WO2022102763A1 - 変異型ＩｓｐＨ及び該変異型酵素を使用したイソプレンを構成単位として持つ化合物の合成方法 - Google Patents

変異型ＩｓｐＨ及び該変異型酵素を使用したイソプレンを構成単位として持つ化合物の合成方法 Download PDF

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太輔 梅野
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国立大学法人 千葉大学
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase

Definitions

  • the present invention comprises a mutant 4-hydroxy-3-methylbut-2-enyldiphosphate reductase (IspH) and an isoprene using the mutant enzyme as a constituent unit.
  • the present invention relates to a method for screening an enzyme involved in the isoprenoid pathway in an isoprenoid pathway expression system in which the enzymatic activity of geraniol is enhanced.
  • the number of compounds consisting of isoprene units such as terpenes, terpenoids, and carotenoids amounts to 70,000, and there are many with market value such as pharmaceuticals, pigments, fragrances, health foods, cosmetics, resins and rubber raw materials. Many researchers are aiming to establish these highly efficient and stable microbial production systems, and there are many companies that are implementing metabolic engineering targeting terpenes.
  • the increase in terpene production is mainly realized by the MEV route (see: Fig. 37 left).
  • Studies over the last 15 years have shown that the MEV pathway can be remodeled into a highly potent fortified pathway, depending on enzyme selection and expression balance.
  • the production volume may reach as high as 30-100g / L.
  • the MEP pathway (see: right in Fig. 37) has not been successfully improved in production volume, unlike the MEV pathway, although many studies have been conducted.
  • Non-Patent Documents 1-3 Several previous studies have not elucidated which enzyme involved in the MEP pathway is the rate-determining step of the MEP pathway. In addition, even if all seven genes constituting MEP were overexpressed with a multi-copy plasmid, the effect of increasing the production of carotenoids could not be confirmed (see: Non-Patent Document 4-6).
  • Non-Patent Document 7 There is a report on IspH mutants. However, the MEV pathway containing the IspH mutant has not been able to contribute to the improvement of the amount of ⁇ -Pinene synthesis (see: Non-Patent Document 7).
  • the present invention elucidates an enzyme that is a rate-determining factor for improving the amount of isoprenoid synthesis in the MEP pathway, and uses a variant of the enzyme and a compound having isoprene as a constituent unit using the MEP pathway in which the rate-determining element is eliminated (particularly, isoprene). It is an object of the present invention to provide a method for synthesizing (hydrocarbons as a constituent unit) and a screening system for enzymes involved in the isoprenoid pathway using an isoprenoid pathway expression system.
  • the enzyme that is the rate-determining factor for improving the amount of isoprenoid synthesis in the MEP pathway is IspH. Furthermore, it was confirmed that the amount of isoprenoid synthesis was high in the MEP pathway containing the IspH mutant. This completed the present invention.
  • the present invention is as follows. 1.
  • (1) A gene encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, 7, 9 or 11.
  • (2) In the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, 7, 9 or 11, 1 to 30 amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added, and in SEQ ID NO: 5, 7, 9 or 11.
  • IPP isopentenyl diphosphate
  • DMAPP dimethyl
  • the peptide has substantially the same activity as the activity of producing IPP and / or DMAPP using HMB-PP as a substrate of the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, 7, 9 or 11.
  • Peptide and (7) A peptide consisting of an amino acid sequence encoded by a DNA having 80% or more identity with the DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 6, 8, 10 or 12. 9.
  • a variant IspH or a derivative thereof comprising a polypeptide consisting of an amino acid sequence characterized by having an amino acid substitution at 6 or 7 sites. 10.
  • the mutant IspH or a derivative thereof according to the above item 9 wherein the mutant IspH has a higher isopentenyl diphosphate and / or dimethylallyl diphosphate synthetic activity as compared with the wild-type IspH.
  • a mutant IspH or derivative thereof comprising the polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and further having an amino acid substitution of Thr207Ser and / or Glu301Asp. 14.
  • a mutant IspH or a derivative thereof having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and further comprising a polypeptide having an amino acid substitution of Thr175Ser.
  • a mutant IspH or derivative thereof comprising the polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and further having an amino acid substitution of Leu105Gln. 16.
  • a mutant IspH or derivative thereof comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and further comprising a polypeptide having an amino acid substitution of Gln211Leu, Gln220Arg and / or Asn306Asp. 17.
  • a gene library of enzymes involved in the mutant isoprenoid pathway is introduced into cells in which the enzymatic activity of geraniol is enhanced, and the mutant isoprenoid pathway is indexed by an increase, decrease or loss of the cell proliferation rate of the cells.
  • the screening method according to item 17, wherein the increase in the cell proliferation rate of the cells is an increase in the amount of ⁇ -pinene and / or diaponeurosporene synthesis. 19.
  • the screening method according to item 17 or 18, wherein the cells are Escherichia coli.
  • the present invention was able to provide a mutant IspH having a higher amount of isoprenoid synthesis than the wild-type IspH, and an isoprenoid synthesis method using the mutant IspH.
  • GES geraniol synthase
  • plasmid map of p15A-ispH mut1 results of (a) biosynthetic pathway of ⁇ -pinene and diaponeurosporene, and (b) synthetic amount of ⁇ -pinene and diaponeurosporene. plasmid map of pJ404-PShis-GPPS.
  • a plasmid map of pUC-crtM-crtN results of the carotenoid synthesis pathway using the IspH mutant, as well as the amount of carotenoid synthesis. Results of synthesis of the isoprenoid pinene via the non-mevalonate pathway using the IspH variant.
  • a plasmid map of p15A-ispH wt .
  • the present invention relates to "variant IspH", "a method for synthesizing a compound having isoprene as a constituent unit using mutant IspH (hydrocarbon having isoprene as a constituent unit)", and "a compound having isoprene containing mutant IspH as a constituent unit”. (Hydrocarbons having isoprene as a constituent unit) ", and” a method for screening enzymes involved in the isoprenoid pathway in an isoprenoid pathway expression system in which the enzymatic activity of geraniol is enhanced ".
  • the "compound having isoprene as a constituent unit” in the present invention is intended for all compounds having isoprene as a partial structure, and examples thereof include isoprenoids, terpenes, carotenoids, cannabinoids, and coenzyme Q10.
  • the "hydrocarbon having isoprene as a constituent unit” in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include isoprenoids, terpenes, and carotenoids.
  • mutant IspH The mutant IspH of the present invention or a derivative thereof means an enzyme having one or more amino acids or bases different from that of the wild-type IspH.
  • Wild IspH is an enzyme found in many prokaryotic organisms and plants including Escherichia coli, and IPP (iso) using HMB-PP ((E) -4-hydroxy-3-methyl-2-butenyldiphosphate) as a substrate. It is known as an enzyme that produces pentenyl diphosphate) and DMAPP (dimethylallyl diphosphate).
  • the mutant IspH of the present invention or a derivative thereof has a high amount of IPP and / or DMAPP synthesis (high synthetic activity) as compared with the wild-type IspH.
  • the IspH derivative of the present invention is intended for a protected derivative of mutant IspH, a sugar chain modified product, an acylated derivative, or an acetylated derivative.
  • the protected derivative, sugar chain modified product, acylated derivative, or acetylated derivative can be obtained by a method known per se.
  • the mutant of the present invention is preferably a mutant having high enzyme activity, expression level or stability of the expressing enzyme. Mutants that enhance substrate specificity are also preferred.
  • mutants that enhance enzyme activity are preferred.
  • a library of mutants (a gene library in which substitution, deletion, insertion and / or addition is introduced into the wild type) is prepared, and the enzyme activity and expression level in the host are prepared from the library.
  • a mutant with high stability can be obtained. It does not matter if it is derived from a gene extracted from a natural cell, a gene of a prepared library, a chemically synthesized gene, a PCR amplification gene, or the like. Since the screening method of the present invention uses the substrate supply capacity of the expressed enzyme as an index, unidentified genes can also be screened.
  • Isoprenoid synthesizable cells HMB-PP synthesizable cells in the MEP pathway
  • ispH gene gene library into which wild-type substitutions, defects, insertions and / or additions have been introduced
  • the mutant IspH of the present invention or a derivative thereof has the mutation shown below in the amino acid sequence as compared with IspH derived from Escherichia coli (SEQ ID NO: 1). Substitution of 105th, 175th, 207th, 211th, 220th, 301st, and / or 306th.
  • the IspH of the present invention has the mutation shown below in the amino acid sequence as compared with the IspH derived from Escherichia coli (SEQ ID NO: 1). Leu105Gln, Thr175Ser, Thr207Ser, Gln211Leu, Gln220Arg, Glu301Asp, and / or Asn306Asp.
  • the mutant IspH of the present invention has a mutation shown by any one of the following in the amino acid sequence as compared with IspH derived from Escherichia coli (SEQ ID NO: 1). (1) Thr207Ser and / or Glu301Asp (2) Thr175Ser (3) Leu105Gln (4) Gln211Leu, Gln220Arg and / or Asn306Asp
  • the mutant IspH of the present invention is ⁇ -pinene as compared with the wild-type ispH derived from Escherichia coli by having one or more amino acid mutations of the following as compared with the IspH derived from Escherichia coli (SEQ ID NO: 1). And / or it is confirmed in the following examples that the amount of diaponeurosporene isoprene synthesized is high.
  • Thr207Ser and Glu301Asp SEQ ID NO: 5
  • Thr175Ser SEQ ID NO: 7
  • Leu105Gln SEQ ID NO: 9
  • Gln211Leu, Gln220Arg and Asn306Asp SEQ ID NO: 11
  • High IPP, DMAPP, ⁇ -pinene and / or diaponeurosporene isoprene synthesis is 1.1 times or more, 1.2 times or more, 1.3 times or more compared to wild-type IspH (SEQ ID NO: 1) derived from Escherichia coli.
  • the mutant ispH gene of the present invention contains any one or more of the following genes.
  • 1 to 30 amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added, and in SEQ ID NO: 5, 7, 9 or 11.
