CN109312378A - 在重组宿主中产生甜菊醇糖苷 - Google Patents

在重组宿主中产生甜菊醇糖苷 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于产生甜菊醇糖苷、甜菊醇前体的糖苷和甜菊醇糖苷前体的重组微生物和方法。

Description

在重组宿主中产生甜菊醇糖苷
发明背景
发明领域
本公开涉及在重组宿主中重组产生甜菊醇糖苷、甜菊醇前体的糖苷和甜菊醇糖苷前体。特别地，本公开涉及在重组宿主中产生甜菊醇糖苷，所述甜菊醇糖苷包括甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)、甜菊醇-19-O-葡糖苷(19-SMG)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜茶苷、莱鲍迪苷A(RebA)、莱鲍迪苷B(RebB)、莱鲍迪苷C(RebC)、莱鲍迪苷D(RebD)、莱鲍迪苷E(RebE)、莱鲍迪苷F(RebF)、莱鲍迪苷M(RebM)、莱鲍迪苷Q(RebQ)、莱鲍迪苷I(RebI)、杜尔可苷A、单糖基化的对映-贝壳杉烯酸(ent-kaurenoicacids)、二-糖基化的对映-贝壳杉烯酸、三-糖基化-对映-贝壳杉烯酸、单-糖基化-贝壳杉烯醇、二-糖基化的对映-贝壳杉烯醇、三-糖基化的对映-贝壳杉烯醇、三-糖基化的甜菊醇糖苷、四-糖基化的甜菊醇糖苷、五-糖基化的甜菊醇糖苷、六-糖基化的甜菊醇糖苷、七-糖基化的甜菊醇糖苷或其异构体。
相关技术描述
众所周知，甜味剂是食物、饮料或糖果行业中最常用的成分。甜味剂既可在生产过程中掺入最终食品中，也可在适当稀释的情况下作为佐餐甜味剂(tabletop sweetener)或作为烘焙中糖的家用替代品独立使用。甜味剂包括天然甜味剂诸如蔗糖、高果糖玉米糖浆、糖蜜、槭糖浆和蜂蜜，和人造甜味剂诸阿斯巴甜、糖精和三氯蔗糖。甜叶菊提取物是可从多年生灌木甜菊(Stevia rebaudiana)中分离和提取的天然甜味剂。甜叶菊在南美洲和亚洲被普遍种植用于商业生产甜叶菊提取物。各种程度纯化的甜菊提取物在商业上用作食物和共混物中的高强度甜味剂，或单独用作佐餐甜味剂。
图1中显示了几种甜菊醇糖苷(包括二萜甜菊醇和各种甜菊醇糖苷)的化学结构。甜叶菊植物的提取物通常包含促成甜味的甜菊醇糖苷，尽管每种甜菊醇糖苷的量尤其在不同的生产批次间通常是变化的。
由于从甜叶菊植物中回收和纯化甜菊醇糖苷已被证明是劳动密集型的和低效的，因此存在对能够以高产率积累所需甜菊醇糖苷(诸如RebD和RebM)的重组生产系统的需要。还需要改善用于商业用途的重组宿主中甜菊醇糖苷的生产。同样，存在对鉴定对特定底物具有选择性的酶以产生一种或多种特定甜菊醇糖苷的需要。在一些方面，仍然需要增加具有19-O糖基化活性的酶的催化能力，以产生更高产率的甜菊醇糖苷。
发明内容
针对上述背景，本发明提供了优于现有技术的某些有利方面和进步。
尽管本文公开的本发明不限于特定的有利方面或功能性，但本发明提供了能够产生一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的重组宿主细胞，其包含：
(a)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的基因，所述多肽与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性，并且还具有至少一个对应于SEQ ID NO：4的残基79、80、81、83、184、260、286或377的氨基酸取代；
(b)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的基因，所述多肽与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性，并且还具有至少一个对应于SEQ ID NO：4的残基68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82或83的氨基酸取代；
(c)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的双功能多肽的基因，所述双功能多肽与SEQ ID NO：132、SEQID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：140或SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：148所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性；和/或
(d)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的基因，所述多肽与SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：178或SEQ ID NO：180所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性；
其中所述基因中的至少一种基因是重组基因；以及
其中所述重组宿主细胞能够产生对映-贝壳杉烯酸、对映-贝壳杉烯醇或甜菊醇的糖苷。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽包含对应于SEQ ID NO：4的M79V、M79E、S80C、A81W、E83K、H184V、H184TN260T、K286C、K286E、K286N、K286T和/或S377Q的氨基酸取代。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽包含：
(a)对应于SEQ ID NO：4的K286C取代；
(b)对应于SEQ ID NO：4的M79V取代；
(c)对应于SEQ ID NO：4的S377Q取代；
(d)对应于SEQ ID NO：4的S80C取代；
(e)对应于SEQ ID NO：4的N260T和K286C取代；
(f)对应于SEQ ID NO：4的H184V取代；
(g)对应于SEQ ID NO：4的A81W和E83K取代；
(h)对应于SEQ ID NO：4的A81W取代；
(i)对应于SEQ ID NO：4的H184T取代；
(k)对应于SEQ ID NO：4的K286N取代；
(l)对应于SEQ ID NO：4的M79E取代；或
(m)对应于SEQ ID NO：4的K286T取代；
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽还包含标签。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，所述标签包含与SEQ ID NO：152的二硫化物氧化还原酶、SEQ ID NO：153的麦芽糖结合蛋白、SEQ ID NO：154的N-利用物质或SEQID NO：155的小遍在蛋白样修饰物具有至少90％同一性的标签序列。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽包含与SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：178或SEQ ID NO：180所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，重组宿主细胞还包含：
(a)编码能够从法呢基二磷酸(FPP)和异戊烯二磷酸(IPP)合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)的多肽的基因；
(b)编码能够从GGPP合成对映-柯巴基二磷酸的多肽的基因；
(c)编码能够从对映-柯巴基二磷酸合成对映-贝壳杉烯的多肽的基因；
(d)编码能够从对映-贝壳杉烯合成对映-贝壳杉烯酸的多肽的基因；
(e)编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因；
(f)编码能够从对映-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽的基因；
(g)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽的基因；
(h)编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3′进行β1，3糖基化的多肽的基因；
(i)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的基因；和/或
(k)编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′进行β1，2糖基化的多肽的基因；
其中所述基因中的至少一种基因是重组基因。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面：
(a)能够合成GGPP的多肽包含与SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：116所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(b)能够合成对映-柯巴基二磷酸的多肽包含与SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：120所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(c)能够合成对映-贝壳杉烯的多肽包含与SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ IDNO：48、SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(d)能够合成对映-贝壳杉烯酸的多肽包含与SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQID NO：117、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：76所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(e)能够还原细胞色素P450复合物的多肽包含与SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(f)能够合成甜菊醇的多肽包含与SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106、SEQ IDNO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112或SEQ ID NO：114所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽。
(g)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽包含与SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；
(h)能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3′进行β1，3糖基化的多肽包含与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽；
(i)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽包含与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；和/或
(k)能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′进行β1，2糖基化的多肽包含与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有80％或更高同一性的多肽；与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有80％或更高同一性的多肽；或与SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列具有至少65％序列同一性的多肽。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，相对于缺少一种或多种重组基因的相应宿主，所述一种或多种重组体的表达增加了由细胞积累的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的量。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，相对于缺少一种或多种重组基因的相应宿主，所述一种或多种重组体的表达使由细胞积累的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的量增加至少约5％、至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％或至少约100％。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，相对于缺少一种或多种重组基因的相应宿主，所述一种或多种重组基因的表达增加了由细胞积累的对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、对映-贝壳杉烯醇+2Glc(#8)、对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)、甜菊醇-19-O-葡糖苷(19-SMG)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、1，2-甜菊苷、莱鲍迪苷A(RebA)、莱鲍迪苷B(RebB)、莱鲍迪苷E(RebE)、甜菊醇+4Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+4Glc(#26)、甜菊醇+4Glc(#33)、莱鲍迪苷D(RebD)、甜菊醇+5Glc、莱鲍迪苷M(RebM)、甜菊醇+6Glc(#23)、甜菊醇+7Glc(异构体2)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，相对于缺少一种或多种重组基因的相应宿主，所述一种或多种重组基因的表达减少了由细胞积累的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的量。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，相对于缺少一种或多种重组基因的相应宿主，所述一种或多种重组基因的表达使由细胞积累的一种或多种甜菊醇糖苷的量减少至少约5％、至少约10％、至少约25％或至少约50％。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，相对于缺少一种或多种重组基因的相应宿主，所述一种或多种重组基因的表达减少了由细胞积累的对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、19-SMG、1，2-甜菊苷、RebA、甜菊醇+4Glc(#26)、RebD、甜菊醇+5Glc(#24)、甜菊醇+5Glc(#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、RebM、甜菊醇+7Glc(异构体2)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的量。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体是以下物质或其组合物包含以下物质：13-SMG、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜茶苷、RebA、RebB、RebC、RebD、RebE、莱鲍迪苷F(RebF)、RebM、莱鲍迪苷Q(RebQ)、莱鲍迪苷I(RebI)、杜可尔苷A、单-糖基化的对映-贝壳杉烯酸、二-糖基化的对映-贝壳杉烯酸、三-糖基化的对映-贝壳杉烯酸、单-糖基化的对映-贝壳杉烯醇、二-糖基化的对映-贝壳杉烯醇、三-糖基化的对映-贝壳杉烯醇、三-糖基化的甜菊醇糖苷、四-糖基化的甜菊醇糖苷、五-糖基化的甜菊醇糖苷、六-糖基化的甜菊醇糖苷，七-糖基化的甜菊醇糖苷和/或其异构体。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面：
(a)二-糖基化的对映-贝壳杉烯酸包括表1的KA2.7
(b)三-糖基化的对映-贝壳杉烯酸包括表1的KA3.1或KA3.2；
(c)二-糖基化的对映-贝壳杉烯醇包括表1的KL2.8；
(d)三-糖基化的对映-贝壳杉烯醇包括表1的KL3.1或KOL3.2；
(e)甜菊醇糖苷包括13-SMG、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、RebA、RebE、RebD或RebM；
(f)四-糖基化的甜菊醇包括表1的化合物4.26或化合物4.33；
(g)五-糖基化的甜菊醇包括表1的化合物5.24或化合物5.25；
(h)六-糖基化的甜菊醇包括表1的化合物6.1或化合物6.23；和/或
(i)七-糖基化的甜菊醇包括表1的化合物7.2或化合物7.5。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，重组宿主细胞包括植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类细胞或细菌细胞。
本发明还提供了在细胞培养物中产生一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的方法，其包括在其中表达所述基因的条件下在细胞培养物中生长本文公开的重组宿主细胞，并且其中所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物由细胞培养物中的重组宿主细胞产生。
在本文公开的方法的一个方面，组成型地表达基因和/或诱导基因的表达。
在本文公开的方法的一个方面，相对于缺少一种或多种重组基因的相应宿主，由细胞积累的对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、对映-贝壳杉烯醇+2Glc(#8)、对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、1，2-甜菊苷、RebB、RebA、RebE、甜菊醇+4Glc(#24和/或#25)，甜菊醇+4Glc(#26)、甜菊醇+4Glc(#33)、RebD、甜菊醇+5Glc、RebM、甜菊醇+6Glc(#23)、甜菊醇+7Glc(异构体2)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的量增加至少约5％。
在本文公开的方法的一个方面，相对于缺少一种或多种重组基因的相应宿主，由细胞积累的对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、19-SMG、1，2-甜菊苷、RebA、甜菊醇+4Glc(#26)、RebD、甜菊醇+5Glc(#24)、甜菊醇+5Glc(#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、RebM、甜菊醇+7Glc(异构体2)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的量减少至少约5％。
在一个方面，本文公开的方法还包括从细胞培养物中分离由此产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物。
在本文公开的方法的一个方面，所述分离步骤包括：
(a)提供包含一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的细胞培养物；
(b)将细胞培养物的液相与细胞培养物的固相分离，以获得含有所产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的上清液；
(c)提供一种或多种吸附树脂，包括在填充柱中提供吸附树脂；以及
(d)使步骤(b)的上清液与一种或多种吸附树脂接触，以获得至少一部分所产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体，或其组合物，从而分离所产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物；
或者
(a)提供包含一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的细胞培养物；
(b)将细胞培养物的液相与细胞培养物的固相分离，以获得含有所产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的上清液；
(c)提供一个或多个离子交换或离子交换或反相色谱柱；以及
(d)使步骤(b)的上清液与一个或多个离子交换或离子交换或反相色谱柱接触，以获得至少一部分所产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体，或其组合物，从而分离所产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体，或其组合物；
或者
(a)提供包含一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的细胞培养物；
(b)将细胞培养物的液相与细胞培养物的固相分离，以获得含有所产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的上清液；
(c)结晶或提取所产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物，从而分离所产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物。
在一个方面，本文公开的方法还包括从细胞培养物中回收一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物，其中细胞培养物相对于来自甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物富集了一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物，并且相对于源自植物的甜叶菊提取物具有降低的水平的源自甜叶菊植物的组分。
在本文公开的方法的一个方面，回收的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物以与从甜叶菊植物中回收的甜菊醇糖苷组合物不同的相对量存在，并且相对于源自植物的甜叶菊提取物具有降低的水平的源自甜叶菊植物的组分。
本发明还提供了用于产生一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的方法，所述方法包括在重组宿主细胞的细胞培养基中使用以下多肽对源自植物的或合成的甜菊醇、甜菊醇前体、糖基化的甜菊醇前体和/或甜菊醇糖苷进行的全细胞生物转化：
(a)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽，所述多肽与SEQID NO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性，并且还具有至少一个对应于SEQ IDNO：4的残基79、80、81、83、184、260、286或377的氨基酸取代；
(b)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽，所述多肽与SEQID NO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性，并且还具有至少一个对应于SEQ IDNO：4的残基68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82或83的氨基酸取代；
(c)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的双功能多肽，所述双功能多肽与SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：140或SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：144、SEQ IDNO：146或SEQ ID NO：148所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性；和/或
(d)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽，所述多肽与SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：178或SEQ ID NO：180所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性；
其中所述多肽中的至少一种是在重组宿主细胞中表达的重组多肽；并由此产生一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物。
在本文公开的方法的一个方面，重组宿主细胞是植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类细胞或细菌细胞。
本发明还提供了用于产生一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的体外方法，所述方法包括向反应混合物中添加：
(a)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽，所述多肽与SEQID NO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性，并且还具有至少一个对应于SEQ IDNO：4的残基79、80、81、83、184、260、286或377的氨基酸取代；
(b)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽，所述多肽与SEQID NO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性，并且还具有至少一个对应于SEQ IDNO：4的残基68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82或83的氨基酸取代；
(c)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的双功能多肽，所述双功能多肽与SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：140或SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：144、SEQ IDNO：146或SEQ ID NO：148所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性；和/或
(d)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽，所述多肽与SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：178或SEQ ID NO：180所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性；
和源自植物的或合成的甜菊醇糖苷前体或源自植物的或合成的甜菊醇前体；
其中所述多肽中的至少一种多肽是重组多肽；以及
由此产生一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物。
在本文公开的方法的一个方面，所述反应混合物包含：
(a)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-葡糖胺；和/或
(b)反应缓冲剂和/或盐。
在本文公开的方法的一个方面，一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体是以下物质或其组合物包含以下物质：13-SMG、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜茶苷、RebA、RebB、RebC、RebD、RebE、RebF、RebM、RebQ、RebI、杜可尔苷A、单-糖基化的对映-贝壳杉烯酸、二-糖基化的对映-贝壳杉烯酸、三-糖基化的对映-贝壳杉烯酸、单-糖基化的对映-贝壳杉烯醇、二-糖基化的对映-贝壳杉烯醇、三-糖基化的对映-贝壳杉烯醇、三-糖基化的甜菊醇糖苷、四-糖基化的甜菊醇糖苷、五-糖基化的甜菊醇糖苷、六-糖基化的甜菊醇糖苷，七-糖基化的甜菊醇糖苷和/或其异构体。
在本文公开的方法的一个方面：
(a)二-糖基化的对映-贝壳杉烯酸包括表1的KA2.7；
(b)三-糖基化的对映-贝壳杉烯酸包括表1的KA3.1或KA3.2；
(c)二-糖基化的对映-贝壳杉烯醇包括表1的KL2.8；
(d)三-糖基化的对映-贝壳杉烯醇包括表1的KL3.1或KOL3.2；
(e)甜菊醇糖苷包括13-SMG、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、RebA、RebE、RebD或RebM；
(f)四-糖基化的甜菊醇包括表1的化合物4.26或化合物4.33；
(g)五-糖基化的甜菊醇包括表1的化合物5.24或化合物5.25；
(h)六-糖基化的甜菊醇包括表1的化合物6.1或化合物6.23；和/或
(i)七-糖基化的甜菊醇包括表1的化合物7.2或化合物7.5。
本发明还提供细胞培养物，其包含本文公开的重组宿主细胞，所述细胞培养物还包含：
(a)由重组宿主细胞产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体，或其组合物，
(b)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-葡糖胺；和
(c)补充营养物，包括微量金属、维生素、盐、酵母氮源基础(YNB)和/或氨基酸；
其中所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物以至少1mg/升细胞培养物的浓度存在；
其中细胞培养物相对于来自甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物富集了一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物，并且相对于源自植物的甜叶菊提取物具有降低的水平的源自甜叶菊植物的组分。
本发明还提供了在细胞培养物中生长的来自本文公开的重组宿主细胞的细胞裂解物，其包含：
(a)由重组宿主细胞产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体，或其组合物，
(b)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-葡糖胺；和/或
(c)补充营养物，包括微量金属、维生素、盐、酵母氮源基础(YNB)和/或氨基酸；
其中由所述重组宿主细胞产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物以至少1mg/升细胞培养物的浓度存在；
本发明还提供反应混合物，其包含：
(a)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽，所述多肽与SEQID NO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性，并且还具有至少一个对应于SEQ IDNO：4的残基79、80、81、83、184、260、286或377的氨基酸取代；
(b)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽，所述多肽与SEQID NO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性，并且还具有至少一个对应于SEQ IDNO：4的残基68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82或83的氨基酸取代；
(c)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的双功能多肽，所述双功能多肽与SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：140或SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：144、SEQ IDNO：146或SEQ ID NO：148所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性；和/或
(d)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽，所述多肽与SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：178或SEQ ID NO：180所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性；
并且还包含：
(e)一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体，或其组合物；
(f)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-葡糖胺；和/或
(g)反应缓冲剂和/或盐。
本发明还提供了由本文公开的重组宿主细胞产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体的组合物；其中由重组宿主细胞产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体以与来自甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物不同的相对量存在，并且相对于源自植物的甜菊提取物具有降低的水平的源自甜叶菊植物的组分。
本发明还提供了通过本文公开的方法产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体的组合物；其中由重组宿主细胞产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体以与来自甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物不同的相对量存在，并且相对于源自植物的甜菊提取物具有降低的水平的源自甜叶菊植物的组分。
本发明还提供了甜味剂组合物，其包含由重组宿主细胞和/或本文公开的方法产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体。
本发明还提了供食品，其包含本文公开的甜味剂组合物。
本发明还提供了饮料或饮料浓缩物，其包含本文公开的甜味剂组合物。
本发明还提供了编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽或其催化活性部分的核酸分子，其中所述编码的多肽或其催化活性部分包含与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽，并且还包含具有至少一个对应于SEQID NO：4的残基79、80、81、83、184、260、286或377的氨基酸取代的多肽。
本发明还提供了编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽或其催化活性部分的核酸分子，其中所述编码的多肽或其催化活性部分包含与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽，并且还包含具有至少一个对应于SEQID NO：4的残基68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82或83的氨基酸取代的多肽；
在本文公开的核酸分子的一个方面，所编码的多肽或其催化活性部分包含对应于SEQ ID NO：4的M79V、M79E、S80C、A81W、E83K、H184V、H184T N260T、K286C、K286E、K286N、K286T和/或S377Q氨基酸取代。
在本文公开的核酸分子的一个方面，所述编码的多肽或其催化活性部分包含：
(a)对应于SEQ ID NO：4的K286C取代；
(b)对应于SEQ ID NO：4的M79V取代；
(c)对应于SEQ ID NO：4的S377Q取代；
(d)对应于SEQ ID NO：4的S80C取代；
(e)对应于SEQ ID NO：4的N260T和K286C取代；
(f)对应于SEQ ID NO：4的H184V取代；
(g)对应于SEQ ID NO：4的A81W和E83K取代；
(h)对应于SEQ ID NO：4的A81W取代；
(i)对应于SEQ ID NO：4的H184T取代；
(k)对应于SEQ ID NO：4的K286N取代；
(l)对应于SEQ ID NO：4的M79E取代；或
(m)对应于SEQ ID NO：4的K286T取代；
本发明还提供了编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽或其催化活性部分的核酸分子，其中所述编码的多肽或其催化活性部分包含与SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：178或SEQ ID NO：180所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽。
本发明还提供了编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的双功能多肽或其催化活性部分的基因，其中所述编码的双功能多肽或其催化活性部分与SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：140或SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：148所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性。
在本文公开的核酸分子的一个方面，核酸是分离的核酸。
在本文公开的核酸分子的一个方面，核酸是cDNA。
本发明还提供了能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽或其催化活性部分，其中所述多肽或其催化活性部分包含与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽，并且还包含具有至少一个对应于SEQ ID NO：4的残基79、80、81、83、184、260、286或377的氨基酸取代的多肽。
本发明还提供了能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽或其催化活性部分，其中所述多肽或其催化活性部分包含与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽，并且还包含具有至少一个对应于SEQ ID NO：4的残基68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82或83的氨基酸取代的多肽。
在一个方面，本文公开的多肽或其催化活性部分包含对应于SEQ ID NO：4的M79V、M79E、S80C、A81W、E83K、H184V、H184T N260T、K286C、K286E、K286N、K286T和/或S377Q氨基酸取代。
在一个方面，本文公开的多肽或其催化活性部分包含：
(a)对应于SEQ ID NO：4的K286C取代；
(b)对应于SEQ ID NO：4的M79V取代；
(c)对应于SEQ ID NO：4的S377Q取代；
(d)对应于SEQ ID NO：4的S80C取代；
(e)对应于SEQ ID NO：4的N260T和K286C取代；
(f)对应于SEQ ID NO：4的H184V取代；
(g)对应于SEQ ID NO：4的A81W和E83K取代；
(h)对应于SEQ ID NO：4的A81W取代；
(i)对应于SEQ ID NO：4的H184T取代；
(k)对应于SEQ ID NO：4的K286N取代；
(l)对应于SEQ ID NO：4的M79E取代；或
(m)对应于SEQ ID NO：4的K286T取代；
本发明还提供了能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽或其催化活性部分，其中所述标记的多肽或其催化活性部分包含与SEQ ID NO：174、SEQID NO：176、SEQ ID NO：178或SEQ ID NO：180所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽。
