CN100558889C - 生产辅酶q-10的改进方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了生产CoQ10的改进方法,所述方法通过对Rhodobacter属的微生物进行发酵来实现,所述微生物已经被Paracoccuszeaxanthinifaciens的甲羟戊酸盐/酯操纵子所转化。
Description
本发明涉及通过微生物对辅酶Q-10进行生产的方法。更具体地,本发明涉及通过经转化的微生物和转化子(transformant)本身增加辅酶Q-10产量的方法。转化子是Rhodobacter属的微生物,优选地,是已经过来自不同微生物的甲羟戊酸盐/酯操纵子转化过的R.sphaeroides,所述不同微生物优选是Paracoccus属的,更优选是P.zeaxanthinifaciens种的。
辅酶Q-10(2,3-二甲氧基-二甲基-6-十异戊二烯基-1,4-苯醌),也被称为泛醌-10,是脂溶性苯醌,具有类异戊二烯侧链,所述侧链包括十个C-5类异戊二烯单元。辅酶Q-10(下文中缩写为CoQ10)被发现于微生物和植物以及动物中。它是人类和大多数哺乳动物中泛醌最普遍的存在形式。已有人提出,并有越来越多的证据表明,CoQ10对人类健康状况以及对疾病抵抗来说是重要因素。CoQ10的医药和健康方面的有益效果已被认为与其两种主要的生理功能相关,即作为线粒体电子传递链的重要辅助因子的功能(与三磷酸腺苷的合成偶联)以及作为脂溶性抗氧化剂发挥作用的功能。
CoQ10的健康方面的好处使得该化合物的商业重要性增加。可以通过化学合成或通过用微生物发酵来生产CoQ10。这些微生物可以是已通过遗传工程对其CoQ10生产进行过改进的天然的CoQ10生产者,或者它们可以不是天然生产CoQ10的,但是通过遗传功能改造而能对CoQ10进行合成了。
在细菌中,泛醌的醌环获得自分支酸(Chorismate),其是芳香族化合物生物合成中的核心中间产物,而泛醌的类异戊二烯尾巴获得自C-5化合物异戊烯焦磷酸酯(IPP)。加到醌环上的类异戊二烯尾巴的长度取决于细菌中存在的特定异戊二烯转移酶。例如,在Escherichia coli中,八异戊二烯焦磷酸酯合酶催化从法尼基焦磷酸酯(FPP,C-15)和五个IPP单位来合成八异戊二烯焦磷酸酯(C-40)的过程。将该分子加入到醌环中导致了泛醌-8的形成。在Paracoccus和Rhodobacter的种中,十异戊二烯焦磷酸酯(DPP)合酶催化用FPP(C-15)和七个IPP单位来形成DPP(C-50)的过程。将DPP加入到醌环中然后会导致泛醌-10(CoQ10)的形成。
自然界中,已知有两种不同的对IPP进行生物合成的途径(图1)。甲羟戊酸盐/酯途径,如其名称所暗示的,其利用甲羟戊酸盐/酯作为核心中间产物,该途径已被很好地研究于真核生物中。多年以来甲羟戊酸盐/酯途径都被认为是自然界中IPP合成的普遍途径。但是,近十年来,还发现了第二条IPP生物合成途径,其被称为非甲羟戊酸盐/酯途径或MEP途径(因为其用2C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸酯作为中间产物)。目前已发现,该MEP途径存在于多种真细菌以及高等植物的质体区室中。
US 4070244公开了一种通过培养Sporidiobolus和Oosporidium属的某些微生物来生产CoQ10的方法,所述方法在含有可被吸收的碳源和可被消化的氮源的培养基中进行。
Zhu,X.et al.(J.Fermentation&Bioengin.,79,493-5,1995)最先描述了对含有泛醌生物合成所涉及的基因的质粒的构建,以及将这些基因在E.coli中过量表达,以生产泛醌。
