagga ggaattacag gagccggaac agctcttgac 120

gcggcatcaa ggggaatgaa ggtcgcacta agcgaaatgc aggactttgc ggcgggaaca 180

tcaagccgat caacgaagct ggtacatggc ggcttgcgct atttaaaaca atttgaagtg 240

aaaatggtcg ctgaggtagg aaaagagcgg gcgattgtgt atgaaaacgg cccgcatgtc 300

actacaccgg aatggatgct gcttccgttt cataaaggcg gcacattcgg ttcatttaca 360

acatctattg ggttaagggt ttatgacttc cttgcaggtg tgaaaaagtc agaacgaaga 420

agcatgcttt cagcaaaaga aacgctgcaa aaagagcctt tggtgaaaaa agacggctta 480

aaaggcggcg ggtactatgt ggaataccgc actgacgatg cgagactgac catcgaagtc 540

atgaaggaag cggttaaatt cggggcagag cctgtgaatt actccaaagt gaaggagctt 600

ctttacgaaa aaggcaaagc cgtcggcgta ttaattgaag atgtgctgac aaagaaagaa 660

tataaagtgt atgcgaaaaa aattgtcaat gctacaggcc cttgggtcga tcagctcaga 720

gaaaaagacc attcgaaaaa cggaaagcat ttgcagcata caaaaggcat tcaccttgta 780

tttgaccagt ctgtctttcc gctgaaacag gctgtatatt tcgatacacc tgatggccgg 840

atggtatttg cgattcctcg tgaaggcaaa acatacgtgg gaacaacaga cactgtttac 900

aaagaggcgc tggagcatcc gcggatgaca acggaggatc gtgattatgt catcaaatca 960

atcaattaca tgttcccgga actgaatatc actgcgaatg acatcgaatc cagctgggcg 1020

gggctgcgtc cgctgattca tgaagaaggc aaagatcctt ctgaaatttc acggaaagac 1080

gagatttgga catctgactc aggcctgatc accattgccg gcggaaaact gactggatac 1140

agaaaaatgg cggacgacat cgttgatctt gtccgtgatc gcttaaaaga agagggcgaa 1200

aaggattttg gaccatgtaa aacgaaaaac atgccaatct ctggcgggca cgtcggcggt 1260

tcgaaaaatc ttatgtcctt cgttaccgcg aaaacaaaag aaggaattgc agccggttta 1320

tcagaaaaag acgcaaaaca gcttgcgatc agatacggct ctaacgtaga tcgcgtcttt 1380

gaccgggtag aagcgctgaa agatgaggcc gcgaaacgca acattccggt tcatattctt 1440

gctgaggcag aatacagtat agaagaagag atgactgcaa cccctgctga cttctttgtc 1500

cgcagaacgg gacgtttatt ttttgatatc aattgggtaa gaacatataa agatgccgtt 1560

attgatttta tgagcgagcg attccaatgg gatgagcagg cgaaaaacaa acatacagaa 1620

aacctcaaca agcttttaca cgatgcggtc gtaccgcttg agcaataaat cataacgggc 1680

tgtctgcagc ccgttatttc tttttacgtg ccgaaagggg gagatctcag gttatcaggt 1740

gacagacgc 1749

<210> 17

<211> 3917

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ttcatattcg gtattactat ccgaggggcg ttcgtcaatc ggcccgattc cggcagagcg 60