本发明还提供了能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的双功能多肽或其催化活性部分，其中所述双功能多肽或其催化活性部分包含与SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：140或SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：148所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽。
在一个方面，本文公开的多肽或其催化活性部分是纯化的多肽或其催化活性部分。
通过以下结合所附权利要求的详细描述，将更全面地理解本发明的这些和其它特征和有利方面。应注意，权利要求的范围由其中的叙述限定，而不是由本说明书中阐述的特征和有利方面的具体讨论限定。
附图说明
图1显示了由合适的UGT酶催化的代表性主要甜菊醇糖苷糖基化反应和几种甜菊醇糖苷化合物的化学结构。
图2显示了从异戊二烯基磷酸产生甜菊醇、糖基化的对映-贝壳杉烯酸和糖基化的对映-贝壳杉烯醇的生物化学途径。
图3显示对照酿酒酵母菌株、表达UGT74G1(SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：4)的酿酒酵母菌株、表达UGT74G1 Var_7(SEQ ID NO：129，SEQ ID NO：130)的酿酒酵母菌株和表达Chim_4(SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138)的酿酒酵母菌株的培养物。
图4显示甜菊醇+6Glc(异构体1)和甜菊醇+7Glc(异构体2)的结构。
图5显示甜菊醇+7Glc(异构体5)和甜菊醇+4Glc(#26)的结构。
图6显示对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1)和对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)的结构。
图7显示由表达标记的UGT74G1多肽的产生甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株(菌株1)对13-SMG、RebA、RebB、RebD和RebM的积累。图例：是源自菌株对照A(经工程化以破坏天然UGT74G1多肽的表达)的对照菌株(用空质粒转化的)。对照B代表典型的产生甜菊醇糖苷的菌株，并被包括在本文中作为参照。使用两个不同的整合位点来表达实施例7的表15中描述的标记的UGT74G1多肽，下面是：XII-1(左组的条)或XII-5(右组的条)。每个值代表6个独立克隆的平均值。参见实施例7。对于每个变体(对于每组的条)，条从左到右对应于13-SMG、RebB、RebA、RebD和RebM积累。
图8显示表达标记的UGT74G1多肽的产生甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株(菌株1)对糖基化的对映-贝壳杉烯酸和糖基化的对映-贝壳杉烯醇的积累。参见实施例7。关于图例，参见图7的描述。每个变体(对于每组的条)，条从左到右对应于对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、对映-贝壳杉烯醇+2Glc(#8)和对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和2)的积累。
图9显示表达标记的UGT74G1多肽的产生甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株(菌株1)对总甜菊醇糖苷的积累。参见实施例7。每个标记的UGT74G1多肽从2个不同的整合位点(XII-1(左条))或XII-5(右条))表达。每个条代表6个独立克隆的平均值。关于图例，参见图7的描述。
图10显示表达标记的UGT74G1多肽的产生甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株(菌株2)对13-SMG、RebA、RebB、RebD和RebM的积累。参见实施例8。图例：是用空质粒转化的对照菌株(对照A，参见上文图7的描述)。对照B代表典型的产生甜菊醇糖苷的菌株，并被包括在本文中作为参照。每个条代表6个独立克隆的平均值。对于顶部图的每个变体(对于每个条)，条的部分从上到下对应于RebM、RebD、RebA和RebB的积累。
图11显示表达标记的UGT74G1多肽的产生甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株(菌株2)对RebE、1，3-甜菊苷、甜茶苷、1，2-二糖苷和19-SMG的积累。参见实施例8。关于图例，参见图10的描述。对于每个变体(对于每个条)，条的部分从上到下对应于对RebE、1，3-甜菊苷、甜茶苷、1，2-二糖苷和19-SMG的积累。
图12显示表达标记的UGT74G1多肽的产生甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株(菌株2)对糖基化的对映-贝壳杉烯酸和糖基化的对映-贝壳杉烯醇的积累。参见实施例8。关于图例，参见图10的描述。对于每个变体(对于每组的条)，条从左到右对应于对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、对映-贝壳杉烯醇+2Glc(#8)和对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和2)的积累。
图13显示表达标记的UGT74G1多肽的产生甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株(菌株3和4)对13-SMG(底部)和RebA、RebB、RebD和RebM(顶部)的积累。参见实施例9。图例：对照A(参见上文图7的描述)是用空质粒转化的。对照B代表典型的产生甜菊醇糖苷的菌株，并被包括在本文中作为参照。对于顶部图的每个变体(对于每个条)，条的部分从上到下对应于RebM、RebD、RebA和RebB的积累。
图14(顶图)显示表达标记的UGT74G1多肽的产生甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株(菌株3和4)对19-SMG、1，2-二糖苷、甜茶苷和Reb E的积累。对于顶部图的每个变体(对于每个条)，条的部分从上到下对应于19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜茶苷和Reb E的积累。图14(底图)显示表达标记的UGT74G1多肽的产生甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株(菌株3和4)对糖基化的对映-贝壳杉烯酸和糖基化的对映-贝壳杉烯醇的积累。参见实施例9。关于图例，参见图13的描述。对于底图的每个变体(对于每组的条)，条的部分从下到上对应于对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、对映-贝壳杉烯醇+2Glc(#8)和对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和2)的积累。
图15A、15B和15C显示对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)的1H NMR谱以及1H和13CNMR化学位移(以ppm表示)。图15D、15E和15F显示对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)的1HNMR谱以及1H和13C NMR化学位移(以ppm表示)。图15G、15H和15I显示对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1)的1H NMR谱以及1H和13C NMR化学位移(以ppm表示)。图15J、15K和15L显示甜菊醇+6Glc(异构体1)的1H NMR谱以及1H和13C NMR化学位移(以ppm表示)。图15N、15O、15P和15Q显示甜菊醇+7Glc(异构体2)的1H NMR谱以及1H和13C NMR化学位移(以ppm表示)。图15R、15S、15T和15U显示甜菊醇+7Glc(异构体5)的1H NMR谱以及1H和13C NMR化学位移(以ppm表示)。图15V、15W、15X和15Y显示甜菊醇+4Glc(#26)的1H NMR谱以及1H和13C NMR化学位移(以ppm表示)。
技术人员将理解，附图中的元件是为了简单和清楚而示出的，并且不一定按比例绘制。例如，附图中的一些元件的尺寸可以相对于其它元件夸大，以帮助提高对本发明的一个或多个实施方案的理解。
具体实施方式
出于所有目的，本文中引用的所有出版物、专利和专利申请由此通过引用明确地并入。
在详细描述本发明之前，将定义若干术语。如本文中所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”包括复数指代物。例如，提及“核酸”是指一个/种或多个/种核酸。
应注意，术语如“优选地”、“一般地”和“通常”在本文中不用于限制要求保护的发明的范围，或暗示某些特性对于要求保护的发明的结构或功能是至关重要的、必要的或者甚至是重要的。相反，这些术语仅旨在突出可被用在或不被用在本发明的特定实施方案中的替代或额外特征。
为了描述和限定本发明的目的，应注意术语″基本上″在本文中用于表示可归因于任何定量比较、值、测量或其它表述的固有的不确定程度。术语″基本上″在本文中也用于表示在不导致所讨论主题的基本功能改变的情况下，定量表达可不同于所述参考的程度。
可使用本领域技术人员公知的方法来构建根据本发明的遗传表达构建体和重组细胞。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术、体内重组技术和聚合酶链式反应(PCR)技术。参见，例如描述于如下文献中的技术：Green&Sambrook，2012，MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，第4版，Cold Spring Harbor Laboratory，New York；Ausubel等，1989，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Greene Publishing Associates andWiley Interscience，New York，和PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications(Innis等，1990，Academic Press，San Diego，CA)。
如本文中所用，术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互换使用，是指包括单链或双链实施方案(取决于本领域技术人员理解的背景)中的DNA、RNA、其衍生物或其组合的核酸。
如本文中所用，术语“微生物”、“微生物宿主”和“微生物宿主细胞”可以互换使用。如本文中所用，术语“重组宿主”和“重组宿主细胞”可互换使用。本领域普通技术人员将理解，术语“微生物”、“微生物宿主”和“微生物宿主细胞”，当用于描述包含重组基因的细胞时，可以被认为是指“重组宿主”或“重组宿主细胞”。如本文中所用，术语“重组宿主”意图指这样的宿主，其基因组已经增加(augment)至少一个DNA序列。此类DNA序列包括但不限于非天然存在的基因、通常不转录成RNA或翻译成蛋白质(“表达的”)的DNA序列和期望引入宿主中的其它基因或DNA序列。应当理解，通常通过稳定引入一个或多个重组基因来增加本文所述的重组宿主的基因组。一般而言，引入的DNA最初不是作为DNA接受者的宿主中所固有的，而是在本公开内容的范围内从给定宿主中分离DNA片段，并随后将该DNA的一个或更多个另外的拷贝引入同一宿主中，例如用来提高基因产物的产量或改变基因的表达模式。在一些情况下，引入的DNA将通过例如同源重组或定点诱变来修饰或甚至替代内源基因或DNA序列。合适的重组宿主包括微生物。
如本文中所用，术语“重组基因”是指被引入接受者宿主的基因或DNA序列，而不管相同或相似的基因或DNA序列是否可能已经存在于此类宿主中。在本上下文中，“引入”或“增加”在本领域中已知是指人工(by the hand of man)引入或增加。因此，重组基因可以是来自另一物种的DNA序列，或者可以是源自或存在于相同物种但已通过重组方法并入宿主以形成重组宿主的DNA序列。应当理解，被引入宿主的重组基因可以与正常存在于被转化宿主中的DNA序列相同，并且被引入以提供所述DNA的一个或更多个另外的拷贝，从而允许该DNA基因产物的过表达或经修饰表达。在一些方面，所述重组基因由eDNA编码。在其它实施方案中，重组基因是合成的和/或经密码子优化的，以用于在酿酒酵母中表达。
如本文中所用，术语”经工程化的生物合成途径″是指在如本文所述的重组宿主中发生的生物合成途径。在一些方面，生物合成途径的一个或多个步骤并非天然地存在于未修饰的宿主中。在一些实施方案中，将基因的异源形式引入包含所述基因的内源形式的宿主。
如本文中所用，术语“内源”基因是指源自特定生物体、组织或细胞并在其中产生或合成的基因。在一些实施方案中，所述内源基因是酵母基因。在一些实施方案中，所述基因对于酿酒酵母(包括但不限于酿酒酵母菌株S288C)是内源性的。在一些实施方案中，内源酵母基因过表达。如本文中所用，术语“过表达”用于指生物体中基因以高于野生型生物体中的基因表达水平的水平表达。参见，例如，Prelich，2012，Genetics 190：841-54。在一些实施方案中，缺失内源酵母基因例如ADH。参见，例如，Giaever&Nislow，2014，Genetics 197(2)：451-65。如本文中所用，术语“缺失”、“缺失的”、“敲除”和“敲除的”可互换使用，指已被操作而不再在生物体中表达的内源基因，所述生物体包括但不限于酿酒酵母。
如本文中所用，术语“异源序列”和“异源编码序列”用于描述源自除重组宿主外的物种的序列。在一些实施方案中，重组宿主是酿酒酵母细胞，异源序列源自除酿酒酵母外的生物体。异源编码序列例如可以来自不同于表达异源序列的重组宿主的原核微生物、真核微生物、植物、动物、昆虫或真菌。在一些实施方案中，编码序列是对宿主是天然的序列。
″可选择标志物″可以是补充宿主细胞营养缺陷型、提供抗生素抗性或导致颜色改变的许多基因之一。然后使用本领域公知的方法(参见下文)将基因置换载体的线性化DNA片段引入细胞。可以基于选择标志物来确定线性片段整合到基因组中和基因的破坏，并且可以通过例如PCR或Southern印迹分析来验证。在将其用于选择之后，可以通过例如Cre-LoxP系统从宿主细胞的基因组中除去可选择性标志物(参见例如Gossen等，2002，Ann.Rev.Genetics 36：153-173和U.S.2006/0014264)。或者，可以以包括待破坏的基因之一部分的方式构建基因置换载体，其中所述部分缺少任何内源基因启动子序列并且不编码所述基因的编码序列，或编码所述基因的无活性片段。
如本文中所用，术语“变体”和“突变体”用于描述与特定蛋白质的野生型序列相比在一个或更多个氨基酸处已经被修饰的蛋白质序列。
如本文中所用，术语“无活性片段”是编码活性小于例如从基因的全长编码序列所产生之蛋白质的约10％(例如小于约9％，小于约8％，小于约7％，小于约6％，小于约5％，小于约4％，小于约3％，小于约2％，小于约1％，或0％)的蛋白质的基因片段。将这样的基因部分以这样的方式插入载体中，使得没有已知的启动子序列可操作地连接于基因序列，但终止密码子和转录终止序列可操作地连接于基因序列的所述部分。随后可在基因序列的所述部分中对该载体进行线性化并将其转化到细胞中。然后通过单一同源重组，将该线性化载体整合到基因的内源对应物中，使其失活。
如本文中所用，术语“甜菊醇糖苷”指莱鲍迪苷A(RebA)(CAS#58543-16-1)、莱鲍迪苷B(RebB)(CAS#58543-17-2)、莱鲍迪苷C(RebC)(CAS#63550-99-2)、莱鲍迪苷D(RebD)(CAS#63279-13-0)、莱鲍迪苷E(RebE)(CAS#63279-14-1)、莱鲍迪苷F(RebF)(CAS#438045-89-7)、莱鲍迪苷M(RebM)(CAS#1220616-44-3)、甜茶苷(CAS#63849-39-4)、杜尔可苷(CAS#64432-06-0)、莱鲍迪苷I(RebI)(MassBank记录：FU000332)、莱鲍迪苷Q(RebQ)、1，2-甜菊苷(CAS#57817-89-7)、1，3-甜菊苷(RebG)、1，2-二糖苷(MassBank记录号：FU000299)、1，3-二糖苷、甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)、甜菊醇-19-O-葡糖苷(19-SMG)、三-糖基化的甜菊醇糖苷、四-糖基化的甜菊醇糖苷、五-糖基化的甜菊醇糖苷、六-糖基化的甜菊醇糖苷、七-糖基化的甜菊醇糖苷及其异构体。参见图1；另见，Steviol Glycosides Chemical andTechnical Assessment 69th JECFA，2007，由Harriet Wallin，Food Agric.Org.畴备的。本文公开的甜菊醇糖苷异构体的核磁共振(NMR)谱可见于图15中。
如本文中所用，术语“甜菊醇糖苷前体”和“甜菊醇糖苷前体化合物”用于指甜菊醇糖苷生物合成途径中的中间化合物。甜菊醇糖苷前体包括但不限于牻牛儿基牻牛儿基二磷酸(GGPP)、对映-柯巴基-二磷酸、对映-贝壳杉稀、对映-贝壳杉稀醇、对映-贝壳杉稀醛(ent-kaurenal)、对映-贝壳杉稀酸和甜菊醇。参见图2。如本文中所用，术语“甜菊醇前体”和“甜菊醇前体化合物”用于指甜菊醇生物合成途径中的中间化合物。甜菊醇前体还可以是甜菊醇糖苷前体，包括但不限于牻牛儿基牻牛儿基二磷酸(GGPP)、对映-柯巴基-二磷酸、对映-贝壳杉稀、对映-贝壳杉稀醇、对映-贝壳杉稀醛和对映-贝壳杉稀酸。在一些实施方案中，甜菊醇前体可以是糖基化的，例如，三-糖基化的对映-贝壳杉稀酸(对映-贝壳杉稀酸+3Glc)、二-糖基化的对映-贝壳杉稀酸、单-糖基化的对映-贝壳杉稀酸、三-糖基化的对映-贝壳杉稀醇、二-糖基化的对映-贝壳杉稀醇(对映-贝壳杉稀醇+2Glc)或单-糖基化的对映-贝壳杉稀醇(对映-贝壳杉稀醇+1Glc)。在一些实施方案中，甜菊醇糖苷前体本身就是甜菊醇糖苷化合物。例如，19-SMG、甜茶苷、甜菊苷和RebE是RebM的甜菊醇糖苷前体。参见图1。
如本文中所用，术语“接触”用于指两个物体之间的任何物理相互作用。例如，术语“接触”可以指酶与底物之间的相互作用。在另一个实例中，术语“接触”可以指液体(例如，上清液)与吸附树脂之间的相互作用。
可在体内(即，在重组宿主中)、体外(即，酶促地)或通过全细胞生物转化产生甜菊醇糖苷、甜菊醇糖苷前体和/或甜菊醇前体的糖苷。如本文中所用，术语“产生”和“积累”可以互换使用，用于描述体内、体外或通过全细胞生物转化合成甜菊醇糖苷、甜菊醇前体的糖苷和甜菊醇糖苷前体。
在WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227和WO 2014/122328中描述了产生重组甜菊醇糖苷的酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株。在WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227和WO 2014/122328中也描述了在重组宿主中、通过全细胞生物转化和在体外产生甜菊醇糖苷的方法。
如本文中所用，术语“培养液”、“培养基”和“生长培养基”可以互换使用，是指支持细胞生长的液体或固体。培养液可包含葡萄糖、果糖、蔗糖、痕量金属、维生素、盐、酵母氮源基础(yeast nitrogen base)(YNB)和/或氨基酸。痕量金属可以是二价阳离子，包括但不限于Mn2+和/或Mg2+。在一些实施方案中，Mn2+可呈MnCl2二水合物的形式，并且范围为约0.01g/L至100g/L。在一些实施方案中，Mg2+可呈MgSO4七水合物的形式，并且范围为约0.01g/L至100g/L。例如，培养液可包含i)约0.02-0.03g/L的MnCl2二水合物和约0.5-3.8g/L的MgSO4七水合物，ii)约0.03-0.06g/L的MnCl2二水合物和约0.5-3.8g/L的MgSO4七水合物，和/或iii)约0.03-0.17g/L MnCl2二水合物和约0.5-7.3g/L MgSO4七水合物。另外，培养液可包含一种或多种由重组宿主产生的甜菊醇糖苷，如本文所述的。
在一些实施方案中，重组宿主可在体内产生甜菊醇，所述重组宿主包含编码能够从法呢基二磷酸(FPP)和异戊烯二磷酸(IPP)合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)的多肽(例如，牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPPS))的基因；编码能够从GGPP合成对映-柯巴基-二磷酸的多肽(例如，对映-柯巴基二磷酸合酶(CDPS))的基因；编码能够从对映-柯巴基二磷酸合成对映-贝壳杉烯的多肽(例如，贝壳杉烯合酶(KS))的基因；编码能够从对映-贝壳杉烯合成对映-贝壳杉烯酸、对映-贝壳杉烯醇和/或对映-贝壳杉烯醛的多肽(例如，贝壳杉烯醛氧化酶(KO))的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽(例如，细胞色素P450还原酶(CPR)或P450氧化还原酶(POR)；例如，但不限于能够在NADPH至NADP+的转化过程中将电子从NADPH转移至细胞色素P450复合物的多肽，其用作萜类生物合成的辅因子)的基因；编码能够从对映-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽(例如，甜菊醇合酶(KAH))的基因；和/或编码能够从GGPP合成内-柯巴基二磷酸并从对映-柯巴基二磷酸合成对映-贝壳杉烯的双功能多肽(例如，对映-柯巴基二磷酸合酶(CDPS)-对映-贝壳杉烯合酶(KS)多肽)的基因。参见，例如，图1。技术人员将理解，这些基因中的一种或多种对于宿主可以是内源的，条件是这些基因中的至少一种(以及在一些实施方案中，所有)是引入重组宿主中的重组基因。
在一些实施方案中，重组宿主可在体内产生甜菊醇糖苷，所述重组宿主包含编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽(例如，UGT85C2多肽)的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3’进行β1，3糖基化的多肽(例如，UGT76G1多肽)的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽(例如，UGT74G1多肽)的基因；和/或编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′进行β1，2糖基化的多肽(例如，UGT91D2或EUGT11多肽)的基因。技术人员将理解，这些基因中的一种或多种对于宿主可以是内源的，条件是这些基因中的至少一种(以及在一些实施方案中，所有)是引入重组宿主中的重组基因。
在一些实施方案中，通过在重组宿主中表达参与甜菊醇糖苷生物合成途径的一种或多种酶而在体内产生甜菊醇糖苷、甜菊醇前体的糖苷和/或甜菊醇糖苷前体。例如，重组宿主可在体内产生甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体，所述重组宿主包含编码能够从FPP和IPP合成GGPP的多肽的基因；编码能够从GGPP合成对映-柯巴基-二磷酸的多肽的基因；编码能够从对映-柯巴基二磷酸合成对映-贝壳杉烯的多肽的基因；编码能够从对映-贝壳杉烯合成对映-贝壳杉烯酸、对映-贝壳杉烯醇和/或对映-贝壳杉烯醛的多肽的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因；编码能够从GGPP合成对映-柯巴基二磷酸并从对映-柯巴基二磷酸合成对映-贝壳杉烯的双功能多肽的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3’进行β1，3糖基化的多肽的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的基因；和/或编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′进行β1，2糖基化的多肽的基因。参见，例如，图1和图2。技术人员将理解，这些基因中的一种或多种对于宿主可以是内源的，条件是这些基因中的至少一种(以及在一些实施方案中，所有)是引入重组宿主中的重组基因。
在一些方面，能够从FPP和IPP合成GGPP的多肽包含具有SEQ ID NO：20(其可由SEQID NO：19所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：22(由SEQ ID NO：21所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：24(由SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：26(由SEQ IDNO：25所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：28(由SEQ ID NO：27所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：30(由SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：32(由SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：116(由SEQ ID NO：115所示的核苷酸序列编码)所示的氨基酸序列的多肽。
在一些方面，能够从GGPP合成对映-柯巴基二磷酸的多肽包含具有SEQ ID NO：34(其可由SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：36(由SEQ ID NO：35所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：38(由SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：40(由SEQ ID NO：39所示的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：42(由SEQ ID NO：41所示的核苷酸序列编码)所示的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，能够从GGPP合成对映-柯巴基二磷酸的多肽缺少叶绿体转运肽。
在一些方面，能够从对映-柯巴基焦磷酸合对映-贝壳杉烯的多肽包含具有SEQ IDNO：44(其可由SEQ ID NO：43所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：46(由SEQ ID NO：45所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：48(由SEQ ID NO：47所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：50(由SEQ ID NO：49所示的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：52(由SEQ ID NO：51所示的核苷酸序列编码)所示的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够从GGPP合成对映-柯巴基二磷酸并从对映-柯巴基焦磷酸合成对映-贝壳杉烯的双功能多肽的基因。在一些方面，所述双功能多肽包含具有SEQ ID NO：54(其可由SEQ ID NO：53所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：56(由SEQ ID NO：55所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：58(由SEQ ID NO：57所示的核苷酸序列编码)所示的氨基酸序列的多肽。
在一些方面，能够从对映-贝壳杉烯合成对映-贝壳杉烯酸、对映-贝壳杉烯醇和/或对映-贝壳杉烯醛的多肽包含具有SEQ ID NO：60(其可由SEQ ID NO：59所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：62(由SEQ ID NO：61所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：117(由SEQID NO：63或SEQ ID NO：64所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：66(由SEQ ID NO：65所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：68(由SEQ ID NO：67所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：70(由SEQ ID NO：69所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：72(由SEQ ID NO：71所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：74(由SEQ ID NO：73所示的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：76(由SEQ ID NO：75所示的核苷酸序列编码)所示的氨基酸序列的多肽。
在一些方面，能够还原细胞色素P450复合物的多肽包含具有SEQ ID NO：78(其可由SEQ ID NO：77所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：80(由SEQ ID NO：79所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：82(由SEQ ID NO：81所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：84(由SEQID NO：83所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：86(由SEQ ID NO：85所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：88(由SEQ ID NO：87所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：90(由SEQ IDNO：89所示的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：92(由SEQ ID NO：91所示的核苷酸序列编码)所示的氨基酸序列的多肽。
在一些方面，能够从对映-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽包含具有SEQ ID NO：94(其可由SEQ ID NO：93所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：97(由SEQ ID NO：95或SEQ IDNO：96所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：100(由SEQ ID NO：98或SEQ ID NO：99所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ IDNO：106(由SEQ ID NO：105所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：108(由SEQ ID NO：107所示的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：110(由SEQ ID NO：109所示的核苷酸序列编码)、SEQ IDNO：112(由SEQ ID NO：111所示的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：114(由SEQ ID NO：113所示的核苷酸序列编码)所示的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽(例如，UGT85C2多肽；SEQ ID NO：7)的核酸；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3’进行β1，3糖基化的多肽(例如，UGT76G1多肽；SEQ ID NO：9)的核酸；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽(例如，UGT74G1多肽；SEQ ID NO：4)的核酸；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′进行β1，2糖基化的多肽(例如，EUGT11多肽；SEQ ID NO：16)的核酸。在一些方面，能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′进行β1，2糖基化的多肽(例如，UGT91D2多肽)可以是UGT91D2e多肽(SEQ ID NO：11)或UGT91D2e-b多肽(SEQ ID NO：13)。
在一些方面，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽由SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：6中所示的核苷酸序列编码，能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3’进行β1，3糖基化的多肽由SEQ ID NO：8中所示的核苷酸序列编码，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽由SEQID NO：3所示的核苷酸序列编码，能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′进行β1，2糖基化的多肽由SEQ ID NO：10、12、14或15中所示的核苷酸序列编码。技术人员将理解，这些基因的表达对于产生特定甜菊醇糖苷是必需的，但这些基因中的一种或多种对于宿主可以是内源的，条件是这些基因中的至少一种(以及在一些实施方案中，所有)是引入重组宿主中的重组基因。
在特定实施方案中，产生甜菊醇的重组微生物包含外源核酸，所述外源核酸编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽、能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3′进行β1，3糖基化的多肽，以及能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′进行β1，2糖基化的多肽。
在另一个特定实施方案中，产生甜菊醇的重组微生物包含外源核酸，所述外源核酸编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽；能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3′进行β1，3糖基化的多肽；能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽；以及能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′进行β1，2糖基化的多肽。
在一些实施方案中，通过将甜菊醇糖苷前体与参与甜菊醇糖苷途径的一种或多种酶接触而在体外产生甜菊醇糖苷、甜菊醇前体的糖苷和/或甜菊醇糖苷前体。例如，将甜菊醇与一种或多种基因接触可导致体外产生甜菊醇糖苷，所述基因编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖的C3′进行β1，3糖基化的多肽、能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′进行β1，2糖基化的多肽，以及能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽或能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽。在一些实施方案中，通过将上游甜菊醇糖苷前体与参与甜菊醇糖苷途径的一种或多种酶接触而在体外产生甜菊醇糖苷前体。例如，将对映-贝壳杉烯酸与能够从对映-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽接触可导致体外产生甜菊醇。
在一些实施方案中，通过全细胞生物转化产生甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体。为了发生全细胞生物转化，使表达参与甜菊醇糖苷途径的一种或多种酶的宿主细胞摄取并修饰细胞中的甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体；在体内修饰后，甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体保留在细胞中和/或分泌到培养基中。在一些实施方案中，重组宿主可将甜菊醇摄入细胞并在细胞中糖基化甜菊糖，所述重组宿主表达编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3’进行β1，3糖基化的多肽的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的基因；和/或编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′进行β1，2糖基化的多肽的基因；在体内进行糖基化后，可将甜菊醇糖苷分泌到培养基中。在某些此类实施方案中，宿主细胞还可表达编码能够从FPP和IPP合成GGPP的多肽的基因；编码能够从GGPP合成对映-柯巴基-二磷酸的多肽的基因；编码能够从对映-柯巴基二磷酸合成对映-贝壳杉烯的多肽的基因；编码能够从对映-贝壳杉烯合成对映-贝壳杉烯酸、对映-贝壳杉烯醇和/或对映-贝壳杉烯醛的多肽的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因；编码能够从对映-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽的基因；和/或编码能够从GGPP合成对映-柯巴基二磷酸并从对映-柯巴基二磷酸合成对映-贝壳杉烯的双功能多肽的基因。
在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽可以通过将其与锚定基序融合而展示在本文公开的重组宿主细胞的表面上。
在一些实施方案中，使细胞透化以摄取待修饰的底物或分泌经修饰的产物。可以加入透化剂以帮助原料进入宿主和产物离开。在一些实施方案中，用溶剂诸如甲苯或用去垢剂诸如Triton-X或Tween透化细胞。在一些实施方案中，用表面活性剂例如阳离子表面活性剂，诸如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)透化细胞。在一些实施方案中，通过周期性机械休克(诸如电穿孔或轻微的渗透压休克)透化细胞。例如，可将培养的微生物的粗裂解物离心以获得上清液。然后可将所得上清液应用于色谱柱，例如C18柱，并用水洗涤以除去亲水性化合物，然后用溶剂诸如甲醇洗脱一种或多种目标化合物。然后可以通过制备型HPLC进一步纯化一种或多种化合物。另见，WO 2009/140394。
在一些实施方案中，通过共培养两种或更多种宿主产生甜菊醇、一种或多种甜菊醇糖苷前体和/或一种或多种甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，一种或多种宿主(每种宿主表达参与甜菊醇糖苷途径的一种或多种酶)，产生甜菊醇、一种或多种甜菊醇糖苷前体和/或一种或多种甜菊醇糖苷。例如，表达编码能够从FPP和IPP合成GGPP的多肽的基因；编码能够从GGPP合成对映-柯巴基-二磷酸的多肽的基因；编码能够从对映-柯巴基二磷酸合成对映-贝壳杉烯的多肽的基因；编码能够从对映-贝壳杉烯合成对映-贝壳杉烯酸、对映-贝壳杉烯醇和/或对映-贝壳杉烯醛的多肽的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因；编码能够从对映-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽的基因；和/或编码能够从GGPP合成对映-柯巴基二磷酸并从对映-柯巴基二磷酸合成对映-贝壳杉烯的双功能多肽的基因的宿主，和表达编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3’进行β1，3糖基化的多肽的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的基因；和/或编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′进行β1，2糖基化的多肽的基因的宿主产生一种或多种甜菊醇糖苷。
