CN101044243B - 类异戊二烯的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过微生物来生产类异戊二烯特别是辅酶Q-10的方法。更具体地，本发明涉及通过Rhodobacter属的微生物(特别是R.sphaeroides种的微生物)增加辅酶Q-10产量的方法，所述微生物已经经过了来自不同微生物的甲羟戊酸(mev)操纵子的一种或多种基因的转化，所述不同微生物优选是Paracoccus属的，更优选是P.zeaxanthinifaciens种的，由此所述mev操纵子被突变，导致产生增加的辅酶Q-10产量。携带此类突变的序列以及携带此类经突变mev操纵子的微生物也包括在本发明内。

Description

类异戊二烯的生产方法
本发明涉及通过微生物来生产类异戊二烯特别是辅酶Q-10的方法。更具体地，本发明涉及通过Rhodobacter属的微生物(特别是R.sphaeroides种的微生物)增加辅酶Q-10产量的方法，所述微生物已经经过了来自不同微生物(优选是Paracoccus属的，更优选是P.zeaxanthinifaciens种的)的甲羟戊酸(mev)操纵子的一种或多种基因的转化，由此所述mev操纵子被突变，导致产生增加的辅酶Q-10产量。携带此类突变的序列以及携带此类经突变mev操纵子的微生物也包括在本发明内。
辅酶Q-10(2，3-二甲氧基-二甲基-6-十异戊二烯基-1，4-苯醌)，也被称为泛醌-10，是脂溶性苯醌，具有类异戊二烯侧链，所述侧链包括十个C-5类异戊二烯单元。辅酶Q-10(下文中缩写为CoQ10)被发现于微生物和植物以及动物中。它是人类和大多数哺乳动物中泛醌最普遍的存在形式。已有人提出，并有越来越多的证据表明，CoQ10对人类健康状况以及对疾病抵抗来说是重要因素。CoQ10的医药和健康方面的有益效果已被认为与其两种主要的生理功能相关，即作为线粒体电子传递链的重要辅助因子的功能(与三磷酸腺苷的合成有关)以及作为脂溶性抗氧化剂发挥作用的功能。
CoQ10的健康方面的好处使得该化合物的商业重要性增加。可以通过化学合成或通过用微生物发酵来生产CoQ10。这些微生物可以是已通过遗传工程对其CoQ10生产进行过改进的天然的CoQ10生产者，或者它们可以不是天然生产CoQ10的，但是通过遗传功能改造而能对CoQ10进行合成了。
在细菌中，泛醌的醌环获得自分支酸盐/酯(Chorismate)，其是芳香族化合物生物合成中的核心中间产物，而泛醌的类异戊二烯尾巴获得自C-5化合物异戊烯焦磷酸酯(IPP)。加到醌环上的类异戊二烯尾巴的长度取决于细菌中存在的特定异戊二烯转移酶。例如，在Escherichia coli中，八异戊二烯焦磷酸酯合酶催化从法尼基焦磷酸酯(FPP，C-15)和五个IPP单位来合成八异戊二烯焦磷酸酯(C-40)的过程。将该分子加入到醌环中导致了泛醌-8的形成。在Paracoccus和Rhodobacter的种中，十异戊二烯焦磷酸酯(DPP)合酶催化用FPP(C-15)和七个IPP单位来形成DPP(C-50)的过程。将DPP加入到醌环中然后会导致泛醌-10(CoQ10)的形成。
自然界中，已知有两种不同的对IPP进行生物合成的途径(图1)。甲羟戊酸途径，如其名称所暗示的，其利用甲羟戊酸盐/酯作为核心中间产物，该途径已于真核生物中被很好地研究。多年以来甲羟戊酸途径都被认为是自然界中IPP合成的普遍途径。但是，近十年来，还发现了第二条IPP生物合成途径，其被称为非甲羟戊酸途径或MEP途径(因为其用2C-甲基-D-赤藻糖醇4-磷酸酯MEP作为中间产物)。目前已发现，该MEP途径存在于多种真细菌以及高等植物的质体区室中。
基于R.sphaeroides中yaeM基因(现在被称为ispC，其编码1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸酯还原异构酶)的存在，以及基于近来完成的对R.sphaeroides基因组序列的研究，看上去该细菌排他性地使用MEP途径用于对IPP进行生物合成。支持R.sphaeroides中排他性使用MEP途径的其它证据是以下发现：与其紧密相关的种，Rhodobacter capsulatus，仅用MEP途径进行类异戊二烯生物合成。
WO 02/26933A1公开了在Rhodobacter sphaeroides中提高CoQ 10产量的方法，其通过过量表达编码MEP途径中某些酶的一些天然和/或异源基因来实现。但是，这些酶的过量表达仅使CoQ10的产量获得非常有限的提高。
如上所述，一些细菌仅用甲羟戊酸途径来对IPP进行生物合成。Paracoccus zeaxanthinifaciens是此类细菌的一个例子。在P.zeaxanthinifaciens中，编码甲羟戊酸途径的五个酶的基因加上编码IPP异构酶的基因(见图1)，一起成簇于染色体的单个转录单元中，即下文中被称为甲羟戊酸(mev)操纵子的操纵子(Hümbelin et al.，Gene 297，129-139，2002)。