ttggggctgt aagacgccat attatgccgg cgtgattgat ggcgtcagct attttgatcc 120

tgatttcttt ttgcttcacg aagaagacgt aagggcgatg gatccgcaag cactgctcgt 180

gttggaagag tgtctgaagc tcttgtatca cgccggttat acacctgagg aaataaaggg 240

caagcccgtc ggtgtttata tcggaggcag aagccagcac aaacctgatg aagacagcct 300

tgatcatgcc aagaatccga tcgtgacagt cggccaaaat tatttagccg ctaatctttc 360

acaatttttt gatgtccgcg gtccaagtgt tgtagttgac actgcatgct cgtcagcttt 420

ggtcggcatg aatatggcca ttcaggcgct gcgtggcgga gatattcaat ccgccatagt 480

cggcggtgtc agcttgctga gctcagatgc gtctcacagg ctgtttgacc ggcgcggcat 540

tttaagcaag cattcatcct tccatgtgtt tgatgagcgt gctgacggag ttgtgttagg 600

tgaaggcgtc ggaatggtca tgctaaaaac cgtaaaacag gcactggaag acggagatat 660

catatatgct gtcgtcaaag cggcctcggt caataacgac ggaagaacgg cgggacctgc 720

aacacctaat cttgaggcac aaaaggaagt catgaaagat gcgcttttca aaagcggaaa 780

aaaaccagag gacatcagct accttgaggc aaacgggtca ggttcaatcg taaccgatct 840

ccttgagcta aaagcgatcc aatcagtgta ccgttctggg cactcatcgc ctctttctct 900

tggctcaatc aagcggaaca tctcttcaac taaagcaccc attagttcaa caaacgaaaa 960

ttggataaag tgggatattt ttaaaatata tatttatgtt acagtaatat tgacttttaa 1020

aaaaggattg attctaatga agaaagcaga caagtaagcc tcctaaattc actttagata 1080

aaaatttagg aggcatatca aatgaacttt aataaaattg atttagacaa ttggaagaga 1140

aaagagatat ttaatcatta tttgaaccaa caaacgactt ttagtataac cacagaaatt 1200

gatattagtg ttttataccg aaacataaaa caagaaggat ataaatttta ccctgcattt 1260

attttcttag tgacaagggt gataaactca aatacagctt ttagaactgg ttacaatagc 1320

gacggagagt taggttattg ggataagtta gagccacttt atacaatttt tgatggtgta 1380

tctaaaacat tctctggtat ttggactcct gtaaagaatg acttcaaaga gttttatgat 1440

ttataccttt ctgatgtaga gaaatataat ggttcgggga aattgtttcc caaaacacct 1500

atacctgaaa atgctttttc tctttctatt attccatgga cttcatttac tgggtttaac 1560

ttaaatatca ataataatag taattacctt ctacccatta ttacagcagg aaaattcatt 1620

aataaaggta attcaatata tttaccgcta tctttacagg tacatcattc tgtttgtgat 1680

ggttatcatg caggattgtt tatgaactct attcaggaat tgtcagatag gcctaatgac 1740

tggcttttat aatatgagat aatgccgact gtacttttta cagtcggttt tctaatgtca 1800

ctaacctgcc ccgttagttg aaggcatttt ctgtcaatgt tttcttacaa agaacgctgt 1860

gatatactga aatttgtccg tatacatttt ggaggaatgg atatgttacc aaaatacgcg 1920

caagtaaaag aagaaatcag ttcttggatt aatcaaggca aaatactgcc cgatcaaaaa 1980

atccctaccg aaaacgaatt aatgcagcaa ttcggcgtca gccggcatac catccgcaaa 2040

gcgatcggag acctcgtatc acaaggtctg ctgtacagcg tgcaaggcgg aggcaccttt 2100

gtcgcttcac gctctgctaa gtcagcgctg cattccaata aaacgatcgg tgttttgaca 2160

acttacatat cagactatat tttcccgagc atcatcagag gaatcgagtc ctatttaagc 2220