在一些实施方案中，能够在体外、在重组宿主中(即，体内)或通过全细胞生物转化能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽包括UGT74G1的功能同源物(SEQID NO：4)(即，UGT74G1同源物)。在一些实施方案中，能够在体外、在重组宿主中或通过全细胞生物转化能够使甜菊醇前体(例如，对映-贝壳杉烯酸)在其C-19羧基处糖基化和/或使对映-贝壳杉烯的多肽包括UGT74G1(SEQ ID NO：4)在其C-19羟基处糖基化的功能同源物。在一些实施方案中，能够在体外、在重组宿主中(即，在体内)或通过全细胞生物转化能够使甜菊醇前体(例如，对映-贝壳杉烯)在其C-19羧基处糖基化的多肽包括能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽(例如，UGT85C2多肽；SEQ ID NO：7)的功能同源物。
在一些实施方案中，适合用于在体外、在重组宿主中或通过全细胞生物转化产生(即，能够合成)甜菊醇糖苷和/或甜菊醇前体的糖苷，诸如13-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜茶苷、RebB、RebA、RebE、RebD、RebM、19-SMG、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜菊醇+4GLc(#26和/或#33)、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1和/或#23)、甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)、对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)和/或对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)的多肽包括UGT74G1(SEQ ID NO：4)的功能同源物，诸如UGT74G1 Var_1(SEQ ID NO：118)、UGT74G1 Var_2(SEQ ID NO：120)、UGT74G1 Var_3(SEQ ID NO：122)、UGT74G1 Var_4(SEQID NO：124)、UGT74G1 Var_5(SEQ ID NO：126)、UGT74G1Var_6(SEQ ID NO：128)、UGT74G1Var_7(SEQ ID NO：130)、UGT74G1 Var_8(SEQ ID NO：161)、UGT74G1 Var_9(SEQ ID NO：163)、UGT74G1 Var_10(SEQ ID NO：165)、UGT74G1 Var_11(SEQ ID NO：167)和UGT74G1Var_12(SEQ ID NO：169)。
在一些实施方案中，有用的UGT74G1功能同源物可具有一个或多个对应于SEQ IDNO：4的残基18、20、21、23、79、80、81、82、83、85、86、119、140、148、179、184、185、191、194、195、284、285、286、375、376、377或378的氨基酸取代。参见，下表2。有用的UGT74G1同源物的非限制性实例包括具有对应于残基79(例如，对应于残基79的缬氨酸或谷氨酸)、80(例如，对应于残基80的半胱氨酸)、81(例如，对应于残基81的色氨酸)、83(例如，对应于残基83的赖氨酸)、184(例如，对应于残基184的缬氨酸或苏氨酸)、260(例如，对应于残基260的苏氨酸)、286(例如，对应于残基286的半胱氨酸、天冬酰胺、苏氨酸或谷氨酸)或377(例如，对应于残基377的谷氨酰胺)的取代(相对于SEQ ID NO：4)的多肽。
在一些实施方案中，有用的UGT74G1功能同源物可具有一个或多个对应于位于SEQID NO：4的A68-E83区域内的残基的氨基酸取代，即，一个或多个对应于SEQ ID NO：4的残基68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82或83的氨基酸取代。
在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽(例如，UGT74G1同源物)还包含标签，例如，具有SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：153、SEQ IDNO：154或SEQ ID NO：155所示的氨基酸序列的标签。
在一些实施方案中，表达一种或多种UGT74G1变体(不限于UGT74G1 Var_10(SEQID NO：165)、UGT74G1 Var_11(SEQ ID NO：167))的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)。在一些实施方案中，表达一种或多种UGT74G1变体(不限于UGT74G1 Var_10(SEQ ID NO：165)或UGT74G1 Var_11(SEQ ID NO：167))的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)。
在一些实施方案中，表达一种或多种UGT74G1变体(不限于UGT74G1 Var_1(SEQ IDNO：118)、UGT74G1 Var_2(SEQ ID NO：120)、UGT74G1 Var_4(SEQ ID NO：124)、UGT74G1Var_5(SEQ ID NO：126)、UGT74G1 Var_6(SEQ ID NO：128)、UGT74G1 Var_10(SEQ ID NO：165)或UGT74G1 Var_11(SEQ ID NO：167))的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)。在一些实施方案中，表达一种或多种UGT74G1变体(不限于UGT74G1 Var_1(SEQ ID NO：118))的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累对映-贝壳杉烯醇+2Glc(#8)。
在一些实施方案中，表达一种或多种UGT74G1变体(不限于UGT74G1 Var_2(SEQ IDNO：120)、UGT74G1 Var_3(SEQ ID NO：122)、UGT74G1 Var_4(SEQ ID NO：124)、UGT74G1Var_5(SEQ ID NO：126)、UGT74G1 Var_6(SEQ ID NO：128)或UGT74G1 Var_7(SEQ ID NO：130))的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和异构体2)。
在一些实施方案中，表达一种或多种UGT74G1变体(不限于UGT74G1 Var_3(SEQ IDNO：122)、UGT74G1 Var_4(SEQ ID NO：124)、UGT74G1 Var_5(SEQ ID NO：126)、UGT74G1Var_6(SEQ ID NO：128)、UGT74G1 Var_7(SEQ ID NO：130)、UGT74G1 Var_8(SEQ ID NO：161)、UGT74G1 Var_9(SEQ ID NO：163)、UGT74G1Var_10或UGT74G1 Var_11(SEQ ID NO：167))的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累13-SMG。在一些实施方案中，表达一种或多种UGT74G1变体(不限于UGT74G1 Var_3(SEQ ID NO：122)或UGT74G1 Var_9(SEQID NO：163))的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累甜菊醇-1，2-二糖苷。
在一些实施方案中，表达一种或多种UGT74G1变体(不限于UGT74G1 Var_1(SEQ IDNO：118)或UGT74G1 Var_3(SEQ ID NO：122))的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累甜菊醇-1，3-二糖苷。在一些实施方案中，表达一种或多种UGT74G1变体(不限于UGT74G1 Var_1(SEQ ID NO：118)、UGT74G1 Var_2(SEQ ID NO：120)、UGT74G1 Var_4(SEQID NO：124)、UGT74G1 Var_5(SEQ ID NO：126)、UGT74G1 Var_6(SEQ ID NO：128)、UGT74G1Var_7(SEQ ID NO：130)、UGT74G1 Var_8(SEQ ID NO：161)、UGT74G1Var_9(SEQ ID NO：163)、UGT74G1 Var_10(SEQ ID NO：165)或UGT74G1 Var_11(SEQ ID NO：167))的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累甜茶苷。
在一些实施方案中，表达一种或多种UGT74G1变体(不限于UGT74G1 Var_6(SEQ IDNO：128)、UGT74G1 Var_7(SEQ ID NO：130)、UGT74G1 Var_8(SEQ ID NO：161)或UGT74G1Var_9(SEQ ID NO：163))的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累1，2-甜菊苷。
在一些实施方案中，表达一种或多种UGT74G1变体(不限于UGT74G1 Var_3(SEQ IDNO：122)、UGT74G1 Var_4(SEQ ID NO：124)、UGT74G1 Var_5(SEQ ID NO：126)、UGT74G1Var_6(SEQ ID NO：128)、UGT74G1 Var_7(SEQ ID NO：130)、UGT74G1 Var_8(SEQ ID NO：161)、UGT74G1 Var_9(SEQ ID NO：163)、UGT74G1Var_10(SEQ ID NO：165)或UGT74G1 Var_11(SEQ ID NO：167))的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累RebB。
在一些实施方案中，表达一种或多种UGT74G1变体(不限于UGT74G1 Var_4(SEQ IDNO：124)、UGT74G1 Var_6(SEQ ID NO：128)、UGT74G1 Var_7(SEQ ID NO：130)、UGT74G1Var_8(SEQ ID NO：161)、UGT74G1 Var_9(SEQ ID NO：163)或UGT74G1 Var_10(SEQ ID NO：165))的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累RebA。
在一些实施方案中，表达一种或多种UGT74G1变体(不限于UGT74G1 Var_2(SEQ IDNO：120)或UGT74G1 Var_4(SEQ ID NO：124))的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累RebE。
在一些实施方案中，表达一种或多种UGT74G1变体(不限于UGT74G1 Var_1(SEQ IDNO：118)、UGT74G1 Var_2(SEQ ID NO：120)、UGT74G1 Var_4(SEQ ID NO：124)、UGT74G1Var_5(SEQ ID NO：126)、UGT74G1 Var_6(SEQ ID NO：128)、UGT74G1 Var_9(SEQ ID NO：163)、UGT74G1 Var_10(SEQ ID NO：165)或UGT74G1Var_11(SEQ ID NO：167))的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累甜菊醇+4Glc(#26)。
在一些实施方案中，表达一种或多种UGT74G1变体(不限于UGT74G1 Var_3(SEQ IDNO：122)、UGT74G1 Var_7(SEQ ID NO：130)、UGT74G1 Var_8(SEQ ID NO：161)、UGT74G1Var_9(SEQ ID NO：163)或UGT74G1 Var_11(SEQ ID NO：167))的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累甜菊醇+4Glc(#33)。
在一些实施方案中，表达一种或多种UGT74G1变体(不限于UGT74G1 Var_7(SEQ IDNO：130)、UGT74G1 Var_8(SEQ ID NO：161)、UGT74G1 Var_9(SEQ ID NO：163)或UGT74G1Var_11(SEQ ID NO：167))的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累RebD。
在一些实施方案中，表达一种或多种UGT74G1变体(不限于UGT74G1 Var_1(SEQ IDNO：118)、UGT74G1 Var_9(SEQ ID NO：163)或UGT74G1 Var_11(SEQ ID NO：167))的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累甜菊醇+5Glc(#24)。
在一些实施方案中，表达一种或多种UGT74G1变体(不限于UGT74G1 Var_8(SEQ IDNO：161)、UGT74G1 Var_9(SEQ ID NO：163)或UGT74G1 Var_10(SEQ ID NO：165))的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累甜菊醇+5Glc(#25)。
在一些实施方案中，表达一种或多种UGT74G1变体(不限于UGT74G1 Var_2(SEQ IDNO：120)、UGT74G1 Var_4(SEQ ID NO：124)、UGT74G1 Var_6(SEQ ID NO：128)、UGT74G1Var_7(SEQ ID NO：130)、UGT74G1 Var_8(SEQ ID NO：161)、UGT74G1 Var_9(SEQ ID NO：163)、UGT74G1 Var_10(SEQ ID NO：165)或UGT74G1Var_11(SEQ ID NO：167))的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累RebM。
在一些实施方案中，表达一种或多种UGT74G1变体(不限于UGT74G1 Var_7(SEQ IDNO：122)或UGT74G1 Var_10(SEQ ID NO：165))的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累甜菊醇+6Glc(#23)。
在一些实施方案中，表达一种或多种UGT74G1变体(不限于UGT74G1 Var_7(SEQ IDNO：130)、UGT74G1 Var_8(SEQ ID NO：161)、UGT74G1 Var_9(SEQ ID NO：163)、UGT74G1Var_11(SEQ ID NO：167))的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累甜菊醇+7Glc(异构体2)。
在一些实施方案中，表达一种或多种UGT74G1变体(不限于UGT74G1 Var_1(SEQ IDNO：118)、UGT74G1 Var_2(SEQ ID NO：120)、UGT74G1 Var_5(SEQ ID NO：126)、UGT74G1Var_7(SEQ ID NO：130)或UGT74G1 Var_9(SEQ ID NO：163))的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累甜菊醇+7Glc(异构体5)。参见，表4-6和表8-10。
在一些实施方案中，增加重组宿主例如产生甜菊醇-糖苷的酿酒酵母菌株(参见WO2014/122227，其通过引用整体并入)中的甜菊醇糖苷和/或甜菊醇前体的糖苷的积累的UGT74G1变体的表达，与重组宿主中野生型UGT74G1(SEQ ID NO：4)的表达(例如，产生甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株中野生型UGT74G1的表达)相比，改变对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、对映-贝壳杉烯醇+2Glc(#8)、对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、1，2-甜菊苷、RebB、RebA、RebE、RebD、RebM、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、甜菊醇+6Glc(#23)和甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累。
在一些实施方案中，减少和/或增加重组宿主例如酿酒酵母的对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)积累的UGT74G1变体的表达，也导致对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、13-SMG、甜茶苷、1，3-甜菊苷、RebB、RebA、RebD、RebM、甜菊醇+4Glc(#26)、甜菊醇+4Glc(#33)、甜菊醇+5Glc(#24)、甜菊醇+5Glc(#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、甜菊醇+6Glc(#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2)的积累增加，但导致RebA、RebD、1，2-甜菊苷、甜菊醇+4Glc(#33)、甜菊醇+5Glc(#25)、甜菊醇+7Glc(异构体2)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主例如酿酒酵母的对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)积累的UGT74G1变体的表达，也导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、13-SMG、甜茶苷、1，3-甜菊苷、RebB、RebA、RebD、RebM、甜菊醇+4Glc(#26)、甜菊醇+4Glc(#33)、甜菊醇+5Glc(#24)、甜菊醇+5Glc(#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、甜菊醇+6Glc(#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2)的积累增加，但导致RebA、RebD、1，2-甜菊苷、甜菊醇+4Glc(#33)、甜菊醇+5Glc(#25)、甜菊醇+7Glc(异构体2)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主例如酿酒酵母的对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)积累的UGT74G1变体的表达，也导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯醇+2Glc(#8)、对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、13-SMG、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、RebB、RebA、RebD、RebE、甜菊醇+4Glc(#26)、甜菊醇+4Glc(#33)、甜菊醇+5Glc(#24)、甜菊醇+5Glc(#25)、RebM、甜菊醇+6Glc(异构体1)、甜菊醇+6Glc(#23)、甜菊醇+7Glc(异构体2)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、RebA、RebD、1，2-甜菊苷、甜菊醇+4Glc(#33)、甜菊醇+5Glc(#25)、甜菊醇+7Glc(异构体2)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的对映-贝壳杉烯醇+2Glc(#8)积累的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽(例如，UGT85C2多肽)的功能同源物和/或能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使在甜菊醇或甜菊醇糖苷其C-13羟基处糖基化的双功能多肽(例如，UGT74G1-b-UGT85C2和/或UGT85C2-b-UGT74G1嵌合酶)的功能同源物的表达，也导致对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、甜菊醇+4Glc(#26)、甜菊醇+5Glc(#24)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累增加，但导致甜菊醇+6Glc(异构体1)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)积累的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的双功能多肽(例如，UGT74G1-b-UGT85C2和/或UGT85C2-b-UGT74G1嵌合酶)的功能同源物的表达，也导致对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、13-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、1，2-甜菊苷、RebB、RebA、RebE、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、RebD、RebM、甜菊醇+6Glc(#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、1，2-甜菊苷、RebA、甜菊醇+4Glc(#26)、RebD、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、RebM和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的13-SMG积累的UGT74G1变体的表达，也导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、1，2-甜菊苷、RebB、RebE、RebA、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、RebM、RebD、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、甜菊醇+6Glc(#23)、甜菊醇+7Glc(异构体2)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、1，2-甜菊苷、RebA、甜菊醇+4Glc(#26)、甜菊醇+4Glc(#33)、RebD、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、RebM和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的甜菊醇-1，2-二糖苷积累的UGT74G1变体的表达，也导致对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、RebB、RebA、RebD、RebM、甜菊醇+4Glc(#26)、甜菊醇+4Glc(#33)、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、1，2-甜菊苷、RebA、甜菊醇+4Glc(#26)、RebD、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、RebM和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的甜菊醇-1，3-二糖苷积累的UGT74G1变体的表达，也导致对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、对映-贝壳杉烯醇+2Glc(#8)、对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜茶苷、RebB、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、甜菊醇+5Glc(#24)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、1，2-甜菊苷、RebA、甜菊醇+4Glc(#26)、RebD、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、RebM和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的甜茶苷积累的UGT74G1变体的表达，也导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、对映-贝壳杉烯醇+2Glc(#8)、对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、RebB、RebA、RebE、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、RebD、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、RebM、甜菊醇+6Glc(#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、RebA、RebD、1，2-甜菊苷、甜菊醇+4Glc(#33)甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的1，2-甜菊苷积累的UGT74G1变体的表达，也导致对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、1，3-甜菊苷、甜茶苷、RebB、RebA、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、RebD、RebM、甜菊醇+6Glc(异构体1和/或#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、甜菊醇+4Glc(#26)、甜菊醇+5Glc(#24)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的1，3-甜菊苷积累的UGT74G1变体的表达，也导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜茶苷、RebB、RebA、RebD、RebM、1，2-甜菊苷、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1和/或#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、RebD、1，2-甜菊苷、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、甜菊醇+5Glc(#24)、甜菊醇+7Glc(异构体2)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的RebB积累的UGT74G1变体的表达，也导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、1，2-甜菊苷、RebE、RebA、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、RebD、RebM、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、甜菊醇+6Glc(#23)和甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、1，2-甜菊苷、RebA、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、RebD、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5))的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的RebA积累的UGT74G1变体的表达，也导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、甜茶苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜菊醇-1，2-二糖苷、RebB、RebE、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)RebD、RebM、甜菊醇+6Glc(异构体1和/或#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、RebD、1，2-甜菊苷、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、甜菊醇+5Glc(#24)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的RebE积累的UGT74G1变体的表达，也导致对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、甜茶苷、RebB、RebA、甜菊醇+4Glc(#26)、RebM和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的甜菊醇+4Glc(#26)积累的UGT74G1变体的表达，导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、对映-贝壳杉烯醇+2Glc(#8)、对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、1，2-甜菊苷、RebB、RebA、RebE、甜菊醇+4Glc#33)、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1和/或#23)、RebM、RebD、甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、RebA、RebD、1，2-甜菊苷、甜菊醇+4Glc(#33)、甜菊醇+5Glc(#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的甜菊醇+4Glc(#33)积累的UGT74G1变体的表达，导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、RebB、RebA、甜菊醇+4Glc(#26)、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、RebD、RebM、甜菊醇+6Glc(异构体1和/或#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、1，2-甜菊苷、RebA、甜菊醇+4Glc(#26)、RebD、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、RebM和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的RebD积累的UGT74G1变体的表达，导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、甜茶苷、甜菊醇-1，2-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、RebB、RebA、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、RebM、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1和/或#23)、甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、RebA、甜菊醇+4Glc(#26)、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的甜菊醇+5Glc(#24)积累的UGT74G1变体的表达，导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、对映-贝壳杉烯醇+2Glc(#8)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、RebB、RebA、RebD、RebM、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、甜菊醇+5Glc(#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、RebA、1，2-甜菊苷、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的甜菊醇+5Glc(#25)积累的UGT74G1变体的表达，也导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜茶苷、RebB、RebA、RebD、RebM、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、甜菊醇+5Glc(#24)、甜菊醇+6Glc(异构体1和/或#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、RebD、1，2-甜菊苷、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、甜菊醇+5Glc(#24)、甜菊醇+7Glc(异构体2)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的RebM积累的UGT74G1变体的表达，导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、甜茶苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜菊醇-1，2-二糖苷、RebB、RebA、RebE、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、RebD、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)甜菊醇+6Glc(异构体1和/或#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、RebA、RebD、1，2-甜菊苷、甜菊醇+4Glc(#33)、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的甜菊醇+6Glc(异构体1)积累的UGT74G1变体的表达，导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜茶苷、1，3-甜菊苷、RebB、RebA、RebD、RebM、1，2-甜菊苷、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜茶苷、1，3-甜菊苷、RebB、RebA、RebD、RebM、1，2-甜菊苷、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的甜菊醇+6Glc(#23)积累的UGT74G1变体的表达，导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、甜茶苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、RebB、RebA、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、甜菊醇+5Glc(#25)、RebM、甜菊醇+6Glc(异构体1)、甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、RebD、1，2-甜菊苷、甜菊醇+4Glc(#33)、甜菊醇+5Glc(#24)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的甜菊醇+7Glc(异构体2)积累的UGT74G1变体的表达，导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、甜茶苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜菊醇-1，2-二糖苷、RebB、RebA、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、RebM、RebD、甜菊醇+6Glc(异构体1和/或#23)、甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、RebA、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的甜菊醇+7Glc(异构体5)积累的UGT74G1变体的表达，导致对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、对映-贝壳杉烯醇+2Glc(#8)、对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、1，2-甜菊苷、RebB、RebA、RebE、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、RebD、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、RebM、甜菊醇+6Glc(异构体1和/或#23)、甜菊醇+7Glc(异构体2)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、甜菊醇+5Glc(#24)和/或甜菊醇+6Glc(异构体1)的积累减少。
在一些实施方案中，UGT74G1 Var_10(SEQ ID NO：165)和/或UGT74G1 Var_11(SEQID NO：167)的表达导致重组宿主的对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)积累增加。在一些实施方案中，UGT74G1Var_10(SEQ ID NO：165)和/或UGT74G1 Var_11(SEQ ID NO：167)的表达导致重组宿主的对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)积累增加。
在一些实施方案中，UGT74G1 Var_1(SEQ ID NO：118)、UGT74G1 Var_2(SEQ IDNO：120)、UGT74G1 Var_4(SEQ ID NO：124)、UGT74G1 Var_5(SEQ ID NO：126)、UGT74G1Var_6(SEQ ID NO：128)、UGT74G1 Var_10(SEQ ID NO：165)和/或UGT74G1Var_11(SEQ IDNO：167)的表达导致重组宿主的对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)积累增加。
在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽(例如，UGT85C2多肽；SEQ ID NO：7)的功能同源物和/或能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的双功能多肽的功能同源物(UGT74G1-b-UGT85C2嵌合多肽；SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：144、SEQID NO：146或SEQ ID NO：148和/或UGT85C2-b-UGT74G1嵌合多肽；SEQ ID NO：132、SEQ IDNO：138、SEQ ID NO：140或SEQ ID NO：142)的表达导致重组宿主的对映-贝壳杉烯醇+2Glc(#8)积累增加。
在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的双功能多肽(UGT74G1-b-UGT85C2嵌合多肽；SEQID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：148和/或UGT85C2-b-UGT74G1嵌合多肽；SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：140或SEQ IDNO：142)的功能同源物的表达导致重组宿主的对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)积累增加。