  • IPP isopentenyl diphosphate
  • DMAPP dimethyl
  • the gene of (1) above is preferably a gene encoding the mutant ispH obtained from the method for screening the mutant IspH of the present invention.
  • the mutant IspH has the activity of producing IPP and / or DMAPP using HMB-PP as a substrate.
  • the gene (2) above is a gene encoding a polypeptide having a mutation introduced into the mutant ispH of the present invention to the extent that the enzyme activity is not lost.
  • Such mutations include human-induced mutations as well as those that occur in nature.
  • a site-directed mutagenesis method (Nucleic Acids Res. 10,6487-6500, 1982) and the like can be mentioned.
  • the number of mutated amino acids is usually 30 amino acids or less, preferably 20 amino acids or less, more preferably 10 amino acids or less, still more preferably 5 amino acids or less, and most preferably 3 amino acids or less.
  • Whether or not the mutated polypeptide retains enzymatic activity is determined, for example, by introducing a gene encoding the mutated polypeptide into Escherichia coli or the like and expressing it, and the Escherichia coli or the like uses HMB-PP as a substrate for IPP. And / or can be found by examining whether DMAPP can be generated. Since there is a high possibility that the enzyme activity will be lost if a mutation is introduced at the position / site of these amino acids, it is preferable that the mutation is introduced into an amino acid other than these amino acids.
  • IPP and / or DMAPP is produced using HMB-PP contained in the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, 7, 9 or 11 in (2), (3) and / or (5) above as a substrate.
  • Activity substantially equivalent to activity means that the degree of activity is compared with the activity of producing IPP and / or DMAPP using HMB-PP of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, 7, 9 or 11 as a substrate. It may be strong or weak.
  • 0.1 times, 0.2 times, 0.3 times, 0.4 times, 0.5 times, 0.6 times, 0.7 times, 0.8 times, 0.9 times, 1.0 times, 1.1 times, 1.2 times, 1.3 times, 1.4 times, 1.5 times, 2.0 times, 2.1 times, 2.2 times, 2.3 times, 2.4 times, 2.5 times, 2.6 times, 2.7 times, 2.8 times, 2.9 times, 3.0 times, 4.0 times, 5.0 times, 10 times, 15 times, 20 times, 30 times, 40 times , 50x, 100x, 500x, or 1000x activity can be exemplified.
  • identity can be calculated using BLAST (Basic LocalAlignment Search Tool at the NationalCenter for Biological Information) or the like (for example, using default or default parameters).
  • the gene of (3) is 80% or more or 90% or more, preferably 93% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, 7, 9 or 11.
  • the gene of (5) above is a gene obtained by utilizing hybridization between DNAs.
  • the "stringent condition" in this gene means a condition in which only specific hybridization occurs and non-specific hybridization does not occur.
  • Such conditions are usually conditions such as hybridization at 37 ° C. in a buffer containing 5 ⁇ SSC, 1% SDS and washing treatment at 37 ° C. with a buffer solution containing 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS.
  • the DNA obtained by utilizing hybridization encodes an active polypeptide is determined, for example, by introducing the DNA into Escherichia coli or the like and expressing it, and the Escherichia coli or the like uses HMB-PP as a substrate for IPP. And / or can be found by examining whether DMAPP can be generated.
  • the DNA obtained by hybridization usually has high identity (homology) with the gene (SEQ ID NO: 6, 8, 10 or 12) of (4) above.
  • High identity (homology) means 80% or more or 90% or more identity, preferably 95% or more identity, more preferably 98% or more identity, most preferably 99% or more identity. Point to.
  • the gene of (6) is 1 to 50, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 20, and particularly preferably 1 to 50 in the DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 6, 8, 10 or 12. It is a gene consisting of DNA in which 1 to 10, most preferably 1 to 5 base sequences are substituted, deleted, inserted and / or added.
  • the gene of (7) is 80% or more or 90% or more, preferably 93% or more, more preferably 95% or more, still more preferably, with the DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 6, 8, 10 or 12. Contains a gene consisting of DNA having 98% or more identity, most preferably 99% or more identity.
  • the degenerate isomer of the base sequence of (8) above means another base sequence corresponding to the amino acid encoded by the base sequence set forth in SEQ ID NO: 6, 8, 10 or 12.
  • the mutant IspH of the present invention has one of the following peptides.
  • HMB-PP as a substrate, which is a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which individual amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added, and which is possessed by the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, 7, 9 or 11.
  • the peptide has substantially the same activity as the activity of producing IPP and / or DMAPP using HMB-PP as a substrate of the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, 7, 9 or 11.
  • homologous amino acids polar amino acids, non-polar amino acids, etc.
  • hydrophobic amino acids hydrophilic amino acids, positive charged amino acids, negative charged amino acids, aromatic amino acids, etc.
  • the "method for screening an enzyme involved in the isoprenoid pathway in an isoprenoid pathway expression system in which the enzymatic activity of geraniol of the present invention is enhanced (hereinafter, may be abbreviated as” the screening method of the present invention ")" is a mutant type.
  • Enzyme genes involved in the mutant isoprenoid pathway preferably enzyme gene libraries involved in the isoprenoid pathway, especially random mutations, in cells enriched with the enzymatic activity of geraniol capable of synthesizing products of any of the MEP pathways. Introduced (enzyme gene library involved in the isoprenoid pathway into which) was introduced, the viability of the introduced cells, the amount of product produced in each pathway, and further, geraniol, diaponeulosporene, ubiquinone, bactoprenol, etc.
  • the present invention relates to a screening method using the amount of production as an index.
  • cells with enhanced enzymatic activity of geraniol capable of synthesizing products of either the MEV pathway or the MEP pathway are characterized by having higher enzymatic activity of geraniol as compared with the wild type.
  • cells having high enzyme activity of geraniol can be obtained by forcibly expressing geraniol synthase (particularly, geraniol synthase having high activity) in cells by a method known per se.
  • each enzyme and each substrate shown in FIG. 37 may be contained in the cell.
  • Each enzyme and each substrate may be endogenous to the cell or exogenous by external gene transfer or protein transfer.
  • the cell of the present invention may be a natural cell or a cell transformed by genetic recombination.
  • the recombinant cell include Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast and the like, which are cells that are convenient for the operation of gene recombination.
  • a compound having isoprene as a constituent unit using an enzyme involved in the mutant isoprenoid pathway A compound having isoprene as a constituent unit using an enzyme involved in the mutant isoprenoid pathway of the present invention (particularly, a hydrocarbon having isoprene as a constituent unit, further, an isoprenoid synthesis method, hereinafter referred to as "the synthesis method of the present invention".
  • the enzyme involved in the mutant isoprenoid pathway with high enzymatic activity obtained in the above-mentioned "screening method of the present invention” is used.
  • a method known per se can be used except that an enzyme involved in the mutant isoprenoid pathway is used.
  • production in the MEV and / or MEP pathways by introducing an enzyme gene involved in the mutant isoprenoid pathway into a cell line having the MEV and / or MEP pathways and expressing the enzyme in the cell line. It is possible to express substances and the like with high yield.
  • an artificial pathway that directly diphosphorylates DMAOH and IOH which is being actively studied recently, and a pathway that supplies IPP / DMAPP from glycerol via IOH / DMAOH (JM. Clomburg, PNAS, 116,12810 (2019)).
  • the ratio of the carbon number of the hydrocarbon containing isoprene as a constituent unit can be changed depending on the type of the mutant IspH used.
  • IspH mut1 SEQ ID NO: 5
  • high carbon number carotenoids eg, C45, C40: high molecular weight carotenoids
  • IspH mut2 SEQ ID NO: 7
  • IspH mut12 SEQ ID NO: 9
  • IspH mut14 SEQ ID NO: 11
  • the DMAPP: IPP ratio to be synthesized can be adjusted according to the type of mutant IspH used according to the results of the following examples.
  • IspH mut1 can be used to reduce the DMAPP / IPP ratio and efficiently synthesize C45 and C40.
  • IspH mut 2,12,14 can be used to increase the DMAPP / IPP ratio and efficiently synthesize C35 and C30.
  • synthesis system of the present invention For a compound (particularly, isoprenoid) synthesis system containing an enzyme involved in the mutant isoprenoid pathway of the present invention (hereinafter, may be abbreviated as "synthesis system of the present invention"), the above-mentioned "synthesis method of the present invention” is carried out. can do. As long as the synthetic system of the present invention contains an enzyme involved in the mutant isoprenoid pathway, other constituents known per se can be used. For example, the synthetic system of the present invention contains cell lines having MEV and MEP pathways and enzyme genes involved in the mutant isoprenoid pathway.
  • GPP geranyl diphosphate
  • the rescue capacity confirmed in FIG. 15a showed a good correlation with the isoprenoid raw material supply capacity brought about by the expression of each gene.
  • Dxs the MEP enzyme with the highest rescue effect, was found to have the effect of doubling the amount of biosynthesis of the isoprenoid pigment diaponeurosporene (Fig. 15b).
  • Idi which has a rescue effect of 8300 times, showed a production increase effect of 6 times or more. note that.
  • the effect of increasing the production of IspA is lower than that of the rescue effect, which is that IspA is a 2-step enzyme and converts DMAPP to FPP without releasing the intermediate GPP, which is a direct substrate of GES M53 . It is thought that this is due to.
  • the 11 genotypes had four genotypes, "Thr207Ser, Glu301Asp", “Thr175Ser”, "Leu105Gln” and "Gln211Leu, Gln220Arg, Asn306Asp”.
  • the plasmids p15A-ispH mut1 , p15A-ispH mut2 , p15A-ispH mut12 , p15A-ispH mut14 and pUC18nm-CrtM W38A -FDS Y81A used are shown in FIGS. 17 to 21.
  • the expression plasmids of the four genotype variants were expressed as pinen synthase (PtPS) and diaponeurosporene synthesis pathway. It was introduced into an Escherichia coli strain (BW25113) together with an expression vector of (CrtM, CrtN), and the production amounts of ⁇ -pinene and diaponeurosporene were confirmed (Fig. 22b).