gagcaggggt attctatgct tttgacaagc acaaacaaca acccggacaa tgaaagaaga 2280

ggcttagaaa acctgctgtc ccagcatatt gacggactca tcgtagaacc gacaaaaagc 2340

gcccttcaaa ccccaaacat cggctattat ctgaacttgg agaaaaacgg cattcctttt 2400

gcgatgatta acgcgtcata tgccgagctt gccgcgccaa gttttacctt ggatgatgtg 2460

aaaggcggga tgatggcggc ggagcatttg ctttctctcg gccacacgca tatgatgggt 2520

atttttaaag ctgatgacac acaaggcgtg aaacggatga acggatttat acaggcgcac 2580

cgggagcgtg agttgtttcc ttctccggat atgatcgtga catttacaac ggaagaaaaa 2640

gaatcaaaac ttctggagaa agtaaaagcc acactggaga aaaacagcaa gcacatgccg 2700

acagccattc tttgttataa cgatgaaatt gcgctgaagg tgattgatat gctgagggag 2760

atggatctta aagtgccgga ggatatgtct attgtcgggt acgatgattc acatttcgcc 2820

caaatctcag aagtgaaact aacctctgtc aaacatccga aatcagtgct tggaaaagca 2880

gccgccaaat atgtcattga ctgcttagag cataaaaagc cgaagcaaga ggatgtcata 2940

tttgagcctg agttgatcat tcgccagtcc gcacgaaaac tgaatgaata agatactgag 3000

gaggttactg atcatcgccg tctcgcgaag ttgatcgctg atgagtttta ttccgattct 3060

tatgatgcgg aggtttgcta cagggatggt ttacggtatc aagcttttct aaaagctcat 3120

ccggaaacag gtaaggccac ggaacagagc gcggtcttcc cgaaagatca tgtacttctc 3180

attacaggcg gcacacgagg catcggacta ttatgcgccc gtcattttgc agagtgctat 3240

ggagtgaaaa aactggtgct gaccggacga gaacagcttc ctccgcgaga ggagtgggct 3300

cgttttaaga catcaaacac atcattggca gagaaaatcc aggcagtgcg ggagctggaa 3360

gcgaagggtg tacaggtgga gatgctgtcg ctgacgttat ctgatgatgc tcaggttgag 3420

caaacgctgc aacatatcaa gcgaacatta ggaccgattg gcggtgtcat tcattgtgca 3480

ggtctgacgg atatggatac gctggcattt atccgaaaaa cttcggatga tatccagcgg 3540

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<210> 18

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

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<210> 23

<211> 4492

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tggaggaaga gtggtattat ctccttctcc aagtccagat gacgcatttc ctttaattga 60

acgggaaaag gtcacgataa ccgctcttgt tccgcctctt gcgatggtat ggatggatgc 120

ggcatcctca cgccgtgatg atttatccag ccttcaagtg ctgcaggtcg gcggtgccaa 180

gtttagtgct gaagccgcgc gcagggtaaa agctgttttc ggctgcacgc tgcagcaggt 240

gttcggaatg gcagagggtc tcgtcaatta tacgagattg gatgatcctg aggagatcat 300

tgtcaacacc caaggaaaac cgatgtctcc atatgatgaa atgcgtgttt gggatgatca 360

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gaaggatcaa attaaccgtg gaggagaaaa ggttgcggct gaagaggtag aaaatcatct 600

gctggcgcat ccggctgtcc atgatgcggc aatggtctcc atgcctgatc aatttcttgg 660

cgaaagatct tgtgtgttca ttattccccg ggatgaagcc ccaaaagccg cagagcttaa 720

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ttgaagaagc tttgcggcac gtgatcaagg aagcggaatc gctgcatgtc cgcttcggtg 1320