EP 1070759 A1中公开了一种生产CoQ10的方法,其通过对宿主微生物转化并对转化子生物进行培养来进行,所述宿主微生物尤其是E.coli,用来自Agrobacterium属的、编码具有十异戊二烯二磷酸酯合酶活性的蛋白质的DNA对其进行转化。
EP 1072683 A1中公开了一种通过经转化的微生物来生产(尤其是泛醌)类异戊二烯化合物的方法。在列出的70来种宿主物种中,特别提到了Rhodobacter capsulatus和R.sphaeroides。然而,其实施例仅描述了在E.coli的转化子中进行的对CoQ8的生产。
EP 1123979 A1公开了通过对E.coli进行转化使得对CoQ10的生产效率提高的方法,其中,用包含来自Saitoella属的真菌菌株的、编码十异戊二烯二磷酸酯合酶的DNA的表达载体对E.coli进行转化。
WO 02/099095 A2最后公开了一种对细菌进行改造的方法,尤其是对Paracoccus属的细菌进行的,以通过过量表达甲羟戊酸盐/酯途径的基因来生产类异戊二烯化合物,特别是玉米黄质。
革兰氏阴性细菌Rhodobacter sphaeroides是天然的CoQ10生产者,并且,人们已企图用其来发展对CoQ10进行工业生产的方法。Yoshida et al.(J.Gen.Appl.Microbiol.44,19-26,1998)描述了通气情况对于CoQ10生产的影响,还描述了对具有提高的CoQ10含量的R.sphaeroides非重组突变体的分离,此外,Sakato et al.(Biotechnol.Appl.Biochem.16,19-28,1992)也描述了:通过优化培养(发酵)条件,在R.sphaeroides的非重组突变体中提高CoQ10产量的方法。最近,人们已在用分子遗传技术来增加R.sphaeroides对CoQ10的生产。
EP 1227155 A1公开了通过能生产CoQ10的微生物(尤其是Rhodobacter属的)来提高CoQ10产量的方法。CoQ10产量的增加是通过向微生物中引入一种或多种属性来获得的,所述属性选自由如下属性所构成的组:降低的或有缺陷的牻牛儿基牻牛儿基转移酶活性,增强的十异戊二烯二磷酸酯合酶活性及增强的对-羟基安息香酸十异戊二烯转移酶活性。
基于R.sphaeroides中yaeM基因(现在被称为ispC,其编码1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸酯还原异构酶)的存在,以及基于近来完成的对R.sphaeroides基因组序列的研究,看上去该细菌排他性地使用MEP途径用于对IPP进行生物合成。支持R.sphaeroides中排他性使用MEP途径的其它证据是以下发现:与其紧密相关的种,Rhodobacter capsulatus,仅用MEP途径进行类异戊二烯生物合成。
WO 02/26933公开了在Rhodobacter sphaeroides中提高CoQ10产量的方法,其通过过量表达编码MEP途径中某些酶的一些天然和/或异源基因来实现。但是,这些酶的过量表达仅使CoQ10的产量获得非常有限的提高。这可能是由于如下事实:MEP途径中仅有少量酶的活性被提高,而在R.sphaeroides中显著提高IPP生物合成还需要其它基因的过量表达。
如上所述,一些细菌仅用甲羟戊酸盐/酯途径来对IPP进行生物合成。Paracoccus zeaxanthinifaciens是此类细菌的一个例子。在P.zeaxanthinifaciens中,编码甲羟戊酸盐/酯途径的五个酶的基因加上编码IPP异构酶的基因(见图1),一起成簇于染色体的单个转录单元中,即下文中被称为甲羟戊酸盐/酯操纵子的操纵子(Hümbelin et al.,Gene 297,129-139,2002)。从乙酰乙酰CoA到IPP的转化所需要的所有基因的单一簇可以提供有效的遗传途径:通过将克隆的甲羟戊酸盐/酯操纵子插入到细胞中,以在任何细菌中增加IPP的产量。这不仅仅可在天然含有用于IPP生物合成的甲羟戊酸盐/酯途径的细菌中实现,还可在仅利用MEP途径的细菌中实现,因为甲羟戊酸盐/酯途径的前体,乙酰乙酰CoA是共同的代谢物。乙酰乙酰CoA是通过被称为β-酮硫解酶的一大家族酶的作用,从两个乙酰CoA分子制得的。因此,甚至在不用甲羟戊酸盐/酯途径进行IPP生物合成的细菌中,也有乙酰乙酰CoA的供应。
