JP4528297B2 - コエンザイムq−10の向上した産生 - Google Patents
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Description
実施例
この実施例は、Paracoccus zeaxanthinifaciens由来のクローニングされたメバロネートオペロンの導入によって、R. sphaeroides DSM158のCoQ10産生が改善されたことを示す。
Rhodobacter sphaeroides株DSM 158(ドイツ細胞バンクから入手した)を、CoQ10の向上した産生を有する組換え株の作製のための基本宿主として使用した。全てのR. sphaeroides株を、RS100培地中、28℃で生育させた。RS100培地の組成及び調製を表1にまとめる。50mg/lのカナマイシンを組換え株の生育用培地に加えた。大腸菌株を、LB培地(ベクトンディキンソン、スパークス、MD、米国)中、37℃で生育させた。組換え型大腸菌株のプラスミドの保持のために、アンピシリン(100mg/l)及び/又はカナマイシン(プラスミドに応じて25〜50mg/l)を培地に加えた。大腸菌及びR. sphaeroidesの液体培養は、回転振盪機中で200回転数/分にて好気的にルーチン的に生育させた。固形培地が必要なときは、寒天(最終濃度1.5%)を加えた。
プラスミドpBBR−K−Nde(空のプラスミド)及びpBBR−K−mev−op−up−4(メバロネートオペロンの最初の4つの遺伝子を含んでいるプラスミド)の作製は、それぞれWO 02/099095の実施例6(91ページ、12〜17行)及び13(105ページ、10行〜106ページ、8行)において詳述されている。
プラスミドによる大腸菌S17−1の形質転換、続く接合によるS17−1からR. sphaeroides DSM 158へのプラスミドの移入は、標準的方法を使用して成し遂げられた(Nishimura et al., Nucl. Acids Res. 18, 6169,1990 ; Simon et al., Bio/Technology 1983, 784-91)。最初に、R. sphaeroides DSM 158の自然発生的なリファンピシン耐性変異株を、100mg/lのリファンピシンを補充したRS100液体培地中でDSM 158を生育させ、細胞を100mg/lのリファンピシン含有RS100プレート上に播き、そして単一のコロニーを単離することによって、単離した。接合のために、100mg/lのリファンピシンを含有するRS100培地で生育させたレシピエント細胞(リファンピシン耐性R. sphceroides DSM 158)の培地の1ミリリットルのアリコートと、ドナー細胞(移入されるべきプラスミドを運搬する大腸菌S17−1。50mg/lカナマイシンを含有するLBブロスで生育させた)を、遠心分離によってペレット化した。上澄みを捨て、細胞を新鮮なRS100培地によって二回洗浄して抗生物質を除去した。それから、各々のペレットを1mlの新鮮なRS100培地中に再懸濁させた。50マイクロリットルのドナー細胞及び0.45mlのレシピエント細胞を混合し、遠心分離によってペレット化し、0.03mlの新しいRS100培地中に再懸濁し、そしてRS100プレート上にスポットした。28℃で一晩インキュベーションした後、細胞を接種用白金ループによって収集して、0.3mlのRS100培地中に再懸濁させた。この懸濁液の希釈液を、100mg/lのリファンピシン及び50mg/lのカナマイシンを含有するRS100プレート上に塗り広げて、28℃でインキューベートした。そのプレートからコロニー(R. sphaeroides DSM158の推定形質転換細胞)を拾い上げ、50mg/lのカナマイシンを含有する液体RS100培地中で生育させ、そしてプラスミドの存在を適切なプライマーを使用してPCRによって試験した。陽性クローンを、50mg/lのカナマイシンを含有するRS100プレート上に縞状に播き、単一のコロニーを得た。各々のクローンからの1個の単一コロニーを、50mg/lのカナマイシンを含有する液体RS100培地において再度生育させて、予想されるプラスミドの存在をPCRによって確認した。R. sphaeroides DSM 158の最終形質転換株を、培養液にグリセリンを添加(15%v/v)して−80℃で凍結することによって保存した。
RS100培地をR. sphaeroidesを用いる全実験に使用された(50mg/lカナマイシンを、組換え型R. sphaeroides株の生育のために添加した)。25ミリリットルの培養液を、250mlのバッフル付きエルレンマイヤーフラスコ中で、28℃、200回転数/分で振盪して生育させた。CoQ10産生を試験するために、R.sphaeroides株の凍結グリセロール添加保存培養液を、25mlの種培地に接種するために使用した。24〜28時間の種培地の生育の後、660ナノメートル(OD660)の最初の光学濃度が0.16になるように、培地の適切な容量を使用して実験用フラスコに接種した。2ミリリットルのサンプルを、24時間間隔で無菌的に取り出した。分析は、生育(OD660として測定された)、pH、培地上清中のブドウ糖、ならびにCoQ10及びのカロチノイド(高速液体クロマトグラフィー[HPLC]で測定した−以下の分析法の部を参照)を含んだ。