  • a pinene synthesis plasmid (pJ404-PShis-GPPS) or a diaponeurosporene synthesis plasmid (pUC-CrtM-CrtN) is used as an expression plasmid for a wild-type or IspH variant of IspH (p15A-ispHwt, p15A-ispH mut1 ).
  • IspH mut12 contributes not only to Vmax but also to change the product selectivity to increase the DMAPP ratio, it is consistent with the pinene production increase effect of the result of FIG. 22b. This elucidated how the IspH mutant IspH mut12 increased monoterpene production. Details are as follows.
  • DMAPP product specificity
  • FDSY81A FDSY81A
  • CrtM mutant CrtMW38A
  • Amino acid substitutions in the reaction pockets alleviate the specificity of both mutants, intentionally making them low-specific enzyme variants.
  • the FDS mutant can release C15, 20, 25PP as a product
  • the CrtM mutant can synthesize C30, C35, C40, and C45 carotenoids using these as raw materials.
  • these IspH mutants were introduced into the cell BW25113 ⁇ tna strain into which pUC18nm-CrtMW38A-FDSY81A was introduced.
  • FDS mutants can release C15, 20, 25PP as a product, and CrtM mutants can use these as raw materials to synthesize C 30 , C 35 , C 40 , and C 45 carotenoids. That is, a system with extremely low selectivity was constructed as a pathway (see: Furubayashi et al., Nat. Commun., 6, 7534 (2015)). If the intracellular DMAPP / IPP ratio is high, this less specific carotenoid pathway is synthesized by lower molecular weight carotenoids.
  • the expression plasmid for pUC18nm -CrtM W38A -FDS Y81A is shown in FIG.
  • FIG. 26 shows the results of HPLC analysis of the carotenoid fraction accumulated by this carotenoid pathway coexisting with the IspH mutant.
  • C30 and C45 carotenoids are mainly synthesized mainly in the C40 pathway.
  • Idi coexists, the production volume is greatly improved without changing the ratio of wild-type IspH carotenoids (C40 carotenoids are the main product).
  • IspH mut1 had similar results to the proportion of wild-type IspH carotenoids.
  • IPPs per DMAPP for FPP which is the raw material for squalene and diaponeulosporene
  • 3 IPPs per DMAPP for GGPP which is the raw material for diterpenes and tetraterpenes
  • the size distribution of the carotenoid skeleton given by the carotenoid biosynthetic pathway with low size selectivity reflects the abundance of precursors IPP and DMAPP (DMAPP: IPP ratio), so the results shown in FIG. 26 are obtained. It is thought that it became.
  • the DMAPP: IPP supply ratio of the MEP pathway is defaulted to 1: 5 (see: Altincicek et al., FEBS Lett., 532, 437-440 (2002)). .. From this example, it was confirmed that it is important not only to increase the metabolic flux but also to increase the DMAPP / IPP ratio in order to efficiently produce a small molecule terpene (a product with a high demand for DMAPP). That is, if IspH mut1 is used, the DMAPP / IPP ratio can be lowered and C45 and C40 can be synthesized efficiently. In addition, IspH mut 2,12,14 can be used to increase the DMAPP / IPP ratio and efficiently synthesize C35 and C30.
  • the map of the plasmid used (pJ404-PtPS Q457L -GPPS, p15A-ispH wt , p15A-ispH wt -dxs, p15A-ispH wt -dxs-ispG, p15A-ispH wt -dxs-ispG-dxr, p15A-P lac / lacO-ispH mut12 , p15A-ispH mut12 -dxs, p15A-ispH mut12 -dxs-ispG and p15A-ispH mut12 -dxs-ispG-dxr) are shown in FIGS. 28-36.
  • the present invention can provide a mutant IspH having a higher amount of isoprenoid synthesis as compared with a wild-type IspH, and an isoprenoid synthesis method using the mutant IspH.

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Abstract

MEP経路のイソプレノイド合成量向上の律速要因の酵素を解明して、該酵素の変異体、該律速要素を解消したMEP経路を使用したイソプレンを構成単位とする炭化水素合成方法、並びに、イソプレノイド経路発現系を使用するイソプレノイド経路に関与する酵素のスクリーニング系を提供する。　MEP経路のイソプレノイド合成量向上の律速要因の酵素は、IspHであることを特定した。さらに、該IspHの変異型を含むMEP経路ではイソプレノイド合成量が高いことを確認した。

Description

変異型ＩｓｐＨ及び該変異型酵素を使用したイソプレンを構成単位として持つ化合物の合成方法
　本発明は、変異型4-ヒドロキシ-3-メチル-2-ブテニル二リン酸レダクターゼ(4-hydroxy-3-methylbut-2-enyldiphosphate reductase：IspH)、該変異型酵素を使用したイソプレンを構成単位として持つ化合物（特に、イソプレンを構成単位とする炭化水素）の合成方法、該変異型酵素を含むイソプレンを構成単位として持つ化合物合成系（特に、イソプレンを構成単位とする炭化水素合成系）、並びに、ゲラ二オールの酵素活性を強化したイソプレノイド経路発現系でのイソプレノイド経路に関与する酵素のスクリーニング方法に関する。
　本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願2020-189676号優先権を請求する。
　テルペン、テルペノイド、カロテノイドなど、イソプレンユニットからなる化合物は7万にのぼり、医薬、色素、香料、健康食品、化粧品、樹脂やゴム原料など、市場価値を持つものも多数ある。多くの研究者がこれらの高効率で安定な微生物生産系の確立を目指しており、テルペンをターゲットとした代謝工学を実施している企業も多数存在する。
　テルペンの生産量向上は、主にMEV経路（参照：図３７左）によって実現している。MEV経路は、酵素の選択や発現バランスなどによって、非常に力価の高い強化経路に作り替えることができることが、この15年ほどの研究によってわかってきた。生産量が、30-100g/Lもの生産量を実現することもある。
　一方、MEP経路（参照：図３７右）は、多くの研究がされているがMEV経路とは異なり、生産量の向上に成功していない。
　複数の先行研究では、どのMEP経路に関与する酵素がMEP経路の律速段階であることは解明されていない（参照：非特許文献１－３）。
　加えて、MEPを構成する7つの遺伝子すべてをマルチコピーplasmidで過剰発現させてもカロテノイドの増産効果を確認できなかった（参照：非特許文献４－６）。
　IspH変異体に関する報告がある。しかし、該IspH変異体を含むMEV経路は、α-Pinene合成量向上に寄与できていない（参照：非特許文献７）。
Kajiwara et al., Biochem. J., 324, 421-6(1997) Albrecht et al., Biotechnol. Lett., 21, 791-795 (1999) Li et al., Metab. Eng., 44, 13-21 (2017) Yuan et al., Metab. Eng., 8, 79-90 (2006) Zurbriggen et al., Bioenergy Res., 5, 814-828 (2012) Zhou et al., J. Biotechnol., 248, 1-8 (2017) Puan et al., FEBS Lett., 579, 3802-3806 (2005)
　本発明は、MEP経路のイソプレノイド合成量向上の律速要因の酵素を解明して、該酵素の変異体、該律速要素を解消したMEP経路を使用したイソプレンを構成単位として持つ化合物（特に、イソプレンを構成単位とする炭化水素）合成方法、並びに、イソプレノイド経路発現系を使用するイソプレノイド経路に関与する酵素のスクリーニング系を提供することを課題とする。
　本発明者らは鋭意検討した結果、MEP経路のイソプレノイド合成量向上の律速要因の酵素は、IspHであることを特定した。さらに、該IspHの変異型を含むMEP経路ではイソプレノイド合成量が高いことを確認した。
　これにより、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
　１．以下の（１）～（８）のいずれか１である遺伝子を含む変異型IspH遺伝子、
（１）配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子、