在通过对天然CoQ10生产者进行遗传改造,在微生物中进一步提高CoQ10产量的一种尝试中,已发现,这可通过将来自Paracoccus属微生物的克隆的甲羟戊酸盐/酯操纵子引入到Rhodobacter属的微生物中来实现。虽然通过引入来自Paracoccus的甲羟戊酸盐/酯操纵子以在Rhodobacter中增加IPP供应并提高CoQ10产量的概念在推理上看似简单,但之前并无证据表明,这些来自Paracoccus的基因可在Rhodobacter中进行功能性表达,也没有证据表明,IPP生物合成中涉及的Paracoccus的酶可在Rhodobacter中正常地发挥作用。此外,鉴于所有可获得的证据都表明,Rhodobacter原本不含甲羟戊酸盐/酯途径的中间产物,因此明显存在下述可能:这些非天然的化合物将被降解,或者,会使异源表达的Paracoccus酶不可用。
本发明涉及在Rhodobacter属的微生物中,尤其是在Rhodobactersphaeroides中,增加CoQ10产量的方法,这是通过向Rhodobacter菌株中引入来自Paracoccus属的微生物(尤其是Paracoccus zeaxanthinifaciens)的甲羟戊酸盐/酯操纵子,并对转化子进行培养来实现的。因此,本发明提供了一种生产CoQ10的方法,其中包括:将属于Paracoccus属的微生物中的(尤其是Paracoccus zeaxanthinifaciens中的)甲羟戊酸盐/酯操纵子引入到属于Rhodobacter属的微生物,尤其是Rhodobacter sphaeroides中,并对经过修饰的Rhodobacter菌株进行培养,由此所述方法导致CoQ10产量提高。
换句话说,本发明涉及生产CoQ10的方法,所述方法包括:在培养基中培养Rhodobacter属的微生物,所述微生物中已经引入了来自Paracoccus属的微生物的甲羟戊酸盐/酯操纵子,使得CoQ10形成并积累于培养物中;以及从其中回收CoQ10。
本发明还涉及Rhodobacter属的微生物,尤其是Rhodobactersphaeroides,所述微生物中含有来自Paracoccus属的微生物(尤其是Paracoccus zeaxanthinifaciens)的甲羟戊酸盐/酯操纵子。
本发明还涉及来自Paracoccus属的微生物(尤其是Paracoccuszeaxanthinifaciens)的甲羟戊酸盐/酯操纵子的用途,用于在Rhodobacter属的微生物,尤其是Rhodobacter sphaeroides中增加CoQ10产量的方法或过程。
本发明基于如下发现:通过将来自Paracoccus属的微生物的甲羟戊酸盐/酯操纵子引入到Rhodobacter属的宿主生物中,并对经转化的宿主进行培养,后者能以较高产量表达CoQ10。
实际操作中,实现本发明需要进行的所有步骤都是本领域技术人员熟悉的传统步骤,无须对其进行特别的解释。
用于本发明的甲羟戊酸盐/酯操纵子由9066个核苷酸的DNA序列构成,除调控序列(操纵序列)之外,其含有编码下述酶的结构基因,所述的酶是将乙酰乙酰CoA转化为DMAPP所必需的,它们按照如下顺序:MvaA(羟甲基戊二酸单酰-CoA还原酶)、Idi(异戊烯二磷酸异构酶)、Hcs(羟甲基戊二酸单酰-CoA合酶)、Mvk(甲羟戊酸盐/酯激酶)、Pmk(磷酸甲羟戊酸盐/酯激酶)和Mvd(二磷酸甲羟戊酸盐/酯脱羧酶)。该操纵子的DNA序列被公开于WO 02/099095(见,例如SEQ ID NO:42)中。该序列获得自Paracoccus sp.R114,其是生产玉米黄质的菌株(P.zeaxanthinifaciens),根据《布达佩斯条约》,已于2001年4月24日将其保藏至ATCC,专利保藏号为PTA-3335。必须注意,操纵子中结构基因的顺序不同于它们编码的酶催化连续代谢途径反应的顺序。