现在已经发现，通过将经突变的mev操纵子引入是mev操纵子的一个或多个基因天然缺陷型的微生物(即，天然使用非甲羟戊酸途径用于生产类异戊二烯的微生物)中，可显著提高对类异戊二烯特别是CoQ10的生产，其中，可引入包含一处或多处突变的完整mev操纵子或所述mev操纵子的一个或多个基因。所述一处或多处突变可以例如在下述基因的一种或全部中：编码羟甲基戊二酸单酰-CoA(hydroxymethylglutaryl-CoA)还原酶的mvaA、编码异戊烯二磷酸异构酶的idi、编码羟甲基戊二酸单酰-CoA合酶的hcs、编码甲羟戊酸激酶的mvk、编码磷酸甲羟戊酸激酶的pmk以及编码二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的mvd。
因此，本发明提供了一种多核苷酸序列，其包含编码下述蛋白的一种或多种基因，所述蛋白具有羟甲基戊二酸单酰-CoA还原酶活性、异戊烯二磷酸异构酶活性、羟甲基戊二酸单酰-CoA合酶活性、甲羟戊酸激酶活性、磷酸甲羟戊酸激酶活性和/或二磷酸甲羟戊酸脱羧酶活性，其中，所述多核苷酸序列携带一处或多处突变，存在于微生物中时能导致产生提高的类异戊二烯产量。类异戊二烯产量的提高可例如通过下述方法来测量：比较不携带所述多核苷酸序列的野生型微生物(即，不使用mev途径)与携带本发明多核苷酸的微生物的产量。
在一种实施方式中，本发明涉及可从SEQ ID NO：1或2获得的多核苷酸序列，即，包含野生型mev操纵子或其片段的基因，其中，所述片段具有mev操纵子的基因中至少一种的活性，例如，编码羟甲基戊二酸单酰-CoA还原酶的mvaA、编码异戊烯二磷酸异构酶的idi、编码羟甲基戊二酸单酰-CoA合酶的hcs、编码甲羟戊酸激酶的mvk、编码磷酸甲羟戊酸激酶的pmk以及编码二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的mvd。优选地，经突变的多核苷酸序列由SEQ ID NO：23或其片段所代表，当存在于微生物中时其导致例如CoQ10产量的增加。
在一个方面，本发明涉及包含携带突变的mev操纵子的DNA序列，所述DNA序列由SEQ ID NO：23所代表。
术语“提高的类异戊二烯产量”，特别是提高的CoQ10产量，在本文中用于表示，例如，较之携带各自的野生型多核苷酸的各自的微生物而言，通过携带包含如上所述一处或多处突变的多核苷酸的微生物获得的至少大约10％的增加。类异戊二烯的产量通过标准方法来测量，例如，HPLC(见实施例2)，其可表示为mg/l或mg/l/OD600(见实施例5)。
携带一处或多处突变的完整mev操纵子或其一种或多种基因可例如是完全合成的，或部分分离和合成的。经分离的mev操纵子或其一种或多种基因可来源于使用甲羟戊酸途径的任何微生物，即，其中所述操纵子中包括的一种或多种基因天然存在。优选地，该微生物属于Paracoccus属，更优选地，来自Paracoccus zeaxanthinifaciens，例如，Paracoccus sp.R114或P.zeaxanthinifaciens ATCC 21588。具有完全功能的、操纵子DNA序列的等位基因变异和突变体也被上述术语所包括。P.zeaxanthinifaciens ATCC21588的完整mev操纵子如SEQ ID NO：1所示，Paracoccus sp.R114的完整mev操纵子如SEQ ID NO：2所示(也见WO 02/099095的SEQ IDNO：42)。
菌株Paracoccus sp.R114是P.zeaxanthinifaciens ATCC 21588的衍生物，其已按照Budapest Treaty的条款于2001年4月24日以专利保藏号PTA-3335保藏于ATCC。关于可用于本发明的Paracoccus种和菌株，以及对Flavobacterium sp.的分类学重新分类为Paracoccus，参见WO02/099095的47ff页。可使用的此类物种的例子是P.marcusii、P.carotinifaciens、P.solventivorans、P.zeaxanthinifaciens或Paracoccus sp.R114。
本发明的mev操纵子携带一处或多处突变，所述突变可位于操纵子内的任何位置，导致所述操纵子内一种或多种基因活性的变化，从而在携带此类多核苷酸的微生物中产生提高的类异戊二烯产量。
在一种实施方式中，mev操纵子携带至少一处突变，其优选位于mev操纵子的hcs基因中，例如，Paracoccus zeaxanthinifaciens的mev操纵子的hcs基因中，例如，Paracoccus sp.R114或P.zeaxanthinifaciens ATCC21588的mev操纵子的hcs基因中。更优选地，本发明所用的经突变的mev操纵子由SEQ ID NO：23所代表。Paracoccus sp.R114的各个蛋白质和野生型hcs基因的序列由SEQ ID NO：4和3分别代表。