（２）配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列において、1～30個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するHMB-PP｛(E)-4-ヒドロキシ-3-メチル-2-ブテニル二リン酸｝を基質としてIPP（イソペンテニル二リン酸）及び／又はDMAPP（ジメチルアリル二リン酸）を生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（３）配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列と80%以上の同一性を有し、かつ配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するHMB-PPを基質としてIPP及び／又はDMAPPを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（４）配列番号６、８、１０又は１２に記載の塩基配列からなるDNAからなる遺伝子、
（５）配列番号６、８、１０又は１２に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するHMB-PPを基質としてIPP及び／又はDMAPPを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（６）配列番号６、８、１０又は１２に記載の塩基配列からなるDNAにおいて、1～50個の塩基配列が置換、欠損、挿入及び／又は付加しているDNAからなる遺伝子、
（７）配列番号６、８、１０又は１２に記載の塩基配列からなるDNAと同一性が80%以上のDNAからなる遺伝子、及び
（８）配列番号６、８、１０又は１２に記載の塩基配列の縮重異性体からなるDNAからなる遺伝子。
　２．前記遺伝子が、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子又は配列番号６に記載の塩基配列からなるDNAからなる遺伝子である、前項１に記載の変異型IspH遺伝子。
　３．前記遺伝子が、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子又は配列番号８に記載の塩基配列からなるDNAからなる遺伝子である、前項１に記載の変異型IspH遺伝子。
　４．前記遺伝子が、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子又は配列番号１０に記載の塩基配列からなるDNAからなる遺伝子である、前項１に記載の変異型IspH遺伝子。
　５．前記遺伝子が、配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子又は配列番号１２に記載の塩基配列からなるDNAからなる遺伝子である、前項１に記載の変異型IspH遺伝子。
　６．イソペンテニル二リン酸及び／又はジメチルアリル二リン酸合成活性が高い変異型IspH遺伝子を導入した細胞を使用するイソプレンを構成単位として持つ化合物の合成方法。
　７．前記変異型IspH遺伝子が請求項１～５のいずれか１に記載の変異型IspH遺伝子である、前項６に記載の化合物の合成方法。
　８．以下の（１）～（７）のいずれか１であるペプチドを有する変異型IspH、
（１）配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列において、1～30個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、かつ配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するHMB-PPを基質としてIPP及び／又はDMAPPを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチド、
（３）配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポプリペプチドであり、かつ配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するHMB-PPを基質としてIPP及び／又はDMAPPを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチド、
（４）配列番号６、８、１０又は１２に記載の塩基配列にコードされたアミノ酸配列からなるペプチド、
（５）配列番号６、８、１０又は１２に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされたアミノ酸配列からなるペプチドを有し、ここで、該ペプチドは配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するHMB-PPを基質としてIPP及び／又はDMAPPを生成する活性と実質的同等の活性を有する、
（６）配列番号６、８、１０又は１２に記載の塩基配列からなるDNAにおいて、1～50個の塩基配列が置換、欠損、挿入及び／又は付加しているDNAによりコードされたアミノ酸配列からなるペプチド、及び、
（７）配列番号６、８、１０又は１２に記載の塩基配列からなるDNAと同一性が80%以上のDNAによりコードされたアミノ酸配列からなるペプチド。
　９．配列番号１で示されるアミノ酸を有し、並びに、１０５位、１７５位、２０７位、２１１位、２２０位、３０１位、及び３０６位からなる群より選択される１、２、３、４、５、６又は７つの部位にアミノ酸置換を有することを特徴とするアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、変異型IspH又はその誘導体。
　１０．前記変異型IspHは、野生型IspHと比較して、イソペンテニル二リン酸及び／又はジメチルアリル二リン酸合成活性が高いことを特徴とする、前項９に記載の変異型IspH又はその誘導体。
　１１．前記アミノ酸置換は、以下の群より選択される少なくとも１以上からなる前項９又は１０に記載の変異型IspH又はその誘導体。
　Leu105Gln、Thr175Ser、Thr207Ser、Gln211Leu、Gln220Arg、Glu301Asp及びAsn306Asp
　１２．前記アミノ酸置換は、以下の（１）～（４）のいずれか１以上から選択される前項９～１１のいずれか１項に記載の変異型IspH又はその誘導体。
（１）Thr207Ser及び／又はGlu301Asp
（２）Thr175Ser
（３）Leu105Gln
（４）Gln211Leu、Gln220Arg及び／又はAsn306Asp
　１３．配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、さらに、Thr207Ser及び／又はGlu301Aspのアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む、変異型IspH又はその誘導体。
　１４．配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、さらに、Thr175Serのアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む、変異型IspH又はその誘導体。
　１５．配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、さらに、Leu105Glnのアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む、変異型IspH又はその誘導体。
　１６．配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、さらに、Gln211Leu、Gln220Arg及び／又はAsn306Aspのアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む、変異型IspH又はその誘導体。
　１７．変異を導入したイソプレノイド経路に関与する酵素の遺伝子ライブラリを、ゲラ二オールの酵素活性を強化した細胞に導入し、該細胞の細胞増殖速度の増加、低下又は喪失を指標とする、変異型イソプレノイド経路に関与する酵素のスクリーニング方法。
　１８．前記細胞の細胞増殖速度の増加が、α-ピネン及び／又はジアポニューロスポレン合成量の増加である、前項１７に記載のスクリーニング方法。
　１９．前記細胞が大腸菌である、前項１７又は１８に記載のスクリーニング方法。
　本発明は、野生型IspHと比較してイソプレノイド合成量が高い変異型IspH、該変異型IspHを使用したイソプレノイド合成方法を提供することができた。
pUCara-(40,000)-GESM53hisのプラスミドマップ。 pUCara-(40,000)-GESwtのプラスミドマップ。 pACmod-Plac-idiのプラスミドマップ。 ゲラ二オール合成酵素（GES）遺伝子の強制発現による大腸菌の増殖阻害効果とその解消を示す結果。 pAC-modのプラスミドマップ。 p15A-dxsのプラスミドマップ。 p15A-dxrのプラスミドマップ。 p15A-ispDのプラスミドマップ。 p15A-ispEのプラスミドマップ。 p15A-ispFのプラスミドマップ。 p15A-ispGのプラスミドマップ。 p15A-ispHwtのプラスミドマップ。 p15A-idiのプラスミドマップ。 p15A-ispAのプラスミドマップ。 (a)各種MEP酵素の追加発現によるGES誘導毒性（イソプレノイド原料枯渇毒性）からのレスキュー効果の確認。(b)それぞれのMEP酵素発現によるカロテノイド色素の増産効果の結果。(c)ジアポニューロスポレンの生合成経路の模式図。 IspHのランダムライブラリの作製並びにGES発現の毒性回避を選択原理とする改良型変異体の取得方法の概要図。 p15A-ispHmut1のプラスミドマップ。 p15A-ispHmut2のプラスミドマップ。 p15A-ispHmut12のプラスミドマップ。 p15A-ispHmut14のプラスミドマップ。 pUC18nm-CrtMW38A-FDSY81Aのプラスミドマップ。 （a）α-ピネン及びジアポニューロスポレンの生合成経路、（ｂ）α-ピネン及びジアポニューロスポレンの合成量の結果。 pJ404-PShis-GPPSのプラスミドマップ。 pUC-crtM-crtNのプラスミドマップ。 pUC18nm-CrtMW38A-FDSY81Aのプラスミドマップ。 IspH変異体を使用したカロテノイド合成経路、並びに、カロテノイドの合成量の結果。 IspH変異体を使用しての非メバロン酸経路を介したイソプレノイドであるピネンの合成量の結果。 pJ404-PtPSQ457L-GPPSのプラスミドマップ。 p15A-ispHwtのプラスミドマップ。 p15A-ispHwt-dxsのプラスミドマップ。 p15A-ispHwt-dxs-ispGのプラスミドマップ。 p15A-ispHwt-dxs-ispG-dxrのプラスミドマップ。 p15A-Plac/lacO-ispHmut12のプラスミドマップ。 p15A-ispHmut12-dxsのプラスミドマップ。 p15A-ispHmut12-dxs-ispGのプラスミドマップ。 p15A-ispHmut12-dxs-ispG-dxrのプラスミドマップ。 MEP経路とMEV経路の概要図。
（本発明の対象）
　本発明は、「変異型IspH」、「変異型IspHを使用したイソプレンを構成単位として持つ化合物（イソプレンを構成単位とする炭化水素）合成方法」、「変異型IspH含むイソプレンを構成単位として持つ化合物（イソプレンを構成単位とする炭化水素）合成系」、並びに、「ゲラ二オールの酵素活性を強化したイソプレノイド経路発現系でのイソプレノイド経路に関与する酵素のスクリーニング方法」に関する。
　本発明での「イソプレンを構成単位として持つ化合物」とは、イソプレンを部分構造とする全ての化合物を対象とし、イソプレノイド、テルペン、カルテノイド、カンナビノイド、コエンザイムQ10等を例示することができる。
　本発明での「イソプレンを構成単位とする炭化水素」とは、特に限定されないが、イソプレノイド、テルペン、カルテノイド等を例示することができる。
（変異型IspH）
　本発明の変異型IspH又はその誘導体は、野生型IspHと比較して、アミノ酸又は塩基が１以上異なる酵素を意味する。
　野生型IspHは、大腸菌を含む多くの原核生物や植物にみられる酵素であり、HMB-PP（(E)-4-ヒドロキシ-3-メチル-2-ブテニル二リン酸）を基質としてIPP（イソペンテニル二リン酸）及びDMAPP（ジメチルアリル二リン酸）を生成する酵素として知られている。
　特に、本発明の変異型IspH又はその誘導体は、野生型IspHと比較して、IPP及び／又はDMAPP合成量が高い（合成活性が高い）ことが好ましい。