試薬:
アセトニトリル、ジメチルスルホキシド(DMSO)、テトラヒドロフラン(THF)、tert−ブチルメチルエーテル(TBME)、及びブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)は、puriss. p.a.又はHPLCグレードであり、Fluka(スイス)から入手した。
CoQ10もまたFlukaから購入した。メタノール(Lichrosolv)はメルク(ダルムシュタット)から購入した。カロチノイドの標準は、ロシュビタミン社のケミストリーリサーチ部(スイス)から入手した。
400マイクロリットルの全ブロスを、使い捨ての15mlのポリプロピレン遠心管に移した。4ミリリットルの安定化抽出溶液(1:1(v/v)のDMSO/THF中の0.5g/lのBHT)を添加し、そしてサンプルを実験室用振盪機(IKA、ドイツ)で20分間混合して抽出を促進させた。最後に、サンプルを遠心分離し、そして上澄みをHPLCによって分析するためにアンバーガラスバイアルに移した。
逆相HPLC法を、ユビキノン及びそれらの対応するヒドロキノンの同時定量のために開発した。この方法は、カロチノイドのフィトエン、スフェロイデノン、スフェロイデン、及びノイロスポレンをCoQ10から明確に分離することができる。クロマトグラフィーは、温度制御型オートサンプラー及びダイオードアレイ検出器を備えたAgilent1100HPLCシステムを使用して行った。
方法パラメータは、以下の通りだった:
方法の選択性は、関連した参照化合物の標準溶液を注入することによって検証された。目標化合物(CoQ10及びユビキノール−10)は、完全に分離されて、干渉を示さなかった。
安定化抽出溶液(上記参照)のCoQ10の希釈系列を調製して分析した。直線範囲は5mg/lから50mg/lまで見いだされた。相関係数は0.9999であった。このHPLC法によるCoQ10の検出限界は4mg/lであると決定された。
抽出手順を含む方法の再現性を点検した。10個の個々の試料調製を比較した。相対標準偏差を4%と決定した。
R. sphaeroides株DSM 158、DSM 158/pBBR-K-Nde(空のベクター対照)、及びDSM 158/pBBR-K-mev-opR114を上記で特定した条件下で振とうフラスコ培養において生育させてCoQ10産生を測定した。結果を表3にまとめる。示される値は2つの独立した実験の平均であり、そして各々の独立実験の範囲内で各々の株を二回反復して試験した。これらの結果は、P. zeaxanthinifaciensからクローニングされたメバロネートオペロンの発現が有意にR. sphaeroidesのCoQ10産生を改良したことを明確に示す。
Claims (2)
- パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス(Paracoccus zeaxanthinifaciens)のメバロネートオペロンが導入されたロドバクター・スファエロイデス(Rhodobacter sphaeroides)を培地中で培養すること、CoQ10を形成させて培地中に蓄積させること、及びそこからCoQ10を回収することを含む、CoQ10の産生方法であって、
前記メバロネートオペロンが以下の酵素:MvaA(ヒドロキシメチルグルタリル−CoAレダクターゼ)、Idi(イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ)、Hcs(ヒドロキシメチルグルタリル−CoAシンターゼ)、Mvk(メバロン酸キナーゼ)、Pmk(ホスホメバロン酸キナーゼ)及びMvd(ジホスホメバロネート・デカルボキシラーゼ)をコードする構造遺伝子を含有する、方法。 - パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス(Paracoccus zeaxanthinifaciens)のメバロネートオペロンを含有する、ロドバクター・スファエロイデス(Rhodobacter sphaeroides)であって、
前記メバロネートオペロンが以下の酵素:MvaA(ヒドロキシメチルグルタリル−CoAレダクターゼ)、Idi(イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ)、Hcs(ヒドロキシメチルグルタリル−CoAシンターゼ)、Mvk(メバロン酸キナーゼ)、Pmk(ホスホメバロン酸キナーゼ)及びMvd(ジホスホメバロネート・デカルボキシラーゼ)をコードする構造遺伝子を含有する、ロドバクター・スファエロイデス。
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