术语“Paracoccus属的微生物的甲羟戊酸盐/酯操纵子”或“Paracoccus属甲羟戊酸盐/酯操纵子”并不意味着:用于本发明的该操纵子实际上就分离或获得自一种Paracoccus生物,而仅表示:其与存在于Paracoccus生物中的甲羟戊酸盐/酯操纵子相同。因此,其可能是完全分离自Paracoccus的、完全合成的或部分分离部分合成的。该操纵子DNA序列的具有完全功能的等位变异体或突变体也被包括于上述术语中。
WO 02/099095的47ff页中描述了其它的Paracoccus菌种和菌株,以及将Flavobacterium sp.重新作为Paracoccus分类的参考。应当理解,微生物“Paracoccus zeaxanthinifaciens”和“Rhodobacter sphaeroides”还包括:具有同样的物理化学属性的、此类物种的异名和有效名,如International Code of Nomenclature of Prokaryotes所定义的。
术语“引入”被用于本发明说明书和权利要求中关于对Rhodobacter属的宿主生物或微生物进行转化的部分,其包括本领域技术人员公知的、任何可用于将遗传物质(特别是甲羟戊酸盐/酯操纵子)有效带入到宿主生物中的方法,即以能使微生物对其进行表达的方式进行的。引入(例如)可通过载体(优选地,表达质粒)来进行,或根据标准方法,通过整合到宿主基因组中来进行。
虽然根据本发明用于改进CoQ10生产的优选宿主生物是Rhodobactersphaeroides,但是Rhodobacter属的能生产CoQ10的其它菌种也可以作为宿主使用,例如R.adriaticus、R.capsulatus、R.sulfidophilus和R.veldkampii。所有宿主细胞可代表野生型菌株的突变体,或者代表经过遗传操作的菌株,所述菌株的特征在于,较之野生型菌株的CoQ10产量,其具有被提高的CoQ10产量。
将甲羟戊酸盐/酯操纵子成功引入到宿主微生物之后,根据已知的方法对经转化的宿主进行培养,即:在含有可被宿主吸收的碳源和氮源、无机盐等的培养基中,在适于有效生长以及适于目标产物CoQ10表达的温度、pH和通风条件下进行培养。
从发酵培养物和/或转化子(即,其中已被引入了属于Paracoccus属的微生物的甲羟戊酸盐/酯操纵子的微生物)进行分离,以及,如果需要的话,对获得的CoQ10进行纯化(包括针对人类和动物的使用对其进行配方),都可按照本领域公知的方法来进行。但是,为用于动物健康和营养用途,可以不需要进行特定的纯化。在这种情况下,可对CoQ10和生物物质和/或发酵培养物的其它组分一同进行进一步加工,以得到具有商业吸引力的产品。
图1示出了在R.sphaeroides中对CoQ10进行生物合成的途径,其用MEP途径来形成IPP。框出的区域表示:包含甲羟戊酸盐/酯途径(导致IPP形成)加上IPP异构酶步骤的反应序列。甲羟戊酸盐/酯途径在R.sphaeroides中天然并不存在。在P.zeaxanthinifaciens中,编码甲羟戊酸盐/酯途径的五个酶加上IPP异构酶的基因组成一个操纵子,其在下文中被称为甲羟戊酸盐/酯操纵子。
下述实施例用于阐述本发明,而非以任何方式对其进行限制。
实施例
该实施例显示了将来自Paracoccus zeaxanthinifaciens的克隆的甲羟戊酸盐/酯操纵子引入之后,R.sphaeroides DSM 158中CoQ10产量的提高。
细菌和培养条件