　また、本発明のIspH誘導体とは、変異型IspHの保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、若しくはアセチル化誘導体を対象とする。
　なお、保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、若しくはアセチル化誘導体は、自体公知の方法で得ることができる。
　また、本発明の変異体は、発現酵素の酵素活性、発現量又は安定性が高くなる変異体が好ましい。また基質特異性を高めるような変異体も好ましい。特に、酵素活性を高める変異体が好ましい。
　本発明の変異型IspHスクリーニング方法では、変異体のライブラリ（野生型に置換、欠損、挿入及び／又は付加が導入された遺伝子ライブラリ）を作成し、そのライブラリから、その宿主において酵素活性、発現量又は安定性が高い変異体を取得することができる。
　天然の細胞から抽出した遺伝子、作製したライブラリの遺伝子、化学合成遺伝子、ＰＣＲ増幅遺伝子など由来は問わない。本発明のスクリーニング方法は、発現する酵素の基質供給能を指標とするため、未同定の遺伝子もスクリーニングすることができる。
　ispH遺伝子（野生型に置換、欠損、挿入及び／又は付加が導入された遺伝子ライブラリ）の、ゲラ二オールの酵素活性を強化したイソプレノイド合成可能な細胞（MEP経路でのHMB-PP合成可能な細胞）への導入は、遺伝子組み換え技術で用いられている常法によることができる。例えば、ベクターにスクリーニング対象の遺伝子を組み込み、細胞を形質転換する等である。
　本発明の変異型IspH又はその誘導体は、大腸菌由来のIspH（配列番号１）と比較して、アミノ酸配列に以下で示される変異を有する。
　１０５位、１７５位、２０７位、２１１位、２２０位、３０１位、及び／又は３０６位の置換。
　また、本発明のIspHは、大腸菌由来のIspH（配列番号１）と比較して、アミノ酸配列に以下で示される変異を有する。
　Leu105Gln、Thr175Ser、Thr207Ser、Gln211Leu、Gln220Arg、Glu301Asp、及び／又はAsn306Asp。
　本発明の変異型IspHは、大腸菌由来のIspH（配列番号１）と比較して、アミノ酸配列に以下のいずれか１で示される変異を有する。
（１）Thr207Ser及び／又はGlu301Asp
（２）Thr175Ser
（３）Leu105Gln
（４）Gln211Leu、Gln220Arg及び／又はAsn306Asp
　本発明の変異型IspHは、大腸菌由来のIspH（配列番号１）と比較して、以下のいずれか１以上のアミノ酸変異を有することにより、大腸菌由来の野生型IspHと比較して、α-ピネン及び／又はジアポニューロスポレンイソプレン合成量が高いことを下記の実施例で確認している。
（１）Thr207Ser及びGlu301Asp（配列番号５）
（２）Thr175Ser（配列番号７）
（３）Leu105Gln（配列番号９）
（４）Gln211Leu、Gln220Arg及びAsn306Asp（配列番号１１）
　IPP、DMAPP、α-ピネン及び／又はジアポニューロスポレンイソプレン合成量が高いとは、大腸菌由来の野生型IspH（配列番号１）と比較して、1.1倍以上、1.2倍以上、1.3倍以上、1.4倍以上、1.5倍以上、2.0倍以上、2.1倍以上、2.2倍以上、2.3倍以上、2.4倍以上、2.5倍以上、2.6倍以上、2.7倍以上、2.8倍以上、2.9倍以上、3.0倍以上、約4.0倍（以上）、約5.0倍（以上）、約6.0倍（以上）、約7.0倍（以上）、約8.0倍（以上）、約9.0倍（以上）、約10倍（以上）、約11倍（以上）、約12倍（以上）、約13倍（以上）、約14倍（以上）、約15倍（以上）、約16倍（以上）、約17倍（以上）、約18倍（以上）、約19倍（以上）、約20倍（以上）、約21倍（以上）、約22倍（以上）、約23倍（以上）、約24倍（以上）、約25倍（以上）、約26倍（以上）、約27倍（以上）、約28倍（以上）、約29倍（以上）、約30倍（以上）、約31倍（以上）、約35倍（以上）、約40倍（以上）、約45倍（以上）、約50倍（以上）、約60倍（以上）、約70倍（以上）、約80倍（以上）、約90倍（以上）、約100倍（以上）、約200倍（以上）、約300倍（以上）、約400倍（以上）、約500倍（以上）、約1000倍（以上）、約5000倍（以上）、約10000倍（以上）を例示することができる。
（変異型ispH遺伝子）
　本発明の変異型ispH遺伝子は、以下のいずれか１以上の遺伝子を含む。
（１）配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子。
（２）配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列において、1～30個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するHMB-PP｛(E)-4-ヒドロキシ-3-メチル-2-ブテニル二リン酸｝を基質としてIPP（イソペンテニル二リン酸）及び／又はDMAPP（ジメチルアリル二リン酸）を生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
（３）配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列と80%以上の同一性を有し、かつ配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するHMB-PPを基質としてIPP及び／又はDMAPPを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
（４）配列番号６、８、１０又は１２に記載の塩基配列からなるDNAからなる遺伝子。
（５）配列番号６、８、１０又は１２に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するHMB-PPを基質としてIPP及び／又はDMAPPを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
（６）配列番号６、８、１０又は１２に記載の塩基配列からなるDNAにおいて、1～50個の塩基配列が置換、欠損、挿入及び／又は付加しているDNAからなる遺伝子。
（７）配列番号６、８、１０又は１２に記載の塩基配列からなるDNAと同一性が80%以上のDNAからなる遺伝子。
（８）配列番号６、８、１０又は１２に記載の塩基配列の縮重異性体からなるDNAからなる遺伝子。
　上記（１）の遺伝子は、好ましくは、本発明の変異型IspHのスクリーニング方法から得られた変異型ispHをコードする遺伝子である。該変異型IspHは、HMB-PPを基質としてIPP及び／又はDMAPPを生成する活性を持つ。
　上記（２）の遺伝子は、本発明の変異型ispHに対して酵素活性を失わせない程度の変異を導入したポリペプチドをコードする遺伝子である。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段としては、部位特異的変異誘発法（Nucleic Acids Res. 10,6487-6500, 1982）などを挙げることができる。変異したアミノ酸の数は、通常は、30アミノ酸以内であり、好ましくは20アミノ酸以内であり、より好ましくは10アミノ酸以内であり、更に好ましくは5アミノ酸以内であり、最も好ましくは3アミノ酸である。変異を導入したポリペプチドが酵素活性を保持しているかどうかは、例えば、変異を導入したポリペプチドをコードする遺伝子を大腸菌等に導入し、発現させ、その大腸菌等がHMB-PPを基質としてIPP及び／又はDMAPPを生成することができるかどうか調べることによりわかる。これらのアミノ酸の位置・部位に変異が導入されると酵素活性が失われる可能性が高いので、変異はこれらのアミノ酸以外のアミノ酸に導入されることが好ましい。
　上記（２）、（３）及び／又は（５）の「配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するHMB-PPを基質としてIPP及び／又はDMAPPを生成する活性と実質的同等の活性」とは、その活性程度が、配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列のHMB-PPを基質としてIPP及び／又はDMAPPを生成する活性と比較して強くても弱くてもよい。例えば、0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1.0倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、500倍、又は1000倍の活性を例示することができる。
　また、同一性（相同性）は、BLAST（Basic LocalAlignment Search Tool at the NationalCenter forBiological Information）等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算することができる。
　上記（３）の遺伝子は、配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列と80%以上又は90%以上、好ましくは93％以上、より好ましくは95％以上、更に好ましくは98％以上の同一性（相同性）、最も好ましくは99％以上の同一性（相同性）を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む。
　上記（５）の遺伝子は、DNA同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる遺伝子である。この遺伝子における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、5×SSC、1％SDSを含む緩衝液中の37℃でのハイブリダイゼーション及び1×SSC、0.1％SDSを含む緩衝液による37℃での洗浄処理といった条件であり、好ましくは、5×SSC、1％SDSを含む緩衝液中の42℃でのハイブリダイゼーション及び0.5×SSC、0.1％SDSを含む緩衝液による42℃での洗浄処理といった条件であり、更に好ましくは、5×SSC、1％SDSを含む緩衝液中の65℃でのハイブリダイゼーション及び0.2×SSC、0.1％SDSを含む緩衝液による65℃での洗浄処理といった条件である。ハイブリダイゼーションを利用することにより得られたDNAが、活性を有するポリペプチドをコードするかどうかは、例えば、そのDNAを大腸菌等に導入し、発現させ、その大腸菌等がHMB-PPを基質としてIPP及び／又はDMAPPを生成することができるかどうか調べることによりわかる。ハイブリダイゼーションにより得られるDNAは、上記（４）の遺伝子（配列番号６、８、１０又は１２）と通常、高い同一性（相同性）を有する。高い同一性（相同性）とは、80％以上又は90％以上の同一性、好ましくは95％以上の同一性、更に好ましくは98％以上の同一性、最も好ましくは99％以上の同一性を指す。
　上記（６）の遺伝子は、配列番号６、８、１０又は１２に記載の塩基配列からなるDNAにおいて、1～50個、好ましくは1～30個、より好ましくは1～20個、特に好ましくは1～10個、最も好ましくは1～5個の塩基配列が置換、欠損、挿入及び／又は付加しているDNAからなる遺伝子である。
　上記（７）の遺伝子は、配列番号６、８、１０又は１２に記載の塩基配列からなるDNAと80％以上又は90%以上、好ましくは93％以上、より好ましくは95％以上、更に好ましくは98％以上の同一性、最も好ましくは99％以上の同一性を有するDNAからなる遺伝子を、含む。
　上記（８）の塩基配列の縮重異性体とは、配列番号６、８、１０又は１２に記載の塩基配列がコードするアミノ酸に対応する他の塩基配列を意味する。
（変異型IspH）
　本発明の変異型IspHは、以下のいずれか１のペプチドを有する。
（１）配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列において、1～30個又は1～20個、好ましくは1～15個、より好ましくは1～10個、最も好ましくは1～5個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、かつ配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するHMB-PPを基質としてIPP及び／又はDMAPPを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチド。