在一种实施方式中，本发明涉及包含位于hcs基因中的一处或多处突变的多核苷酸，优选如SEQ ID NO：5所示的多核苷酸，其编码如SEQ IDNO：6所示的具有羟甲基戊二酸单酰-CoA合酶的蛋白，其中，SEQ IDNO：4中第90位上存在的谷氨酰胺被赖氨酸所代替。
因此，本发明的目的是提供如前所述的多核苷酸序列，其包括mev操纵子的一个或多个基因，所述多核苷酸选自如下多核苷酸构成的组：
(a)编码包含根据SEQ ID NO：6的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
(b)包含根据SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸，
(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述序列编码被(a)或(b)的多核苷酸编码的多肽的片段或衍生物，其中，在所述衍生物中，较之所述多肽，一个或多个氨基酸残基被保守取代，并且所述片段或衍生物具有羟甲基戊二酸单酰-CoA合酶(Hcs)的活性，
(d)多核苷酸，其互补链能在严格条件下与(a)至(c)中任意一项定义的多肽杂交，并且编码Hcs蛋白。
本发明的多肽和多核苷酸优选以经分离的形式提供，优选被纯化至同质(homogeneity)。
术语“经分离的”指物质从其原始环境(例如，如果天然存在的话，天然环境)移出。例如，存在于活的微生物中的天然存在的多核苷酸或多肽不是经分离的，但是与天然系统中共存物质中的一些或所有分离开的同样的多核苷酸或多肽就是经分离的。此类多核苷酸可以是载体的一部分，和/或此类多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，但它们仍是经分离的，因为此类载体或组合物并非其天然环境的一部分。
本文中使用的经分离的多核苷酸或核酸可以是下述DNA或RNA，其并不与其来源生物的天然存在的基因组中紧密相邻的两段编码序列(一段在5’末端，一段在3’末端)紧密相邻。因此，在一种实施方式中，核酸包括与编码序列紧密相邻的5’非编码(例如启动子)序列的一些或全部。术语“经分离的多核苷酸”因此包括例如，被包括进载体，包括进自主复制质粒或病毒、或被包括进原核或真核生物基因组DNA的重组DNA，或者作为独立于其它序列的单独分子存在(例如，通过PCR或限制性内切酶处理产生的基因组DNA片段或cDNA)。其还包括下述重组DNA，所述DNA是编码额外多肽的杂交基因的一部分，所述多肽基本不含细胞内物质、病毒物质或培养基(当通过重组DNA技术产生时)、或化学物质前体或其它化学物质(当通过化学合成时)。此外，“经分离的核酸片段”是天然不作为片段存在，并且在自然状态下将不会发现的核酸片段。
基因可包括编码序列、非编码序列(例如，在基因编码序列3’和5’末端的非翻译序列)以及调控序列。此外，基因指本文所定义的经分离的核酸分子。此外，本领域技术人员还将知道，在种群中可能存在导致蛋白质氨基酸序列有所改变的DNA序列多态性。
本发明还涉及下述经分离的多核苷酸，它们能在严格条件，优选高度严格条件下与本发明的多核苷酸，例如，SEQ ID NO：5所示的多核苷酸杂交。
本文中使用的术语“杂交”用于描述下述杂交和洗涤条件，在所述条件下，相互之间至少大约50％，至少大约60％，至少大约70％，更优选至少大约80％，进一步更优选至少大约85％至90％，最优选至少大约95％同源的核苷酸序列典型地保持相互杂交。
此类杂交条件的一种优选的、非限制性的例子是：在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中于大约45℃杂交，接着在1x SSC、0.1％SDS中于50℃，优选于55℃，更优选于60℃，进一步更优选于65℃洗一次或多次。
高度严格条件包括，例如，使用地高辛(DIG)标记的DNA探针(使用DIG标记系统制备的；Roche Diagnostics GmbH，68298 Mannheim，Germany)，在例如含或不含100μg/ml鲑鱼精DNA的DigEasyHyb溶液(Roche Diagnostics GmbH)，或包含50％甲酰胺、5x SSC(150mMNaCl、15mM柠檬酸三钠)、0.02％十二烷基硫酸钠、0.1％N-月桂酰肌氨酸以及2％封闭试剂(Roche Diagnostics GmbH)的溶液中，于42℃温育2小时至4天，接着于室温在2x SSC和0.1％SDS中对滤膜洗两次，每次5至15分钟，然后于65-68℃在0.5x SSC和0.1％SDS或0.1x SSC和0.1％SDS中洗两次，每次15-30分钟。