在一些实施方案中，UGT74G1 Var_3(SEQ ID NO：122)、UGT74G1 Var_4(SEQ IDNO：124)、UGT74G1 Var_5(SEQ ID NO：126)、UGT74G1 Var_6(SEQ ID NO：128)、UGT74G1Var_7(SEQ ID NO：130)、UGT74G1 Var_8(SEQ ID NO：161)、UGT74G1 Var_9(SEQ ID NO：163)、UGT74G1 Var_10(SEQ ID NO：165)和/或UGT74G1 Var_11(SEQ ID NO：167)的表达导致重组宿主的13-SMG积累增加。
在一些实施方案中，UGT74G1 Var_3(SEQ ID NO：122)和/或UGT74G1 Var_9(SEQID NO：163)的表达导致重组宿主的甜菊醇-1，2-二糖苷积累增加。
在一些实施方案中，UGT74G1 Var_1(SEQ ID NO：118)和/或UGT74G1 Var_3(SEQID NO：122)的表达导致重组宿主的甜菊醇-1，3-二糖苷积累增加。在一些实施方案中，UGT74G1 Var_1(SEQ ID NO：118)、UGT74G1 Var_2(SEQ ID NO：120)、UGT74G1 Var_4(SEQID NO：124)、UGT74G1 Var_5(SEQ ID NO：126)、UGT74G1Var_6(SEQ ID NO：128)、UGT74G1Var_7(SEQ ID NO：130)、UGT74G1 Var_8(SEQ ID NO：161)、UGT74G1 Var_9(SEQ ID NO：163)、UGT74G1 Var_10(SEQ ID NO：165)和/或UGT74G1 Var_11(SEQ ID NO：167)的表达导致重组宿主的甜茶苷积累增加。在一些实施方案中，UGT74G1 Var_6(SEQ ID NO：128)、UGT74G1 Var_7(SEQ ID NO：130)、UGT74G1 Var_8(SEQ ID NO：161)和/或UGT74G1 Var_9(SEQ ID NO：163)的表达导致重组宿主的1，2-甜菊苷积累增加。
在一些实施方案中，UGT74G1 Var_3(SEQ ID NO：122)、UGT74G1 Var_4(SEQ IDNO：124)、UGT74G1 Var_5(SEQ ID NO：126)、UGT74G1 Var_6(SEQ ID NO：128)、UGT74G1Var_7(SEQ ID NO：130)、UGT74G1 Var_8(SEQ ID NO：161)、UGT74G1 Var_9(SEQ ID NO：163)、UGT74G1 Var_10(SEQ ID NO：165)和/或UGT74G1 Var_11(SEQ ID NO：167)的表达导致重组宿主的RebB积累增加。
在一些实施方案中，UGT74G1 Var_4(SEQ ID NO：124)、UGT74G1 Var_6(SEQ IDNO：128)、UGT74G1 Var_7(SEQ ID NO：130)、UGT74G1 Var_8(SEQ ID NO：161)、UGT74G1Var_9(SEQ ID NO：163)和/或UGT74G1 Var_10(SEQ ID NO：165)的表达导致重组宿主的RebA积累增加。
在一些实施方案中，UGT74G1 Var_4(SEQ ID NO：124)的表达导致重组宿主的RebE积累增加。在一些实施方案中，UGT74G1Var_1(SEQ ID NO：118)、UGT74G1 Var_2(SEQ IDNO：120)、UGT74G1 Var_4(SEQ ID NO：124)、UGT74G1 Var_5(SEQ ID NO：126)、UGT74G1Var_6(SEQ ID NO：128)、UGT74G1 Var_9(SEQ ID NO：163)、UGT74G1 Var_10(SEQ ID NO：165)和/或UGT74G1Var_11(SEQ ID NO：167)的表达导致重组宿主的甜菊醇+4Glc(#26)积累增加。在一些实施方案中，UGT74G1 Var_3(SEQ ID NO：122)、UGT74G1 Var_7(SEQ ID NO：130)、UGT74G1 Var_8(SEQ ID NO：161)、UGT74G1 Var_9(SEQ ID NO：163)和/或UGT74G1Var_11(SEQ ID NO：167)的表达导致重组宿主的甜菊醇+4Glc(#33)积累增加。
在一些实施方案中，UGT74G1 Var_7(SEQ ID NO：130)、UGT74G1 Var_8(SEQ IDNO：161)、UGT74G1 Var_9(SEQ ID NO：163)和/或UGT74G1 Var_11(SEQ ID NO：167)的表达导致重组宿主的RebD积累增加。
在一些实施方案中，UGT74G1 Var_1(SEQ ID NO：118)、UGT74G1 Var_9(SEQ IDNO：163)和/或UGT74G1 Var_11(SEQ ID NO：167)的表达导致重组宿主的甜菊醇+5Glc(#24)积累增加。
在一些实施方案中，UGT74G1 Var_8(SEQ ID NO：161)、UGT74G1 Var_9(SEQ IDNO：163)和/或UGT74G1 Var_10(SEQ ID NO：165)的表达导致重组宿主的甜菊醇+5Glc(#25)积累增加。在一些实施方案中，UGT74G1 Var_2(SEQ ID NO：120)、UGT74G1Var_4(SEQ IDNO：124)、UGT74G1 Var_6(SEQ ID NO：128)、UGT74G1 Var_7(SEQ ID NO：130)、UGT74G1Var_8(SEQ ID NO：161)、UGT74G1 Var_9(SEQ ID NO：163)、UGT74G1 Var_10(SEQ ID NO：165)和/或UGT74G1 Var_11(SEQ ID NO：167)的表达导致重组宿主的RebM积累增加。
在一些实施方案中，UGT74G1 Var_8(SEQ ID NO：161)、UGT74G1 Var_9(SEQ IDNO：163)、UGT74G1 Var_10(SEQ ID NO：165)、UGT74G1 Var_11(SEQ ID NO：167)和/或UGT74G1 Var_12(SEQ ID NO：169)的表达导致重组宿主的甜菊醇+6Glc(异构体1)积累增加。
在一些实施方案中，UGT74G1 Var_7(SEQ ID NO：130)和/或UGT74G1 Var_10(SEQID NO：165)的表达导致重组宿主的甜菊醇-+6Glc(#23)积累增加。在一些实施方案中，UGT74G1 Var_7(SEQ ID NO：130)、UGT74G1 Var_8(SEQ ID NO：161)、UGT74G1 Var_9(SEQID NO：163)和/或UGT74G1 Var_11(SEQ ID NO：167)的表达导致重组宿主的甜菊醇+7Glc(异构体2)积累增加。
在一些实施方案中，UGT74G1 Var_1(SEQ ID NO：118)、UGT74G1 Var_2(SEQ IDNO：120)、UGT74G1 Var_5(SEQ ID NO：126)、UGT74G1 Var_7(SEQ ID NO：130)和/或UGT74G1Var_9(SEQ ID NO：163)的表达导致重组宿主的甜菊醇+7Glc(异构体5)积累增加。
在一些实施方案中，UGT74G1 Var_3(SEQ ID NO：122)、UGT74G1 Var_4(SEQ IDNO：124)、UT74G1 Var_7(SEQ ID NO：130)、UGT74G1 Var_8(SEQ ID NO：161)、UGT74G1 Var_9(SEQ ID NO：163)和/或UGT74G1 Var_12(SEQ ID NO：169)的表达导致重组宿主的对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)积累减少。
在一些实施方案中，UGT74G1 Var_3(SEQ ID NO：122)、UGT74G1 Var_7(SEQ IDNO：130)、UGT74G1 Var_8(SEQ ID NO：161)、UGT74G1 Var_9(SEQ ID NO：163)和/或UGT74G1Var_12(SEQ ID NO：169)的表达导致重组宿主的对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)积累减少。
在一些实施方案中，UGT74G1 Var_3(SEQ ID NO：122)、UGT74G1 Var_7(SEQ IDNO：130)、UGT74G1 Var_8(SEQ ID NO：161)、UGT74G1 Var_9(SEQ ID NO：163)和/或UGT74G1Var_12(SEQ ID NO：169)的表达导致重组宿主的对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)积累减少。
在一些实施方案中，UGT74G1 Var_12(SEQ ID NO：169)的表达导致重组宿主的13-SMG积累减少。在一些实施方案中，UGT74G1Var_3(SEQ ID NO：122)、UGT74G1 Var_7(SEQ IDNO：130)、UGT74G1 Var_8(SEQ ID NO：161)、UGT74G1 Var_9(SEQ ID NO：163)和/或UGT74G1Var_12(SEQ ID NO：169)的表达导致重组宿主的19-SMG积累减少。
在一些实施方案中，UGT74G1 Var_3(SEQ ID NO：122)、UGT74G1 Var_10(SEQ IDNO：165)、UGT74G1 Var_11(SEQ ID NO：167)和/或UGT74G1 Var_12(SEQ ID NO：169)的表达导致重组宿主的1，2-甜菊苷积累减少。
在一些实施方案中，UGT74G1 Var_12(SEQ ID NO：169)的表达导致重组宿主的1，3-甜菊苷积累减少。在一些实施方案中，UGT74G1 Var_12(SEQ ID NO：169)的表达导致重组宿主的甜菊醇-1，2-糖苷积累减少。
在一些实施方案中，UGT74G1 Var_12(SEQ ID NO：169)的表达导致重组宿主的甜茶苷积累减少。在一些实施方案中，UGT74G1Var_3(SEQ ID NO：122)和/或UGT74G1 Var_12(SEQ ID NO：169)的表达导致重组宿主的RebA积累减少。
在一些实施方案中，UGT74G1 Var_12(SEQ ID NO：169)的表达导致重组宿主的RebB积累减少。在一些实施方案中，UGT74G1Var_3(SEQ ID NO：122)、UGT74G1 Var_8(SEQID NO：161)和/或UGT74G1 Var_12(SEQ ID NO：169)的表达导致重组宿主的甜菊醇+4Glc(#26)积累减少。
在一些实施方案中，UGT74G1 Var_10(SEQ ID NO：165)和/或UGT74G1 Var_12(SEQID NO：169)的表达导致重组宿主的甜菊醇+4Glc(#33)积累减少。
在一些实施方案中，UGT74G1 Var_3(SEQ ID NO：122)、UGT74G1 Var_10(SEQ IDNO：165)和/或UGT74G1 Var_12(SEQ ID NO：169)的表达导致重组宿主的RebD积累减少。
在一些实施方案中，UGT74G1 Var_3(SEQ ID NO：122)、UGT74G1 Var_7(SEQ IDNO：130)、UGT74G1 Var_8(SEQ ID NO：161)和/或UGT74G1 Var_12(SEQ ID NO：169)的表达导致重组宿主的甜菊醇+5Glc(#24)积累减少。
在一些实施方案中，UGT74G1 Var_3(SEQ ID NO：122)、UGT74G1 Var_11(SEQ IDNO：167)和/或UGT74G1 Var_12(SEQ ID NO：169)的表达导致重组宿主的甜菊醇+5Glc(#25)积累减少。
在一些实施方案中，UGT74G1 Var_1(SEQ ID NO：118)和/或UGT74G1 Var_3(SEQID NO：122)的表达导致重组宿主的甜菊醇+6Glc(异构体1)积累减少。
在一些实施方案中，UGT74G1 Var_3(SEQ ID NO：122)和/或UGT74G1 Var_12(SEQID NO：169)的表达导致重组宿主的RebM积累减少。
在一些实施方案中，UGT74G1 Var_3(SEQ ID NO：122)、UGT74G1 Var_10(SEQ IDNO：165)和/或UGT74G1 Var_12(SEQ ID NO：169)的表达导致重组宿主的甜菊醇+7Glc(异构体2)积累减少。
在一些实施方案中，UGT74G1 Var_3(SEQ ID NO：122)、UGT74G1 Var_4(SEQ IDNO：124)、UGT74G1 Var_7(SEQ ID NO：130)、UGT74G1 Var_11(SEQ ID NO：167)和/或UGT74G1 Var_12(SEQ ID NO：169)的表达导致重组宿主的甜菊醇+7Glc(异构体5)积累增加。
在一些实施方案中，双功能多肽能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的双功能多肽，包含通过接头连接的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽(例如，UGT74G1多肽)和能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽(例如，UGT85C2多肽)(即，嵌合酶或融合多肽)。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽能够使甜菊醇前体糖(例如，对映-贝壳杉烯酸)在其C-19羧基处糖基化和/或使对映-贝壳杉烯醇在其C-19羟基处糖基化。
在一些实施方案中，通过接头将能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的C-末端与能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽的N-末端连接，以提供双功能多肽。在一些实施方案中，通过接头将能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽的C-末端与能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的N-末端连接，以提供双功能多肽。在一些实施方案中，接头可以是氨基酸序列“KLVK”。在一些实施方案中，接头可以是氨基酸序列“EGKSSGSGSESKST”(SEQ ID NO：151)。在一些实施方案中，接头是氨基酸序列“RASSTKLVK”(SEQ ID NO：150)。在一些实施方案中，接头是氨基酸序列“GGGGS”。在一些实施方案中，接头是两个重复的氨基酸序列“GGGGS”(即，“GGGGSGGGGS”)。在一些实施方案中，接头是3个重复的氨基酸序列“GGGGS”。在一些实施方案中，接头是直接键(即，在第一多肽的C末端和第二多肽的N末端之间)。
在一些实施方案中，能够在体外、在重组宿主中(即，体内)或通过全细胞生物转化使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处和在其C-19羧基处糖基化的多肽，包括包含通过接头(“b”)连接至UGT85C2(SEQ ID NO：7)的功能同源物的UGT74G1(SEQ ID NO：4)的功能同源物的双功能多肽(即，UGT74G1-b-UGT85C2或UGT85C2-b-UGT74G1)。
在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的双功能多肽(例如，UGT74G1-b-UGT85C2或UGT85C2-b-UGT74G1)还包含标签，例如，具有SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：154或SEQ ID NO：155所示的氨基酸序列的标签。
在一些实施方案中，适合用于在重组宿主中产生(即，能够合成)甜菊醇糖苷和/或甜菊醇前体的糖苷，诸如13-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜茶苷、RebB、RebA、RebE、RebD、RebM、19-SMG、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜菊醇+4GLc(#26和/或#33)、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1和/或#23)、甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)、对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)和/或对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)的多肽包括UGT74G1-b-UT85C2嵌合酶，诸如Chim_2(SEQ ID NO：134)、Chim_3(SEQ ID NO：136)、Chim_7(SEQ ID NO：144)、Chim_8(SEQ ID NO：146)或Chim_9(SEQ ID NO：148)。
在一些实施方案中，表达Chim_2(SEQ ID NO：134)的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累对映-贝壳烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)和/或13-SMG。在一些实施方案中，表达Chim_3(SEQ ID NO：136)的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累13-SMG、RebB和/或甜菊醇+4Glc(#33)。在一些实施方案中，表达Chim_7(SEQ ID NO：144)的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累对映-贝壳烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体-2)、13-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、RebB和/或甜菊醇+4Glc(#33)。在一些实施方案中，表达Chim_8(SEQ ID NO：146)的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累13-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、RebB和/或甜菊醇+4Glc(#33)。在一些实施方案中，表达Chim_9(SEQ ID NO：148)的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和2)、19-SMG、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、1，2-甜菊苷、RebB、甜菊醇+4Glc(#26)和/或甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)。参见，表8-10。
在一些实施方案中，适合用于在重组宿主中产生(即，能够合成)甜菊醇糖苷和/或甜菊醇前体的糖苷，诸如对映-贝壳杉烯醇+3Glc(#33)、13-SMG、甜茶苷、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、RebB、Reb A、RebE、甜菊醇+4Glc(#33)RebD、RebM、甜菊醇+6Glc(#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2)的多肽包括UGT85C2-b-UT74G1嵌合酶，诸如Chim_1(SEQ ID NO：132)、Chim_4(SEQ ID NO：138)、Chim_5(SEQ ID NO：140)或Chim_6(SEQID NO：142)。
在一些实施方案中，表达Chim_1(SEQ ID NO：132)的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、甜茶苷和/或RebB。在一些实施方案中，表达Chim_4(SEQ ID NO：138)的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累13-SMG、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、RebB、RebA、RebE、甜菊醇+4Glc(#33)、RebD、RebM、甜菊醇+6Glc(#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2)。在一些实施方案中，表达Chim_5(SEQ ID NO：140)的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、甜茶苷、RebB、RebE和/或甜菊醇+4Glc(#33)。在一些实施方案中，表达Chim_6(SEQ ID NO：142)的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷和/或甜菊醇+4Glc(#33)。参见，表8-10。
在一些实施方案中，双功能多肽(例如，UGT74G1-b-UGT85C2和/或UGT85C2-b-UGT74G1嵌合酶)的表达能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化，这增加了重组宿主的对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)积累，导致13-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、1，2-甜菊苷、RebB、RebA、RebE、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、RebA、甜菊醇+4Glc(#26)、RebD、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、RebM和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，双功能多肽(例如，UGT74G1-b-UGT85C2和/或UGT85C2-b-UGT74G1嵌合酶)的表达能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化，这增加了重组宿主的13-SMG积累，导致对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、1，2-甜菊苷、RebB、RebE、甜菊醇+4Glc(#33)、RebD、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、RebM、甜菊醇+6Glc(#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、1，2-甜菊苷、RebA、甜菊醇+4Glc(#26)、RebD、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、RebM和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，双功能多肽(例如，UGT74G1-b-UGT85C2和/或UGT85C2-b-UGT74G1嵌合酶)的表达能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化，这增加了重组宿主的19-SMG积累，导致对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、1，2-甜菊苷、RebB、甜菊醇+4Glc(#26)和/或甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、RebD、甜菊醇+6Glc(异构体1)、RebM和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，双功能多肽(例如，UGT74G1-b-UGT85C2和/或UGT85C2-b-UGT74G1嵌合酶)的表达能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化，这增加了重组宿主的甜菊醇-1，2-二糖苷积累，导致对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、甜菊醇-1，3-二糖苷、RebB和/或甜菊醇+4Glc(#33)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、1，2-甜菊苷、RebA、RebD、甜菊醇+5Glc(#24)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、RebM和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，双功能多肽(例如，UGT74G1-b-UGT85C2和/或UGT85C2-b-UGT74G1嵌合酶)的表达能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化，这增加了重组宿主的甜菊醇-1，3-二糖苷积累，导致对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜茶苷、1，2-甜菊苷、RebB、RebA、RebE、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、RebD、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、RebM、甜菊醇+6Glc(#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、1，2-甜菊苷、RebA、RebD、甜菊醇+5Glc(#24)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、RebM和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，双功能多肽(例如，UGT74G1-b-UGT85C2和/或UGT85C2-b-UGT74G1嵌合酶)的表达能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化，这增加了重组宿主的甜茶苷积累，导致对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、19-SMG、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、RebB、RebA、RebE、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、RebD、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、RebM、甜菊醇+6Glc(#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、RebD、甜菊醇+6Glc(异构体1)、RebM和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，双功能多肽(例如，UGT74G1-b-UGT85C2和/或UGT85C2-b-UGT74G1嵌合酶)的表达能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化，这增加了重组宿主的1，2-甜菊苷积累，导致对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、RebB、甜菊醇+4Glc(#26)和/或甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、RebD、甜菊醇+6Glc(异构体1)、RebM和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，双功能多肽(例如，UGT74G1-b-UGT85C2和/或UGT85C2-b-UGT74G1嵌合酶)的表达能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化，这增加了重组宿主的RebB积累，导致对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、1，2-甜菊苷、RebA、RebE、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、RebD、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、RebM、甜菊醇+6Glc(#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、1，2-甜菊苷、RebA、甜菊醇+4Glc(#26)、RebD、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、RebM和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，双功能多肽(例如，UGT74G1-b-UGT85C2和/或UGT85C2-b-UGT74G1嵌合酶)的表达能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化，这增加了重组宿主的RebA积累，导致13-SMG、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、RebB、RebE、甜菊醇+4Glc(#33)、RebD、RebM、甜菊醇+6Glc(#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，双功能多肽(例如，UGT74G1-b-UGT85C2和/或UGT85C2-b-UGT74G1嵌合酶)的表达能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化，这增加了重组宿主的RebE积累，导致对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、RebB、RebA、甜菊醇+4Glc(#33)、RebD、RebM、甜菊醇+6Glc(#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，双功能多肽(例如，UGT74G1-b-UGT85C2和/或UGT85C2-b-UGT74G1嵌合酶)的表达能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化，这增加了重组宿主的甜菊醇+4Glc(#26)积累，导致对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、1，2-甜菊苷、RebB和/或甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、RebD、甜菊醇+6Glc(异构体1)、RebM和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，双功能多肽(例如，UGT74G1-b-UGT85C2和/或UGT85C2-b-UGT74G1嵌合酶)的表达能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化，这增加了重组宿主的甜菊醇+4Glc(#33)积累，导致对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、RebB、RebA、RebE、RebD、RebM、甜菊醇+6Glc(#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2)的积累增加，但导致贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、1，2-甜菊苷、RebA、甜菊醇+4Glc(#26)、RebD、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、RebM和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，双功能多肽(例如，UGT74G1-b-UGT85C2和/或UGT85C2-b-UGT74G1嵌合酶)的表达能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化，这增加了重组宿主的RebD积累，导致13-SMG、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、RebB、RebA、RebE、甜菊醇+4Glc(#33)、RebM、甜菊醇+6Glc(#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，双功能多肽(例如，UGT74G1-b-UGT85C2和/或UGT85C2-b-UGT74G1嵌合酶)的表达能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化，这增加了重组宿主的甜菊醇+4Glc(#24和/或#25)积累，导致对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、1，2-甜菊苷、RebB和/或甜菊醇+5Glc(#26)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)，对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、RebD、甜菊醇+6Glc(异构体1)、RebM和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，双功能多肽(例如，UGT74G1-b-UGT85C2和/或UGT85C2-b-UGT74G1嵌合酶)的表达能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化，这增加了重组宿主的RebM积累，导致13-SMG、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、RebB、RebA、RebE、甜菊醇+4Glc(#33)、RebD、甜菊醇+6Glc(#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，双功能多肽(例如，UGT74G1-b-UGT85C2和/或UGT85C2-b-UGT74G1嵌合酶)的表达能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化，这增加了重组宿主的甜菊醇+6Glc(#23)积累，导致13-SMG、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、RebB、RebA、RebE、甜菊醇+4Glc(#33)、RebD、RebM和/或甜菊醇+7Glc(异构体2)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，双功能多肽(例如，UGT74G1-b-UGT85C2和/或UGT85C2-b-UGT74G1嵌合酶)的表达能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化，这增加了重组宿主的甜菊醇+7Glc(异构体2)积累，导致13-SMG、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、RebB、RebA、RebE、甜菊醇+4Glc(#33)、RebD、RebM和/或甜菊醇+6Glc(#23)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，Chim_1(SEQ ID NO：132)、Chim_2(SEQ ID NO：134)、Chim_5(SEQ ID NO：140)、Chim_6(SEQ ID NO：142)、Chim_7(SEQ ID NO：144)和/或Chim_9(SEQ IDNO：148)的表达导致重组宿主的对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)积累减少。在一些实施方案中，UGT74G1 Chim_1(SEQ ID NO：132)、UGT74G1 Chim_2(SEQ ID NO：134)、UGT74G1 Chim_3(SEQ ID NO：136)、UGT74G1 Chim_4(SEQ ID NO：138)、UGT74G1 Chim_5(SEQ ID NO：140)、UGT74G1 Chim_6(SEQ ID NO：142)、UGT74G1Chim_7(SEQ ID NO：144)和/或UGT74G1 Chim_8(SEQ ID NO：146)的表达导致重组宿主的13-SMG积累增加。在一些实施方案中，UGT74G1 Chim_9(SEQ ID NO：148)的表达导致重组宿主的19-SMG积累增加。在一些实施方案中，UGT74G1 Chim_7(SEQ ID NO：144)和/或UGT74G1 Chim_8(SEQ ID NO：146)的表达导致重组宿主的甜菊醇-1，2-二糖苷积累增加。在一些实施方案中，Chim_4(SEQ IDNO：138)、Chim_6(SEQ ID NO：142)、Chim_7(SEQ ID NO：144)、Chim_8(SEQ ID NO：146)和/或Chim_9(SEQ ID NO：148)的表达导致重组宿主的甜菊醇-1，3-二糖苷积累增加。在一些实施方案中，Chim_1(SEQ ID NO：132)、Chim_4(SEQ ID NO：138)、Chim_5(SEQ ID NO：140)、Chim_6(SEQ ID NO：142)和/或Chim_9(SEQ ID NO：148)的表达导致重组宿主的甜茶苷积累增加。在一些实施方案中，UGT74G1 Chim_9(SEQ ID NO：148)的表达导致重组宿主的1，2-甜菊苷积累增加。在一些实施方案中，Chim_1(SEQ ID NO：132)、Chim_3(SEQ ID NO：136)、Chim_4(SEQ ID NO：138)、Chim_5(SEQ ID NO：140)、Chim_7(SEQ ID NO：144)、Chim_8(SEQID NO：146)和/或Chim_9(SEQ ID NO：148)的表达导致重组宿主的RebB积累增加。在一些实施方案中，UGT74G1 Chim_4(SEQ ID NO：138)的表达导致重组宿主的RebA积累增加。在一些实施方案中，UGT74G1 Chim_4(SEQ ID NO：138)和/或_12UGT74G1 Chim_5(SEQ ID NO：140)的表达导致重组宿主的RebE积累增加。在一些实施方案中，UGT74G1 Chim_9(SEQ ID NO：148)的表达导致重组宿主的甜菊醇+4Glc(#26)积累增加。在一些实施方案中，Chim_1(SEQID NO：132)、Chim_3(SEQ ID NO：136)、Chim_4(SEQ ID NO：138)、Chim_5(SEQ ID NO：140)、Chim_6(SEQ ID NO：142)、Chim_7(SEQ ID NO：144)和/或Chim_8(SEQ ID NO：146)的表达导致重组宿主的RebD积累增加。在一些实施方案中，UGT74G1 Chim_4(SEQ ID NO：138)的表达导致重组宿主的甜菊醇+5Glc(#24)积累增加。在一些实施方案中，UGT74G1 Chim_9(SEQ IDNO：148)的表达导致重组宿主的甜菊醇+5Glc(#24)积累增加。在一些实施方案中，UGT74G1Chim_9(SEQ ID NO：148)的表达导致重组宿主的甜菊醇+5Glc(#25)积累增加。在一些实施方案中，UGT74G1 Chim_4(SEQ ID NO：138)的表达导致重组宿主的RebM积累增加。在一些实施方案中，UGT74G1 Chim_4(SEQ ID NO：138)的表达导致重组宿主的甜菊醇+6Glc(#23)积累增加。在一些实施方案中，UGT74G1 Chim_4(SEQ ID NO：138)的表达导致重组宿主的甜菊醇+7Glc(异构体2)积累增加。