（３）配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列と80%以上、85％以上、90％以上、93％以上、95％以上、97％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポプリペプチドであり、かつ配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するHMB-PPを基質としてIPP及び／又はDMAPPを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチド。
（４）配列番号６、８、１０又は１２に記載の塩基配列にコードされたアミノ酸配列からなるペプチド。
（５）配列番号６、８、１０又は１２に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされたアミノ酸配列からなるペプチドを有し、ここで、該ペプチドは配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するHMB-PPを基質としてIPP及び／又はDMAPPを生成する活性と実質的同等の活性を有する。
（６）配列番号６、８、１０又は１２に記載の塩基配列からなるDNAにおいて、1～50個（1～30個又は1～20個、好ましくは1～15個、より好ましくは1～10個、最も好ましくは1～5個）の塩基配列が置換、欠損、挿入及び／又は付加しているDNAによりコードされたアミノ酸配列からなるペプチド。
（７）配列番号６、８、１０又は１２に記載の塩基配列からなるDNAと同一性が80%以上（85％以上、87％以上、90％以上、93％以上、95％以上、97％以上）のDNAによりコードされたアミノ酸配列からなるペプチド。
　なお、ペプチドの変異の導入において、当該ペプチドの基本的な性質（物性、機能、生理活性又は免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸及び芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。
（本発明のスクリーニング方法）
　本発明のゲラ二オールの酵素活性を強化したイソプレノイド経路発現系でのイソプレノイド経路に関与する酵素のスクリーニング方法（以後、「本発明のスクリーニング方法」と略する場合がある）」は、変異型のイソプレノイド経路に関与する酵素｛例、MEP経路：DOXPシンターゼ(Dxs)、DOXPレダクトイソメラーゼ(Dxr、IspC)、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールシンターゼ(IspD)、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリトリトールキナーゼ(IspE)、2-C-メチル-D-エリトリトール-2,4-シクロ二リン酸シンターゼ(IspF)、HMB-PPシンターゼ(IspG)、HMB-PPレダクターゼ(IspH)、MEV経路：アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼ、HMG-CoAシンターゼ、HMG-CoAレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、5-ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ｝の探索を行うため、図３７に記載のMEV経路及びMEP経路のいずれかの生成物を合成可能なゲラ二オールの酵素活性を強化した細胞に、変異型イソプレノイド経路に関与する酵素遺伝子（好ましくは、イソプレノイド経路に関与する酵素遺伝子ライブラリ、特に、ランダム変異を導入したイソプレノイド経路に関与する酵素遺伝子ライブラリ）を導入し、該導入細胞の生存率、各経路の生成物の生成量、さらには、ゲラニオール、ジアポニューロスポレン、ユビキノン、バクトプレノール等の生成量を指標とする、スクリーニング方法に関する。
（MEV経路及びMEP経路のいずれかの生成物を合成可能なゲラ二オールの酵素活性を強化した細胞）
　本発明での「ゲラ二オールの酵素活性を強化した細胞」は、野生型と比較して、ゲラ二オールの酵素活性が高いことを特徴とする。なお、ゲラ二オールの酵素活性を高い細胞は、自体公知の方法により、ゲラニオール合成酵素（特に、活性が高いゲラニオール合成酵素）を細胞中に強制発現させることで得られる。
　また、本発明での「MEV経路及びMEP経路のいずれかの生成物を合成可能な細胞」は、図３７に記載の各酵素及び各基質が細胞に含まれていれば良い。各酵素及び各基質は、細胞の内因性でもよく、外部からの遺伝子導入やタンパク質導入による外因性でも良い。
　加えて、本発明の細胞は、天然の細胞でも、遺伝子組み換えにより形質転換されている細胞でもよい。遺伝子組み換え細胞は、遺伝子組み換えの操作に簡便な細胞である、大腸菌、枯草菌、酵母などが挙げられる。
（変異型イソプレノイド経路に関与する酵素を使用したイソプレンを構成単位として持つ化合物）
　本発明の変異型イソプレノイド経路に関与する酵素を使用したイソプレンを構成単位として持つ化合物（特に、イソプレンを構成単位とする炭化水素、さらには、イソプレノイド合成方法、以後、「本発明の合成方法」と略する場合がある）では、上記「本発明のスクリーニング方法」で得られた酵素活性の高い変異型イソプレノイド経路に関与する酵素を使用する。
　本発明の合成方法は、変異型イソプレノイド経路に関与する酵素を使用する以外は、自体公知の方法を利用することができる。例えば、変異型イソプレノイド経路に関与する酵素遺伝子をMEV経路及び／又はMEP経路を有する細胞株に導入して、該酵素を該細胞株で発現させることにより、MEV経路及び／又はMEP経路での生産物等を高収量で発現させることができる。あるいは、最近盛んに研究されつつある、DMAOHやIOHを直接二リン酸化する人工経路、グリセロールからIOH/DMAOHを介してIPP/DMAPPを供給する経路(JM. Clomburg ,PNAS, 116,12810 (2019))、さらには、別の経路の酵素の特異性改変によって、DOXPを他の経路から作る経路（Perez-Gil, Plos ONE, 8, e43775）などとも併用できる。
　本発明の変異型IspHを使用した合成方法では、高収量のイソプレノイドを合成できることを確認している。
　本発明の合成方法では、下記の実施例の結果により、使用する変異型IspHの種類により、イソプレンを構成単位として含む炭化水素の炭素数の割合を変化させることができる。
　例えば、図２６の結果か明らかなように、炭素数が高いカロテノイド（例、C45、C40：分子量が大きいカロテノイド）の含有割合を高めるためには、IspHmut1（配列番号５）を使用する。
　また、炭素数が低いカロテノイド（例、C35、C30：分子量が小さいカロテノイド）の含有割合を高めるためには、IspHmut2（配列番号７）、IspHmut12（配列番号９）及びIspHmut14（配列番号１１）を使用する。
　本発明の合成方法では、下記の実施例の結果により、使用する変異型IspHの種類により、合成するDMAPP:IPP比を調整することができる。
　例えば、図２６の結果か明らかなように、IspHmut1を使用すれば、DMAPP/IPP比を下げて、効率的にC45、C40を合成することができる。また、IspHmut 2,12,14を使用すれば、DMAPP/IPP比を上げて、効率的にC35、C30を合成することができる。
　本発明のMEV経路及びMEP経路の両経路を持つ合成方法では、MEV経路及びMEP経路の両経路を同時に高効率に発現させるためには、DMAPP/IPP比を上げる必要がある（参照：図３７）。すなわち、本発明のIspHmut 2,12,14を使用する合成方法では、DMAPP/IPP比を上げることにより、MEV経路及びMEP経路の両経路を同時に高効率に発現させることができる。
（変異型イソプレノイド経路に関与する酵素を含むイソプレノイド合成系）
　本発明の変異型イソプレノイド経路に関与する酵素を含む化合物（特に、イソプレノイド）合成系（以後、「本発明の合成系」と略する場合がある）は、上記「本発明の合成方法」を実施することができる。
　本発明の合成系は、変異型イソプレノイド経路に関与する酵素を含む系であれば、他は自体公知の構成物を利用することができる。例えば、本発明の合成系は、MEV経路及びMEP経路を有する細胞株と変異型イソプレノイド経路に関与する酵素遺伝子を含む。
　以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
｛イソプレノイド経路に関与する酵素のスクリーニング系の構築｝
　本実施例では、イソプレノイド経路に関与する酵素の酵素活性を測定するためのスクリーニング系の構築を構築した。詳細は、以下の通りである。
　4つの異なる大腸菌株であるBW25113Δtna（deletion of the indole productionenzyme tryptophanase）、BW25113、DH5a及びXL1 blueにpUCara-(400000)-GESM53を導入した。これらの形質転換体を含む培地にアラビノースを添加することによって、活性強化型のGES変異体（GESM53）を高収量で発現誘導できることを確認した（参照：Tashiro et al., ACS Synth. Biol., 5, 1011-1021 (2016)）。
　使用したpUCara-(40,000)-GESM53his、pUCara-(40,000)-GESwt及びpACmod-Plac-idiは、それぞれ、図１～図３に示した。
　0.2%のアラビノースを添加したLB寒天培地に、これらの４種類の形質転換体（Idi添加有又は無の条件下）をそれぞれおよそ100万細胞程度撒き、コロニー形成させた。すべての形質転換体のGESM53発現を誘導したとき（図４の「灰色バー」）のコロニー形成数（colony forming unit）は、非誘導時（アラビノース無添加の寒天培地、図４の「白バー」）に比べ、有意に小さかった。DH5aでは1桁程度の低下であったが、BW25113（Δtna）では、5桁も低下した。また、不活性化変異（D323A）を導入したGESM53変異体（GES(D323A)）は、どの株も全くコロニー形成能が変動しなかった。
　これにより、GES発現によるcfu低下は、GESの酵素活性が寄与していることを確認した。
　GESM53活性による細胞増殖阻害としては、2つの可能性がある。１つは、GESの生産物毒性である。ゲラ二オールを含むモノテルペンは抗菌剤として広く使われる物質であり、その過剰な生産は、生産株そのものの増殖阻害をもたらす可能性がある。もう一つの可能性は、GESM53活性による代謝物枯渇である。大腸菌の代謝経路上、GES前駆体であるゲラニル二リン酸（GPP）の蓄積量は低い。GPPはtRNA修飾（ゲラニル化）に使われる（参照：Dumelin et al., Nat. Chem. Biol., 8, 913-9 (2012)）だけでなく、キノン（呼吸鎖の電子伝達メディエータ）やバクテリオプレノール（細胞壁合成に必要）の原料、ファルネシル二リン酸の前駆体でもある。GESM53の強い活性によってGPPが吸い上げられた場合、増殖に必須なFPPの枯渇によって細胞増殖が止まる可能性がある。
　３倍程度のイソプレノイド増産効果があるイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子（idi）（Kajiwara et al., Biochem. J., 324,421-6(1997)）を共発現して同様の実験を行ったところ、いずれの株においても、GES発現誘導によるコロニー形成能の低下は大幅に低減した（参照：図４）。この結果は、Idi発現によって増加したイソプレノイド原料（IPP、DMAPP）が、GESの基質消費を緩和した。仮に、ゲラ二オールの蓄積毒性であれば、コロニー形成能はさらに下がるはずである。
　XL1blueやDH5aのように完全にcfuを回復できないものもあったが、BW25113およびBW25113(Δtna)株は、GESM53発現毒性によって4～5桁も低下したコロニー形成能が、idiの発現だけで完全に回復している。ファルネセン合成酵素（FS）による細胞増殖低下は増殖速度が2倍程度低下するにとどまっていることが報告されている（参照：Wang et al., Metab. Eng., 13, 648-655 (2011)）。一方、本実施例の系では、GESM53発現によって都合最大5桁もcfuが低下し、かつ、それがidiの追加発現で完全に回復している。つまり、GESM53の発現誘導によって、idiを発現している細胞が、発現していない細胞と比較して、一晩で～10万倍も濃縮されることになる。