Rhodobacter sphaeroides菌株DSM 158(从the Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH获得)被用作为基础菌株,以构建具有提高的CoQ10产量的重组菌株。在培养基RS100中,于28℃下对所有的R.sphaeroides菌株进行培养。表1中概括了培养基RS100的组成和制备方法。将50mg/l的卡纳霉素加入到培养基中,以培养重组菌株。在LB培养基(Becton Dickinson,Sparks,MD,USA)中,于37℃对E.coli菌株进行培养。为保持重组E.coli菌株中的质粒,向培养基中加入氨苄青霉素(ampicillin,100mg/l)和/或卡纳霉素(25-50mg/l,取决于质粒)。在旋转式摇床中,于200rpm,需氧条件下,对E.coli和R.sphaeroides的液体培养物进行常规培养。当需要固体培养基时,加入琼脂(1.5%的终浓度)。
表1培养基RS100的组成和制备方法
构建质粒pBBR-K-Nde和pBBR-K-mev-opR114
在WO 02/099095中的实施例6(第91页,12-17行)和实施例13(第105页,第10行至第106页第8行),对质粒pBBR-K-Nde(空质粒)和pBBR-K-mev-op-up-4(含有甲羟戊酸盐/酯操纵子前4个基因的质粒)的构造分别进行了详细的描述。
PCR引物hcs-5326(SEQ ID NO:1)对应P.zeaxanthinifaciens hcs基因(起始于密码子214,结束于密码子220的第二个核苷酸),而PCR引物mvd-9000(SEQ ID NO:2)对应于P.zeaxanthinifaciens mvd基因终止子后104至123位核苷酸序列的反向互补序列(WO 02/099095,分别见SEQ ID Nos:46和52)。通过克隆用引物hcs-5326和mvd-9000(用P.zeaxanthinifaciens ATCC 21588基因组DNA作为模板)在pCR2.1-TOPO中获得的PCR片段,来构建质粒TOPO-pCR2.1-mev-op-d-3wt。因此该质粒含有甲羟戊酸盐/酯操纵子的下游一半,其中包括hcs的3’末端和最后三个基因,mvk、pmk和mvd。用限制性内切酶SacI和NdeI来消化质粒pBBR-K-mev-op-up-4和TOPO-pCR2.1-mev-op-d-3wt,将后一消化得到的较短片段与来自pBBR-K-mev-op-up-4的较大片段连接。得到的质粒,pBBR-K-mev-op-wt,含有来自P.zeaxanthinifaciens ATCC 21588的完整的甲羟戊酸盐/酯操纵子,其中包括其(可能的)启动子。P.zeaxanthinifaciens菌株ATCC 21588(野生型)和R114的甲羟戊酸盐/酯操纵子序列之间仅有的区别在于mvk中的突变,导致残基265从丙氨酸变为缬氨酸(A265V)。因为P.zeaxanthinifaciens ATCC 21588的基因组DNA被用作为PCR模板,以构建质粒TOPO-pCR2.1-mev-op-d-3wt,因此其中含有野生型mvk基因。通过定点诱变向mvk中引入突变(密码子265从GCC变为GTC),产生了质粒pBBR-K-mev-op-R114。
用于R.sphaeroides的转化方法