在一些实施方案中，Chim_1(SEQ ID NO：132)、Chim_2(SEQ ID NO：134)、Chim_3(SEQ ID NO：136)、Chim_4(SEQ ID NO：138)、Chim_5(SEQ ID NO：140)、Chim_6(SEQ ID NO：142)、Chim_7(SEQ ID NO：144)、Chim_8(SEQ ID NO：146)和/或Chim_9(SEQ ID NO：148)的表达导致重组宿主的对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)积累减少。在一些实施方案中，Chim_1(SEQ ID NO：132)、Chim_2(SEQ ID NO：134)、Chim_3(SEQ ID NO：136)、Chim_4(SEQ ID NO：138)、Chim_5(SEQ ID NO：140)、Chim_6(SEQ ID NO：142)、Chim_7(SEQ ID NO：144)、Chim_8(SEQ ID NO：146)和/或Chim_9(SEQ ID NO：148)的表达导致重组宿主的对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)积累减少。在一些实施方案中，Chim_1(SEQ ID NO：132)、Chim_2(SEQ IDNO：134)、Chim_3(SEQ ID NO：136)、Chim_4(SEQ ID NO：138)、Chim_5(SEQ ID NO：140)、Chim_6(SEQ ID NO：142)、Chim_7(SEQ ID NO：144)和/或Chim_8(SEQ ID NO：146)的表达导致重组宿主的对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)积累减少。在一些实施方案中，Chim_1(SEQID NO：132)、Chim_2(SEQ ID NO：134)、Chim_3(SEQ ID NO：136、Chim_4(SEQ ID NO：138)、Chim_5(SEQ ID NO：140)、Chim_6(SEQ ID NO：142)、Chim_7(SEQ ID NO：144)和/或Chim_8(SEQ ID NO：146)的表达导致重组宿主的19-SMG积累减少。在一些实施方案中，Chim_3(SEQID NO：136)和/或Chim_8(SEQ ID NO：146)的表达导致重组宿主的1，2-甜菊苷积累减少。在一些实施方案中，Chim_2(SEQ ID NO：134)、Chim_3(SEQ ID NO：136)、Chim_7(SEQ ID NO：144)和/或Chim_8(SEQ ID NO：146)的表达导致重组宿主的RebA积累减少。在一些实施方案中，Chim_2(SEQ ID NO：134)和/或Chim_3(SEQ ID NO：136)的表达导致重组宿主的甜菊醇+4Glc(#26)积累减少。在一些实施方案中，Chim_2(SEQ ID NO：134)、Chim_3(SEQ ID NO：136)、Chim_7(SEQ ID NO：144)、Chim_8(SEQ ID NO：146)和/或Chim_9(SEQ ID NO：148)的表达导致重组宿主的RebD积累减少。在一些实施方案中，Chim_5(SEQ ID NO：132)、Chim_2(SEQ ID NO：134)、Chim_3(SEQ ID NO：136)、Chim_7(SEQ ID NO：144)和/或Chim_8(SEQ IDNO：146)的表达导致重组宿主的甜菊醇+5Glc(异构体24)积累减少。在一些实施方案中，Chim_2(SEQ ID NO：134)和/或Chim_3(SEQ ID NO：136)的表达导致重组宿主的甜菊醇+5Glc(#25)积累减少。在一些实施方案中，Chim_3(SEQ ID NO：136)、Chim_7(SEQ ID NO：144)、Chim_8(SEQ ID NO：146)和/或Chim_9(SEQ ID NO：148)的表达导致重组宿主的甜菊醇+6Glc(异构体1)积累减少。在一些实施方案中，Chim_2(SEQ ID NO：134)、Chim_3(SEQ IDNO：136)、Chim_7(SEQ ID NO：144)和/或Chim_9(SEQ ID NO：148)的表达导致重组宿主的RebM积累减少。在一些实施方案中，Chim_3(SEQ ID NO：136)和/或Chim_9(SEQ ID NO：148)的表达导致重组宿主的甜菊醇+7Glc(异构体2)积累减少。在一些实施方案中，Chim_1(SEQID NO：132)、Chim_2(SEQ ID NO：134)、Chim_3(SEQ ID NO：136)、Chim_4(SEQ ID NO：138)、Chim_5(SEQ ID NO：140)、Chim_6(SEQ ID NO：142)、Chim_7(SEQ ID NO：144)、Chim_8(SEQID NO：146)和/或Chim_9(SEQ ID NO：148)的表达导致重组宿主的甜菊醇+7Glc(异构体5)积累减少。
在一些实施方案中，能够在体外、在重组宿主中(即，体内)或通过全细胞生物转化使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽包括包含通过接头连接的UGT74G1(SEQ ID NO：4)的功能同源物和标签(例如，具有SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：153、SEQ IDNO：154或SEQ ID NO：155所示的氨基酸序列的标签)的多肽(即，嵌合酶或融合多肽；即，标记的多肽)。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽能够使甜菊醇前体糖(例如，对映-贝壳杉烯酸)在其C-19羧基处糖基化和/或使对映-贝壳杉烯醇在其C-19羟基处糖基化。在一些实施方案中，通过接头将能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的N-末端与标签的C末端连接以提供标记的多肽。在一些实施方案中，接头可以是氨基酸序列“EGKSSGSGSESKST”(SEQ ID NO：151)。在一些实施方案中，接头可以是氨基酸序列“KLVK”。在一些实施方案中，接头是氨基酸序列“RASSTKLVK”(SEQ ID NO：150)。在一些实施方案中，接头是氨基酸序列“GGGGS”。在一些实施方案中，接头可以是两个重复的氨基酸序列“GGGGS”(即，“GGGGSGGGGS”)。在一些实施方案中，接头是3个重复的氨基酸序列“GGGGS”。在一些实施方案中，接头是直接键(即，在第一多肽的C末端和标签的N末端之间)。
在一些实施方案中，能够在体外、在重组宿主中(即，体内)或通过全细胞生物转化使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽包括包含通过接头(例如，具有SEQ ID NO：151所示的氨基酸序列的接头)连接至标签(例如，具有SEQ ID NO：152、SEQID NO：153、SEQ ID NO：154或SEQ ID NO：155所示的氨基酸序列的标签)的UGT74G1(SEQ IDNO：4)的功能同源物的多肽。
在一些实施方案中，适合用于产生(即，能够合成)甜菊醇糖苷和/或甜菊醇前体的糖苷，诸如13-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、RebB、RebA、RebD、RebM、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1和/或#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的多肽包括标记的多肽，诸如Chim_10(SEQ ID NO：174)、Chim_11(SEQ ID NO：176)、Chim_12(SEQ ID NO：178)或Chim_13(SEQ ID NO：180)。
在一些实施方案中，表达Chim_10(SEQ ID NO：174)的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累13-SMG、RebD、RebM、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1和/或#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)。在一些实施方案中，表达Chim_11(SEQ ID NO：176)的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累13-SMG、RebA、RebD、RebM、1，2-甜菊苷、甜菊醇+5Glc(#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1和/或#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2)。在一些实施方案中，表达Chim_12(SEQ ID NO：178)的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累13-SMG、RebA、RebD、RebM、1，2-甜菊苷、甜菊醇+5Glc(#24和#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1和/或#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2)。在一些实施方案中，表达Chim_13(SEQ ID NO：180)的重组宿主在体内和/或通过全细胞生物转化积累13-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、RebB、RebA、RebD、RebM、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、甜菊醇+5Glc(#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1和/或#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2)。
在一些实施方案中，增加重组宿主的13-SMG积累的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽(例如，标记的UGT74G1多肽)的表达导致甜菊醇-1，2-二糖苷、RebB、RebA、RebD、RebM、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1和/或#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜茶苷、RebB、RebA、RebE、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、甜菊醇+5Glc(#24)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的甜菊醇-1，2-二糖苷积累的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽(例如，标记的UGT74G1多肽)的表达导致13-SMG、RebB、RebA、RebD、RebM、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、甜菊醇+5Glc(#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1和/或#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、甜茶苷、RebE、1，3-甜菊苷、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、甜菊醇+5Glc(#24)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的RebB积累的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽(例如，标记的UGT74G1多肽)的表达导致13-SMG、RebA、RebD、RebM、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、甜菊醇+5Glc(#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1和/或#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、甜茶苷、RebE、1，3-甜菊苷、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、甜菊醇+5Glc(#24)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的RebA积累的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽(例如，标记的UGT74G1多肽)的表达导致13-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、RebB、RebD、RebM、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1和/或#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜茶苷、RebB、RebE、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，3-甜菊苷、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、甜菊醇+5Glc(#24)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的RebD积累的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽(例如，标记的UGT74G1多肽)的表达导致13-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、RebB、RebA、RebM、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1和/或#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜茶苷、RebB、RebA、RebE、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、甜菊醇+5Glc(#24)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的RebM积累的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽(例如，标记的UGT74G1多肽)的表达导致13-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、RebB、RebA、RebD、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1和/或#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜茶苷、RebB、RebA、RebE、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、甜菊醇+5Glc(#24)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的甜菊醇-1，3-二糖苷积累的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽(例如，标记的UGT74G1多肽)的表达导致13-SMG、RebB、RebA、RebD、RebM、甜菊醇-1，2-二糖苷、1，2-甜菊苷、甜菊醇+5Glc(#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1和/或#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、甜茶苷、RebE、1，3-甜菊苷、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、甜菊醇+5Glc(#24)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的1，2-甜菊苷积累的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽(例如，标记的UGT74G1多肽)的表达导致13-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、RebA、RebB、RebD、RebM、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1和/或#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜茶苷、RebB、RebE、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，3-甜菊苷、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、甜菊醇+5Glc(#24)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的甜菊醇+5Glc(#24)积累的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽(例如，标记的UGT74G1多肽)的表达导致13-SMG、RebA、RebD、RebM、1，2-甜菊苷、甜菊醇+5Glc(#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1和/或#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜茶苷、RebB、RebA、RebE、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的甜菊醇+5Glc(#25)积累的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽(例如，标记的UGT74G1多肽)的表达导致13-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、RebB、RebA、RebD、RebM、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、甜菊醇+5Glc(#24)、甜菊醇+6Glc(异构体1和/或#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜茶苷、RebB、RebA、RebE、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、甜菊醇+5Glc(#24)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的甜菊醇+6Glc(异构体1)积累的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽(例如，标记的UGT74G1多肽)的表达导致13-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、RebB、RebA、RebD、RebM、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜茶苷、RebB、RebA、RebE、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、甜菊醇+5Glc(#24)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的甜菊醇+6Glc(#23)积累的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽(例如，标记的UGT74G1多肽)的表达导致13-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、RebB、RebA、RebD、RebM、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2和/或异构体5)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜茶苷、RebB、RebA、RebE、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、甜菊醇+5Glc(#24)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的甜菊醇+7Glc(异构体2)积累的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽(例如，标记的UGT74G1多肽)的表达导致13-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、RebB、RebA、RebD、RebM、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1和/或#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜茶苷、RebB、RebA、RebE、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)、甜菊醇+5Glc(#24)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的积累减少。
在一些实施方案中，增加重组宿主的甜菊醇+7Glc(异构体5)积累的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽(例如，标记的UGT74G1多肽)的表达导致13-SMG、RebD、RebM、甜菊醇+5Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1和/或#23)和/或甜菊醇+7Glc(异构体2)的积累增加，但导致对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1和/或异构体2)、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜茶苷、RebB、RebA、RebE、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷和/或甜菊醇+4Glc(#26和/或#33)的积累减少。
在一些实施方案中，Chim_10(SEQ ID NO：174)、Chim_11(SEQ ID NO：176)、Chim_12(SEQ ID NO：178)和/或Chim_13(SEQ ID NO：180)的表达导致重组宿主的13-SMG积累增加。在一些实施方案中，Chim_13(SEQ ID NO：180)的表达导致重组宿主的甜菊醇-1，2-二糖苷积累增加。在一些实施方案中，Chim_13(SEQ ID NO：180)的表达导致重组宿主的RebB积累增加。在一些实施方案中，Chim_11(SEQ ID NO：176)、Chim_12(SEQ ID NO：178)和/或Chim_13的表达导致重组宿主的RebA积累增加。在一些实施方案中，Chim_10(SEQ ID NO：174)、Chim_11(SEQ ID NO：176)、Chim_12(SEQ ID NO：178)和/或Chim_13(SEQ ID NO：180)的表达导致重组宿主的RebD积累增加。在一些实施方案中，Chim_10(SEQ ID NO：174)、Chim_11(SEQ ID NO：176)、Chim_12(SEQ ID NO：178)和/或Chim_13(SEQ ID NO：180)的表达导致重组宿主的RebM积累增加。在一些实施方案中，Chim_13(SEQ ID NO：180)的表达导致重组宿主的甜菊醇-1，3-二糖苷积累增加。在一些实施方案中，Chim_11(SEQ ID NO：176)、Chim_12(SEQ ID NO：178)和/或Chim_13(SEQ ID NO：180)的表达导致重组宿主的1，2-甜菊苷积累增加。在一些实施方案中，Chim_10(SEQ ID NO：174)和/或Chim_12(SEQ IDNO：178)的表达导致重组宿主的甜菊醇+5Glc(#24)积累增加。在一些实施方案中，Chim_10(SEQ ID NO：174)、Chim_11(SEQ ID NO：176)、Chim_12(SEQ ID NO：178)和/或Chim_13(SEQID NO：180)的表达导致重组宿主的甜菊醇+5Glc(#25)积累增加。在一些实施方案中，Chim_10(SEQ ID NO：174)、Chim_11(SEQ ID NO：176)、Chim_12(SEQ ID NO：178)和/或Chim_13(SEQ ID NO：180)的表达导致重组宿主的甜菊醇+6Glc(异构体1)积累增加。在一些实施方案中，Chim_10(SEQ ID NO：174)、Chim_11(SEQ ID NO：176)、Chim_12(SEQ ID NO：178)和/或Chim_13(SEQ ID NO：180)的表达导致重组宿主的甜菊醇+6Glc(#23)积累增加。在一些实施方案中，Chim_10(SEQ ID NO：174)、Chim_11(SEQ ID NO：176)、Chim_12(SEQ ID NO：178)和/或Chim_13(SEQ ID NO：180)的表达导致重组宿主的甜菊醇+7Glc(异构体2)积累减少。在一些实施方案中，Chim_10(SEQ ID NO：174)的表达导致重组宿主的甜菊醇+7Glc(异构体5)积累增加。
在一些实施方案中，Chim_10(SEQ ID NO：174)、Chim_11(SEQ ID NO：176)和/或Chim_12(SEQ ID NO：178)的表达导致重组宿主的甜菊醇-1，3-二糖苷积累减少。在一些实施方案中，Chim_10(SEQ ID NO：174)的表达导致重组宿主的1，2-甜菊苷积累减少。在一些实施方案中，Chim_10(SEQ ID NO：174)、Chim_11(SEQ ID NO：176)、Chim_12(SEQ ID NO：178)和/或Chim_13(SEQ ID NO：180)的表达导致重组宿主的1，3-甜菊苷积累减少。在一些实施方案中，Chim_10(SEQ ID NO：174)、Chim_11(SEQ ID NO：176)、Chim_12(SEQ ID NO：178)和/或Chim_13(SEQ ID NO：180)的表达导致重组宿主的甜菊醇+4Glc(#26)积累减少。在一些实施方案中，Chim_10(SEQ ID NO：174)、Chim_11(SEQ ID NO：176)、Chim_12(SEQ IDNO：178)和/或Chim_13(SEQ ID NO：180)的表达导致重组宿主的甜菊醇+4Glc(#33)积累减少。在一些实施方案中，Chim_11(SEQ ID NO：176)和/或Chim_13(SEQ ID NO：180)的表达导致重组宿主的甜菊醇+5Glc(#24)积累减少。在一些实施方案中，Chim_11(SEQ ID NO：176)、Chim_12(SEQ ID NO：178)和/或Chim_13(SEQ ID NO：180)的表达导致重组宿主的甜菊醇+7Glc(异构体5)积累减少。在一些实施方案中，Chim_10(SEQ ID NO：174)、Chim_11(SEQ IDNO：176)、Chim_12(SEQ ID NO：178)和/或Chim_13(SEQ ID NO：180)的表达导致重组宿主的19-SMG积累减少。在一些实施方案中，Chim_10(SEQ ID NO：174)、Chim_11(SEQ ID NO：176)和/或Chim_12(SEQ ID NO：178)的表达导致重组宿主的甜菊醇-1，2-二糖苷积累减少。在一些实施方案中，Chim_10(SEQ ID NO：174)、Chim_11(SEQ ID NO：176)、Chim_12(SEQ ID NO：178)和/或Chim_13(SEQ ID NO：180)的表达导致重组宿主的甜茶苷积累减少。在一些实施方案中，Chim_10(SEQ ID NO：174)、Chim_11(SEQ ID NO：176)和/或Chim_12(SEQ ID NO：178)的表达导致重组宿主的RebB积累减少。在一些实施方案中，Chim_10(SEQ ID NO：174)的表达导致重组宿主的RebA积累增加。在一些实施方案中，Chim_11(SEQ ID NO：176)、Chim_12(SEQ ID NO：178)和/或Chim_13的表达导致重组宿主的RebE积累增加。在一些实施方案中，Chim_10(SEQ ID NO：174)、Chim_11(SEQ ID NO：176)、Chim_12(SEQ ID NO：178)和/或Chim_13(SEQ ID NO：180)的表达导致重组宿主的对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)积累减少。在一些实施方案中，Chim_10(SEQ ID NO：174)、Chim_11(SEQ ID NO：176)、Chim_12(SEQID NO：178)和/或Chim_13(SEQ ID NO：180)的表达导致重组宿主的对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)积累减少。在一些实施方案中，Chim_10(SEQ ID NO：174)、Chim_11(SEQ ID NO：176)、Chim_12(SEQ ID NO：178)和/或Chim_13(SEQ ID NO：180)的表达导致重组宿主的对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)积累减少。
在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的基因。在某些此类实施方案中，编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的基因是UGT74G1同源物(例如，具有对一个或多个应于SEQ ID NO：4的残基18、20、21、23、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、85、86、119、140、148、179、184、185、191、194、195、284、285、286、375、376、377、378的氨基酸取代的UGT74G1同源物)。在某些此类实施方案中，编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的基因是UGT74G1同源物，所述UGT74G1同源物相对于SEQ ID NO：4具有对应于残基79的取代(例如，对应于残基79的缬氨酸或谷氨酸)。在某些此类实施方案中，编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的基因是UGT74G1同源物，所述UGT74G1同源物相对于SEQ ID NO：4具有对应于残基80的取代(例如，对应于残基80的半胱氨酸)。在某些此类实施方案中，编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的基因是UGT74G1同源物，所述UGT74G1同源物相对于SEQ ID NO：4具有对应于残基81的取代(例如，对应于残基81的色氨酸)。在某些此类实施方案中，编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的基因是UGT74G1同源物，所述UGT74G1同源物相对于SEQ ID NO：4具有对应于残基83的取代(例如，对应于残基83的赖氨酸)。在某些此类实施方案中，编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的基因是UGT74G1同源物，所述UGT74G1同源物相对于SEQ ID NO：4具有对应于残基184的取代(例如，对应于残基184的缬氨酸或苏氨酸)。在某些此类实施方案中，编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的基因是UGT74G1同源物，所述UGT74G1同源物相对于SEQ ID NO：4具有对应于残基260的取代(例如，对应于残基260的苏氨酸)。在某些此类实施方案中，编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的基因是UGT74G1同源物，所述UGT74G1同源物相对于SEQ ID NO：4具有对应于残基286的取代(例如，对应于残基286的谷氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸或苏氨酸)。在某些此类实施方案中，编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的基因是UGT74G1同源物，所述UGT74G1同源物相对于SEQ ID NO：4具有对应于残基377的取代(例如，对应于残基377的谷氨酰胺)。
在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：163、SEQID NO：165、SEQ ID NO：167或SEQ ID NO：169所示的氨基酸序列的多肽)的基因。在某些实施方案中，包含编码够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：126、SEQ IDNO：128、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：167或SEQ ID NO：169所示的氨基酸序列的多肽)的基因的重组宿主细胞，还包含编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3’进行β1，3糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧羟基处糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的多肽)的基因；和/或编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2’进行β1，2糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的多肽)的基因。在某些实施方案中，重组宿主细胞还包含编码能够从FPP和IPP合成GGPP的多肽(例如，具有SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够从GGPP合成对映-柯巴基二磷酸的多肽(例如，具有SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够从对映-柯巴基二磷酸合成对映-贝壳杉烯的多肽(例如，具有SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够从对映-贝壳杉烯合成对映-贝壳杉烯酸、对映-贝壳杉烯醇和/或对映-贝壳杉烯醛的多肽(例如，具有SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：117所示的氨基酸序列多肽)的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽(例如，具有SEQ ID NO：78、SEQ IDNO：86或SEQ ID NO：92所示的氨基酸序列的多肽)的基因；和/或编码能能够从对映-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽(例如，具有SEQ ID NO：94所示的氨基酸序列的多肽)的基因。
在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的双功能多肽的基因。在某些此类实施方案中，所述多肽是UGT74G1-b-UGT85C2嵌合多肽(例如，具有SEQ ID NO：134、SEQID NO：136、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：148所示的氨基酸序列的多肽)。在某些此类实施方案中，所述多肽是UGT85C2-b-UGT74G1嵌合多肽(例如，具有SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：140或SEQ ID NO：142所示的氨基酸序列的多肽)。
在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的双功能多肽(例如，SEQ IDNO：132、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：148)的基因。在一些实施方案中，包含编码够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的双功能多肽(例如，SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：148)的基因的重组宿主，还包含编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3’进行β1，3糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧羟基处糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的多肽)的基因；和/或编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2’进行β1，2糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQID NO：16所示的氨基酸序列的多肽)的基因。在某些实施方案中，重组宿主细胞还包含编码能够从FPP和IPP合成GGPP的多肽(例如，具有SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够从GGPP合成对映-柯巴基二磷酸的多肽(例如，具有SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列的多肽)的基因；编码够从对映-柯巴基二磷酸合成对映-贝壳杉烯的多肽(例如，具有SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够从对映-贝壳杉烯合成对映-贝壳杉烯酸、对映-贝壳杉烯醇和/或对映-贝壳杉烯醛的多肽(例如，具有SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：117所示的氨基酸序列多肽)的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽(例如，具有SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：92所示的氨基酸序列的多肽)的基因；和/或编码能够从对映-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽(例如，具有SEQ ID NO：94所示的氨基酸序列的多肽)的基因。
在一些实施方案中，重组宿主包含编码标记的多肽的基因，所述标记的多肽包含通过接头(例如，具有SEQ ID NO：151所示的氨基酸序列的接头)连接的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽(例如，UGT74G1同源物；例如，具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的多肽)和标签(例如，具有SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：154或SEQ ID NO：155所示的氨基酸序列的标签)。
在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽(例如，具有SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：178或SEQID NO：180所示的氨基酸序列的多肽)的基因。在某些实施方案中，包含编码够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽(例如，具有SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：178或SEQ ID NO：180所示的氨基酸序列的多肽)的基因的重组宿主，还包含编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3’进行β1，3糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧羟基处糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的多肽)的基因；和/或编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2’进行β1，2糖基化的多肽(例如，具有SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的多肽)的基因。在某些实施方案中，重组宿主细胞还包含编码能够从FPP和IPP合成GGPP的多肽(例如，具有SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够从GGPP合成对映-柯巴基二磷酸的多肽(例如，具有SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够从对映-柯巴基二磷酸合成对映-贝壳杉烯的多肽(例如，具有SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够从对映-贝壳杉烯合成对映-贝壳杉烯酸、对映-贝壳杉烯醇和/或对映-贝壳杉烯醛的多肽(例如，具有SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：117所示的氨基酸序列多肽)的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽(例如，具有SEQ IDNO：78、SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：92所示的氨基酸序列的多肽)的基因；和/或编码能够从对映-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽(例如，具有SEQ ID NO：94所示的氨基酸序列的多肽)的基因。