　以上により、ゲラ二オールの酵素活性を強化したイソプレノイド経路発現系を使用するイソプレノイド経路に関与する酵素のスクリーニング系を構築した。
（ゲラ二オールの酵素活性を強化したイソプレノイド経路発現系でのイソプレノイド経路に関与する酵素の過剰発現）
　本実施例では、実施例１で構築したゲラ二オールの酵素活性を強化したイソプレノイド経路発現系でイソプレノイド経路に関与する酵素の過剰発現によるカロテノイドの増産効果を確認した。詳細は、以下の通りである。
　MEPを構成する酵素はDXS、DXR、IspD、IspE、IspF、IspG及びIspHの7種類である。これらの追加過剰発現がどれほどGES発現毒性（イソプレノイド原料枯渇による増殖阻害）のレスキュー効果があるかを確認した。
　詳しくは、pACベクターをベースに、各種MEP酵素（dxs、dxr、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH）idi、ispAの合計9種類を単独で定常発現させるプラスミドを作成した。これをpUCara(40,000)-GESM53hisを形質転換済みの細胞（BW25113Δtna株）に導入し、GESM53誘導条件（0.2%アラビノース添加した寒天培地）でのコロニー形成数を、非誘導プレート（アラビノース添加なしの寒天培地）でのコロニー数で割った値を調べた。何も発現しなかった株に関し、コロニー形成数は、アラビノース添加によって、約1/10000（0.01%）にまで低下した。
　使用したpACmod、９種類の遺伝子を挿入した９個のplasmidのプラスミドマップを図５～図１４に示す。
　Dxsの過剰発現は、270倍程度のレスキュー効果が認められたが（図１５a：コロニー形成率は～2.7%）、他のMEP酵素（DXR、IspD、IspE、IspF、IspG及びIspH）は、1～45倍であった。これらのMEP酵素の過剰発現は、Idi（8300倍）及びIspA（8800倍）の過剰発現に比べると低いことを確認した（図１５a）。
　また、これら9つの遺伝子の発現、イソプレノイド色素であるカロテノイド増産に与える影響を調べた。詳しくは、これらの単独定常発現プラスミドをpUC-MNをBW25113Δtna株に共導入し、その細胞あたりのカロテノイド蓄積量を既報の手順によって測定した（図１５b）。図１５aで確認されたレスキュー能は、それぞれの遺伝子発現によってもたらされるイソプレノイド原料供給能力と良い相関を示した。最もレスキュー効果の高かったMEP酵素であるDxsはイソプレノイド色素であるジアポニューロスポレンの生合成量を2倍に増産する効果が認められた（図１５b）。8300倍のレスキュー効果をもたらすIdiは、6倍以上の増産効果を示した。なお。IspAの増産効果は、レスキュー効果に比べると低いものであるが、これは、IspAが2-step酵素であり、GESM53の直接基質である中間体GPPをリリースせずDMAPPをFPPに変換することによるものであると考えられる。
　DXSを除く全てのMEP酵素の過剰発現は、GESM53発現からのレスキュー効果を顕著に示すことはなく、そして色素増産効果も僅かであった。この結果は、MEP経路において律速ではないことを示している。すなわち、MEP酵素だけでなくイソプレノイド経路に関与する酵素がなんらかの進化により酵素活性を向上させることができれば、色素増産効果を得ることができる。
　すなわち、GES発現毒性からのレスキュー効果を指標としたイソプレノイド経路に関与する酵素のスクリーニングが可能である。
（イソプレノイド経路に関与する酵素活性のスクリーニング）
　図１５ｂの結果により、MEP経路のどれか一つの酵素が明確な律速段階をなしているとは考えにくい。すなわち、１つのMEP酵素活性があがるだけで、MEP経路の力価が大きく変化するわけではないと考えられる。なお、DXSに有意な効果がみとめられたのは、この酵素が律速段階であるというよりは、経路の第1ステップにあって、内在の代謝経路と競合すると考える。
　MEP経路の最終ステップにあって2つのプロダクト（DMAPPとIPP）を同時供給するIspH（図１５c）は、他酵素よりもMEP経路の力価を向上させることができる可能性が高いと判断した。また、IspHには明確な生産物選択性があり、DMAPPとIPPの細胞内供給量は1:5に固定されている。
　これにより、イソプレノイド経路に関与する酵素としてIspHを選択した。詳細は、以下の通りである。
　IspH遺伝子の全長にランダム変異を導入し、IspHライブラリを作製した（多様性は4,650）（図１６）。これをGESM53発現した大腸菌株BW25113(Δtna)に導入し、アラビノース含有寒天培地に撒いた。
　約5,000細胞を撒いたアラビノース培地の上に、15のコロニーが生じた。これらの形質転換体の内、再形質転換実験でアラビノース培地でコロニーを形成できないものが4つあった。残り11の形質転換体は、再現性よくGESM53発現から宿主をレスキューできることを確認した。
　１５個の遺伝子型を下記表１に示す。11個の遺伝子型は、「Thr207Ser、Glu301Asp」、「Thr175Ser」、「Leu105Gln」及び「Gln211Leu、Gln220Arg、Asn306Asp」の４つの遺伝子型を有することを確認した。
　なお、使用したプラスミドp15A-ispHmut1、p15A-ispHmut2、p15A-ispHmut12、p15A-ispHmut14及びpUC18nm-CrtMW38A-FDSY81Aを図１７～図２１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（IspH変異体の酵素活性の測定）
　本実施例では、実施例３で取得した４つの遺伝子型のIspH変異体が実際に前駆体供給力（色素増産効果）を有するかを確認した。詳細は、以下の通りです。
　図２２aに記載のように、α-ピネン及びジアポニューロスポレンを発現可能とするために、４つの遺伝子型変異体の発現plasmidsを、ピネン合成酵素（PtPS）、ジアポニューロスポレン合成経路（CrtM、CrtN）の発現ベクターとともに大腸菌株（BW25113）に導入し、α-ピネン及びジアポニューロスポレンの生産量を確認した（図２２b）。
　詳しくは、ピネン合成プラスミド（pJ404-PShis-GPPS）又はジアポニューロスポレン合成プラスミド（pUC-CrtM-CrtN）を、IspHの野生型又はIspH変異体の発現プラスミド（p15A-ispHwt、p15A-ispHmut1、p15A-ispHmut2、p15A-ispHmut12、p15A-ispHmut14）と共導入したBW25113Δtna株を48時間振盪培養し、その生産量を既報の手法（ピネンはGC-FID、ジアポニューロスポレンはHPLC-PDA-MS）によって解析した。対照として、IspH変異体のかわりにidiを発現するプラスミドを使って、同様の実験を行った。ジアポニューロスポレン酵素（pJ404-PShis-GPPS）及びピネン酵素（pUC-crtM-crtN）の発現プラスミドを図２３～図２４に示す。
　すべての遺伝子変異型は、α-ピネン及びジアポニューロスポレンの増産効果を示した（図２２b）。FPPを原料とするジアポニューロスポレン合成に関し、野生型IspHは増産効果を示さなかった。一方、すべてのIspH変異体は、単独増強発現で約3～8倍の増産効果を示した。GPPを原料とするモノテルペンであるピネン合成に関し、IspHmut12単独増強により、数十倍の増産効果を示した。
（IspH変異体の酵素活性向上の解明）
　一般に、酵素の活性（Vmax）が一つのアミノ酸置換（Leu105Gln）だけで数十倍になることは想定しづらい。さらに、イソプレノイドの増産効果は、MEP経路全体のフラックスを反映したものであり、IspH野生型の過剰発現が全く増産効果を示さないことからも（図１５a、図２２b）、IspH過程がMEP経路の律速工程ではないことは明らかである。
　ピネン生産で最高のパフォーマンスを示したIspHmut12が、FPPを原料とするジアポニューロスポレンの増産効果は、IspHmut2に劣る点にある。前者は1分子のDMAPPと1分子のIPPからつくられるが（DMAPP:IPP=1:1）、後者は2分子のDMAPPと4分子のIPPからつくられる（DMAPP:IPP=1:2）。仮に、IspHmut12がVmaxだけでなく、プロダクト選択性を変化させてDMAPP比を高めることに寄与しているのであれば、図２２bの結果のピネン増産効果と一致する。
　これにより、IspH変異体であるIspHmut12はどのようにして、モノテルペンの生産量を高めたかを解明した。詳細は、以下の通りある。
　IspH変異体のプロダクト特異性（DMAPP:IPP比）を調べるために、酵素機能の特異性が低いFDS変異体（FDSY81A）とCrtM変異体（CrtMW38A）を発現する発現ベクターを使用した。両変異体は、反応ポケット内のアミノ酸置換によって、その特異性が緩和され、意図的に、特異性の低い酵素変異体としている。FDS変異体は、C15、20、25PPをプロダクトとして放出でき、CrtM変異体は、これらを原料に、C30、C35、C40、C45カロテノイドを合成できる。
　詳しくは、具体的には、pUC18nm-CrtMW38A-FDSY81Aを導入した細胞BW25113Δtna株にこれらのIspH変異体を導入した。変異体の発現プラスミドを追加導入し、30℃で48時間振盪培養した。培養液を集菌してアセトン抽出し、ヘキサン・生理食塩水で抽出してヘキサン画分を取得・濃縮した。これをTHF:アセトニトリル=6:4に溶解してサンプルとした。これをHPLC-PDA-MS分析（移動相：アセトニトリル：THF：メタノール＝58：4：38）した。ここで共発現するのは、FDS変異体（FDSY81A）とCrtM変異体（CrtMW38A）である。両者ともに反応ポケット内のアミノ酸置換によって、その特異性がrelaxされ、故意に、特異性の低い酵素変異体としている。FDS変異体は、C15、20、25PPをプロダクトとして放出でき、CrtM変異体は、これらを原料に、C30、C35、C40、C45カロテノイドを合成できる。すなわち、経路としても極めて選択性の低い系を構築でした（参照：Furubayashi et al., Nat. Commun., 6, 7534 (2015)）。仮に、細胞内のDMAPP/IPP比率が大きくなるならば、この特異性の低いカロテノイド経路は、より低分子量のカロテノイドが合成する。
　pUC18nm-CrtMW38A-FDSY81Aの発現プラスミドを図２５に示す。
　IspH変異体と共存したこのカロテノイド経路が蓄積したカロテノイド画分をHPLC解析した結果を図２６に示す。野生型IspHを共存させた場合は、C40経路を中心に、C30、C45カロテノイドを主に合成している。Idiを共存させた場合は、野生型のIspHのカロテノイドの比率を変えることなく（C40カロテノイドをメインプロダクトとしている）、生産量を大きく向上させている。IspHmut1は、野生型IspHのカロテノイドの比率と同様の結果であった。
　一方で、IspHmut2、IspHmut12、IspHmut14は、野生型IspHと比較して、明らかにプロダクトが低分子量側に偏っているのを確認した。IspH変異体が供給するイソプレノイド原料が、DMAPPに偏ったことによるものである（DMAPP:IPP比が高い）。
　カロテノイドやテルペンは、DMAPPを出発原料とし、これに複数個のIPPを付加してそれぞれのテルペンの直接基質を与える（モノテルペンであるピネン原料GPPの場合はひとつのIPP、セスキテルペンのファルネセンやトリテルペンであるスクアレンやジアポニューロスポレンの原料であるFPPの場合はDMAPPあたり2つのIPP、ジテルペンやテトラテルペンの原料GGPPの場合はDMAPPあたり3つのIPP、大腸菌のキノン側鎖C40の場合はDMAPPあたり7つのIPP、大腸菌バクテリオプレノールの場合はDMAOHあたり10のIPPが消費される）。
　つまり、サイズ選択性の低いカロテノイド生合成経路が与えるカロテノイド骨格のサイズ分布は、前駆体であるIPP、DMAPPの存在量（DMAPP:IPP比）を反映するため、図２６に記載のような結果になったと考えられる。
　有価テルペノイドの生産は、低分子量（低沸点）テルペン類、モノテルペンやヘミテルペン（C5、イソプレンガス）では、DMAPPの供給量を高める（DMAPP:IPP比を高める）ことが重要であることを解明した。
　大腸菌宿主では、イソプレノイド経路の主な使い道は、キノン側鎖分子（C40、DMAPP:IPP=1:7）、バクテリオプレノール（C55、DMAOH:IPP=1:10）である。この宿主の代謝ネットワークの要請に応じて、MEP経路のDMAPP:IPP供給比率は1:5にデフォルト設定されている（参照：Altincicek et al.,FEBS Lett., 532, 437-440 (2002)）。