aaaatatgga cgggccttgg cagatgataa acccgtctcc ggatgtacag ctgcacgtca 1380

ttgacgtcag ctctgagcct gatccggaaa aaacagcatt aaactggatg aaagctgatt 1440

tagcaaagcc ggttgattta gggtatgccc ctttgttcaa tgaagctctg tttattgccg 1500

ggcctgatcg tttcttttgg tatcagcgca ttcaccatat agcgatcgac ggcttcggtt 1560

tttccctgat agcccagcgt gtggcaagta catatactgc ccttataaaa ggacaaacag 1620

ctaaaagccg ttcctttggg tctctccagg ccattttgga ggaggataca gattatcgcg 1680

gatcagagca gtatgagaag gatcgtcaat tctggctgga ccgttttgca gatgcacctg 1740

aagttgtgag cttggctgat cgggcgccaa gaacatctaa cagttttctt cgtcatacgg 1800

catatcttcc tccgtctgtc ttcaactaaa gcacccatta gttcaacaaa cgaaaattgg 1860

ataaagtggg atatttttaa aatatatatt tatgttacag taatattgac ttttaaaaaa 1920

ggattgattc taatgaagaa agcagacaag taagcctcct aaattcactt tagataaaaa 1980

tttaggaggc atatcaaatg aactttaata aaattgattt agacaattgg aagagaaaag 2040

agatatttaa tcattatttg aaccaacaaa cgacttttag tataaccaca gaaattgata 2100

ttagtgtttt ataccgaaac ataaaacaag aaggatataa attttaccct gcatttattt 2160

tcttagtgac aagggtgata aactcaaata cagcttttag aactggttac aatagcgacg 2220

gagagttagg ttattgggat aagttagagc cactttatac aatttttgat ggtgtatcta 2280

aaacattctc tggtatttgg actcctgtaa agaatgactt caaagagttt tatgatttat 2340

acctttctga tgtagagaaa tataatggtt cggggaaatt gtttcccaaa acacctatac 2400

ctgaaaatgc tttttctctt tctattattc catggacttc atttactggg tttaacttaa 2460

atatcaataa taatagtaat taccttctac ccattattac agcaggaaaa ttcattaata 2520

aaggtaattc aatatattta ccgctatctt tacaggtaca tcattctgtt tgtgatggtt 2580

atcatgcagg attgtttatg aactctattc aggaattgtc agataggcct aatgactggc 2640

ttttataata tgagataatg ccgactgtac tttttacagt cggttttcta atgtcactaa 2700

cctgccccgt tagttgaagg cattttctgt caatgttttc ttacaaagaa cgctgtgata 2760

tactgaaatt tgtccgtata cattttggag gaatggatat gttaccaaaa tacgcgcaag 2820

taaaagaaga aatcagttct tggattaatc aaggcaaaat actgcccgat caaaaaatcc 2880

ctaccgaaaa cgaattaatg cagcaattcg gcgtcagccg gcataccatc cgcaaagcga 2940

tcggagacct cgtatcacaa ggtctgctgt acagcgtgca aggcggaggc acctttgtcg 3000

cttcacgctc tgctaagtca gcgctgcatt ccaataaaac gatcggtgtt ttgacaactt 3060

acatatcaga ctatattttc ccgagcatca tcagaggaat cgagtcctat ttaagcgagc 3120

aggggtattc tatgcttttg acaagcacaa acaacaaccc ggacaatgaa agaagaggct 3180

tagaaaacct gctgtcccag catattgacg gactcatcgt agaaccgaca aaaagcgccc 3240

ttcaaacccc aaacatcggc tattatctga acttggagaa aaacggcatt ccttttgcga 3300

tgattaacgc gtcatatgcc gagcttgccg cgccaagttt taccttggat gatgtgaaag 3360

gcgggatgat ggcggcggag catttgcttt ctctcggcca cacgcatatg atgggtattt 3420

ttaaagctga tgacacacaa ggcgtgaaac ggatgaacgg atttatacag gcgcaccggg 3480

agcgtgagtt gtttccttct ccggatatga tcgtgacatt tacaacggaa gaaaaagaat 3540

caaaacttct ggagaaagta aaagccacac tggagaaaaa cagcaagcac atgccgacag 3600

ccattctttg ttataacgat gaaattgcgc tgaaggtgat tgatatgctg agggagatgg 3660

atcttaaagt gccggaggat atgtctattg tcgggtacga tgattcacat ttcgcccaaa 3720

tctcagaagt gaaactaacc tctgtcaaac atccgaaatc agtgcttgga aaagcagccg 3780

ccaaatatgt cattgactgc ttagagcata aaaagccgaa gcaagaggat gtcatatttg 3840

agcctgagtt gatcattcgc cagtccgcac gaaaactgaa tgaataacct gaagaatcaa 3900

tatgttcagc ttgggattcc tgttgtctat accgcacagc cgggaagcca aaatccggat 3960

gaccgtgcgc tgctgacaga cttttggggc ccgggattaa acagcggtcc ttatgaggag 4020

aaaattataa ccgagctggc accagaggat gatgatcttg tgctgacaaa atggagatac 4080

agcgcgttta agagaacgaa tctgcttgaa atgatgcgca aagagggacg cgatcagctg 4140

atcattacag gaatttacgc ccatatcggc tgtcttgtta cagcatgtga agcatttatg 4200

gaggatatta aagccttttt tgtgggagat gcagttgctg atttttcatt agaaaaacat 4260

caaatggcgc tggaatatgc ggctggacgc tgtgcgttta ccgtgatgac tgacagtctt 4320

cttgatcagc tgcagaatgc gccggcagac gttcaaaaaa cgtcagcaaa cactggcaaa 4380

aagaacgtgt ttacatgtga gaatatccgt aaacaaattg ctgaccttct acaagaaaca 4440

ccggaagaca tcacagatca agaggatttg ctcgatcgtg gtcttgattc gg 4492

Claims

1.过表达基因和/或敲除基因在提高微生物次级代谢产物的代谢通量中的应用；

所述基因具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

I、具有基因glpD和/或dhbB的核苷酸序列；

IV、如IV、Ⅴ或Ⅵ所示序列的互补序列。

2.过表达基因menA、dxs、dxr、yacM-yacN、glpD和/或dhbB在提高微生物次级代谢产物的代谢通量中的应用；

所述基因具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

VI、具有如V所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；

VIII、如V、VI或VII所示序列的互补序列。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述次级代谢产物为甘油代谢路径的产物。

4.如权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述微生物为原核生物；所述次级代谢产物醌类物质。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述原核生物为枯草芽孢杆菌；所述醌类物质为甲基萘醌-7。

6.菌株，其特征在于，其基因过表达或被敲除；

所述基因具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

IX、具有基因glpD和/或dhbB的核苷酸序列；

XII、如IX、X或XI所示序列的互补序列。

7.菌株，其特征在于，其基因过表达；

所述基因具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：

XVI、如XIII、XIV或XV所示序列的互补序列。

8.如权利要求6或7所述的菌株在提高微生物次级代谢产物的代谢通量中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述次级代谢产物为甘油代谢路径的产物。

10.如权利要求6或7所述菌株的发酵方法，其特征在于，包括补料发酵的步骤，所述补料发酵为在发酵过程中补加2～6％(v/v)的甘油和/或5～18.9％(w/v)的大豆蛋白胨。