使用标准方法,通过接合,用质粒来转化E.coli S17-1,用于克隆和随后将质粒从S117-1转运到R.sphaeroides DSM 158中(Nishimura et al.,Nucl.Acids Res.18,6169,1990;Simon et al.,Bio/Technology 1983,784-91)。首先分离出R.sphaeroides DSM 158的、具有自发的利福平抗性的突变体,这是通过如下步骤来进行的:在补充有100mg/l利福平(rifampicin)的RS100液体培养基上对DSM 158进行培养,将细胞涂布于含有100mg/l利福平的RS100平板上,分离单个菌落。为达到接合的目的,从受体细胞(具有利福平抗性的R.sphaeroides DSM 158)培养物(生长于含有100mg/l利福平的RS100培养基中)和供体细胞(携带有将被转移的质粒的E.coli S17-1,被培养于含有50mg/l卡纳霉素的LB培养基中)中各取1ml,通过离心获得沉淀。弃去上清液,用新鲜的RS100培养基洗两次细胞,以去除抗生素。然后将每份沉淀重新悬浮于1ml新鲜的RS100培养基中。混合50微升的供体细胞和0.45ml的受体细胞,通过离心获得沉淀,重新悬浮于0.03ml的RS100培养基中,点到RS100平板上。在28℃进行过夜培养后,用接种环收获细胞,将其重新悬浮于0.3ml的RS100培养基中。将该悬浮液的稀释液涂布到含有100mg/l利福平和50mg/l卡纳霉素的RS100平板上,在28℃进行培养。从平板上挑出菌落(可能经过转化的R.sphaeroides DSM 158细胞),培养于含有50mg/l卡纳霉素的液体RS100培养基中,用合适的引物通过PCR来检测是否存在质粒。将阳性克隆划线到含有50mg/l卡纳霉素的RS100平板上,获得单个菌落。然后在含有50mg/l的液体RS100培养基上,再次对来自每个克隆的单个菌落进行培养,通过PCR证实了目标质粒的存在。通过向培养物中加入甘油(15%v/v)并冷冻于-80℃,来保存最终经过转化的R.sphaeroides DSM 158菌株。
用于评价R.sphaeroides中CoQ10生产情况的培养条件
将培养基RS100用于用R.sphaeroides进行的所有实验(培养重组的R.sphaeroides菌株时,加入50mg/l的卡纳霉素)。在200rpm振荡下,于28℃,在250ml带盖Erlenmeyer瓶中,对25毫升培养物进行培养。为检验CoQ10的生产情况,用R.sphaeroides菌株的经冷冻和加入甘油的贮藏培养物去接种25ml的种子培养物。对种子培养物进行24-28小时的培养之后,取合适体积的培养物,用于接种实验用瓶,使得660纳米处最初的光密度(OD660)为0.16。以24小时为间隔,分别于无菌条件下取2毫升样品。分析项目包括:生长情况(以OD660来测)、pH、培养物上清液中的葡萄糖、以及CoQ10和类胡萝卜素(通过高效液相色谱[HPLC]来测定-见下文中“分析方法”一节)。
分析方法
试剂:乙腈、二甲基亚砜(DMSO)、四氢呋喃(THF)、叔丁基甲醚(TBME)和丁基化羟基甲苯(BHT)是分析纯或HPLC级的,其都获得自Fluka(瑞士)。CoQ10也购自Fluka。甲醇(Lichrosolv)购自Merck,Darmstadt。类胡萝卜素标准品从Chemistry Research Department,RocheVitamins Ltd.,Switzerland获得。
样品制备和抽提:将全培养液中的400微升转移到一次性的15ml聚丙烯离心管中。加入4毫升经稳定的抽提溶液(0.5g/l BHT,处于1∶1(v/v)DMSO/THF中),在实验室摇床(IKA,德国)中,对样品进行20分钟的混合,以促进抽提。最后,对样品进行离心,将上清液转移到琥珀色玻璃管中,以通过HPLC进行分析。
HPLC:开发了反向HPLC方法,用于对泛醌及其相应氢醌进行同时测定。该方法能将类胡萝卜素(八氢番茄红素、球形酮(spheroidenone)、spheroidene和链孢红素(neurosporene))与CoQ10清楚地分开。用装备有温控自动上样仪和二极管阵列检测器的Agilent1100HPLC系统来进行色谱分析。该方法的参数如下所示:
柱 YMC Carotenoid C30柱
3微米,钢质,150mm长x 3.0mm I.D.