技术人员将知道何种条件应用于严格和高度严格杂交条件。关于此类条件的额外指导在本领域中易于获得，例如，在Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，cold Spring Harbor Press，N.Y.和Ausubel et al.(eds.)，1995，Current Protocols in Molecular Biology，(John Wiley&Sons，N.Y.)中。当然，仅与poly(A)序列(例如mRNA的3’末端poly(A)片断)，或与T(或U)的互补延伸段杂交的多核苷酸将不被包括在用于特异杂交本发明核酸一部分的多核苷酸中，因为此类多核苷酸将与含有poly(A)延伸段或其互补序列的任何核酸分子(例如，实践中，任何双链cDNA克隆)杂交。
本发明可用于生产类异戊二烯，特别是泛醌，优选是CoQ10。优选地，包含一处或多处突变的多核苷酸，即完整mev操纵子或仅其片断被引入合适的微生物，所述微生物原本是mev操纵子的一种或多种基因缺陷型的，即，天然仅使用MEP途径用于生产类异戊二烯。
前文所述经突变的mev操纵子或其一种或多种基因可例如引入Rhodobacter属的微生物中。
特别地，本发明涉及生产类异戊二烯，特别是泛醌，优选是CoQ10的方法，所述方法包括：(1)将本发明的多核苷酸引入原本是所述多核苷酸缺陷型的微生物中，以及(2)在允许生产类异戊二烯的条件下培养步骤(1)的微生物。优选地，将属于Paracoccus属的微生物的经突变mev操纵子或其片段引入属于Rhodobacter属的微生物。更优选地，在编码羟甲基戊二酸单酰-CoA合酶的基因中包含一处或多处突变的多核苷酸被引入所述微生物，最优选的是引入SEQ ID NO：23示出的多核苷酸序列。
原本是mev操纵子的一种或多种基因缺陷型的，即，天然仅使用MEP途径用于生产类异戊二烯的任何微生物可用于本发明的目的。特别地，Rhodobacter属的微生物可用于引入本发明的经突变多核苷酸，例如R.sphaeroides、R.adriaticus、R.capsulatus、R.sulfidophilus或R.veldkampii。优选菌株是R.sphaeroide，进一步更优选的是R.sphaeroideATCC 35053。
应当理解，本文提到的微生物包括具有如International Code ofNomenclature of Prokaryotes所定义的相同物理化学性质的此类菌株的异名体(synonym)以及基原异名体(basonym)。
本发明还提供了具有引入的上述多核苷酸的重组微生物，即包含携带有一处或多处突变的mev操纵子的一种或多个基因，其中，对应的野生型微生物原本是mev操纵子的一种或多种基因缺陷型的，即，天然仅使用MEP途径用于生产类异戊二烯，这导致产生了类异戊二烯(特别是泛醌，优选是CoQ 10)产量较之对应的野生型微生物提高。
除上述mev操纵子的一种或多种基因中的突变之外，重组微生物可含有进一步的修饰/变化，只要它们能导致所述微生物中类异戊二烯产量提高即可。
在一种实施方式中，此类进一步修饰是将编码具有十异戊二烯二磷酸酯合酶活性的蛋白的DNA序列引入所述重组微生物，优选地，可从Paracoccus属的微生物，例如P.zeaxanthinifaciens，特别是P.zeaxanthinifaciens ATCC 21588获得的。最优选的是SEQ ID NO：7的多核苷酸序列或编码SEQ ID NO：8的蛋白的多核苷酸。
因此，本发明涉及上述生产类异戊二烯，优选CoQ10的方法，其中，编码具有十异戊二烯二磷酸酯合酶活性的蛋白的DNA序列也被引入下述微生物，所述微生物天然情况下使用MEP途径，并且具有包含按照上文引入的一处或多处突变的mev操纵子的一种或多种基因，例如，Rhodobacter属的微生物。
编码具有十异戊二烯二磷酸酯合酶活性的蛋白的任何DNA序列都可用于本发明。此类DNA的例子是Paracoccus属的微生物，例如Paracoccus zeaxanthinifaciens，更优选P.zeaxanthinifaciens ATCC 21588的编码具有十异戊二烯二磷酸酯合酶活性的蛋白的ddsA基因或其部分序列。最优选的是SEQ ID NO：5示出的来自P.zeaxanthinifaciens ATCC21588的ddsA基因，其编码十异戊二烯二磷酸酯合酶(SEQ ID NO：6)。
因此，本发明的一个方面是提供生产CoQ10的方法，所述方法包括(1)将属于Paraccoccus属的微生物的、编码具有十异戊二烯二磷酸酯合酶活性的蛋白的DNA序列和甲羟戊酸(mev)操纵子引入属于Rhodobacter属的微生物，其中，所述mev操纵子携带有一处或多处突变，以及(2)培养经过修饰的Rhodobacter菌株。
术语“引入”被用于本发明说明书和权利要求中关于对例如Rhodobacter属的宿主生物或微生物进行转化的部分，其包括本领域技术人员公知的、任何可用于将遗传物质(特别是经突变甲羟戊酸操纵子或其一种或多种基因)高效带入到宿主生物中的方法，即以能使生物对其进行表达的方式进行的。引入例如可通过载体(优选地，表达质粒)来进行，或根据标准方法，通过整合到宿主基因组中来进行。优选的方法是通过质粒引入基因，例如处于PcrtE启动子控制下的、在表达质粒pBBR-K-PcrtE(该质粒的构建已被详细描述于WO 02/099095实施例6，第91页12-27行)中克隆的基因。用于向Rhodobacter属的微生物引入DNA例如表达质粒的一种优选方法是质粒的接合转移(conjugational transfer)，例如，来自E.coli S 17-1的质粒向Rhodobacter菌株的接合转移(Nishimura et al.，Nucl.Acids Res.18，6169，1990；Simon et al.，Bio/Technology 1983，784-91)。