　本実施例により、低分子テルペン（DMAPP要求度の高いプロダクト）を効率的に生産させるためには、代謝フラックスを高めるだけではなく、DMAPP/IPP比を高めることが重要であることを確認した。
　すなわち、IspHmut1を使用すれば、DMAPP/IPP比を下げて、効率的にC45、C40を合成することができる。また、IspHmut 2,12,14を使用すれば、DMAPP/IPP比を上げて、効率的にC35、C30を合成することができる。
（IspH変異体を使用しての非メバロン酸経路を介したイソプレノイド合成）
　上記実施例で創出したIspH変異体であるIspHmut12、さらには、非メバロン酸経路に関与する酵素であるDxs、IspG、Dxrを増強発現した非メバロン酸経路を介したイソプレノイド合成系を構築して、イソプレノイドであるα-ピネンの合成量を確認した。詳細は、以下の通りである。
　IspH又はIspH mut12にそれぞれDxs、IspG及び／又はDxrを発現可能なオペロン、並びに、GPPSとPtPSを共発現したplasmidを大腸菌株に導入した（参照：図２７）。この形質転換体をTB培地で培養しながら、上層したドデカンに連続抽出した。各バッチからドデカンを回収し、そこに抽出されたピネンを、ガスクロマトグラフ-FID検出方式によって定量・比較した。
　なお、使用したプラスミドのマップ（pJ404-PtPSQ457L-GPPS、p15A-ispHwt、p15A-ispHwt-dxs、p15A-ispHwt-dxs-ispG、p15A-ispHwt-dxs-ispG-dxr、p15A-Plac/lacO-ispHmut12、p15A-ispHmut12-dxs、p15A-ispHmut12-dxs-ispG及びp15A-ispHmut12-dxs-ispG-dxr）を図２８～図３６に示した。
　IspH野生型を使用した合成系に関し、他の生合成遺伝子を追加発現しても、生産量は横ばいであった（図２７）。一方、IspHmut12に関し、単独でも30倍以上の増産効果を示すだけでなく、dxs、ispG、dxrを足し増すたびに、その生産量は純増してゆき、約100倍を超える生産量を実現した（図２７）。
（総論）
　先行研究では、図３７に示すように、MEV経路の改良には成功してきたが、MEP経路の改良には成功していない。炭素収率においてMEVを上回るMEP経路には解明されていない制御が多重にかかっていて、増産が制限されていると考えられている。従来、MEP経路の7-stepsある酵素ステップにおいて、最初の反応（dxs）が律速要素であるとされていた。しかし、本実施例でで、最後の反応であるIspHが律速要素であることを解明した。そして、本実施例では、IspH変異体を導入したMEP経路を含む大腸菌は、テルペン生産量を170倍も増強することができた。
　加えて、図３７の経路により、MEV経路及びMEP経路の両経路を同時に高効率に発現させるためには、DMAPP/IPP比を上げる必要がある。本発明の実施例５の結果から明らかなように、本発明のIspHmut 2,12,14を使用すれば、DMAPP/IPP比を上げることにより、MEV経路及びMEP経路の両経路を同時に高効率に発現させることができる。
　本発明は、野生型IspHと比較してイソプレノイド合成量が高い変異型IspH、並びに該変異型IspHを使用したイソプレノイド合成方法を提供することができる。

Claims (19)

  1. 　以下の（１）～（８）のいずれか１である遺伝子を含む変異型IspH遺伝子、
    （１）配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子、
    （２）配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列において、1～30個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するHMB-PP｛(E)-4-ヒドロキシ-3-メチル-2-ブテニル二リン酸｝を基質としてIPP（イソペンテニル二リン酸）及び／又はDMAPP（ジメチルアリル二リン酸）を生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
    （３）配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列と80%以上の同一性を有し、かつ配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するHMB-PPを基質としてIPP及び／又はDMAPPを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
    （４）配列番号６、８、１０又は１２に記載の塩基配列からなるDNAからなる遺伝子、
    （５）配列番号６、８、１０又は１２に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するHMB-PPを基質としてIPP及び／又はDMAPPを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
    （６）配列番号６、８、１０又は１２に記載の塩基配列からなるDNAにおいて、1～50個の塩基配列が置換、欠損、挿入及び／又は付加しているDNAからなる遺伝子、
    （７）配列番号６、８、１０又は１２に記載の塩基配列からなるDNAと同一性が80%以上のDNAからなる遺伝子、及び
    （８）配列番号６、８、１０又は１２に記載の塩基配列の縮重異性体からなるDNAからなる遺伝子。
  2. 　前記遺伝子が、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子又は配列番号６に記載の塩基配列からなるDNAからなる遺伝子である、請求項１に記載の変異型IspH遺伝子。
  3. 　前記遺伝子が、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子又は配列番号８に記載の塩基配列からなるDNAからなる遺伝子である、請求項１に記載の変異型IspH遺伝子。
  4. 　前記遺伝子が、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子又は配列番号１０に記載の塩基配列からなるDNAからなる遺伝子である、請求項１に記載の変異型IspH遺伝子。
  5. 　前記遺伝子が、配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子又は配列番号１２に記載の塩基配列からなるDNAからなる遺伝子である、請求項１に記載の変異型IspH遺伝子。
  6. 　イソペンテニル二リン酸及び／又はジメチルアリル二リン酸合成活性が高い変異型IspH遺伝子を導入した細胞を使用するイソプレンを構成単位として持つ化合物の合成方法。
  7. 　前記変異型IspH遺伝子が請求項１～５のいずれか１に記載の変異型IspH遺伝子である、請求項６に記載の化合物の合成方法。
  8. 　以下の（１）～（７）のいずれか１であるペプチドを有する変異型IspH、
    （１）配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （２）配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列において、1～30個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、かつ配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するHMB-PPを基質としてIPP及び／又はDMAPPを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチド、
    （３）配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポプリペプチドであり、かつ配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するHMB-PPを基質としてIPP及び／又はDMAPPを生成する活性と実質的同等の活性を有するポリペプチド、
    （４）配列番号６、８、１０又は１２に記載の塩基配列にコードされたアミノ酸配列からなるペプチド、
    （５）配列番号６、８、１０又は１２に記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされたアミノ酸配列からなるペプチドを有し、ここで、該ペプチドは配列番号５、７、９又は１１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するHMB-PPを基質としてIPP及び／又はDMAPPを生成する活性と実質的同等の活性を有する、
    （６）配列番号６、８、１０又は１２に記載の塩基配列からなるDNAにおいて、1～50個の塩基配列が置換、欠損、挿入及び／又は付加しているDNAによりコードされたアミノ酸配列からなるペプチド、及び、
    （７）配列番号６、８、１０又は１２に記載の塩基配列からなるDNAと同一性が80%以上のDNAによりコードされたアミノ酸配列からなるペプチド。
  9. 　配列番号１で示されるアミノ酸を有し、並びに、１０５位、１７５位、２０７位、２１１位、２２０位、３０１位、及び３０６位からなる群より選択される１、２、３、４、５、６又は７つの部位にアミノ酸置換を有することを特徴とするアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、変異型IspH又はその誘導体。
  10. 　前記変異型IspHは、野生型IspHと比較して、イソペンテニル二リン酸及び／又はジメチルアリル二リン酸合成活性が高いことを特徴とする、請求項９に記載の変異型IspH又はその誘導体。
  11. 　前記アミノ酸置換は、以下の群より選択される少なくとも１以上からなる請求項９又は１０に記載の変異型IspH又はその誘導体。
    　Leu105Gln、Thr175Ser、Thr207Ser、Gln211Leu、Gln220Arg、Glu301Asp及びAsn306Asp
  12. 　前記アミノ酸置換は、以下の（１）～（４）のいずれか１以上から選択される請求項９～１１のいずれか１項に記載の変異型IspH又はその誘導体。
    （１）Thr207Ser及び／又はGlu301Asp
    （２）Thr175Ser
    （３）Leu105Gln
    （４）Gln211Leu、Gln220Arg及び／又はAsn306Asp
  13. 　配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、さらに、Thr207Ser及び／又はGlu301Aspのアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む、変異型IspH又はその誘導体。
  14. 　配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、さらに、Thr175Serのアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む、変異型IspH又はその誘導体。
  15. 　配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、さらに、Leu105Glnのアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む、変異型IspH又はその誘導体。
  16. 　配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、さらに、Gln211Leu、Gln220Arg及び／又はAsn306Aspのアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む、変異型IspH又はその誘導体。
  17. 　変異を導入したイソプレノイド経路に関与する酵素の遺伝子ライブラリを、ゲラ二オールの酵素活性を強化した細胞に導入し、該細胞の細胞増殖速度の増加、低下又は喪失を指標とする、変異型イソプレノイド経路に関与する酵素のスクリーニング方法。
  18. 　前記細胞の細胞増殖速度の増加が、α-ピネン及び／又はジアポニューロスポレン合成量の増加である、請求項１７に記載のスクリーニング方法。
  19. 　前記細胞が大腸菌である、請求項１７又は１８に記載のスクリーニング方法。
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