在一些实施方案中，通过全细胞生物转化产生一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物。在一些实施方案中，如本文所公开的产生一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的方法包括在重组宿主细胞的细胞培养基中使用以下物质对源自植物的或合成的甜菊醇糖苷前体或源自植物的或合成的甜菊醇前体进行全细胞生物转化：(a)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽，其与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性，并且还具有至少一个对应于SEQID NO：4的残基79、80、81、83、184、260、286或377的氨基酸取代；(b)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽，其与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性，并且还具有至少一个对应于SEQ ID NO：4的残基68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82或83的氨基酸取代；(c)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊糖或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的双功能多肽，其与SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：140或SEQ ID NO：142、SEQ IDNO：144、SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：148所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性；和/或(d)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽，其与SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：178或SEQ ID NO：180所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性；其中所述多肽中的至少一种是在重组宿主细胞中表达的重组多肽；以及由此产生一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物。
在一些实施方案中，体内、体外或通过全细胞生物转化产生的甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体组合物相较于来自除其它以外甜叶菊植物的甜叶菊提取物包含较少的污染物或较少的任何特定污染物。污染物可包括促成异味的源自植物的化合物。潜在污染物包括色素、脂质、蛋白质、酚类、糖类、匙叶桉油烯醇和其它倍半萜类、半日花烷型二萜、单萜、癸酸、8，11，14-二十碳三烯酸、2-甲基十八烷、二十五烷、二十八烷、二十四烷、十八烷醇、豆固醇、β-谷固醇、α-香树素、β-香树素、羽扇豆醇、β-乙酸香树素酯、五环三萜、矢车菊黄素(centauredin)、槲皮素、表-α-杜松醇、丁香稀(carophyllene)及衍生物、β-蒎稀、β-谷固醇和赤霉素。
如本文中所用，术语“可检测的量”、“可检测浓度”、“可测量的量”和“可测量的浓度”是指以AUC、μM/OD600、mg/L、μM或mM表示的测量的甜菊醇糖苷的水平。可通过本领域技术人员通常可获得的技术检测和/或分析甜菊醇糖苷产量(即，总的上清液和/或细胞内甜菊醇糖苷水平)，所述技术是例如但不限于液相色谱-质谱法(LC-MS)、薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、紫外-可见光谱/分光光度法(UV-Vis)、质谱法(MS)和NMR。
如本文中所用，术语“不可检测的浓度”是指太低而不能通过技术诸如TLC、HPLC、UV-Vis、MS或NMR测量和/或分析的化合物的水平。在一些实施方案中，“不可检测的浓度”的化合物不存在于甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体组合物中。
如本文中所用，术语“或”和“和/或”被用于描述多种组分的组合或彼此排除。例如，“x、y和/或z”可单独指“x”、单独指“y”、单独指“z”、“x、y和z”、“(x和y)或z”、“x或(y和z)”或“x或y或z”。在一些实施方案中，“和/或”用于指重组细胞包含的外源核酸，其中重组细胞包含选自组的一种或多种外源核酸。在一些实施方案中，“和/或”用于指甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体的产生。在一些实施方案中，“和/或”用于指甜菊醇糖苷的产生，其中产生一种或多种甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，“和/或”用于指甜菊醇糖苷的产生，其中一种或多种甜菊醇糖苷通过一个或多个以下步骤产生：培养重组微生物，在重组微生物中合成一种或多种甜菊醇糖苷，和/或分离一种或多种甜菊醇糖苷。
功能同源物
上述多肽的功能同源物也适用于在重组宿主中产生甜菊醇糖苷。功能同源物是与参考多肽具有序列相似性并且执行参考多肽的一种或多种生物化学或生理功能的多肽。功能同源物和参照多肽可以是天然存在的多肽，并且序列相似性可以归因于趋同或趋异进化事件。因此，功能同源物有时在文献中被指定为同源物，或直系同源物或旁系同源物。天然存在的功能同源物的变体，诸如由野生型编码序列的突变体编码的多肽本身可以是功能同源物。也可以通过多肽编码序列的定点诱变或通过组合来自不同天然存在的多肽的编码序列的结构域(“结构域交换(domain swapping)”)来产生功能同源物。用于修饰本文所述的编码功能性多肽的基因的技术是已知的，并且包括，除其它以外，定向进化技术、定点诱变技术和随机诱变技术，并且可用于增加多肽的比活性，改变底物特异性，改变表达水平，改变亚细胞定位，或以期望的方式修饰多肽-多肽相互作用。此类经修饰的多肽被认为是功能同源物。术语“功能同源物”有时应用于编码功能上同源的多肽的核酸。
可通过分析核苷酸和多肽序列比对来鉴定功能同源物。例如，对核苷酸或多肽序列的数据库进行查询可鉴定甜菊醇糖苷生物合成多肽的同源物。序列分析可涉及使用UGT氨基酸序列作为参考序列的非冗余数据库的BLAST、交互BLAST或PSI-BLAST分析。在某些情况下，氨基酸序列是从核苷酸序列推导而来的。数据库中具有大于40％序列同一性的那些多肽是用于进一步评估作为甜菊醇糖苷生物合成多肽的适合性的候选物。氨基酸序列相似性允许保守的氨基酸取代，诸如一个疏水残基对另一个疏水残基的取代或一个极性残基对另一个极性残基的取代。如果需要，可对此类候选物进行手动检查，以缩小待进一步评估的候选物数量。手动检查可通过选择似乎具有存在于甜菊醇糖苷生物合成多肽中的结构域(例如保守功能结构域)的那些候选物来实施。在一些实施方案中，基于表达水平而非通过使用BLAST分析从转录组数据鉴定核酸和多肽。
保守区可以通过定位甜菊醇糖苷生物合成多肽的一级氨基酸序列内的一个区域来鉴定，所述区域是重复序列，形成一些二级结构(例如，螺旋和β折叠)，建立带正电荷或负电荷的结构域，或者代表蛋白质基序或结构域。参见，例如，在万维网上于sanger.ac.uk/Software/Pfam/和pfam.janelia.org/上描述各种蛋白质基序和结构域的共有序列的Pfam网站。包含在Pfam数据库中的信息描述于Sonnhammer等，Nucl.Acids Res.，26：320-322(1998)；Sonnhammer等，Proteins，28：405-420(1997)和Bateman等，Nucl.Acids Res.，27：260-262(1999).中。保守区还可通过比对来自密切相关的物种的相同或相关多肽的序列来确定。密切相关的物种优选来自同一科。在一些实施方案中，来自两种不同物种的序列的比对足以鉴定此类同源物。
通常，表现出至少约40％氨基酸序列同一性的多肽可用于鉴定保守区域。相关多肽的保守区域显示出至少45％的氨基酸序列同一性(例如，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％或至少90％氨基酸序列同一性)。在一些实施方案中，保守区显示至少92％、94％、96％、98％或99％氨基酸序列同一性。
例如，适合在重组宿主中产生甜菊醇的多肽包括UGT的功能同源物。
修饰例如UGT的底物特异性的方法是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于定点/合理诱变方法、随机定向进化方法和组合，其中随机诱变/饱和技术在酶的活性部位附近进行。例如参见Osmani等，2009，Phytochemistry 70：325-347。
候选序列通常具有参考序列长度的80％至250％的长度，例如82％、85％、87％、89％、90％、93％、95％、97％、99％、100％、105％、110％、115％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％或250％的参考序列的长度。功能同源物多肽通常具有为参考序列长度的95％至105％的长度，例如90％、93％、95％、97％、99％、100％、105％、110％、115％或120％的参考序列的长度，或其间的任何范围内的长度。任何候选核酸或多肽相对于参考核酸或多肽的同一性百分比可如下确定。使用允许在它们的整个长度(全局比对)上进行核酸或多肽序列的比对的计算机程序ClustalOmega(1.2.1版，默认参数)将参考序列(例如，本文所述的核酸序列或氨基酸序列)与一个或多个候选序列进行比对。Chenna等，2003，Nucleic Acids Res.31(13)：3497-500。
ClustalW计算参考序列与一个或多个候选序列之间的最佳匹配，并使它们对齐以便可确定同一性、相似性和差异。可将一个或多个残基的空位插入参考序列、候选序列或两者中，以最大化序列比对。对于核酸序列的快速成对比对，使用以下默认参数：字长：2；窗口大小：4；评分方法：年龄％；顶对角线数目：4；以及空位罚分：5。对于核酸酸序列的多重比对，使用以下参数：空位开放罚分：10.0；空位延伸罚分：5.0；以及权重转换：是。对于蛋白质序列的快速成对比对，使用以下参数：字长：1；窗口大小：5；评分方法：年龄％；顶对角线数目：5；空位罚分：3。对于蛋白质序列的多重比对，使用以下参数：权重矩阵：blosum；空位开放罚分：10.0；空位延伸罚分：0.05；亲水空位：开；亲水残基：Gly、Pro、Ser、Asn、Asp、Gln、Glu、Arg和Lys；残基特异性空位罚分：开。ClustalW输出是反映序列之间关系的序列比对。例如，ClustalW可以在万维网上的Baylor College of Medicine Search Launcher网站(searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html)以及万维网上的欧洲生物信息学研究所网站(ebi.ac.uk/clustalw)上运行。
为了确定候选核酸或氨基酸序列与参考序列的同一性百分比，使用ClustalOmega比对序列，将比对中的相同匹配的数量除以参考序列的长度，并将结果乘以100。要注意的是，可将同一性百分比值四舍五入至最接近的十分之一。例如，将78.11、78.12、78.13和78.14下舍入为78.1，而将78.15、78.16、78.17、78.18和78.19上舍入为78.2。
应理解，功能UGT蛋白质(例如，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽；能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3’进行β1，3糖基化的多肽；能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽；和/或能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′进行β1，2糖基化的多肽)蛋白可包括不参与由酶进行的酶活性的另外的氨基酸。在一些实施方案中，UGT蛋白是融合蛋白。术语“嵌合体”、“融合多肽”、“融合蛋白”、“融合酶”、“融合构建体”、“嵌合蛋白”、“嵌合多肽”、“嵌合构建体”和“嵌合酶”在本文中可互换地用于指通过连接两个或更多个编码不同蛋白质的基因而工程化的蛋白质。
在一些实施方案中，通过将第一多肽蛋白A的C末端通过接头“b”连接至第二多肽蛋白B的N末端(即“蛋白A-b-蛋白B”)来构建嵌合酶。在一些方面，接头可以是氨基酸序列“KLVK”。在一些方面，嵌合酶的接头可以是氨基酸序列“RASSTKLVK”(SEQ ID NO：150)。在一些方面，嵌合酶的接头可以是氨基酸序列“GGGGS”。在一些实施方案中，嵌合酶的接头可以是两个重复的氨基酸序列“GGGGS”(即，“GGGGSGGGGS”)。在一些实施方案中，嵌合酶的接头可以是3个重复的氨基酸序列“GGGGS”。在一些实施方案中，嵌合酶的接头可以是氨基酸序列“EGKSSGSGSESKST”(SEQ ID NO：151)。在一些实施方案中，嵌合酶的接头是在第一多肽的C末端与第二多肽的N末端之间的直接键。在一些实施方案中，通过将第一多肽蛋白A的C末端通过接头“b”连接至第二多肽蛋白B的N末端(即“蛋白A-b-蛋白B”)并将第二多肽蛋白B的C末端通过第二接头“d”连接至第三蛋白C的N末端(即“蛋白A-b-蛋白B-d-蛋白C”)来构建嵌合酶。
在一些实施方案中，编码UGT多肽(例如，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽；能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3’进行β1，3糖基化的多肽；能够甜菊醇或甜菊醇糖苷使在其C-19羧基处糖基化的多肽；和/或能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′进行β1，2糖基化的多肽)的核酸序列可包括标签序列，所述标签序列编码被设计来促进编码的多肽的随后操作(例如，以便于纯化或检测)、溶解度、分泌或定位的“标签”。可将标签序列插入编码多肽的核酸序列中，使得编码的标签位于多肽的羧基(即，C末端)或氨基末端(即，N末端)。编码标签的非限制性实例包括绿色荧光蛋白(GFP)、人流感血凝素(HA)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、聚组氨酸-标签(HIS标签)、二硫化物氧化还原酶(DsbA)(例如，SEQ ID NO：156)、麦芽糖结合蛋白(MBP)(例如，SEQ ID NO：157)、N-利用物质(NusA)(例如，SEQ ID NO：158)和小遍在蛋白样修饰物(SUMO)(例如，SEQ ID NO：159)。标签的其它实例包括叶绿体转运肽、线粒体转运肽、造粉体肽、信号肽或分泌标签。在一些实施方案中，将标签连接至能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽。在一些实施方案中，使用SEQ ID NO：151的接头将标签连接至能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽。参见，实施例5-6和7-9。
在一些实施方案中，融合蛋白是通过结构域交换而改变的蛋白质。如本文中所用，术语“结构域交换”用于描述用第二蛋白质的结构域置换第一蛋白质的结构域的过程在一些实施方案中，第一蛋白质的结构域和第二蛋白质的结构域功能相同或功能相似。在一些实施方案中，第二蛋白质的结构域的结构和/或序列与第一蛋白质的结构域的结构和/或序列不同。在一些实施方案中，通过结构域交换来改变UGT多肽。
在一些实施方案中，融合蛋白是通过环状变换(circular permutation)改变的蛋白质，其包含随后可在其它地方打开的蛋白质末端的共价连接。因此，可改变序列的顺序而不引起蛋白质的氨基酸的变化。在一些实施方案中，可产生靶向环状变换，例如但不限于通过设计间隔子以连接原始蛋白质的末端。一旦确定了间隔子，则存在通过普遍接受的分子生物学技术(例如但不限于通过经由PCR产生多联体并随后扩增多联体内部的特定变换，或通过扩增蛋白质的分立片段以进行交换来以不同顺序连接它们)产生变换的几种可能性。产生变换的步骤之后可以是通过结合片段末端和随机重新切割产生环状基因，从而形成来自独特构建体的变换的集合。在一些实施方案中，DAP1多肽通过环状变换来改变。
甜菊醇和甜菊醇糖苷生物合成核酸
编码本文所述多肽的重组基因包含该多肽的编码序列，其与适于表达所述多肽的一个或多个调控区以有义方向可操作地连接。由于许多微生物能够从多顺反子mRNA表达多种基因产物，因此如果需要，可在这些微生物的单一调控区的控制下表达多种多肽。当调控区和编码序列被定位成使得调控区能够有效地调节所述序列的转录或翻译时，认为该编码序列和调控区是可操作地连接的。通常，对于单顺反子基因，编码序列的翻译阅读框的翻译起始位点位于调控区下游1个至约50个核苷酸之间。
许多情况下，本文所述的多肽的编码序列在除重组宿主外的物种中被鉴定，即，其是异源核酸。因此，如果重组宿主是微生物，则编码序列可来自其它原核或真核微生物、植物或动物。然而，在一些情况下，编码序列是对宿主天然的并且将被重新引入该生物体的序列。天然序列(native sequence)与天然存在的序列(naturally occurring sequence)的区别通常在于存在与外源核酸连接的非天然序列，例如位于重组核酸构建体中天然序列两侧的非天然调节序列。另外，通常将稳定转化的外源核酸整合在不同于其中发现天然序列的位置的位置。“调控区”是指具有影响转录或翻译起始和速率以及转录或翻译产物的稳定性和/或移动性的核苷酸序列的核酸。调控区包括但不限于启动子序列、增强子序列、应答元件、蛋白质识别位点、诱导型元件、蛋白质结合序列、5′和3′非翻译区(UTR)、转录起始位点、终止序列、多腺苷酸化序列、内含子及其组合。调控区通常包含至少一个核心(基础)启动子。调控区还可包括至少一个控制元件，诸如增强子序列、上游元件或上游激活区(UAR)。通过将调控区与编码序列定位成使得调控区有效地调节序列的转录或翻译，来使得调控区与编码序列可操作地连接。例如，为了可操作地连接编码序列和启动子序列，编码序列的翻译阅读框的翻译起始位点通常定位于启动子下游1至约50个核苷酸之间。然而，调控区也可被定位在翻译起始位点上游多达约5,000个核苷酸处，或者转录起始位点上游约2,000个核苷酸处。
对要包含的调控区的选择取决于若干因素，包括但不限于效率、可选择性、可诱导性、期望的表达水平和在某些培养阶段期间的优先表达。对本领域技术人员而言，通过相对于编码序列适当地选择和定位调控区来调节编码序列的表达是常规问题。应该理解，可存在不止一个调控区，例如内含子、增强子、上游激活区、转录终止子和诱导型元件。
可将一个或多个基因以“模块(module)”方式组合在重组核酸构建体中，用于甜菊醇和/或甜菊醇糖苷产生的一个独立方面。将多个基因组合在模块，特别是多顺反子模块中，便于在多种物种中使用所述模块。例如，可以以多顺反子模块组合甜菊醇生物合成基因簇或UGT基因簇，使得在插入合适的调控区后，可将模块引入至众多的物种中。作为另一个实例，可组合UGT基因簇，使得每个UGT编码序列可操作地连接至单独的调控区域，以形成UGT模块。此类模块可用于那些必须或期望单顺反子表达的物种中。除了对甜菊醇或甜菊醇糖苷产生有用的基因以外，重组构建体通常还含有复制起点和使构建体保持在合适的物种中的一种或多种可选择标记。
应理解，由于遗传密码的简并性，许多核酸可编码特定多肽；即，对于许多氨基酸，存在不止一个核苷酸三联体充当该氨基酸的密码子。因此，使用针对宿主(例如，微生物)的合适密码子偏向性表，可以将给定多肽的编码序列中的密码子进行修饰，从而获得在所述特定宿主中的最佳表达。作为经分离的核酸，这些经修饰的序列可以作为经纯化的分子存在，也可以被整合到载体或病毒中用于构建重组核酸构建体的模块。
在一些情况下，期望抑制内源多肽的一种或多种功能，以便使代谢中间体转向甜菊醇或甜菊醇糖苷生物合成。例如，可能需要下调酵母菌株中固醇的合成，以例如通过下调角鲨烯环氧化酶进一步增加甜菊醇或甜菊醇糖苷的产量。作为另一个实例，可能需要抑制某些内源基因产物(例如，从次级代谢物去除葡萄糖部分的糖水解酶或如本文所论述的磷酸酶)的降解功能。在此类情况下，可在转化入菌株的重组构建物中包含过表达多肽或基因产物的核酸。或者，可使用诱变来生成需要增加或增强其功能的基因的突变体。
本公开的一个方面是编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽或其催化活性部分的核酸分子。在一个方面，核酸是分离的核酸。在一个方面，核酸是cDNA。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的编码的多肽或其催化活性部分包含具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列并且还具有至少一个对应于SEQ ID NO：4的残基79、80、81、83、184、260、286或377的氨基酸取代的多肽。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的编码的多肽或其催化活性部分包含具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列并且还具有至少一个对应于SEQ ID NO：4的残基68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82或83的氨基酸取代的多肽。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的编码的多肽或其催化活性部分还包含具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列并且还具有对应于SEQ ID NO：4的M79V、M79E、S80C、A81W、E83K、H184V、H184T N260T、K286C、K286E、K286N、K286T和/或S377Q取代的多肽。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的编码的多肽或其催化活性部分包含这样的多肽，所述多肽具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列并且还具有对应于SEQ ID NO：4的K286C取代(即，SEQ ID NO：118)；对应于SEQ ID NO：4的M79V取代(即，SEQ ID NO：120)；对应于SEQ ID NO：4的S377Q取代(即，SEQ ID NO：122)；对应于SEQ ID NO：4的S80C取代(即，SEQ ID NO：124)；对应于SEQ ID NO：4的N260T和K286C取代(即，SEQ ID NO：126)；对应于SEQ ID NO：4的H184V取代(即，SEQ ID NO：128)；对应于SEQID NO：4的A81W和E83K取代(即，SEQ ID NO：130)；对应于SEQ ID NO：4的A81W取代(即，SEQID NO：161)；对应于SEQ ID NO：4的H184T取代(即，SEQ ID NO：163)；对应于SEQ ID NO：4的K286N取代(即，SEQ ID NO：165)；对应于SEQ ID NO：4的M79E取代(即，SEQ ID NO：167)；或对应于SEQ ID NO：4的K286T取代(即，SEQ ID NO：169)。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的编码的多肽或其催化活性部分还包含标签，例如，具有SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：154或SEQ ID NO：155所示的氨基酸序列的标签。
本公开的另一个方面是编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽或其催化活性部分的核酸分子。在一个方面，核酸是分离的核酸。在一个方面，核酸是cDNA。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的编码的标记多肽或其催化活性部分包含通过接头连接的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽(例如，UGT74G1多肽，例如，具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的多肽)和标签(例如，具有SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：154或SEQ ID NO：155所示的氨基酸序列的标签)。在一些实施方案中，接头可以是氨基酸序列“KLVK”。在一些实施方案中，接头可以是氨基酸序列“EGKSSGSGSESKST”(SEQ ID NO：151)。在一些实施方案中，接头是氨基酸序列“RASSTKLVK”(SEQ ID NO：150)。在一些实施方案中，接头是氨基酸序列“GGGGS”。在一些实施方案中，接头是两个重复的氨基酸序列“GGGGS”(即，“GGGGSGGGGS”)。在一些实施方案中，接头是3个重复的氨基酸序列“GGGGS”。在一些实施方案中，接头是直接键(即，在第一多肽的C末端与第二多肽的N末端之间)。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的编码的标记多肽或其催化活性部分包含在其N末端连接至标签(例如，具有SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：154或SEQ ID NO：155所示的氨基酸序列的标签)的C末端的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽(例如，UGT74G1多肽，例如，具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的多肽)。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的编码的标记多肽或其催化活性部分包含具有SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：178或SEQID NO：180所示的氨基酸序列的多肽。
本公开的另一个方面是编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的双功能多肽或其催化活性部分的核酸分子。在一个方面，核酸是分离的核酸。在一个方面，核酸是cDNA。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的编码的双功能多肽或其催化活性部分包含通过接头连接的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽(例如，UGT74G1多肽，例如，具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的多肽)和能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽(例如，UGT85C2多肽，例如，具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的多肽)。在一些实施方案中，接头可以是氨基酸序列“KLVK”。在一些实施方案中，接头可以是氨基酸序列“EGKSSGSGSESKST”(SEQ ID NO：151)。在一些实施方案中，接头是氨基酸序列“RASSTKLVK”(SEQ ID NO：150)。在一些实施方案中，接头是氨基酸序列“GGGGS”。在一些实施方案中，接头是两个重复的氨基酸序列“GGGGS”(即，“GGGGSGGGGS”)。在一些实施方案中，接头是3个重复的氨基酸序列“GGGGS”。在一些实施方案中，接头是直接键(即，在第一多肽的C末端与第二多肽的N末端之间)。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的编码的双功能多肽或其催化活性部分包含在其C末端连接至能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽(例如，UGT85C2多肽，例如，具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的多肽)的N末端的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽(例如，UGT74G1多肽，例如，具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的多肽)。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的编码的双功能多肽或其催化活性部分包含在其C末端连接至能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽(例如，UGT74G1多肽，例如，具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的多肽)的N末端的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽(例如，UGT85C2多肽，例如，具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的多肽)。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的编码的双功能多肽或其催化活性部分包含具有SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：140或SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：148所示的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的编码的双功能多肽或其催化活性部分还包含标签，例如，具有SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：154或SEQ ID NO：155所示的氨基酸序列的标签。
本公开的一个方面是能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽或其催化活性部分。在一个方面，所述多肽是纯化的多肽。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽或其催化活性部分包含具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列并且还具有至少一个对应于SEQ ID NO：4的残基79、80、81、83、184、260、286或377的氨基酸取代的多肽。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽或其催化活性部分包含具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列并且还具有至少一个对应于SEQ ID NO：4的残基68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82或83的氨基酸取代的多肽。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的编码的多肽或其催化活性部分包含具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列并且还具有对应于SEQ ID NO：4的M79V、M79E、S80C、A81W、E83K、H184V、H184TN260T、K286C、K286E、K286N、K286T和/或S377Q取代的多肽。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽或其催化活性部分包含这样的多肽，所述多肽具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列并且还具有对应于SEQ ID NO：4的K286C取代(即，SEQ ID NO：118)；对应于SEQ ID NO：4的M79V取代(即，SEQ ID NO：120)；对应于SEQ ID NO：4的S377Q取代(即，SEQID NO：122)；对应于SEQ ID NO：4的S80C取代(即，SEQ ID NO：124)；对应于SEQ ID NO：4的N260T和K286C取代(即，SEQ ID NO：126)；对应于SEQ ID NO：4的H184V取代(即，SEQ ID NO：128)；对应于SEQ ID NO：4的A81W和E83K取代(即，SEQ ID NO：130)；对应于SEQ ID NO：4的A81W取代(即，SEQ ID NO：161)；对应于SEQ ID NO：4的H184T取代(即，SEQ ID NO：163)；对应于SEQ ID NO：4的K286N取代(即，SEQ ID NO：165)；对应于SEQ ID NO：4的M79E取代(即，SEQ ID NO：167)；或对应于SEQ ID NO：4的K286T取代(即，SEQ ID NO：169)。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽或其催化活性部分还包含标签，例如，具有SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：154或SEQ ID NO：155所示的氨基酸序列的标签。
本公开的另一个方面是能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽或其催化活性部分。在一个方面，所述多肽是纯化的多肽。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽或其催化活性部分包含通过接头连接的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽(例如，UGT74G1多肽，例如，具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的多肽)和标签(例如，具有SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：154或SEQ ID NO：155所示的氨基酸序列的标签)。在一些实施方案中，接头可以是氨基酸序列“KLVK”。在一些实施方案中，接头可以是氨基酸序列“EGKSSGSGSESKST”(SEQ ID NO：151)。在一些实施方案中，接头是氨基酸序列“RASSTKLVK”(SEQ ID NO：150)。在一些实施方案中，接头是氨基酸序列“GGGGS”。在一些实施方案中，接头是两个重复的氨基酸序列“GGGGS”(即，“GGGGSGGGGS”)。在一些实施方案中，接头是3个重复的氨基酸序列“GGGGS”。在一些实施方案中，接头是直接键(即，在第一多肽的C末端与第二多肽的N末端之间)。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽或其催化活性部分包含在其N末端连接至标签(例如，具有SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：154或SEQ ID NO：155所示的氨基酸序列的标签)的C末端的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽(例如，UGT74G1多肽，例如，具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的多肽)。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽或其催化活性部分包含具有SEQ ID NO：174、SEQID NO：176、SEQ ID NO：178或SEQ ID NO：180所示的氨基酸序列的多肽。
本公开的另一个方面是能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的双功能多肽或其催化活性部分。在一个方面，所述多肽是纯化的多肽。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的编码的双功能多肽或其催化活性部分包含通过接头连接的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽(例如，UGT74G1多肽，例如，具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的多肽)和能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽(例如，UGT85C2多肽，例如，具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的多肽)。在一些实施方案中，接头可以是氨基酸序列“KLVK”。在一些实施方案中，接头可以是氨基酸序列“EGKSSGSGSESKST”(SEQ ID NO：151)。在一些实施方案中，接头是氨基酸序列“RASSTKLVK”(SEQ ID NO：150)。在一些实施方案中，接头是氨基酸序列“GGGGS”。在一些实施方案中，接头是两个重复的氨基酸序列“GGGGS”(即，“GGGGSGGGGS”)。在一些实施方案中，接头是3个重复的氨基酸序列“GGGGS”。在一些实施方案中，接头是直接键(即，在第一多肽的C末端与第二多肽的N末端之间)。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的编码的双功能多肽或其催化活性部分，包含在其C末端连接至能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽(例如，UGT85C2多肽，例如，具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的多肽)的N末端的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽(例如，UGT74G1多肽，例如，具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的多肽)。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的编码的双功能多肽或其催化活性部分，包含在其C末端连接至能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽(例如，UGT74G1多肽，例如，具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的多肽)的N末端的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽(例如，UGT85C2多肽，例如，具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的多肽)。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的双功能多肽或其催化活性部分包含具有SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：140或SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：148所示的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的双功能多肽或其催化活性部分还包含标签，例如，具有SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：154或SEQ ID NO：155所示的氨基酸序列的标签。
宿主微生物
重组宿主可用于表达用于产生甜菊醇糖苷的多肽，其包括哺乳动物、昆虫、植物和藻类细胞。许多原核生物和真核生物也适用于构建本文所述的重组微生物，例如革兰阴性细菌、酵母和真菌。首先分析选择用作甜菊醇糖苷产生菌株的物种和菌株以确定哪些产生基因对于菌株是内源的以及哪些基因不存在。对于其内源对应物不存在于菌株中的基因，其有利地装配在一个或更多个重组构建体中，然后将其转化入菌株以提供缺失的一种或多种功能。
通常，使重组微生物在发酵罐中在一个或多个温度下生长一段时间，其中温度和时间段有助于甜菊醇糖苷的产生。可使用常规发酵方法培养由本发明提供的构建的和遗传工程化的微生物，所述发酵方法，除其它以外，包括恒化器、分批、补料分批培养、半连续发酵诸如吸取和填充、连续灌流发酵和连续灌流细胞培养。根据该方法中使用的特定微生物，也可存在和表达其它重组基因诸如异戊烯基生物合成基因以及萜烯合酶和环化酶基因。可通过从培养基中提取样品以根据公开的方法进行分析来确定底物和中间体(例如异戊烯基二磷酸、二甲基烯丙基二磷酸、GGPP、对映-贝壳杉烯和对映-贝壳杉烯酸)的水平。