mev操纵子或其一种或多种基因的突变可通过例如PCR定点诱变来产生，这使用本领域技术人员熟悉的方法来进行，所述方法无需特别解释。可用于本发明的目的的、技术人员已知的其它诱变方法包括，例如，UV照射、换位(transposition)或化学诱变。用于鉴定展示出增加的类异戊二烯(例如CoQ10)生产力的突变体的筛选方法可例如选自通过UV光、HPLC、NMR或薄层色谱对类异戊二烯(例如CoQ10)进行直接测量。类异戊二烯(例如CoQ10)的产量还可通过对类胡萝卜素色密度的增加进行测量来间接测得，该方法是本领域技术人员熟悉的。
可使用已知方法对用本发明的经突变mev操纵子或其一种或多种基因转化的宿主进行培养，例如在含有可被宿主吸收的、例如碳源和氮源、无机盐等的培养基中，适合高效生长以及目标产物(特别是CoQ10)表达的温度、pH和通风条件下进行。
可按照本领域公知的方法，来进行下述步骤：从发酵培养液和/或转化子(即其中已经引入了属于例如Paracoccus属的微生物的经突变甲羟戊酸操纵子)进行分离，以及可选地，对获得的类异戊二烯(特别是CoQ10)的纯化和进一步加工，包括例如将产生的CoQ10加以配方用于人或动物的用途。但是，为用于动物健康和营养用途，可以不需要进行特定的纯化。在该情况下，可能需要对产生的类异戊二烯(例如CoQ10)与生物物质和/或发酵培养液的其它组分一起进行进一步加工，以产生有商业吸引力的产品。
本发明的方法导致产生更高产量的类异戊二烯，例如CoQ10。这种增加可以是较之使用例如Rhodobacter的非重组菌株或使用携带例如Paracoccus菌株野生型mev操纵子的例如Rhodobacter重组菌株而言增加至少大约10％。
图1示出了在R.sphaeroides(其使用MEP途径用于IPP形成)中对CoQ10进行生物合成的途径。框出的区域展示了反应顺序，其包括甲羟戊酸途径(导致IPP形成)加上IPP异构酶步骤。甲羟戊酸途径在R.sphaeroides中并非天然存在。在P.zeaxanthinifaciens中，编码甲羟戊酸途径的五种酶加上IPP异构酶的基因组成一个操纵子，其在下文中被称为甲羟戊酸操纵子。
下述实施例用于阐述本发明，而非以任何方式加以限制。
实施例1细菌和培养条件
Rhodobacter sphaeroides菌株ATCC 35053(从American TypeCulturecollection，Manassas VA，USA获得)被用作为基础菌株，以构建具有提高的CoQ10产量的重组菌株。在培养基RS100中，于30℃下对所有的R.sphaeroides菌株进行培养。表1中概括了培养基RS100的组成和制备方法。将50mg/l的卡纳霉素加入到培养基中，以培养重组菌株。在LB培养基(Becton Dickinson，Sparks，MD，USA)中，于37℃对E.coli菌株进行培养。为保持重组E.coli菌株中的质粒，向培养基中加入氨苄青霉素(ampicillin，100mg/l)和/或卡纳霉素(25-50mg/l，取决于质粒)。在旋转式摇床中，于200rpm，需氧条件下，对E.coli和R.sphaeroides的液体培养物进行常规培养。当需要固体培养基时，加入琼脂(1.5％的终浓度)。
表1培养基RS100的组成和制备方法
Figure GA20180474200580028026601D00111
Figure GA20180474200580028026601D00121
实施例2  对CoQ10的分析试验
将全培养液(见实施例5)中的400μl转移到一次性的15ml聚丙烯离心管中。加入4ml经稳定的抽提溶液(0.5g/l BHT，处于1∶1(v/v)DMSO/THF中)，在实验室摇床(IKA，德国)中，对样品进行20分钟的混合，以促进抽提。最后，对样品进行离心，将上清液转移到琥珀色玻璃管中，以通过反相HPLC进行分析。该方法被开发来对泛醌及其相应氢醌进行同时测定，并能将类胡萝卜素(八氢番茄红素、球形酮(spheroidenone)、球形烯(spheroidene)和链孢红素(neurosporene))与CoQ10清楚地分开。用装备有温控自动上样仪和二极管阵列检测器的Agilent1100HPLC系统(Agilent Technologies，USA)来进行色谱分析。该方法的参数如下所示：
柱           YMC Carotenoid C30柱
             3微米，钢质，150mm长×3.0mm I.D.