(YMC,Part No.CT99S031503QT)
保护柱 Security Guard C18(ODS,十八烷)
4mm长x 3.0mm I.D.
(Phenomenex,Part No.AJO-4287)
典型柱压 开始时60bar
流速 0.5ml/min
移动相 乙腈(A)∶甲醇(B)∶TBME(C)的混合物
梯度曲线 时间(min) %A %B %C
0 60 15 25
13 60 15 25
20 0 100
22 60 15 25
25 60 15 25
后时间(post time)4分钟
注射体积 10μl
柱温 15℃
检测 按照表2,用三种波长来对特定化合物进行检测
表2.HPLC保留时间和所用的波长
化合物 | 波长(nm) | 保留时间(分钟) |
八氢番茄红素Ubiquinol-10CoQ10球形酮(Z-异构体)E-球形酮E-链孢红素E-Spheroidene | 280210210450450450450 | 7.911.312.610.6、13.0、14.6、18.719.120.420.6 |
计算:计算基于峰的面积来进行。
灵敏度:通过向其中注射相关参照化合物的标准溶液来验证该方法的灵敏度。目标化合物(辅酶Q10和ubiquinol-10)完全分开,没有显示任何的干扰。
线性范围和检测极限:对辅酶Q10在稳定抽提溶液中的一系列稀释物(见上文)进行制备和分析。线性范围被发现为5mg/l至50mg/l。相关系数为0.9999。用该HPLC方法检测辅酶Q10的极限被确定为4mg/l。
可重现性:对该方法(包括抽提步骤)的可重现性进行了验证。对十份单独的样品制剂进行比较。相对标准差被确定为4%。
测定R.sphaeroides菌株对CoQ10的生产情况
在上文指出的条件下,对R.sphaeroides菌株DSM 158、DSM158/pBBR-K-Nde(空载体对照)和DSM 158/pBBR-K-mev-opR114于摇瓶中进行培养,对CoQ10的生产情况进行测定。结果被概括于表3中。其中展示的值是两次独立实验的平均值,在每次独立实验中,对每种菌株进行两次检测。这些结果清楚地表明,来自P.zeaxanthinifaciens的克隆的甲羟戊酸盐/酯操纵子的表达显著地提高了R.sphaeroides中的CoQ10产量。
表3
1比形成率被表示为每mg细胞干物质生产出的CoQ10的mg数/。SD=标准差。
序列表
<110>帝斯曼知识产权资产管理有限公司
<120>生产辅酶Q-10的改进方法
<130>Case 21841
<150>EP 03015367.0
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<170>PatentIn version 3.2
<210>1
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<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR弓物hcs-5336
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<223>PCR弓物mvd-9000
<400>2
cgtcagcgtg gcgggcaagt 20
Claims (4)
1.一种生产CoQ10的方法,所述方法包括:在培养基中培养Rhodobacter属的微生物,所述微生物中已经引入了Paracoccus属的微生物的甲羟戊酸盐/酯操纵子;使得CoQ10形成并积累于培养物中;以及从其中回收CoQ10,其中,所述甲羟戊酸盐/酯操纵子除含有调控序列之外,还含有编码下述酶的结构基因:羟甲基戊二酸单酰-CoA还原酶MvaA、异戊烯二磷酸异构酶Idi、羟甲基戊二酸单酰-CoA合酶Hcs、甲羟戊酸盐/酯激酶Mvk、磷酸甲羟戊酸盐/酯激酶Pmk和二磷酸甲羟戊酸盐/酯脱羧酶Mvd。
2.如权利要求1所述的方法,其中R.sphaeroides被用作为生产CoQ10的微生物。
3.如权利要求1或2所述的方法,其中,将Paracoccuszeaxanthinifaciens的甲羟戊酸盐/酯操纵子引入到Rhodobacter菌株中。
4.Rhodobacter属的微生物,其中含有Paracoccus属的微生物的甲羟戊酸盐/酯操纵子。
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