本方法中使用的碳源包括可被重组宿主细胞代谢以促进生长和/或甜菊醇糖苷产生的任何分子。合适的碳源的实例包括但不限于蔗糖(例如，如在糖蜜中发现的)、果糖、木糖、乙醇、甘油、葡萄糖、纤维素、淀粉、纤维二糖或其它含葡萄糖的聚合物。例如在采用酵母作为宿主的实施方案中，碳源诸如蔗糖、果糖、木糖、乙醇、甘油和葡萄糖是合适的。可在整个培养期间中向宿主生物体提供碳源，或者可选地，可使生物体在另一种能量来源(例如蛋白质)的存在下生长一段时间，然后仅在补料分批阶段为其提供碳源。
在培养物中使重组微生物生长一段时间后，其中温度和时间段有助于甜菊醇糖苷的产生，然后可使用本领域已知的各种技术从培养物中回收甜菊醇和/或一种或多种甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，可加入透化剂以帮助原料进入宿主和产物离开。例如，可将培养的微生物的粗制裂解物离心以获得上清液。然后可将所得的上清液施加到色谱柱(例如，C-18柱)上，并用水洗涤以除去亲水性化合物，随后用溶剂(诸如甲醇)洗脱一种或多种目标化合物。然后可通过制备HPLC进一步纯化一种或多种化合物。另见，WO 2009/140394。
应当理解，本文论述的各种基因和模块可存在于两个或更多个重组宿主中而不是单个宿主中。当使用多种重组宿主时，可将它们在混合培养物中生长以积累甜菊醇和/或甜菊醇糖苷。
或者，可使两种或更多种宿主各自在单独的培养基中生长，并且可将第一培养基的产物例如甜菊醇引入第二培养基中以转化成随后的中间体或转化成终产品诸如，例如RebA。然后回收由第二或最终宿主产生的产物。还应理解的是，在一些实施方案中，使用除培养基外的营养源并利用除发酵罐外的系统来使重组宿主生长。
下面更详细地描述示例性原核生物和真核生物物种。然而，应当理解，其它物种也是合适的。例如，合适的物种可属于诸如以下属的属：伞菌属(Agaricus)、曲霉属(Aspergillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、念珠菌属(Candida)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、假囊酵母属(Eremothecium)、埃希氏菌属(Escherichia)、镰刀菌属(Fusarium)/赤霉菌属(Gibberella)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、硫磺菌属(Laetiporus)、香燕属(Lentinus)、法夫酵母属(Phaffia)、平革菌属(Phanerochaete)、毕赤酵母属(Pichia)、小立碗藓属(Physcomitrella)、红酵母属(Rhodoturula)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、痂圆孢霉属(Sphaceloma)、红法夫酵母属(Xanthophyllomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)。来自此类属的示例性物种包括虎皮香燕(Lentinus tigrinus)、硫横菌(Laetiporus sulphureus)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、杰丁塞伯林德纳氏酵母(Cyberlindnera jadinii)、小立碗藓(Physcomitrella patens)、粘红酵母(Rhodoturula glutinis)、胶红酵母(Rhodoturula mucilaginosa)、红发夫酵母(Phaffiarhodozyma)、红法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)、藤仓镶刀菌(Fusariumfujikuroi)/藤仓赤霉菌(Gibberella fujikuroi)、产朊念珠菌(Candida utilis)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、白色念珠菌(Candida albicans)和解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。
在一些实施方案中，微生物可以是原核生物诸如埃希氏菌属细菌，例如大肠埃希氏菌(Escherichia coli)细胞；乳杆菌属(Lactobacillus)细菌细胞；乳球菌属(Lactococcus)细菌细胞；棒状杆菌属(Cornebacterium)细菌细胞；醋酸杆菌属(Acetobacter)细菌细胞；不动杆菌属(Acinetobacter)细菌细胞；或假单胞菌属(Pseudomonas)细菌细胞。
在一些实施方案中，微生物可以是子囊菌(Ascomycete)，诸如藤仓赤霉菌、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、黑曲霉(Aspergillus niger)、解脂耶氏酵母、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)或酿酒酵母。
在一些实施方案中，微生物可以是藻类细胞，诸如三孢布拉氏霉菌(Blakesleatrispora)、盐生杜氏藻(Dunaliella salina)、雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)、小球藻属某种(Chlorella sp.)、裙带菜(Undaria pinnatifida)、马尾藻属(Sargassum)、海带(Laminaria japoni ca)、Scenedesmus almeriensis物种。
在一些实施方案中，微生物可以是蓝细菌(cyanobacterial)细胞，例如三孢布拉氏霉菌、盐生杜氏藻、雨生红球藻、小球藻某种、裙带菜、马尾藻属、海带、Scenedesmusalmeriensis。
酵母属某些种
酵母属是合成生物学中广泛使用的底盘生物，并且可用作重组微生物平台。例如，存在可用于酿酒酵母的突变体文库、质粒、代谢的详细计算机模型和其它信息，允许合理设计各种模块以提高产物产量。用于制备重组微生物的方法是已知的。
曲霉属某些种
曲霉菌属的某些种诸如米曲霉(A.oryzae)、黑曲霉和酱油曲霉(A.sojae)是食品生产中广泛使用的微生物，并且也可以用重组微生物平台。构巢曲霉(A.nidulans)、烟曲霉(A.fumigatus)、米曲霉、棒曲霉(A.clavatus)、黄曲霉(A.flavus)、黑曲霉和土曲霉(A.terreus)的基因组的核苷酸序列是可获得的，从而允许合理设计和修饰内源途径以增加通量并增加产物产量。已开发了用于曲霉菌属的代谢模型，以及转录组学研究和蛋白质组学研究。黑曲霉被培养用于许多食品成分诸如柠檬酸和葡糖酸的工业生产，因此诸如黑曲霉等种通常适用于产生甜菊醇糖苷。
大肠埃希氏菌
大肠埃希氏菌，作为另一种广泛用于合成生物学的平台生物，也可以用作重组微生物平台。与酵母属相似，大肠埃希氏菌拥有可供使用的突变体文库、质粒、代谢的详细计算机模型和其它信息，从而允许合理设计各种模块以提高产物产量。类似于上述用于酵母属的方法可用于制备重组大肠埃希氏菌微生物。
伞菌属某些种、赤霉菌属某些种和平革菌属某些种
伞菌属某些种、赤霉菌属某些种和平革菌属某些种是可用的，因为已知它们在培养物中产生大量类异戊二烯。因此，用于产生大量甜菊醇糖苷的萜烯前体已由内源基因产生。因此，可将包含甜菊醇糖苷生物合成多肽的重组基因的模块引入来自此类属的种中，而无需引入甲羟戊酸或MEP途径基因。
解腺嘌呤阿氏酵母(Blastobotrys adeninivorans)
解腺嘌呤阿氏酵母是具有独特的生物化学特征的二态酵母(其在高至42℃的温度下，生长为类似面包酵母的出芽酵母，高于该阈值，其以丝状形式生长)。其可在多种底物上生长，并且可以同化硝酸盐。其已被成功应用于产生可产生天然塑料的菌株，或者应用于开发用于环境样品中的雌激素的生物传感器。
解脂耶氏酵母
解脂耶氏酵母是二态酵母(参见解腺嘌呤阿氏酵母)并且属于半子囊菌科(Hemiascomycetes)。解脂耶氏酵母的整个基因组是已知的。耶氏酵母属的种是需氧的并且被认为是非致病性的。耶氏酵母属在使用疏水性底物(例如烷烃、脂肪酸、油)方面是高效的，并且可以在糖上生长。其具有很高的工业应用潜力，是一种产油微生物。解脂耶氏酵母可将脂质含量积累至干细胞重量的约40％，并且是用于脂质积累和再动员的模式生物体。参见，例如，Nicaud，2012，Yeast 29(10)：409-18；Beopoulos等，2009，Biochimie 91(6)：692-6；Bankar等，2009，Appl Microbiol Biotechnol.84(5)：847-65。
红酵母属某种
红酵母属是单细胞的、含色素的酵母。已显示产油红酵母粘红酵母从粗甘油产生脂质和类胡萝卜素(Saenge等，2011，Process Biochemistry 46(1)：210-8)。已显圆红冬孢酵母(Rhodotorula toruloides)菌株是用于改善生物质和脂质产生力的高效补料分批发酵系统(Li等，2007，Enzyme and Microbial Technology 41：312-7)。
圆红冬孢酵母
圆红冬孢酵母是产油酵母并且可用于工程化脂质产生途径(参见例如Zhu等，2013，Nature Commun.3：1112；Ageitos等，2011，Applied Microbiology andBiotechnology 90(4)：1219-27)。
博伊丁假丝酵母
博伊丁假丝酵母是甲基营养型酵母(其可以在甲醇上生长)。与其它甲基营养型物种诸如多形汉逊酵母和巴斯德毕赤酵母一样，其为产生异源蛋白质提供了极好的平台。已经报道了分泌型外源蛋白质在数克范围内的产率。最近，计算方法IPRO预测了在实验上将博伊丁假丝酵母木糖还原酶的辅因子特异性从NADPH转换为NADH的突变。参见例如，Mattanovich等，2012，Methods Mol Biol.824：329-58；Khoury等，2009，Protein Sci.18(10)：2125-38。
多形汉逊酵母(安格斯毕赤酵母(Pichia angusta))
多形汉逊酵母是甲基营养型酵母(参见博伊丁假丝酵母)。其还可在多种其它底物上生长；其是耐热的，并且可同化硝酸盐(另见乳酸克鲁维酵母)。其已被应用于生产乙型肝炎疫苗、胰岛素和干扰素α-2a(用于治疗丙型肝炎)，还用于一系列技术酶。参见，例如，Xu等，2014，Virol Sin.29(6)：403-9。
乳酸克鲁维酵母
乳酸克鲁维酵母是常规地应用于生产开菲尔(kefir)的酵母。其可在数种糖上生长，最重要地在存在于牛奶和乳清中的乳糖上生长。其已被成功地应用于，除其它以外，生产凝乳酶(一种通常存在于小牛胃中的酶)以生产奶酪。生产以40,000L规模在发酵罐中进行。参见，例如，van Ooyen等，2006，FEMS Yeast Res.6(3)：381-92。
巴斯德毕赤酵母
巴斯德毕赤酵母是甲基营养型酵母(参见博伊丁假丝酵母和多形汉逊酵母)。其为产生外源蛋白质提供了高效平台。平台元件可作为试剂盒提供，并且其在全球范围内在学术界中用于产生蛋白质。已将菌株工程化成可产生复杂的人N-聚糖(酵母聚糖与人中发现的类似，但不相同)。参见，例如，Piirainen等，2014，N Biotechnol.31(6)：532-7。
小立宛藓属某些种
小立碗藓苔藓(Physcomitrella mosses)在悬浮培养物中生长时具有与酵母或其它真菌培养物类似的特征。该属可用于产生可能难以在其它类型的细胞中产生的植物次生代谢产物。
应理解，本文公开的重组宿主细胞可包括植物细胞(包括在植物中生长的植物细胞)、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞(包括酵母细胞)，其中所述酵母细胞是来自酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母、光滑念珠菌、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)、杰丁塞伯林德纳氏酵母、巴斯德毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母、多形汉逊酵母、博伊丁假丝酵母、解腺嘌呤阿氏酵母(Arxula adeninivorans)、红发夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)或白色念珠菌物种(Candida albicans species)的细胞，或是酵母菌(Saccharomycete)或是酿酒酵母细胞、藻类细胞或细菌细胞(包括埃希氏菌属细胞、乳杆菌属(Lactobacillus)细胞、乳球菌属(Lactococcus)细胞、棒状杆菌属细胞、醋酸杆菌属细胞、不动杆菌属细胞或假单胞菌属细胞)。
甜菊醇糖苷组合物
甜菊醇糖苷在不同的食物体系中不一定具有等同的性能。因此希望具有将合成导向选择的甜菊醇糖苷组合物的能力。本文所述的重组宿主可产生选择性富集特定甜菊醇糖苷(例如，RebD或RebM)并具有一致的味道特征的组合物。如本文中所用，术语“富集”用于描述与来自甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物(提取物)相比具有增加的比例的特定甜菊醇糖苷的甜菊醇糖苷组合物。因此，本文所述的重组宿主可促进这样的组合物的产生，所述组合物被定制来满足给定食品所需的甜味特性，并且具有批次间一致的每种甜菊醇糖苷的比例。在一些实施方案中，本文所述的宿主不产生或产生减少量的在甜叶菊提取物中发现的不希望的植物副产品。因此，由本文所述的重组宿主产生的甜菊醇糖苷组合物与源自甜叶菊植物的组合物是可区分的。
积累的单种甜菊醇糖苷(例如，RebA、RebB、RebD或RebM)的量可以为约1至约7,000mg/L，例如，约1至约10mg/L、约3至约10mg/L、约5至约20mg/L、约10至约50mg/L、约10至约100mg/L、约25至约500mg/L、约100至约1,500mg/L，或约200至约1,000mg/L、至少约1,000mg/L、至少约1,200mg/L、至少约至少1,400mg/L、至少约1.600mg/L、至少约1.800mg/L、至少约2,800mg/L，或至少约7,000mg/L。在一些方面，甜菊醇糖苷的组合的量可超过7,000mg/L。甜菊醇糖苷(例如，RebA、RebB、RebD或RebM)的组合的积累量可以为约约1mg/L至约7,000mg/L，例如，约200至约1,500、至少约2,000mg/L、至少约3,000mg/L、至少约4,000mg/L、至少约5,000mg/L、至少约6,000mg/L或至少约7,000mg/L。在一些方面，甜菊醇糖苷的组合的量可超过7,000mg/L。一般来说，较长的培养时间将导致更大量的产物。因此，可将重组微生物培养1天至7天、1天至5天、3天至5天、约3天、约4天或约5天。
应当理解，本文讨论的各种基因和模块可存在于两种或更多种重组微生物中而不是单一微生物中。当使用多种重组宿主时，可将它们在混合培养物中生长以产生甜菊醇和/或甜菊醇糖苷。例如，第一微生物可包含一种或多种用于产生甜菊醇糖苷前体的生物合成基因，而第二微生物包含甜菊醇糖苷生物合成基因。然后回收第二或终微生物产生的产物。还应理解，在一些实施方案中，使用除培养基外的营养源并利用除发酵罐外的系统使重组微生物生长。
或者，可使两种或更多种微生物各自在单独的培养基中生长并且可将第一培养基的产物例如甜菊醇引入至第二培养基中以转化成随后的中间体或转化成终产物诸如RebA。然后回收第二或终微生物产生的产物。还应理解，在一些实施方案中，使用除培养基外的营养源并利用除发酵罐外的系统使重组微生物生长。
可将通过本文公开的方法获得的甜菊醇糖苷和组合物用于制备食品、膳食补充剂和甜味剂组合物。参见，例如，WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227和WO2014/122328。
例如，可将基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷诸如RebM或RebD包含在食品诸如冰淇淋、碳酸饮料、果汁、酸奶、烘焙食品、口香糖、硬糖和软糖以及调味汁中。还可将基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷包含在非食品产品诸如药品、医药产品、膳食补充剂和营养补充剂中。还可将基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷包含在用于农业产业和伴侣动物产业的动物饲料产品中。或者，可通过分别培养重组微生物(每种微生物产生特定的甜菊醇或甜菊醇糖苷)，从每种微生物中回收基本上纯的甜菊醇糖醇或甜菊醇糖苷，然后将化合物组合以获得包含所需比例的每种化合物的混合物来制备甜菊醇和/或甜菊醇糖苷的混合物。与目前的甜叶菊产品相比，本文所述的重组微生物允许获得更精确和一致的混合物。
在另一种替代方案中，可将基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷与其它甜味剂(例如糖精、右旋糖、蔗糖、果糖、赤藓糖醇、阿斯巴甜、三氯蔗糖、莫纳甜或乙酰磺胺酸钾)一起掺入食品中。甜菊醇或甜菊醇糖苷相对于其它甜味剂的重量比可根据需要改变，以在最终食品中获得令人满意的味道。参见，例如，U.S.2007/0128311。在一些实施方案中，可将甜菊醇或甜菊醇糖苷与风味剂(例如，柑橘)一起提供，以作为风味调节剂。
可将由本文所述的重组微生物产生的组合物掺入食物产品中。例如，取决于甜菊醇糖苷和食品的类型，可将由重组微生物产生的甜菊醇糖苷组合物按干重计以约20mg甜菊醇糖苷/kg的食品至约1800mg甜菊醇糖苷/kg的食品的量掺入食品中。例如，可将由重组微生物产生的甜菊醇糖苷组合物掺入甜食、冷的糖食(例如，冰淇淋)、乳制品(例如，酸奶)或饮料(例如，碳酸饮料)中，使得食品按干重计具有最多500mg甜味醇糖苷/kg的食物。可将由重组微生物产生的甜菊醇糖苷组合物掺入烘焙食品(例如，饼干)中，使得食品按干重计具有最多300mg甜菊醇糖苷/kg的食物。可将由重组微生物产生的甜菊醇糖苷组合物掺入酱汁(例如，巧克力糖酱)或蔬菜产品(例如，泡菜)中，使得食品按干重计具有最多1000mg甜菊醇糖苷/kg的食物。可将由重组微生物产生的甜菊醇糖苷组合物掺入面包中，使得食品按干重计具有最多160mg甜菊醇糖苷/kg的食物。可将由重组微生物、植物或植物细胞产生的甜菊醇糖苷组合物掺入硬糖或软糖中，使得食品按干重计具有最多1600mg甜菊醇糖苷/kg的食物。可将由重组微生物、植物或植物细胞产生的甜菊醇糖苷组合物掺入加工的水果产品(例如果汁、水果馅、果酱和果冻)中，使得食品按干重计具有最多1000mg甜菊醇糖苷/kg的食物。在一些实施方案中，本文中产生的甜菊醇糖苷组合物是药物组合物的组分。参见，例如，Steviol Glycosides Chemical and Technical Assessment 69th JECFA，2007，由Harriet Wallin，Food Agric.Org.筹备的；EFSA Panel on Food Additives andNutrient Sources added to Food(ANS)，“Scientific Opinion on the safety ofsteviol glycosides for the proposed uses as a food additive，”2010，EFSAJournal 8(4)：1537；美国食品药物管理局GRAS通告323；美国食品药物管理局GRAS通告329；WO 2011/037959；WO 2010/146463；WO 2011/046423和WO 2011/056834。
例如，此类甜菊醇糖糖组合物相对于源自植物的甜叶菊提取物可具有90-99重量％的RebA和不可检测量的源自甜叶菊植物的组分，并且基于干重以25-1600mg/kg，例如，100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg掺入食品中。
此类甜菊醇糖苷组合物可以是富含RebB的组合物，其具有大于3重量％的RebB并且被掺入至食品中，使得产品中RebB的量按干重计为25-1600mg/kg，例如，100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含RebB的组合物具有不可检测量的源自甜叶菊植物的组分。
此类甜菊醇糖苷组合物可以是富含RebD的组合物，其具有大于3重量％的RebD，并且被掺入到食品中，使得产品中RebD的量按干重计为25-1600mg/kg，例如，100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含RebD的组合物具有不可检测量的源自甜叶菊植物的组分。
此类甜菊醇糖苷组合物可以是富含RebE的组合物，其具有大于3重量％的RebE并且被掺入至食品中，使得产品中RebE的量按干重计为25-1600mg/kg，例如，100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含RebE的组合物具有不可检测量的源自甜叶菊植物的组分。
此类甜菊醇糖苷组合物可以是富含RebM的组合物，其具有大于3重量％的RebM并且被掺入至食品中，使得产品中RebM的量按干重计为25-1600mg/kg，例如，100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含RebM的组合物具有不可检测量的源自甜叶菊植物的组分。
在一些实施方案中，将基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷掺入佐餐甜味剂或“杯饮(cup-for-cup)”产品中。此类产品通常用本领域技术人员已知的一种或多种填充剂(例如，麦芽糖糊精)稀释至适当的甜度水平。可将富含RebA、RebB、RebD、RebE或RebM的甜菊醇糖苷组合物例如基于干重以10,000至30,000mg甜菊醇糖苷/kg产品包装于小袋中，用于佐餐使用。在一些实施方案中，在体外、体内或通过全细胞生物转化产生甜菊醇糖苷。
将在以下实施例中进一步描述本发明，所述实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。
实施例
实施例1.LC-MS分析程序
在与以负电离模式操作电喷雾电离(ESI)的Waters ACQUITY TQD三重四极杆质谱仪耦合的Waters ACQUITY(Waters Corporation)上进行LC-MS分析，所述WatersACQUITY具有配备有前置柱(2.1x 5mm，1.7μm的颗粒，的孔径)的WatersACQUITYBEH C18柱(2.1x 50mm，1.7μm的颗粒，的孔径)。使用两种流动相的梯度：A(含0.1％甲酸的水)和B(含0.1％甲酸的MeCN)，通过在0.3至2.0分钟内将从20％B升高至50％B，并在2.01分钟处升至100％B并保持100％B持续0.6分钟，再平衡0.6分钟来实现化合物分离。流速为0.6mL/分钟，并且柱温设置在55℃。使用SIM(单离子监测)监测甜菊醇糖苷并通过与真实的标准品比较来进行定量。关于所检测的甜菊醇糖苷的m/z痕迹和保留时间(trace and retention time)值参见表1。
表1.对映-贝壳杉烯酸、对映-贝壳杉烯醇和甜菊醇的糖苷的LC-MS分析数据.
实施例2.菌株工程化
如WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227和WO 2014/122328(其各自通过引用整体并入)所述构建产生甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株。例如，对包含一个或多个拷贝的以下基因的酵母菌株进行工程化以积累甜菊醇糖苷：编码GGPPS多肽的重组基因(SEQID NO：19、SEQ ID NO：20)，编码截短的CDPS多肽的重组基因(SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40)，编码KS多肽的重组基因(SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52)，编码重组KO多肽的重组基因(SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60)，编码ATR2多肽的重组基因(SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92)，编码EUGT11多肽的重组基因(SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16)，编码KAH多肽的重组基因(SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94)，编码CPR8多肽的重组基因(SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86)，编码UGT85C2多肽(SEQ ID NO：5/SEQ ID NO：6/SEQ ID NO：149、SEQ IDNO：7)或SEQ ID NO：7的UGT85C2变体(或功能同源物)的重组基因，编码UGT74G1多肽(SEQID NO：3、SEQ ID NO：4)或SEQ ID NO：4的UGT74G1变体(或功能同源物)的重组基因，编码UGT76G1多肽(SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9)或SEQ ID NO：9的UGT76G1变体(或功能同源物)的重组基因，和编码UGT91D2e多肽(SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11)和/或SEQ ID NO：11的UGT91D2e变体(或功能同源物)诸如UGT91D2e-b(SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13)多肽的重组基因。
实施例3.UGT74G1的底物特异性的调节
UGT74G1在甜叶菊植物中表达，并且除其它反应以外，催化13-SMG向甜茶苷的转化。因为UGT74G1表现出底物混杂性并且13-SMG在产生甜菊醇糖苷的宿主中积累，所以鉴定了用于催化13-SMG至甜茶苷的变体。
通过使用莱鲍迪苷B(RebB)作为底物进行对接分析，从UGT78K6(PDB：2C1Z)的晶体结构产生UGT74G1的同源性模型。选择RebB，因为其是已知UGT74G1对其具有活性的最大甜菊醇糖苷。使用Molecular Operating Environment(MOE)软件(Chemical ComputingGroup)中的建模套件产生同源性模型。
二十七个氨基酸在同源性模型中被测定为在RebB的内。结果示于2中。使用UGT74G1(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4)的GENEARTTM密码子优化形式中的GENEARTTM(ThermoFisher Scientific)制备27个氨基酸的UGT74G1位点饱和文库(SSL)筛选。组氨酸23(即，His23)是完全保守的并且被认为具有催化活性，因此不包括在位点饱和文库中。在如实施例2中所述的产生甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株中用p416-GPD载体表达460个位点饱和变体，并将其进一步工程化以破坏天然UGT74G1多肽的表达，并在以400rpm振荡的条件下于30℃下在1mL合成完全(SC)尿嘧啶缺陷培养基(uracil dropout media)中孵育5天。将50μL每种培养物转移到50μL DMSO中，在80℃下孵育10分钟，并以3220g离心5分钟。然后将15μL所得上清液转移至105μL 50％的DMSO中进行LC-MS分析。
表2.在同源性模型中鉴定的UGT74G1残基
从SSL变体中选择7个候选物并测序(参见表3)。当表达此类突变的UGT74G1时，这些突变使得产生甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株的存活力增加(参见，图3)。
表3.经测序的UGT74G1变体
对于每种表达UGT74G1 SSL候选物的酿酒酵母菌株，测定对应于甜菊醇、对映-贝壳杉烯醇(KL)、对映-贝壳杉烯酸(KA)的几种糖苷的LC-MS衍生峰的浓度(μM)值或曲线下面积(AUC)值。针对细胞OD600(μM/OD或AUC/OD)归一化的结果示于表4-6中。
表6.使用UGT74G1 SSL候选物产生糖基化的对映-贝壳杉烯酸和糖基化的对映-贝壳杉烯醇(以AUC/OD600计).
KA2.7 KA3.1 KA3.2 KL3.1&KL3.2
UGT74G1 1,026±102 213±31 4,338±374 1,003±93
Var_1 1,190±96 235±33 6,991±625 603±90
Var_2 1,014±102 227±28 6,055±309 807±95
Var_3 N/A N/A 24±29 776±96
Var_4 871±45 203±38 5,710±376 795±46
Var_5 1,070±60 216±51 6,413±553 794±64
Var_6 947±54 215±58 5,415±241 724±76
Var_7 312±33 99±19 2,314±233 811±74
如表4-6所示，UGT74G1 SSL候选物的表达导致甜菊醇、对映-贝壳杉烯醇和/或对映-贝壳杉烯酸的一种或多种糖苷的积累增加和/或减少，从而提供相对于表达野生型UGT74G1多肽的宿主改变的糖苷积累分布。
实施例4.UGT74G1-b-UGT85C2和UGT85C2-b-UGT74G1嵌合酶的评价
UGT85C2在甜叶菊植物中表达，并除其它反应以外，催化甜菊醇转化为甜菊醇-13-O-糖苷(13-SMG)，所述甜菊醇-13-O-糖苷被UGT74G1进一步转化为甜茶苷。然而，UGT74G1可能与其它甜菊醇糖苷途径酶不同地定位于酵母细胞中，导致表观活性降低。
通过向前导UGT添加C末端SpeI限制性位点和两个胸腺嘧啶以在两个UGT之间获得“KLVK”四肽来产生UGT74G1(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4)和UGT85C2(SEQ ID NO：149、SEQID NO：7)的GENEARTTM密码子优化形式的融合构建体。还通过在编码五肽RASST的序列的上游插入编码上述四肽的序列、从而产生接头序列“RASSTKLVK”(SEQ ID NO：150)来产生融合构建体。产生了三种这样的构建体Chim_1-Chim_3(参见表7)。
通过PCR缝合直接将两个UGT的N和C末端直接融合，或通过将两个UGT的N和C末端与一个或三个重复的五肽“GGGGS”柔性连接来另外产生UGT74G1(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4)和UGT85C2(SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：7)的GENEARTTM密码子优化形式的融合构建体，如Chen等，“Fusion protein linkers：Property，design and functionality，”AdvancedDrug Delivery Reviews65(0)：1257-69(2013)中所描述的。产生了六种这样的构建体Chim_4-Chim_9(参见表7)。根据实施例3表达并分析融合构建体。
表7.UGT74G1/UGT85C2嵌合酶
名称 融合构建体 SEQ ID NO
Chim_1 UGT85C2-RASSTKLVK-UGT74G1 131，132
Chim_2 UGT74G1-RASSTKLVK-UGT85C2 133，134
Chim_3 UGT74G1-KLVK-UGT85C2 135，136
Chim_4 UGT85C2-(GGGGS)<sub>3</sub>-UGT74G1 137，138
Chim_5 UGT85C2-(GGGGS)<sub>1</sub>-UGT74G1 139，140
Chim_6 UGT85C2-UGT74G1 141，142
Chim_7 UGT74G1-(GGGGS)<sub>3</sub>-UGT85C2 143，144
Chim_8 UGT74G1-(GGGGS)<sub>1</sub>-UGT85C2 145，146
Chim_9 UGT74G1-UGT85C2 147，148
对于每种UGT74G1-b-UGT85C2和UGT85C2-b-UGT74G1嵌合酶，测定对应于几种甜菊醇糖苷、对映-贝壳杉烯醇(KL)和对映-贝壳杉烯酸(KA)的LC-MS衍生峰的浓度(μM)值或曲线下面积(AUC)值。针对细胞OD600(μM/OD600或AUC/OD600)归一化的结果示于表8-10中。
表10.使用UGT74G1/UGT85C2嵌合酶产生糖基化的对映-贝壳杉烯酸和糖基化的对映-贝壳杉烯醇(以AUC/OD600计)
如表8-10所示，UGT74G1/UGT85C2嵌合酶的表达导致甜菊醇、对映-贝壳杉烯醇和/或对映-贝壳杉烯酸的一种或多种糖苷的积累增加和/或减少，从而提供了相对于表达野生型UGT74G1和/或UGT85C2的宿主改变的糖苷积累分布。
实施例5.标记的UGT74G1多肽的表达
进一步工程化如实施例2中所述的产生甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株(其还包含并表达编码KO多肽的重组基因(SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：64)和编码KAH多肽的重组基因(SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97))以破坏天然UGT74G1多肽的表达。
将天然的UGT74G1-破坏的菌株工程化以包含并表达标记的UGT74G1蛋白。标签是二硫化物氧化还原酶(DsbA：SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：152)、麦芽糖结合蛋白(MBP；SEQID NO：157、SEQ ID NO：153)、N-利用物质(NusA；SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：154)、小遍在蛋白样修饰物(SUMO；SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：155)。不受理论束缚，结果表明此类标签在增加UGT诸如UGT74G1的溶解度方面起作用，这可能导致甜菊醇糖苷(包括RebD和RebM)的积累增加。参见图7-14。
实施例6.UGT74G1的底物特异性的调节(续)
UGT74G1在甜叶菊植物中表达，并且除其它反应以外，催化13-SMG向甜茶苷的转化。因为UGT74G1表现出底物混杂性并且13-SMG在产生甜菊醇糖苷的宿主中积累，所以鉴定了用于催化13-SMG至甜茶苷的替代基因。
通过使用莱鲍迪苷B(RebB)作为底物进行对接分析，从UGT78K6(PDB：2C1Z)的晶体结构产生UGT74G1的同源模型。选择RebB，因为其是已知UGT74G1对其具有活性的最大甜菊醇糖苷。使用Molecular Operating Environment(MOE)软件(Chemical Computing Group)中的建模套件产生同源性模型。
二十七个氨基酸在同源性模型中被测定为在RebB的内。结果示于表2中(参见上文实施例3)。使用UGT74G1(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4)的GENEARTTM密码子优化形式中的GENEARTTM(Thermo Fisher Scientific)制备27个氨基酸的UGT74G1位点饱和文库(SSL)筛选。组氨酸23(即，His23)是完全保守的并且被认为具有催化活性，因此不包括在位点饱和文库中。除了上述实施例3中表达的变体以外，在如实施例2中所述的产生甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株中用p416-GPD载体表达1056个位点饱和变体，所述酿酒酵母菌株还包含并表达编码KO多肽的重组基因(SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：64)和编码KAH多肽的重组基因(SEQID NO：96、SEQ ID NO：97)，并被进一步工程化以破坏天然UGT74G1多肽的表达。将菌株在以400rpm振荡的条件下在1mL合成完全(SC)尿嘧啶缺陷型培养基中于30℃下孵育5天。将50μL每种培养物转移到50μL DMSO中，在80℃下孵育10分钟，并以3220g离心5分钟。然后将15μL所得上清液转移至105μL 50％的DMSO中进行LC-MS分析。
从SSL变体中选择5个候选物(Var_8-Var_12)并测序(参见表11)。
表11.经测序的UGT74G1变体
对于表达UGT74G1 SSL候选物的每种酿酒酵母菌株，测定对应于甜菊醇和对映-贝壳杉烯酸(KA)的几种糖苷的LC-MS衍生峰的浓度(μM)值或曲线下面积(AUC)值。针对细胞OD600(μM/OD或AUC/OD)归一化的结果示于表12-14中。
表14.使用UGT74G1 SSL候选物产生糖基化的对映-贝壳杉烯酸(以AUC/OD600计).
KA2.7 KA3.1 KA3.2
UGT74G1 1184±75 246±34 6195±585
Var_8 597±51 44±76 3351±445
Var_9 856±108 152±133 4618±709
Var_10 1304±33 293±32 7407±867
Var_11 1685±141 285±21 8029±1079
Var_12 833±157 135±117 3836±1664
如表12-14中所示，UGT74G1 SSL候选物的表达导致甜菊醇、对映-贝壳杉烯醇和/或对映-贝壳杉烯酸的一种或多种糖苷的积累增加和/或减少，从而提供了相对于表达野生型UGT74G1多肽的宿主改变的糖苷积累分布。
实施例7.标记的UGT74G1多肽的表达(菌株1)
对如实施例2中所述的产生甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株进一步工程化以破坏天然UGT74G1多肽的表达，所述酿酒酵母菌株包含并表达编码KO多肽的重组基因(SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：64)和编码KAH多肽的重组基因(SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97)。
进一步转化菌株以包含并表达与TEF1启动子(SEQ ID NO：170)和ADH1终止子(SEQID NO：171)可操作地连接的标记的UGT74G1多肽候选物。UGT74G1(SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：4)的GENEARTTM密码子优化形式和在所述蛋白质的N末端部分的目标标签(包括二硫化物氧化还原酶(DsbA：SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：152)、麦芽糖结合蛋白(MBP；SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：153)、N-利用物质(NusA；SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：154)和小遍在蛋白样修饰物(SUMO；SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：155))的经标记的构建体通过用可溶性接头(SEQID NO：172、SEQ ID NO：151)对两个片段进行PCR-缝合来产生。参见图15。
表15.标记的UGTG74G1多肽
名称 构建体 SEQ ID NO
Chim_10 DsbA-EGKSSGSGSESKST-UGT74 173，174
Chim_11 MBP-EGKSSGSGSESKST-UGT74 175，176
Chim_12 NusA-EGKSSGSGSESKST-UGT74 177，178
Chim_13 SUMO-EGKSSGSGSESKST-UGT74 179，180
在抗生素平板上选择转化体，并通过PCR验证构建体的存在。
将转化菌株的单菌落在以280rpm振荡的条件下在Kuhner ISF-1-W孵育箱中于30℃下在Duetz 96-深孔板系统中的500μL缓冲的Delft培养基中生长一天。然后将来自每个孔的50μL细胞培养物转移到含有450μL缓冲的Delft培养基的新Duetz 96-深孔板系统中。然后将深孔板在以280rpm振荡的条件下在Kuhner ISF-1-W孵育箱中于30℃下生长4天，然后准备进行LC-MS分析。通过用100μL DMSO提取100μL细胞溶液，涡旋直至混合，并在80℃孵育10分钟来制备用于LC-MS分析的样品。通过以10,000g离心10分钟使所得提取物澄清。用140μL 50％(v/v)DMSO稀释20μL上清液以用于LC-MS注射。将LC-MS数据针对在多标签读取仪(PerkinElmer，Waltham，Ma)上测量的100μL细胞溶液与100μL水的混合物的OD600进行归一化。
根据实施例1进行LC-MS分析。6个独立克隆的平均结果示于表16-18中。
表18.使用标记的UGT74G1多肽(SEQ ID NO：174、176、178和180)或WT UGT74G1多肽(SEQ ID NO：4)产生糖基化的对映-贝壳杉烯酸(以AUC/OD600计).