             (YMC，Part No.CT99S031503QT)
保护柱       Security Guard C18(ODS，十八烷)
             4mm长×3.0mm I.D.
             (Phenomenex，Part No.AJO-4287)
典型柱压     开始时60bar
流速         0.5ml/min
移动相       乙腈(A)∶甲醇(B)∶TBME(C)的混合物
梯度曲线     时间(min)    ％A    ％B    ％C
                 0       60     15     25
                 13      60     15     25
                 20      00     100
                 22      60     15     25
                  25      60     15     25
后时间(post time) 4分钟
注射体积          10μl
柱温              15℃
检测              按照表2，用三种波长来对特定化合物进行检测
表2.HPLC保留时间和所用的波长
  化合物   波长(nm)   保留时间(分钟)
  八氢番茄红素泛醇-10CoQ10球形酮(Z-异构体)E-球形酮E-链孢红素E-球形烯   280210210450450450450   7.911.312.610.6、13.0、14.6、18.719.120.420.6
计算：计算基于峰的面积来进行。
实施例3  从P.zeaxanthinifaciens来克隆经突变的mev操纵子 构建质粒pBBR-K-mev-op-wt和pBBR-K-mev-op-R114
WO 02/099095的实施例13(105页第10行至106页第8行)中详细描述了对质粒pBBR-K-mev-op-up-4(含有甲羟戊酸操纵子的前4个基因)的构建。
使用P.zeaxanthinifaciens R114的基因组DNA作为模板，用引物hcs-5326(SEQ ID NO：9)和mvd-9000(SEQ ID NO：10)来进行PCR。引物hcs-5326对应P.zeaxanthinifaciens mev操纵子从SEQ ID NO：2的3321至3340位核苷酸的序列，而引物mvd-9000对应SEQ ID NO：2的6977至6996位核苷酸序列的反向互补序列。将获得的3675bp的PCR产物克隆进pCR2.1-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，得到质粒TOPO-pCR2.1-mev-op-d-3wt。该质粒因此含有甲羟戊酸操纵子的下游一半，包括hcs的3’末端和最后三个基因：mvk、pmk和mvd。
用限制性内切酶SacI和NdeI来消化质粒pBBR-K-mev-op-up-4和TOPO-pCR2.1-mev-op-d-3wt，将从TOPO-pCR2.1-mev-op-d-3wt得到的3319bp的片段与来自pBBR-K-mev-op-up-4的8027bp的片段相连。得到的质粒pBBR-K-mev-op-R114含有来自P.zeaxanthinifaciens R114的完整甲羟戊酸操纵子，其中包含其(可能的)启动子。
构建质粒pBBR-K-mev-op-wt-PcrtE-crtE和pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE- crtE
WO 02/099095中实施例6(第92页，10-17行)详细描述了对质粒pBBR-K-PcrtE-crtE的构建。用NaeI来切割质粒pBBR-K-PcrtE-crtE，分离出1.33kb的片段，将其插入到pBBR-K-mev-op-up-4的Ecl136II位点。检查插入的定向，以与甲羟戊酸操纵子基因相同的定向携带crtE基因的质粒被命名为pBBR-K-mev-op-up-4-PcrtE-crtE-2。
用SphI和SpeI切割质粒pBBR-K-mev-op-up-4-PcrtE-crtE-2，分离出得到的含有crtE基因的5566bp的片段。将该片段与使用相同的酶对pBBR-K-mev-op-wt或pBBR-K-mev-op-R114进行限制性消化之后获得的7132bp的SphI-SpeI片段相连，分别得到质粒pBBR-K-mev-op-wt-PcrtE-crtE和pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-crtE。
构建质粒pBBR-K-mev-op-wt-PcrtE-ddsA wt 和pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE- ddsA wt
WO 02/099095中实施例6(第91页，12-27行)详细描述了对质粒pBBR-K-PcrtE的构建。
使用引物dds-Nde(SEQ ID NO：11)和dds-Bam(SEQ ID NO：12)通过PCR(GC-rich PCR System，roche Molecular Biochemicals，Mannheim，Germany)来扩增P.zeaxanthinifaciens菌株ATCC 21588的ddsA基因(被称为ddsAwt)，并将其克隆进pCR2.1-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，得到质粒TOPO-ddsAwt。
用NdeI和BamHI切割质粒TOPO-ddsAwt，将获得的含有ddsA基因的1005bp的片段克隆进用NdeI和BamHI切割过的质粒pBBR-K-PcrtE中，得到质粒pBBR-K-PcrtE-ddsAwt。通过使用寡核苷酸dds-R-1(SEQ IDNO：13)和dds-R-2(SEQ ID NO：14)，利用QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene，La Jolla，CA，USA)引入沉默突变，来去除ddsA基因中内切核酸酶EcoRI的识别位点。得到的质粒pBBR-K-PcrtE-ddsAwt-R用EcoRI和MamI切割，将含有ddsA基因的1278bp的片段插入用EcoRI和EcoRV切割过的TOPO-ddsAwt中，得到质粒pCR2.1-TOPO-ddsAwt-R。用CelII和XbaI切割该质粒，将获得的含有ddsA基因的1211bp的片段与分别用CelII和BlnI对pBBR-K-mev-op-wt-PcrtE-crtE和pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-crtE进行消化获得的11.6kb限制性片段分别相连。得到的质粒被命名为pBBR-K-mev-op-wt-PcrtE-ddsAwt和pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-ddsAwt。
构建质粒pBBR-K-mev-op-4-89-PcrtE-ddsA wt
使用QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene，La Jolla，CA，USA)，以及引物mut4-89-1-fw(SEQ ID NO：15)和mut4-89-1-rev(SEQ ID NO：16)，通过两轮PCR定点诱变来获得质粒pBBR-K-mev-op-4-89-PcrtE-ddsAwt。两条引物相互互补，在SEQ ID NO：23的2949位含有想要的突变A代替C，该位置对应于SEQ ID NO：3的268位。根据厂商说明书，按照下述过程来进行第一轮诱变反应：将5μl 10x反应缓冲液、10ng质粒DNA pBBR-K-mev-op-4-89-PcrtE-ddsAwt、125ng引物mut4-89-1-fw、125ng mut4-89-1-rev、1μl dNTP混合物、3μl QuikSolution和2.5U Pfu Turbo DNA聚合酶混合至最终体积50μl。使用下述参数来进行循环：95℃1分钟，一个循环；95℃50秒，60℃50秒，68℃30分钟，18个循环；68℃7分钟，一个循环。将反应混合物冷却至37℃之后，加入10U限制性内切核酸酶DpnI，在37℃温育反应体系2小时。按照厂商的方案，用经DpnI处理过的DNA转化Escherichia coli XL10-GoldUltracompetent细胞(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。
得到的质粒pBBR-K-mev-op-4-89-1-PcrtE-ddsAwt被分离出，将其用作为模板DNA，进行第二轮PCR定点诱变，其中使用引物mut4-89-2-fw(SEQ ID NO：17)和mut4-89-2-rev(SEQ ID NO：18)，它们在SEQ IDNO：23的6948位含有想要的突变C代替T。按照上文所述来进行诱变。获得的质粒pBBR-K-mev-op-4-89-PcrtE-ddsAwt被分离出，在MicrosynthGmbH(Balgach，Switzerland)上进行测序。经突变mev操纵子的完整序列示为SEQ ID NO：23，其中包含下述基因：617至1639位的mvaA(编码羟甲基戊二酸单酰-CoA还原酶)、1636至2685位的idi(编码异戊烯二磷酸异构酶)、2682至3848位的hcs(编码羟甲基戊二酸单酰-CoA合酶)、3829至4965位的mvk(编码甲羟戊酸激酶)、4965至5882位的pmk(编码磷酸甲羟戊酸激酶)以及5875至6873位的mvd(编码二磷酸甲羟戊酸脱羧酶)。
实施例4 向R.sphaeroides ATCC 35053中引入经突变mev操纵子
使用标准流程，用携带经突变mev操纵子的质粒转化E.coli S17-1(Simon et al.，Bio/Technology 11，784-791，1983)随后通过接合将质粒从E.coli S17-1转移至R.sphaeroides ATCC 35053(Nishimura et al.，Nucl.AcidsRes.18，6169，1990；Simon et al.，Bio/Technology 1983，784-91)。
通过下述方法首先分离出R.sphaeroides ATCC 35053的自发利福平抗性突变体：在补充有100mg/l利福平的RS100液体培养基上培养菌株ATCC 35053，将细胞涂布到含有100mg/l利福平的RS100平板上，分离单个菌落。为进行接合，通过离心，对每份为1毫升的培养于含有100mg/l利福平的RS100培养基上的受体细胞(利福平抗性R.sphaeroidesATCC 35053)培养物和供体细胞(携带有待转移质粒的E.coli S17-1，培养于含有50mg/l卡纳霉素的LB培养基中)进行沉淀。弃去上清液，用新鲜的RS100培养基对细胞洗两次，除去抗生素。然后将每份沉淀重新悬浮于1ml新鲜的RS 100培养基中，混合50微升供体细胞和0.45ml受体细胞，通过离心沉淀，重新悬浮于0.03ml RS100培养基中，点样至RS100平板上。30℃过夜温育之后，用接种环收获细胞，将其重新悬浮于0.3mlRS100培养基中。将该悬浮液的稀释液涂布到含有100mg/l利福平和50mg/l卡纳霉素的RS100平板上，在30℃温育。从平板上挑出菌落(R.sphaeroides ATCC 35053的可能转化细胞)，培养于含有50mg/l卡纳霉素的液体RS100培养基中，在PCR反应中检验质粒的存在，其中退火温度为56℃，延伸时间为1分15秒，使用下述两对不同的引物对：