KA2.7 KA3.1 KA3.2
UGT74G1 6537±2312 1008±555 30440±11785
Chim_10 1702±425 713±211 12809±3137
Chim_11 1228±405 379±336 8641±3274
Chim_12 2561±1340 738±562 15009±7935
Chim_13 2018±456 383±230 9503±3167
如表16-18所示，标记的UGT74G1融合候选物在酵母中的表达通常导致KA+2Glc、KA+3Glc异构体2、KA-3Glc异构体1、RebB和甜茶苷的减少。同时，观察到更高分子量的甜菊醇糖苷的积累增加，表明与野生型UGT74G1酶相比，通过标记的UGT74G1融合候选物将甜菊醇糖苷和其它中间体更好地转化为至少RebD和RebM。不受理论束缚，结果表明标签在增加多肽(例如UGT74G1)的溶解度中起作用，因此其更好的活性可导致甜菊醇糖苷(包括RebD和RebM)的积累增加。参见图7-14。
实施例8.标记的UGT74G1多肽的表达(菌株2)
用两个独立的整合载体(所述载体包含与TEF1启动子(SEQ ID NO：170)和ADH1终止子(SEQ ID NO：171)可操作地连接的标记的UGT74G1多肽(如实施例7中所述))转化如实施例2中所述的产生甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株，所述酿酒酵母菌株被进一步工程化以包含并表达编码KO多肽的重组基因(SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：64)和编码KAH多肽的重组基因(SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97)。在抗生素平板上选择转化体，并通过PCR验证构建体的存在。
将转化菌株的单菌落在以280rpm振荡的条件下在Kuhner ISF-1-W孵育箱中于30℃下在Duetz 96-深孔板系统中的500μL缓冲的Delft培养基中生长一天。然后将来自每个孔的50μL细胞培养物转移到含有450μL缓冲的Delft培养基的新Duetz 96-深孔板系统中。然后将深孔板在以280rpm振荡的条件下在Kuhner ISF-1-W孵育箱中于30℃下生长4天，然后准备进行LC-MS分析。通过用100μL的DMSO提取100μL细胞溶液，涡旋直至混合，并在80℃孵育10分钟来制备用于LC-MS分析的样品。通过以10,000g离心10分钟使所得提取物澄清。用140μL 50％(v/v)DMSO稀释20μL上清液以用于LC-MS注射。将LC-MS数据针对在多标签读取仪(PerkinElmer，Waltham，Ma)上测量的100μL细胞溶液与100μL水的混合物的OD600进行归一化。
根据实施例1进行LC-MS分析。每种构建体的平均6个克隆的结果显示在图10至12中。
标记有溶解度的UGT74G1融合候选物在产生甜菊醇糖苷的菌株中的表达导致以下所有UGT74G1依赖性底物的积累减少：KA+2Glc(#7)、KA+3Glc异构体2以及KA-3Glc异构体1和13-SMG。不受理论束缚，结果表明，与野生型UGT74G1多肽相比，具有改善的溶解度的标记的UGT74G1的表达增加了甜菊醇的一种或多种糖苷的积累，这归因于甜菊醇前体(诸如，对映-贝壳杉烯酸)更好地转化为甜菊醇以及甜菊醇糖苷前体(诸如13-SMG)更好地转化为RebD和RebM。
实施例9.标记的UGT74G1多肽的表达(菌株3和4)
用载体转化经进一步工程化以包含并表达编码KAH多肽的重组基因(SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97)和编码KO多肽的重组基因(SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：64)的如实施例2中所述的产生甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株，所述载体包含另外拷贝的与pTEF1启动子(SEQID NO：170)和CYC1终止子(SEQ ID NO：183)可操作地连接的编码YNK1多肽的基因(SEQ IDNO：181、SEQ ID NO：182)、另外拷贝的与pTEF1启动子(SEQ ID NO：170)和CYC1终止子(SEQID NO：183)可操作地连接的编码PGM1多肽的基因(SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：185)、另外拷贝的与pPGK1启动子(SEQ ID NO：188)和tADH1终止子(SEQ ID NO：171)可操作地连接的编码PGM2多肽的基因(SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：187)以及另外拷贝的与pPGK1启动子(SEQ ID NO：188)和tADH1终止子(SEQ ID NO：171)可操作地连接的编码UGP1多肽的基因(SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：190)。用载体转化两个独立克隆，所述载体包含与TEF1启动子(SEQ ID NO：170)和ADH1终止子(SEQ ID NO：171)可操作地连接的经标记的UGT74G1多肽(如实施例7中所述)。在抗生素平板上选择转化体，并通过PCR验证构建体的存在。
将转化菌株的单菌落在以280rpm振荡的条件下在Kuhner ISF-1-W孵育箱中于30℃下在Duetz 96-深孔板系统中的500μL缓冲的Delft培养基中生长一天。然后将来自每个孔的50μL细胞培养物转移到含有450μL缓冲的Delft培养基的新Duetz 96-深孔板系统中。然后将深孔板在以280rpm振荡的条件下，在Kuhner ISF-1-W孵育箱中于30℃下生长4天，然后准备进行LC-MS分析。通过用100μL的DMSO提取100μL细胞溶液，涡旋直至混合，并在80℃孵育10分钟来制备用于LC-MS分析的样品。通过以10,000g离心10分钟使所得提取物澄清。用140μL 50％(v/v)DMSO稀释20μL上清液以用于LC-MS注射。将LC-MS数据针对在多标签读取仪(PerkinElmer，Waltham，Ma)上测量的100μL细胞溶液与100μL水的混合物的OD600进行归一化。
根据实施例1进行LC-MS分析。结果示于图13和图14中。
标记的UGT74G1多肽在产生甜菊醇糖苷的菌株中的表达导致UGT74G1依赖性底物(包括KA+2Glc(#7)、KA+3Glc(异构体2)、KA+3Glc(异构体1)和13-SMG)的积累减少。不受理论束缚，结果表明，与野生型UGT74G1多肽相比，具有改善的溶解度的标记的UGT74G1多肽的表达增加了一种或多种甜菊醇糖苷的积累，这归因于甜菊醇前体更好地转化为甜菊醇以及甜菊醇糖苷前体进一步地糖基化为例如RebD和RebM。
在已详地并参考其具体实施方案描述了本发明后，显而易见的是，在不脱离所附权利要求限定的本发明范围的情况下，可进行修改和变化。更具体地，尽管本发明的一些方面在本文中被认为特别有利，但是预期本发明不必限于本发明的这些特定方面。
表19.本文公开的序列.

Claims (54)

1.一种能够产生一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含：
(a)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的基因，所述多肽与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性，并且还具有至少一个对应于SEQ ID NO：4的残基79、80、81、83、184、260、286或377的氨基酸取代；
(b)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的基因，所述多肽与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性，并且还具有至少一个对应于SEQ ID NO：4的残基68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82或83的氨基酸取代；
(c)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的双功能多肽的基因，所述双功能多肽与SEQ ID NO：132、SEQ IDNO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：140或SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：148所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性；和/或
(d)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的经标记的多肽的基因，所述多肽与SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：178或SEQ ID NO：180所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性；
其中所述基因中的至少一种是重组基因；以及
其中所述重组宿主细胞能够产生对映-贝壳杉烯酸、对映-贝壳杉烯醇或甜菊醇的糖苷。
2.如权利要求1所述的重组宿主细胞，其中能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的所述多肽包含对应于SEQ ID NO：4的M79V、M79E、S80C、A81W、E83K、H184V、H184TN260T、K286C、K286E、K286N、K286T和/或S377Q氨基酸取代。
3.如权利要求1所述的重组宿主细胞，其中能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的所述多肽包含：
(a)对应于SEQ ID NO：4的K286C取代；
(b)对应于SEQ ID NO：4的M79V取代；
(c)对应于SEQ ID NO：4的S377Q取代；
(d)对应于SEQ ID NO：4的S80C取代；
(e)对应于SEQ ID NO：4的N260T和K286C取代；
(f)对应于SEQ ID NO：4的H184V取代；
(g)对应于SEQ ID NO：4的A81W和E83K取代；
(h)对应于SEQ ID NO：4的A81W取代；
(i)对应于SEQ ID NO：4的H184T取代；
(k)对应于SEQ ID NO：4的K286N取代；
(l)对应于SEQ ID NO：4的M79E取代；或
(m)对应于SEQ ID NO：4的K286T取代。
4.如权利要求1-3中任一项所述的重组宿主细胞，其中能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的所述多肽还包含标签。
5.如权利要求4所述的重组宿主细胞，其中所述标签包含与SEQ ID NO：152的二硫化物氧化还原酶、SEQ ID NO：153的麦芽糖结合蛋白、SEQ ID NO：154的N-利用物质或SEQ IDNO：155的小遍在蛋白样修饰物具有至少90％同一性的标签序列。
6.如权利要求4或5所述的重组宿主细胞，其中能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的所述多肽包含与SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：178或SEQ IDNO：180所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽。
7.如权利要求1-6中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞还包含：
(a)编码能够从法呢基二磷酸(FPP)和异戊烯基二磷酸(IPP)合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)的多肽的基因；
(b)编码能够从GGPP合成对映-柯巴基二磷酸的多肽的基因；
(c)编码能够从对映-柯巴基二磷酸合成对映-贝壳杉烯的多肽的基因；
(d)编码能够从对映-贝壳杉烯合成对映-贝壳杉烯酸的多肽的基因；
(e)编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因；
(f)编码能够从对映-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽的基因；
(g)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽的基因；
(h)编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3′进行β1，3糖基化的多肽的基因；
(i)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的基因；和/或
(k)编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′进行β1，2糖基化的多肽的基因；
其中所述基因中的至少一种基因是重组基因。
8.如权利要求7所述的重组宿主细胞，其中：
(a)能够合成GGPP的所述多肽包含与SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：116所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(b)能够合成对映-柯巴基二磷酸的所述多肽包含与SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：120所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(c)能够合成对映-贝壳杉烯的所述多肽包含与SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ IDNO：48、SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(d)能够合成对映-贝壳杉烯酸的所述多肽包含与SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQID NO：117、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：76所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(e)能够还原细胞色素P450复合物的所述多肽包含与SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(f)能够合成甜菊醇的所述多肽包含与SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106、SEQ IDNO：108、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：112或SEQ ID NO：114所示的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(g)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的所述多肽包含与SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；
(h)能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C3′进行β1，3糖基化的所述多肽包含与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽；
(i)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的所述多肽包含与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；和/或
(k)能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或者13-O-葡萄糖和19-O-葡萄糖两者的C2′进行β1，2糖基化的所述多肽包含与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有80％或更高同一性的多肽；与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列具有80％或更高同一性的多肽；或与SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列具有至少65％序列同一性的多肽。
9.如权利要求1-8中任一项所述的重组宿主细胞，其中相对于缺少所述一种或多种重组基因的相应宿主，所述一种或多种重组体的表达增加了由所述细胞积累的所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的量。
10.如权利要求9所述的重组宿主细胞，其中相对于缺少所述一种或多种重组基因的相应宿主，所述一种或多种重组基因的表达使由所述细胞积累的所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的量增加至少约5％、至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％或至少约100％。
11.如权利要求9或10所述的重组宿主细胞，其中相对于缺少所述一种或多种重组基因的相应宿主，所述一种或多种重组基因的表达增加了由所述细胞积累的对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、对映-贝壳杉烯醇+2Glc(#8)、对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)、甜菊醇-19-O-葡糖苷(19-SMG)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、1，2-甜菊苷、莱鲍迪苷A(RebA)、莱鲍迪苷B(RebB)、莱鲍迪苷E(RebE)、甜菊醇+4Glc(#24和/或#25)，甜菊醇+4Glc(#26)、甜菊醇+4Glc(#33)、莱鲍迪苷D(RebD)、甜菊醇+5Glc、莱鲍迪苷M(RebM)、甜菊醇+6Glc(#23)、甜菊醇+7Glc(异构体2)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)。
12.如权利要求1-11中任一项所述的重组宿主细胞，其中相对于缺少所述一种或多种重组基因的相应宿主，所述一种或多种重组基因的表达减少了由所述细胞积累的所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的量。
13.如权利要求12所述的重组宿主细胞，其中相对于缺少所述一种或多种重组基因的相应宿主，所述一种或多种重组基因的表达使由所述细胞积累的所述一种或多种甜菊醇糖苷的量减少至少约5％、至少约10％、至少约25％或至少约50％。
14.如权利要求11或12所述的重组宿主细胞，其中相对于缺少所述一种或多种重组基因的相应宿主，所述一种或多种重组基因的表达减少了由所述细胞积累的对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、19-SMG、1，2-甜菊苷、RebA、甜菊醇+4Glc(#26)、RebD、甜菊醇+5Glc(#24)、甜菊醇+5Glc(#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、RebM、甜菊醇+7Glc(异构体2)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的量。
15.如权利要求1-14中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体是以下物质或其组合物包含以下物质：13-SMG、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜茶苷、RebA、RebB、RebC、RebD、RebE、莱鲍迪苷F(RebF)、RebM、莱鲍迪苷Q(RebQ)、莱鲍迪苷I(RebI)、杜可尔苷A、单-糖基化的对映-贝壳杉烯酸、二-糖基化的对映-贝壳杉烯酸、三-糖基化的对映-贝壳杉烯酸、单-糖基化的对映-贝壳杉烯醇、二-糖基化的对映-贝壳杉烯醇、三-糖基化的对映-贝壳杉烯醇、三-糖基化的甜菊醇糖苷、四-糖基化的甜菊醇糖苷、五-糖基化的甜菊醇糖苷、六-糖基化的甜菊醇糖苷，七-糖基化的甜菊醇糖苷和/或其异构体。
16.如权利要求15所述的重组宿主细胞，其中：
(a)所述二-糖基化的对映-贝壳杉烯酸包括表1的KA2.7；
(b)所述三-糖基化的对映-贝壳杉烯酸包括表1的KA3.1或KA3.2；
(c)所述二-糖基化的对映-贝壳杉烯醇包括表1的KL2.8；
(d)所述三-糖基化的对映-贝壳杉烯醇包括表1的KL3.1或KOL3.2；
(e)所述甜菊醇糖苷包括13-SMG、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、RebA、RebE、RebD或RebM；
(f)所述四-糖基化的甜菊醇包括表1的化合物4.26或化合物4.33；
(g)所述五-糖基化的甜菊醇包括表1的化合物5.24或化合物5.25；
(h)所述六-糖基化的甜菊醇包括表1的化合物6.1或化合物6.23；和/或
(i)所述七-糖基化的甜菊醇包括表1的化合物7.2或化合物7.5。
17.如权利要求1-16中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包括植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类细胞或细菌细胞。
18.一种在细胞培养物中产生一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的方法，所述方法包括在其中表达所述基因的条件下在所述细胞培养物中生长如权利要求1-17中任一项所述的重组宿主细胞，并且其中所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物由所述细胞培养物中的所述重组宿主细胞产生。
19.如权利要求18所述的方法，其中组成型地表达所述基因和/或诱导所述基因的表达。
20.如权利要求18或19所述的方法，其中相对于缺少所述一种或多种重组基因的相应宿主，由所述细胞积累的对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、对映-贝壳杉烯醇+2Glc(#8)、对映-贝壳杉烯醇+3Glc(异构体1和/或异构体2)、13-SMG、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、1，2-甜菊苷、RebB、RebA、RebE、甜菊醇+4Glc(#24和/或#25)、甜菊醇+4Glc(#26)、甜菊醇+4Glc(#33)、RebD、甜菊醇+5Glc、RebM、甜菊醇+6Glc(#23)、甜菊醇+7Glc(异构体2)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的量增加至少约5％。
21.如权利要求18-20中任一项所述的方法，其中相对于缺少所述一种或多种重组基因的相应宿主，由所述细胞积累的对映-贝壳杉烯酸+2Glc(#7)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体1)、对映-贝壳杉烯酸+3Glc(异构体2)、19-SMG、1，2-甜菊苷、RebA、甜菊醇+4Glc(#26)、RebD、甜菊醇+5Glc(#24)、甜菊醇+5Glc(#25)、甜菊醇+6Glc(异构体1)、RebM、甜菊醇+7Glc(异构体2)和/或甜菊醇+7Glc(异构体5)的量减少至少约5％。
22.如权利要求18-21中任一项所述的方法，所述方法还包括从所述细胞培养物中分离由此产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述分离步骤包括：
(a)提供包含所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的所述细胞培养物；
(b)将所述细胞培养物的液相与所述细胞培养物的固相分离，以获得包含所产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的上清液；
(c)提供一种或多种吸附树脂，包括在填充柱中提供所述吸附树脂；以及
(d)使步骤(b)的所述上清液与所述一种或多种吸附树脂接触，以获得至少一部分所产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物，从而分离所产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物；
或者
(a)提供包含所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的所述细胞培养物；
(b)将所述细胞培养物的液相与所述细胞培养物的固相分离，以获得含有所产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的上清液；
(c)提供一个或多个离子交换或离子交换或反相色谱柱；以及
(d)使步骤(b)的所述上清液与所述一个或多个离子交换或离子交换或反相色谱柱接触，以获得至少一部分所产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物，从而分离所产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物；
或者
(a)提供包含所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的所述细胞培养物；
(b)将所述细胞培养物的液相与所述细胞培养物的固相分离，以获得含有所产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的上清液；
(c)结晶或提取所产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物，从而分离所产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物。
24.如权利要求18-21中任一项所述的方法，所述方法还包括从所述细胞培养物中回收所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物，其中所述细胞培养物相对于源自甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物富集了所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物，并且相对于源自植物的甜叶菊提取物具有降低的水平的源自甜叶菊植物的组分。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述回收的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物以与从甜叶菊植物中回收的甜菊醇糖苷组合物不同的相对量存在，并且相对于源自植物的甜叶菊提取物具有降低水平的源自甜叶菊植物的组分。
26.一种用于产生一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的方法，所述方法包括在重组宿主细胞的细胞培养基中使用以下多肽对源自植物的或合成的甜菊醇、甜菊醇前体、糖基化的甜菊醇前体和/或甜菊醇糖苷进行的全细胞生物转化：
(a)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽，所述多肽与SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性，并且还具有至少一个对应于SEQ ID NO：4的残基79、80、81、83、184、260、286或377的氨基酸取代；
(b)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽，所述多肽与SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性，并且还具有至少一个对应于SEQ ID NO：4的残基68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82或83的氨基酸取代；
(c)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的双功能多肽，所述双功能多肽与SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQID NO：136、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：140或SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：148所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性；和/或
(d)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽，所述多肽与SEQID NO：174、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：178或SEQ ID NO：180所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性；
其中所述多肽中的至少一种是在所述重组宿主细胞中表达的重组多肽；并由此产生所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物。
27.如权利要求18-26中任一项所述的方法，其中所述重组宿主细胞是植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类细胞或细菌细胞。
28.一种用于产生一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物的体外方法，所述方法包括向反应混合物中添加：
(a)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽，所述多肽与SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性，并且还具有至少一个对应于SEQ ID NO：4的残基79、80、81、83、184、260、286或377的氨基酸取代；
(b)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽，所述多肽与SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性，并且还具有至少一个对应于SEQ ID NO：4的残基68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82或83的氨基酸取代；
(c)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的双功能多肽，所述双功能多肽与SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQID NO：136、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：140或SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：148所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性；和/或
(d)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽，所述多肽与SEQID NO：174、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：178或SEQ ID NO：180所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性；
和源自植物的或合成的甜菊醇糖苷前体或源自植物的或合成的甜菊醇前体；
其中所述多肽中的至少一种是重组多肽；以及
由此产生所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述反应混合物包含：
(a)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-葡糖胺；和/或
(b)反应缓冲剂和/或盐。
30.如权利要求18-29中任一项所述的方法，其中所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体是以下物质或其组合物包含以下物质：13-SMG、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜茶苷、RebA、RebB、RebC、RebD、RebE、RebF、RebM、RebQ、RebI、杜可尔苷A、单-糖基化的对映-贝壳杉烯酸、二-糖基化的对映-贝壳杉烯酸、三-糖基化的对映-贝壳杉烯酸、单-糖基化的对映-贝壳杉烯醇、二-糖基化的对映-贝壳杉烯醇、三-糖基化的对映-贝壳杉烯醇、三-糖基化的甜菊醇糖苷、四-糖基化的甜菊醇糖苷、五-糖基化的甜菊醇糖苷、六-糖基化的甜菊醇糖苷、七-糖基化的甜菊醇糖苷和/或其异构体。
31.如权利要求30所述的方法，其中：
(a)所述二-糖基化的对映-贝壳杉烯酸包括表1的KA2.7；
(b)所述三-糖基化的对映-贝壳杉烯酸包括表1的KA3.1或KA3.2；
(c)所述二-糖基化的对映-贝壳杉烯醇包括表1的KL2.8；
(d)所述三-糖基化的对映-贝壳杉烯醇包括表1的KL3.1或KOL3.2；
(e)所述甜菊醇糖苷包括13-SMG、19-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜茶苷、RebA、RebE、RebD或RebM；
(f)所述四-糖基化的甜菊醇包括表1的化合物4.26或化合物4.33；
(g)所述五-糖基化的甜菊醇包括表1的化合物5.24或化合物5.25；
(h)所述六-糖基化的甜菊醇包括表1的化合物6.1或化合物6.23；和/或
(i)所述七-糖基化的甜菊醇包括表1的化合物7.2或化合物7.5。
32.一种细胞培养物，其包含如权利要求1-17中任一项所述的重组宿主细胞，所述细胞培养物还包含：
(a)由所述重组宿主细胞产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体，或其组合物，
(b)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-葡糖胺；和
(c)补充营养物，包括微量金属、维生素、盐、酵母氮源基础(YNB)和/或氨基酸；
其中由所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物以至少1mg/升的所述细胞培养物的浓度存在；
其中所述细胞培养物相对于来自甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物富集了所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物，并且相对于源自植物的甜叶菊提取物具有降低水平的源自甜叶菊植物的组分。
33.一种来自在细胞培养物中生长的如权利要求1-17中任一项所述的重组宿主细胞的细胞裂解物，所述细胞裂解物包含：
(a)由所述重组宿主细胞产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体，或其组合物；
(b)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-葡糖胺；和/或
(c)补充营养物，其包含微量金属、维生素、盐、酵母氮源基础、YNB和/或氨基酸；
其中由所述重组宿主细胞产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体或其组合物以至少1mg/升的所述细胞培养物的浓度存在。
34.一种反应混合物，所述反应混合物包含：
(a)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽，所述多肽与SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性，并且还具有至少一个对应于SEQ ID NO：4的残基79、80、81、83、184、260、286或377的氨基酸取代；
(b)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽，所述多肽与SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性，并且还具有至少一个对应于SEQ ID NO：4的残基68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82或83的氨基酸取代；
(c)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的双功能多肽，所述双功能多肽与SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQID NO：136、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：140或SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：148所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性；和/或
(d)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽，所述多肽与SEQID NO：174、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：178或SEQ ID NO：180所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性；
并且还包含：
(e)一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体，或其组合物；
(f)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-葡糖胺；和/或
(g)反应缓冲剂和/或盐。
35.一种由如权利要求1-17中任一项所述的重组宿主细胞产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体的组合物；
其中由所述重组宿主细胞产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体以与来自甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物不同的相对量存在，并且相对于源自植物的甜叶菊提取物具有降低水平的源自甜叶菊植物的组分。
36.一种由如权利要求18-31中任一项所述的方法产生的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体的组合物；
其中由所述重组宿主细胞产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体以与来自甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物不同的相对量存在，并且相对于源自植物的甜叶菊提取物具有降低水平的源自甜叶菊植物的组分。
37.一种甜味剂组合物，其包含如权利要求35或36所述的一种或多种甜菊醇糖苷和/或糖基化的甜菊醇前体。
38.一种食品，其包含如权利要求37所述的甜味剂组合物。
39.一种饮料或饮料浓缩物，其包含如权利要求37所述的甜味剂组合物。
40.一种编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽或其催化活性部分的核酸分子，其中所述编码的多肽或其催化活性部分包含与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽，并且还包含具有至少一个对应于SEQ ID NO：4的残基79、80、81、83、184、260、286或377的氨基酸取代的多肽。
41.一种编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽或其催化活性部分的核酸分子，其中所述编码的多肽或其催化活性部分包含与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽，并且还包含具有至少一个对应于SEQ ID NO：4的残基68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82或83的氨基酸取代的多肽。
42.如权利要求40或41所述的核酸分子，其中所述编码的多肽或其催化活性部分包含对应于SEQ ID NO：4的M79V、M79E、S80C、A81W、E83K、H184V、H184T N260T、K286C、K286E、K286N、K286T和/或S377Q氨基酸取代。
43.如权利要求40-42中任一项所述的核酸分子，其中所述编码的多肽或其催化活性部分包含：
(a)对应于SEQ ID NO：4的K286C取代；
(b)对应于SEQ ID NO：4的M79V取代；
(c)对应于SEQ ID NO：4的S377Q取代；
(d)对应于SEQ ID NO：4的S80C取代；
(e)对应于SEQ ID NO：4的N260T和K286C取代；
(f)对应于SEQ ID NO：4的H184V取代；
(g)对应于SEQ ID NO：4的A81W和E83K取代
(h)对应于SEQ ID NO：4的A81W取代；
(i)对应于SEQ ID NO：4的H184T取代；
(k)对应于SEQ ID NO：4的K286N取代；
(l)对应于SEQ ID NO：4的M79E取代；或
(m)对应于SEQ ID NO：4的K286T取代。
44.一种编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽或其催化活性部分的核酸分子，其中所述标记的多肽或其催化活性部分包含与SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：178或SEQ ID NO：180所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽。
45.一种编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的双功能多肽或其催化活性部分的核酸分子，其中所述编码的双功能多肽或其催化活性部分包含与SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQID NO：138、SEQ ID NO：140或SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：146或SEQ IDNO：148所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽。
46.如权利要求40-45中任一项所述的核酸，其中所述核酸是分离的核酸。
47.如权利要求40-46中任一项所述的核酸，其中所述核酸是cDNA。
48.一种能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽或其催化活性部分，其中所述多肽或其催化活性部分包含与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽，并且还包含具有至少一个对应于SEQ ID NO：4的残基79、80、81、83、184、260、286或377的氨基酸取代的多肽。
49.一种能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽或其催化活性部分，其中所述多肽或其催化活性部分包含与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽，并且还包含具有至少一个对应于SEQ ID NO：4的残基68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82或83的氨基酸取代的多肽。
50.如权利要求48或49所述的多肽或其催化活性部分，其中所述多肽或其催化活性部分包含对应于SEQ ID NO：4的M79V、M79E、S80C、A81W、E83K、H184V、H184T N260T、K286C、K286E、K286N、K286T和/或S377Q氨基酸取代。
51.如权利要求48-50所述的多肽或其催化活性部分，其中所述多肽或其催化活性部分包含：
(a)对应于SEQ ID NO：4的K286C取代；
(b)对应于SEQ ID NO：4的M79V取代；
(c)对应于SEQ ID NO：4的S377Q取代；
(d)对应于SEQ ID NO：4的S80C取代；
(e)对应于SEQ ID NO：4的N260T和K286C取代；
(f)对应于SEQ ID NO：4的H184V取代；
(g)对应于SEQ ID NO：4的A81W和E83K取代
(h)对应于SEQ ID NO：4的A81W取代；
(i)对应于SEQ ID NO：4的H184T取代；
(k)对应于SEQ ID NO：4的K286N取代；
(l)对应于SEQ ID NO：4的M79E取代；或
(m)对应于SEQ ID NO：4的K286T取代。
52.一种能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的标记的多肽或其催化活性部分，其中所述标记的多肽或其催化活性部分包含与SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：178或SEQ ID NO：180所示的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽。
53.一种能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化并使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的双功能多肽或其催化活性部分，其中所述双功能多肽或其催化活性部分包含与SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：138、SEQ IDNO：140或SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：146或SEQ ID NO：148所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽。
54.如权利要求48-53中任一项所述的多肽或其催化活性部分，其中所述多肽或其催化活性部分是纯化的多肽或其催化活性部分。
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