pBBR-K-up(SEQ ID NO：19)/PcrtE-2442(SEQ ID NO：201)
Kan3out(SEQ ID NO：21)/mvaA3256(SEQ ID NO：22)
将阳性克隆划线到含有50mg/l卡纳霉素的RS100平板上，以获得单个菌落。再在含有50mg/l卡纳霉素的液体RS100培养基中培养来自每个克隆的一个单个菌落，按照上文所述通过PCR证实了期待质粒的存在。得到的重组菌株被称为ATCC 35053/pBBR-K-mev-op-4-89-PcrtE-ddsAwt。
实施例5  在R.sphaeroides ATCC 35053的转化菌株中生产CoQ10
在培养基RS100中在摇瓶培养物中培养R.sphaeroides ATCC 35053、ATCC 35053/pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-ddsAwt和ATCC 35053/pBBR-K-mev-op-4-89-PcrtE-ddsAwt。含有重组R.sphaeroides的培养物含有50mg/l卡纳霉素。在200rpm振荡下，于30℃，在250ml带挡板Erlenmeyer瓶中，对25毫升培养物进行培养。为检验CoQ10的生产情况，用R.sphaeroides菌株的经冷冻且加入甘油的贮藏培养物去接种25ml的种子培养物。对种子培养物进行24-28小时的培养之后，取合适体积的培养物，用于接种实验用瓶，使得660纳米处最初的光密度(OD660)为0.16。以24小时为间隔，分别于无菌条件下取2毫升样品。分析项目包括：生长情况(以OD660来测)、pH、培养物上清液中的葡萄糖、以及CoQ10和类胡萝卜素(通过HPLC来测定)，这按照实施例2所述来进行。结果概括于表3中。这些结果清楚表明，克隆的来自P.zeaxanthinifaciens的经突变甲羟戊酸操纵子的表达显著提高了R.sphaeroides中CoQ10的产量。
表3.经转化的R.sphaeroides ATCC 35053菌株中CoQ10的产量
Figure GA20180474200580028026601D00171
  ATCC 35053/pBBR-K-mev-op-4-89-PcrtE-ddsAwt   24   57.7   2.3
  ATCC 35053   48   56.0   2.0
  ATCC 35053/pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-ddsAwt   48   128.4   3.8
  ATCC 35053/pBBR-K-mev-op-4-89-PcrtE-ddsAwt   48   148.9   4.4
  ATCC 35053   72   62.3   2.2
  ATCC 35053/pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-ddsAwt   72   150.3   4.6
  ATCC 35053/pBBR-K-mev-op-4-89-PcrtE-ddsAwt   72   166.4   5.0
1比形成率被表示为mg/l产生的CoQ10/OD660。
Figure I2005800280266I00011
Figure I2005800280266I00021
Figure I2005800280266I00031
Figure I2005800280266I00041
Figure I2005800280266I00051
Figure I2005800280266I00061
Figure I2005800280266I00071
Figure I2005800280266I00081
Figure I2005800280266I00091
Figure I2005800280266I00101
Figure I2005800280266I00111
Figure I2005800280266I00121
Figure I2005800280266I00131
Figure I2005800280266I00141
Figure I2005800280266I00151
Figure I2005800280266I00161
Figure I2005800280266I00171
Figure I2005800280266I00181
Figure I2005800280266I00191
Figure I2005800280266I00211
Figure I2005800280266I00231

Claims (12)

1.一种多核苷酸，其序列由SEQ ID NO：23所示。
2.权利要求1所述的多核苷酸用于生产类异戊二烯的用途。
3.权利要求2所述的用途，其中所述类异戊二烯是辅酶Q10。
4.生产类异戊二烯的方法，包括：
(a)将权利要求1所述的多核苷酸引入原本是所述多核苷酸缺陷型的微生物中，以及
(b)在允许生产类异戊二烯的条件下培养步骤(a)的微生物其中，所述微生物选自Rhodobacter属。
5.权利要求4的方法，其中，所述微生物为Rhodobacter sphaeroides。
6.如权利要求4或5所述的方法，其中，所述引入的多核苷酸源于选自Paracoccus属的微生物。
7.如权利要求4或5所述的方法，其中所述引入的多核苷酸源于P.zeaxanthinifaciens。
8.一种微生物，包含权利要求1所述的多核苷酸。
9.如权利要求8所述的微生物，选自Rhodobacter属。
10.如权利要求8所述的微生物，其为Rhodobacter sphaeroides。
11.如权利要求8-10中任意一项所述的微生物，其中，引入源于Paracoccus属的微生物的、权利要求1所述的多核苷酸。
12.如权利要求8至11中任意一项所述的微生物用于生产类异戊二烯的用途。
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